CN113388028A - 一种结合冠状病毒rbd的人源单抗及其应用 - Google Patents

Abstract

本公开提供一种特异性结合人冠状病毒刺突蛋白受体结合域（RBD）的人源抗体。从5位新冠病毒感染后康复人员的外周血单个核细胞（PBMC）中分离冠状病毒RBD特异性记忆B细胞，扩增获得49个抗体的轻重链可变区序列，对其中34个抗体进行瞬时表达分析，其中15个抗体能够特异性结合冠状病毒RBD，并且至少3个抗体能够阻断冠状病毒RBD与受体ACE2的结合。

Description

一种结合冠状病毒RBD的人源单抗及其应用

技术领域

本发明属于抗体工程领域，具体涉及一种针对冠状病毒的单抗及其应用， 特别是涉及一种结合冠状病毒刺突蛋白受体结合域RBD的人源单抗、制备方法 及应用。

背景技术

2019新型冠状病毒(2019-nCoV)，因2019年病毒性肺炎病例而被发现， 2020年1月12日被世界卫生组织命名。随后国际病毒分类委员会(ICTV)将 该病毒定名为SARS-CoV-2，其引起的疾病则被世界卫生组织命名为 COVID-19。

冠状病毒是一个大型病毒家族，已知可引起感冒以及中东呼吸综合征 (MERS)和严重急性呼吸综合征(SARS)等较严重疾病。新型冠状病毒是以 前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株。

人感染了冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困 难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚 至死亡。目前对于新型冠状病毒所致疾病没有特异治疗方法，需根据患者临床 情况进行治疗。《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第五版)》公布，在 重型、危重型病人治疗的其他治疗措施中，可采用恢复期血浆治疗。2月8日， 首期在江夏区第一人民医院开展了3名危重患者的新冠特免血浆治疗，目前连 同后续医院治疗的危重病人超过了10人。经临床反映，患者接受治疗12至24 小时后，实验室检测主要炎症指标明显下降，淋巴细胞比例上升，血氧饱和度、 病毒载量等重点指标全面向好，临床体征和症状明显好转。3月4日国家卫生 健康委办公厅、中央军委后勤保障部卫生局联合发布《新冠肺炎康复者恢复期 血浆临床治疗方案(试行第二版)》。围绕康复者血浆中和病毒的治疗目的，细 化了临床使用的适应证、禁忌证和不宜使用的情况。康复者血浆主要用于病情 进展较快、重症、危重症新冠肺炎患者。原则上病程不超过3周；新冠病毒核 酸检测阳性或临床专家判定患者存在病毒血症，在病情急性进展期应当尽早使 用。

尽管康复患者血浆疗法在临床上取得了一定的成效，然而由于抗原患者血 浆来源有限、纯化抗体安全隐患高、特异性抗体效价不稳定，因而限制了其应 用。效价高、性能稳定、安全性好的单克隆抗体对于控制新冠状病毒疫情具有 良好的应用前景。目前已有文献公开或报导了针对新冠病毒RBD制备保护性中 和单抗的报道。如利用新冠病毒刺突蛋白RBD产生抗新冠病毒的保护性中和抗 体(如：bioRxiv，“SARS-CoV-2 and SARS-CoV Spike-RBD Structure and Receptor Binding Comparison and Potential Implications onNeutralizing Antibody and Vaccine Development”，20200220)。另外，SARS刺突蛋白RBD和新冠病毒刺 突蛋白RBD存在交叉中和表位肽，抗SARS的单克隆抗体CR3022能够结合新冠病毒刺突蛋白RBD(Emerging Microbes&Infections,9(1):382-385, 20200217)。已有人采用同源建模的方法，明确了新冠病毒刺突蛋白CTD1区和 人ACE2复合物的蛋白-蛋白相互作用界面的热点和关键残基，并利用基于结构 的药效团方法，筛选靶向CTD1区域与ACE2结合表面的候选抑制剂，以阻断 病毒与人体ACE2蛋白的识别与结合。

但迄今为止，阻断新冠病毒结合宿主ACE2的单克隆抗体仍停留在理论研 究阶段，尚没有序列结构清楚、阻断新冠病毒结合功能明确的单克隆抗体的技 术报道出现。

发明内容

为解决上述问题，本发明从5位新冠病毒感染后康复人员的外周血单个核 细胞(PBMC)中分离冠状病毒RBD特异性记忆B细胞，并扩增获得49个抗体 的轻重链可变区序列，对其中34个抗体成功进行了瞬时表达，经检测其中15 个抗体能够特异性结合冠状病毒RBD，至少3个抗体能够阻断或抑制新型冠状 病毒RBD与宿主受体ACE2的结合。具体而言：

一方面，本发明提供一种特异性结合冠状病毒受体结合域(RBD)的人源 抗体或其片段，在同等测试条件下，所述人源抗体或其片段对SARS-CoV-2 RBD 的亲和力高于人ACE2对SARS-CoV-2 RBD的亲和力。

进一步，所述特异性结合冠状病毒受体结合域(RBD)的人源抗体或其片 段对SARS-CoV-2 RBD的亲和力KD值小于1E-08M。

进一步，所述特异性结合冠状病毒受体结合域(RBD)的人源抗体或其片 段能够抑制SARS-CoV-2 RBD与ACE2的结合，最大抑制率>90％。

进一步，所述特异性结合冠状病毒受体结合域(RBD)的人源抗体或其片 段，与ACE2在SARS-CoV-2 S1蛋白上具有相同的结合位点；或者

所述特异性结合冠状病毒受体结合域(RBD)的人源抗体或其片段，结合 到SARS-CoV-2 S1蛋白后，通过空间位阻效应抑制ACE2与SARS-CoV-2 S1 的结合。

进一步，所述与ACE2在SARS-CoV-2 S1蛋白上具有相同结合位点的特异 性结合冠状病毒受体结合域(RBD)的人源抗体或其片段，包括的重链可变区 选自SEQ ID NO:9、13，轻链可变区选自SEQ ID NO:11、15。

进一步，结合到SARS-CoV-2 S1蛋白后，通过空间位阻效应抑制ACE2与 SARS-CoV-2 S1的结合的人源抗体或其片段，包括的重链可变区为SEQ ID NO:17，轻链可变区为SEQID NO:19。

第二方面，本发明提供一种特异性结合冠状病毒受体结合域(RBD)的抗 体或其片段，其特征在于：所述抗体的6个超变区CDRs区与本发明第一方面 所述特异性结合冠状病毒受体结合域(RBD)的人源抗体或其片段的6个CDRs 区具有100％的氨基酸序列同源性。

第三方面，本发明提供一种特异性结合冠状病毒受体结合域(RBD)的抗 体或其片段，当通过ForteBio表位竞争结合实验检测时，所述抗体或其片段与 本发明第一方面所述特异性结合冠状病毒受体结合域(RBD)的人源抗体或其 片段具有竞争关系。

进一步，所述特异性结合冠状病毒受体结合域(RBD)的抗体或其片段， 与本发明第一方面所述特异性结合冠状病毒受体结合域(RBD)的人源抗体或 其片段具有相同的抗原表位。

第四方面，本发明提供抗体或其片段在制备治疗冠状病毒感染药物中的应 用，其中，所述抗体或其片段包含一种或多种选自由本发明第一方面～第三方面 任一所述抗体组成的组。

进一步，本发明所述的应用，其中所述冠状病毒感染为人冠状病毒感染， 包括SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV等。

第五方面，本发明提供一种多核苷酸，其编码本发明第一方面～第三方面任 一所述抗体或其抗原结合片段。

第六方面，本发明提供一种载体，其包含本发明第五方面所述的多核苷酸。

第七方面，本发明提供一种宿主细胞，其包含本发明第五方面所述的多核 苷酸或本发明第六方面所述的载体。

第八方面，本发明提供一种药物组合物，其含有本发明第一方面～第三方面 任一所述抗体或其抗原结合片段，以及可选的药学上可接受的载体。

为更好理解本发明，首先定义一些术语。其他定义则贯穿具体实施方式部 分而列出。

术语“冠状病毒”是指套式病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科 (Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)的成员。本发明所述冠状病毒 主要涉及感染人的冠状病毒，包括HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、 HCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2(2019-nCov)，本发明 所述冠状病毒特别涉及SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2(2019-nCov)。

术语“特异性”是指在蛋白和/或其他生物异质群体中确定是否存在所述蛋 白，例如本发明所述单抗与SARS-CoV-2 RBD蛋白的结合反应。因此，在所指 定的条件下，特定的配体/抗原与特定的受体/抗体结合，并且并不以显著的量与 样本中存在的其它蛋白结合。

本文中的术语“抗体”意在包括全长抗体及其任何抗原结合片段(即，抗原结 合部分)或单链。全长抗体是包含至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，重 链和轻链由二硫键连接。各重链由重链可变区(简称VH)和重链恒定区构成。重 链恒定区由三个结构域构成，即CH1、CH2和CH3。各轻链由轻链可变区(简 称VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区还 可以划分为称作互补决定区(CDR)的高变区，其由较为保守的框架区(FR)区分隔 开。各VH和VL由三个CDR以及四个FR构成，从氨基端到羧基端以FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的顺序排布。重链和轻链的可变区包 含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或 因子的结合，包括多种免疫系统细胞(例如，效应细胞)和传统补体系统的第一 组分(C1q)。

术语“单克隆抗体”或“单抗”或“单克隆抗体组成”是指单一分子组成的抗体 分子制品。单克隆抗体组成呈现出对于特定表位的单一结合特异性和亲和力。

本文中的术语，抗体的“抗原结合片段”(或简称为抗体部分)，是指抗体的保 持有特异结合抗原能力的一个或多个片段。已证实，抗体的抗原结合功能可以 通过全长抗体的片段来实施。包含在抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的例 子包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1构成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段， 包含铰链区二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1构成的 Fd片段；(iv)由抗体单臂VL和VH构成的Fv片段；(v)由VH构成的dAb片段 (Ward et al.，1989,Nature 341：544-546)；(vi)分离的互补决定区(CDR)；以及(vii) 纳米抗体，一种包含单可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。此外，尽 管Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码，它们可以通过重组法经 由使两者成为单蛋白链的合成接头而连接，其中VL和VH区配对形成单价分 子(称为单链Fc(scFv)；参见例如Bird et al.，1988,Science 242：423-426；Huston et al.，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。这些单链抗体也意在包 括在术语涵义中。这些抗体片段可以通过本领域技术人员已知的常用技术而得 到，且片段可以通过与完整抗体相同的方式进行功能筛选。

本发明的抗原结合片段包括能够特异性结合冠状病毒RBD的那些。抗体结 合片段的实例包括例如但不限于Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv片段、单链Fv(scFv) 片段和单结构域片段。

Fab片段含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab'片 段与Fab片段的不同之处在于重链CH1结构域的羧基末端处的少数残基的添加， 包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。通过切割在F(ab')2胃蛋白酶 消化产物的铰链半胱氨酸处的二硫键产生Fab'片段。抗体片段的另外化学偶联 是本领域普通技术人员已知的。Fab和F(ab')2片段缺乏完整抗体的片段可 结晶(Fc)区，从动物的循环中可更快速地清除，并且可能具有比完整抗体更 少的非特异性组织结合(参见例如，Wahl et al.，1983，J.Nucl.Med.24:316)。

如本领域通常理解的，“Fc”区是不包含抗原特异性结合区的抗体片段可 结晶恒定区。在IgG、IgA和IgD抗体同种型中，Fc区由两个相同的蛋白质片 段组成，衍生自抗体两条重链的第二和第三恒定结构域(分别为CH2和CH3结 构域)。IgM和IgE Fc区在每条多肽链中含有三个重链恒定结构域(CH2、CH3 和CH4结构域)。

“Fv”片段是含有完整靶识别和结合位点的抗体的最小片段。该区域由以 紧密的非共价结合的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体(VH-VL二聚体) 组成。在该构型中，每个可变结构域的三个CDR相互作用，以限定在VH-VL二 聚体表面上的靶结合位点。通常，六个CDR对抗体赋予靶结合特异性。然而， 在一些情况下，甚至单个可变结构域(或仅包含对于靶特异性的三个CDR的Fv 的一半)可以具有识别且结合靶的能力，尽管其亲和力低于整个结合位点。

“单链Fv”或“scFv”抗体结合片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这 些结构域存在于单条多肽链中。一般地，Fv多肽进一步包含在VH和VL结构域 之间的多肽接头，其致使scFv能够形成有利于靶结合的结构。

“单结构域片段”由对冠状病毒RBD显示出足够亲和力的单个VH或VL结 构域组成。在一个具体实施方案中，单结构域片段是骆驼化的(参见例如， Riechmann，1999，J.Immunol.Methods,231:25–38)。

本发明的抗冠状病毒RBD的抗体包括衍生化抗体。例如，衍生化抗体通常 通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/封闭基团 的衍生化、蛋白酶解切割、与细胞配体或其它蛋白质的连接来修饰。可以通过 已知技术进行众多化学修饰中的任一种，所述技术包括但不限于特定的化学切 割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。另外，衍生物可以含有一种或多 种非天然氨基酸，例如，使用ambrx技术(参见例如，Wolfson，2006，Chem.Biol. 13(10):1011-2)。

“人源抗体”包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，并且包括从人 免疫球蛋白文库或动物中分离的抗体，所述动物对于一种或多种人免疫球蛋白 是转基因的，并且不表达内源免疫球蛋白。人抗体可以通过本领域已知的各种 方法制备，所述方法包括使用衍生自人免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展 示方法。参见美国专利号4,444,887和4,716,111；以及PCT公开WO 98/46645；WO 98/50433；WO 98/24893；WO 98/16654；WO 96/34096；WO96/33735；和 WO 91/10741。还可以使用不能表达功能性内源免疫球蛋白，但可以表达人免 疫球蛋白基因的转基因小鼠来产生人抗体。参见例如，PCT公开WO 98/24893； WO92/01047；WO 96/34096；WO 96/33735；美国专利号5,413,923；5,625,126； 5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771； 和5,939,598。另外，使用与上述类似的技术，公司例如LakePharma，Inc. (Belmont，CA)或Creative BioLabs(Shirley，NY)可以从事与提供针对所选 抗原的人抗体。可以使用被称为“引导选择”的技术生成识别所选表位的全人 抗体。在该方法中，选择非人单克隆抗体，例如小鼠抗体，用于引导识别相同 表位的完全人抗体的选择(参见，Jespers et al.，1988，Biotechnology12:899-903)。

术语“识别抗原的抗体”以及“对抗原特异的抗体”在本文中与术语“特异结合 抗原的抗体”交替使用。

术语“高亲和性”对于IgG抗体而言，是指对于抗原的KD为1.0×10^-6M以 下，优选5.0×10^-8M以下，更优选1.0×10^-8M以下、5.0×10^-9M以下，更优选 1.0×10^-9M以下。对于其他抗体亚型，“高亲和性”结合可能会变化。例如，IgM 亚型的“高亲和性”结合是指KD为10^-6M以下，优选10^-7M以下，更优选10^-8M 以下。

术语“Kassoc”或“Ka”是指特定抗体-抗原相互作用的结合速率，而术语 “Kdis”或“Kd”是指特定抗体-抗原相互作用的离解速率。术语“KD”是指解离常 数，由Kd与Ka比(Kd/Ka)得到，并以摩尔浓度(M)表示。抗体的KD值可以通 过领域内已知的方法确定。优选的确定抗体KD的方式是使用表面等离子共振 仪(SPR)测得的，优选使用生物传感系统例如Biacore^TM系统测得。

术语“EC50”，又叫半最大效应浓度，是指引起50％最大效应的抗体浓度。

与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下优点：

第一，本发明提供了一种人源抗冠状病毒RBD的单克隆抗体，氨基酸序列 结构明确、对冠状病毒RBD亲和力高、抑制或阻断冠状病毒RBD与宿主细胞 结合的效果确切，用作药物时具有较低的异源性和较高的临床应用潜力。

第二，本发明提供的人源抗冠状病毒RBD单克隆抗体能够特异性结合多种 人冠状病毒，包括但不限于SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2(2019-nCov)， 因此本发明的人源单抗适用于各种人冠状病毒感染的诊断、预防和/或治疗。

第三，本发明提供的人源抗冠状病毒RBD单克隆抗体是从大量候选人源抗 体中分离获得的。发明人经过研究发现，冠状病毒RBD特异性记忆B细胞中 不必然表达对冠状病毒RBD具有特异性的抗体；特异性结合冠状病毒RBD单 克隆抗体对RBD亲和力的高低与阻断冠状病毒与宿主结合的能力也不必然成 正比。本发明从大量抗体中逐级筛选，最终获得了三株抑制或阻断冠状病毒与 宿主结合能力强的全人源单克隆抗体8B4、24G8和24E5。

附图说明

通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领 域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并 不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的 部件。在附图中：

图1：SARS-CoV-2 S1蛋白RBD与His的融合表达。

图2：SARS-CoV-2 S1蛋白RBD与mFc的融合表达。

图3：SARS-CoV-2 S1蛋白与mFc的融合表达。

图4：人ACE2与人Fc的融合表达。

图5：SARS-CoV-2感染康复患者血清IgG和IgM的检测。

图6：流式单细胞分选捕获SARS-CoV-2 S1蛋白RBD特异性记忆B细胞。

图7：重组抗体24G8、24E5、8B4结合表位分析。

图8：重组抗体24G8、24E5、8B4阻断S1RBD-mFc与ACE2结合的能力。 CR3022是US2010172917A1公开的一株抗SARS-CoV RBD的单抗；8C10是本 发明制备的与S1RBD-mFc有特异性结合的15株抗体之一。

图9：重组抗体24G8、24E5、8B4阻断S1-mFc与ACE2结合的能力。

图10：8B4对不同形式和不同冠状病毒S蛋白的结合活性。

图11：24G8对不同形式和不同冠状病毒S蛋白的结合活性。

图12：ACE2-hFc对不同形式和不同冠状病毒S蛋白的结合活性。

图13：重组抗体24G8与8B4的协同增强作用。

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示 了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不 应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻 地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。

实施例1：SARS-CoV-2抗原及宿主受体的重组表达

将全合成的基因S1RBD(Accession：QHD43416.1，319-541aa)，通过酶切 方法分别克隆入C端带有His标签或mFc标签的真核瞬时表达载体中，将获得 的表达质粒，转入大肠杆菌扩增，分离获得S1RBD-his和S1RBD-mFc表达质粒， 并根据转染试剂293fectin(Cat:12347019，Gibco)的操作说明，将质粒转入 HEK293细胞中重组表达。细胞转染后5-6天，取培养上清，S1RBD-mFc利用ProA 亲和层析柱对表达上清进行纯化，获得S1RBD-mFc蛋白。S1RBD-his利用HisTrap HP亲和层析柱对表达上清进行纯化，获得S1RBD-his蛋白。并将获得的重组蛋 白通过SDS-PAGE检测纯度(图1-2)。S1RBD-his的编码核酸序列如SEQ ID NO:1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；S1RBD-mFc的编码核酸序列如SEQ ID NO:3 所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

通过PCR的方法从购买的全长SARS-CoV-2表达载体(Cat:VG40589-UT，北 京义翘神州)中克隆出S1基因(Accession：QHD43416.1，1-685aa)，并通过酶 切方法分别克隆入C端带有mFc标签的真核瞬时表达载体中，将获得的表达质 粒，转入大肠杆菌扩增，分离获得S1-mFc表达质粒，并根据转染试剂293fectin (Cat:12347019，Gibco)的操作说明，将质粒转入HEK293细胞中重组表达。 细胞转染后5-6天，取培养上清，利用ProA亲和层析柱对S1-mFc表达上清进 行纯化，获得S1-mFc蛋白。并将获得的重组蛋白通过SDS-PAGE检测纯度(图3)。S1-mFc的编码核酸序列如SEQ ID NO:5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:6 所示。

通过PCR的方法从购买的全长人ACEII表达载体(Cat:HG10108-ACR，北京 义翘神州)中克隆出ACEII胞外区基因ACE2(1-615)(Accession：NP_068576.1， 1-615aa)，并通过酶切方法分别克隆入C端带有hFc标签的真核瞬时表达载体 中，将获得的表达质粒，转入大肠杆菌扩增，分离获得ACE2(1-615)-hFc表 达质粒，并根据转染试剂293fectin(Cat:12347019，Gibco)的操作说明，将质 粒转入HEK293细胞中重组表达。细胞转染后5-6天，取培养上清，利用ProA 亲和层析柱对表达上清进行纯化，获得ACE2(1-615)-hFc蛋白，并将获得的重组 蛋白通过SDS-PAGE检测纯度(图4)。ACE2(1-615)-hFc的编码核酸序列如SEQ IDNO:7所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

实施例2：SARS-CoV-2 S1蛋白RBD特异性记忆B细胞的分离

从汕头大学附属第一医院收集到5位新冠恢复期患者的全血样本(AP8、 AP23、AP24、AP25和AP31)，采用新冠抗体检测试剂盒(丽珠试剂)对患者血 清中IgG及IgM抗体进行了检测。结果如图5所示，所有5份血清样本均为新 冠抗体IgG阳性。利用RosetteSep试剂盒(Cat:15064,STEMCELL)对B细胞进 行了富集，在此基础上采用FITC标记的S1-RBD-his去捕获新冠RBD特异性结合 的记忆性B细胞并进行流式单细胞分选。结果如图6所示，S1-RBD特异性记忆 性B细胞(CD3-CD19+CD27+CD38int S1-RBD+)被分选于96孔板中用于后续单B细胞的克隆。

实施例3：人源抗SARS-CoV-2 RBD抗体序列的扩增

采用RNA磁珠(南京诺唯赞)提取单B细胞的RNA，反转录成cDNA，具 体方法如下：

1.每孔分装5μl Catch Buffer B(TCL+1％β-ME)，分选单个记忆性B细胞。

2.贴膜，2000rpm离心1min。

3.每孔加入10μl H₂O和33μl Beads，吹吸混匀，室温作用10min。

4.置磁力架，室温5min，弃上清。

5.用200μl无核酸酶水新鲜配置的80％乙醇漂洗磁珠，室温30s，弃上 清。

6.重复漂洗一次，弃上清，风干3min。

7.移下磁力架，每孔加12μl Mix 1，吹吸5次，室温作用5min。

8.置磁力架，室温2min，转移10μl至新板，300g离心30s，运行程序 1。

9.每孔加10μl Mix 2，混匀、离心，运行程序2。

10.合成好的cDNA尽快进行PCR。

Mix 1：310μl H₂O+50μl dNTP+20μl Random 6+20μl Oligo_dT

Mix 2：170μl H₂O+160μl Buffer+40μl DTT+20μl RNase I+10μl RTase IV(Cat:EN0601 and 18090010,ThermoFisher)

程序1：65℃5min→4℃∞

程序2：23℃10min→50℃30min→80℃10min→4℃∞

采用两步PCR法扩增抗体重链以及轻链(Kappa)可变区基因。引物序列源 自于Human Monoclonal Antibodies书中第114至117页。具体方法如下：

第一轮PCR(Ig-VH1、Ig-VK1)，反应体系(20μl)：

运行程序：

94℃5min→(94℃30s→51℃30s→72℃55s)×15Cycles

→(94℃30s→56℃30s→72℃55s)×30Cycles

→72℃8min

→4℃∞

第二轮PCR(Ig-VH2、Ig-VK2)，反应体系(20μl)：

运行程序：

94℃5min→(94℃30s→57℃30s→72℃45s)×50Cycles

→72℃10min

→4℃∞

琼脂糖凝胶电泳分离纯化PCR产物并进行抗体轻、重链可变区测序。

实施例4：人源抗SARS-CoV-2 RBD抗体的表达及特异性结合初筛鉴定

对测序后的122对序列进行分析、并进一步合成其中的49对抗体轻重链可 变区基因，将其克隆入全抗体瞬时表达载体中，进行重组表达和特异性鉴定。 将全合成的抗体重链可变区，通过酶切克隆入真核瞬时表达载体pKN041的人 IgG1的重链恒定区编码基因的上游，全合成的抗体轻链可变区通过酶切克隆入 真核瞬时表达载体pKN019的人轻链Cκ的编码基因的上游，构建轻、重链表达 载体，获得轻链和重链表达质粒，转入大肠杆菌扩增，分离获得抗体轻链和重 链质粒，并根据转染试剂293fectin(Cat:12347019，Gibco)的操作说明，将抗 体的轻、重链质粒转入HEK293细胞中重组表达。

细胞转染后24小时，取上清利用ForteBio公司的Octet QKe system仪器， 采用抗人免疫球蛋白Fc段传感器(AHC)生物探针捕获抗体Fc段的方法，测 定抗体与S1RBD的结合。测定时将抗体上清及抗体，流经AHC探针(Cat:18-0015， PALL)表面，时间为240s。S1RBD-mFc(北京科诺信诚科技有限公司表达， lot:20200217A)作为流动相，S1RBD-mFc重组蛋白浓度为100nM。结合时间为 300s，解离时间为300s。实验完毕，用软件进行1：1 Langmuir结合模式拟合， 计算抗原抗体结合的动力学常数。共检测了34个抗体，其中与S1RBD-mFc有特异性结合的抗体为15个(表1)。

表1候选抗体与S1RBD-mFc的特异性结合动力学参数

根据表1可知，34株成功表达的抗体分子中，经过初筛对S1RBD-mFc具有 特异性结合能力的15株抗体分别为8A5、8B3、8B4、8C10、23B11、24C6、24E5、 24G7、24G8、24H8、24A2、24E8、24C3、31C6、31C10。从初筛亲和力高的抗 体克隆中，选择24G8、24E5、8B4进行进一步研究。

所述抗体24G8的重轻链可变区氨基酸序列分别为SEQ ID NO:13、15，相应 的编码核酸序列分别为SEQ ID NO:14、16。经过序列分析，抗体24G8的 HCDR1-HCDR3分别为SEQ IDNO:33-35，LCDR1-LCDR3分别为SEQ ID NO:36-38。

所述抗体24E5的重轻链可变区氨基酸序列分别为SEQ ID NO:17、19，相应 的编码核酸序列分别为SEQ ID NO:18、20。经过序列分析，抗体24E5的 HCDR1-HCDR3分别为SEQ IDNO:27-29，LCDR1-LCDR3分别为SEQ ID NO:30-32。

所述抗体8B4的重轻链可变区氨基酸序列分别为SEQ ID NO:9、11，相应的 编码核酸序列分别为SEQ ID NO:10、12。经过序列分析，抗体8B4的 HCDR1-HCDR3分别为SEQ IDNO:21-23，LCDR1-LCDR3分别为SEQ ID NO:24-26。

实施例5：抗体24G8、24E5、8B4的表位竞争结合活性分析

将ForteBio检测初筛亲和力高的抗体克隆(24G8、24E5、8B4)利用ForteBio 进行表位分析。按照Biotin标记试剂盒EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin说明(Cat:21343， Thermo)，对抗体24G8、8B4进行Biotin标记。利用ForteBio公司的Octet QKe system仪器，采用链霉亲和素(SA)生物探针捕获Biotin的方法测定不同抗体 的识别表位。测定时将Biotin标记的24G8、8B4重组抗体(4μg/ml)，流经SA 探针(Cat:18-5019，PALL)表面，时间为240s，每个抗体各loading 4根SA探 针。S1RBD-His(北京科诺信诚科技有限公司表达，lot:20200213A)作为流动相， S1RBD-His重组蛋白浓度为200nM，结合240s后，更换流动相为重组抗体24G8、24E5、8B4，浓度为60nM，结合300s。解离时间为300s。实验完毕，观察各个 抗体的识别表位是否存在竞争关系。

实验设计如表2所示，结果如图7所示。尽管8B4和24G8都与S1-RBD结 合，但两者表位无明显重叠和干扰，8B4结合后24G8仍然可以很好结合S1-RBD， 反之亦然。而另一非阻断型对照抗体24E5则与8B4有竞争关系。提示两者抗原 表位不同。

表2.重组抗体结合表位分析的上样顺序及抗体编号

Sensor location	Loading Sample ID	Sample ID
			A8	24G8-Biotin	24G8
B8	24G8-Biotin	8B4
			C8	24G8-Biotin	24E5
E8	8B4-Biotin	24G8
			F8	8B4-Biotin	8B4
G8	8B4-Biotin	24E5

实施例6：抗体24G8、24E5、8B4的ELISA阻断活性

将上清ForteBio检测亲和力高的克隆(24G8、24E5、8B4)进行进一步的 ELISA阻断活性检测。具体方法如下：

1.包板：包被human ACE2-hFc(1-615)(北京科诺信诚科技有限公司表达， lot:20200213C)，浓度为0.75μg/ml；每孔100ul；4℃过夜；

2.封闭：5％BSA in PBS，37℃，120min，PBST洗板4次；

3.加一抗：在120μl 30ng/ml S1-RBD-mFc(北京科诺信诚科技有限公司表 达，lot:20200217A)或120μl 100ng/ml S1-mFc(北京科诺信诚科技有限公司表达， lot:20200221E)中，分别加入120μl 24G7、CR3022、8C10、24G8、24E5、8B4(10μg/ml) 和8B4+24G8(1:1混合，5μg/ml)，略震荡混匀放置50min后，每孔取2份100μl 混合液，平行加入humanACE2-hFc(1-615)包被孔；

4.加二抗：HRP-anti-mouse IgG(Cat:115-035-071,Jackson Immuno Research)(1:5000)37℃，45min，PBST洗板4次；

5.显色：TMB(Cat:ME142，北京泰天河生物)显色，37℃，10min；

6.终止：2M HCL终止反应；

7.读数：读取并记录波长450nm下孔板的吸光度值。

结果如图8及图9所示，对于S1RBD与ACEII，S1与ACEII的结合，重组抗 体8B4和24G8都有明显的阻断活性，且具有协同效应。重组抗体24E5不能阻 断S1RBD与ACE2的结合，但能够抑制S1与ACE2的结合。上述结果表明抗体 8B4和24G8与ACE2，在SARS-CoV-2 S1蛋白上可能具有相同的结合位点，并 且能够直接阻断S1RBD与ACE2的结合；抗体24E5并不直接结合于ACE2在RBD 上的结合位点，但当RBD位于特定的S1蛋白构象中时，抗体24E5与S1的结合，可通过空间位阻效应抑制ACE2与SARS-CoV-2 S1的结合。

实施例7：抗体8B4和24G8的抗原亲和力和抗原谱分析

应用ForteBio蛋白相互作用系统测定抗体及ACE2-hFc分别与S1RBD-His、 mFc-S1RBD蛋白抗原结合的亲和力。主要步骤如下：

利用ForteBio公司的Octet QKe system仪器，采用抗人抗体Fc段的AHC 生物探针捕获抗体Fc段的方法，测定抗体与单价S1RBD的结合。测定时将8B4、 24G8重组抗体及ACE2-hFc(1-615)重组蛋白(4μg/ml)，流经AHC探针 (Cat:18-5060，PALL)表面，时间为120s。不同浓度稀释的S1RBD-His作为流 动相。结合时间为300s，解离时间为300s。实验完毕，扣除空白对照响应值， 用软件进行1：1 Langmuir结合模式拟合，计算抗原抗体结合的动力学常数， 结果如表3所示。

表3.候选抗体和ACE2-hFc分别与S1RBD-His重组蛋白的亲和力比较

名称	KD(M)	Kon(1/Ms)	Kdis(1/s)
				8B4	7.70E-09	2.04E+05	1.57E-03
24G8	1.08E-09	2.44E+05	2.64E-04
				ACE2-hFc	1.39E-08	2.68E+05	3.73E-03

采用抗人抗体Fc段的捕获抗体(AHC)生物探针捕获抗体Fc段的方法测 定抗体同时与双价及单价S1RBD结合的差异。测定时将8B4、24G8重组抗体及 ACE2-hFc(1-615)重组蛋白(4μg/ml)，分别流经AHC探针(Cat:18-5060，PALL) 表面，时间为120s。等浓度的S1RBD-mFc或S1RBD-his作为流动相。结合时间 为300s，解离时间为300s。实验完毕，扣除空白对照响应值，用软件进行1：1 Langmuir结合模式拟合，计算抗原抗体结合的动力学常数，结果如表4所示。

表4.抗体单双价亲和力差异比较

表4的数据表明，与单价的亲和力相比，抗体对聚体形式的S蛋白整体结 合能力明显增强，且8B4的变化幅度更大，双价亲和力提高数百倍，尤其是Koff 明显改善，甚至高于24G8的双价亲和常数；24G8提高不到10倍，但仍明显优 于ACE2-hFc的双价亲和常数。提示两个候选抗体，尤其是8B4，可能对病毒表 面大量聚合体形式的S蛋白(多拷贝，三聚体)具有更强的结合优势。

通过常规ELISA测定了8B4，24G8和ACE2-hFc(1-615)分别对新冠状病毒 S1RBD-his，S1-his的结合及其与SARS-S1和MERS-S1的交叉反应性。结果如图 10-12所示。8B4仅特异性结合新冠状病毒的S蛋白，24G8和ACE2-hFc均可同 时交叉结合SARS的S1蛋白。

实施例8：抗体8B4和24G8的联合增强阻断作用

将human ACE2-hFc(1-615)重组蛋白，浓度0.75μg/ml，100μl/孔，4℃包被 过夜，用5％BSA于37℃恒温培养箱封闭120min后，PBST洗板4次。将8B4， 24G8(起始浓度为40μg/ml，1.5倍连续稀释，12个梯度)和8B4+24G8(1:1 混合，起始浓度为20μg/ml，1.5倍连续稀释，12个梯度)重组抗体与S1-RBD-mFc 70ng/ml，各取100μl等体积混匀，37℃放置50min后，每个样本各取两份100μl 混合物，平行加入到ACE2-hFc包被孔中；37℃恒温培养箱反应60min后，PBST 洗板4次；然后加入1:5000稀释的HRP-anti-mouse IgG(Cat:115-035-071,Jackson Immuno Research)，反应45min，PBST洗板4次；再加入TMB(Cat:ME142，北 京泰天河生物)底物显色15min，2M HCl终止后读板。读取并记录波长450nm 下孔板的吸光度值，结果如图13和表5所示。

表5. 24G8和8B4对S1RBD/ACE2-hFc结合的抑制及联合增强

结果表明，8B4和24G8均有明显的阻断活性，8B4和24G8对ACE2-mFc(1-615) 与S1RBD-mFC重组蛋白结合的竞争抑制效应，其半数有效抑制浓度(IC50)值 分别23.14nM和11.41nM，而两者1:1联用不仅增强阻断强度，也实现了100％ 的最大抑制率。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局 限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易 想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护 范围应以所述权利要求的保护范围为准。

序列表

<110> 深圳市福田区格物智康病原研究所

迈威（上海）生物科技有限公司

<120> 一种结合冠状病毒RBD的人源单抗及其应用

<130> None

<160> 38

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 747

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

atgcctctgc tgctgctgct gcctctgctg tgggctggag ccctggctcg ggtgcagccc 60

accgagtcca tcgtgcggtt ccccaacatc accaacctgt gccccttcgg cgaggtgttc 120

aacgccaccc ggttcgcctc cgtgtacgcc tggaaccgga agcggatctc caactgcgtg 180

gccgactact ccgtgctgta caactccgcc tccttctcca ccttcaagtg ctacggcgtg 240

tctcccacca agctgaacga cctgtgcttc accaacgtgt acgccgactc cttcgtgatc 300

agaggcgacg aggtgcggca gatcgctcct ggccagaccg gcaagatcgc cgactacaac 360

tacaagctgc ccgacgactt caccggctgc gtgatcgcct ggaactccaa caacctggac 420

tccaaggtgg gaggcaacta caactacctg taccggctgt tccggaagtc caacctgaag 480

cccttcgagc gggacatctc caccgagatc taccaggctg gctccacacc ctgcaacggc 540

gtggagggct tcaactgcta cttccctctg cagtcctacg gcttccagcc caccaacggc 600

gtgggctacc agccctaccg ggtggtggtg ctgtccttcg agctgctgca cgctcctgcc 660

accgtgtgcg gacccaagaa gtccaccaac ctggtgaaga acaagtgcgt gaacttcgct 720

agcggatccc atcaccatca ccatcac 747

<210> 2

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala

1 5 10 15

Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn

20 25 30

Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val

35 40 45

Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser

50 55 60

Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val

65 70 75 80

Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp

85 90 95

Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln

100 105 110

Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr

115 120 125

Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly

130 135 140

Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys

145 150 155 160

Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr

165 170 175

Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser

180 185 190

Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val

195 200 205

Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly

210 215 220

Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Ala

225 230 235 240

Ser Gly Ser His His His His His His

245

<210> 3

<211> 1404

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

atgcctctgc tgctgctgct gcctctgctg tgggctggag ccctggctcg ggtgcagccc 60

accgagtcca tcgtgcggtt ccccaacatc accaacctgt gccccttcgg cgaggtgttc 120

aacgccaccc ggttcgcctc cgtgtacgcc tggaaccgga agcggatctc caactgcgtg 180

gccgactact ccgtgctgta caactccgcc tccttctcca ccttcaagtg ctacggcgtg 240

tctcccacca agctgaacga cctgtgcttc accaacgtgt acgccgactc cttcgtgatc 300

agaggcgacg aggtgcggca gatcgctcct ggccagaccg gcaagatcgc cgactacaac 360

tacaagctgc ccgacgactt caccggctgc gtgatcgcct ggaactccaa caacctggac 420

tccaaggtgg gaggcaacta caactacctg taccggctgt tccggaagtc caacctgaag 480

cccttcgagc gggacatctc caccgagatc taccaggctg gctccacacc ctgcaacggc 540

gtggagggct tcaactgcta cttccctctg cagtcctacg gcttccagcc caccaacggc 600

gtgggctacc agccctaccg ggtggtggtg ctgtccttcg agctgctgca cgctcctgcc 660

accgtgtgcg gacccaagaa gtccaccaac ctggtgaaga acaagtgcgt gaacttcgct 720

agcgtgccca gggattgtgg ttgtaagcct tgcatatgta cagtcccaga agtatcatct 780

gtcttcatct tccccccaaa gcccaaggat gtgctcacca ttactctgac tcctaaggtc 840

acgtgtgttg tggtagacat cagcaaggat gatcccgagg tccagttcag ctggtttgta 900

gatgatgtgg aggtgcacac agctcagacg caaccccggg aggagcagtt caacagcact 960

ttccgctcag tcagtgaact tcccatcatg caccaggact ggctcaatgg caaggagttc 1020

aaatgcaggg tcaacagtgc agctttccct gcccccatcg agaaaaccat ctccaaaacc 1080

aaaggcagac cgaaggctcc acaggtgtac accattccac ctcccaagga gcagatggcc 1140

aaggataaag tcagtctgac ctgcatgata acagacttct tccctgaaga cattactgtg 1200

gagtggcagt ggaatgggca gccagcggag aactacaaga acactcagcc catcatggac 1260

acagatggct cttacttcgt ctacagcaag ctcaatgtgc agaagagcaa ctgggaggca 1320

ggaaatactt tcacctgctc tgtgttacat gagggcctgc acaaccacca tactgagaag 1380

agcctctccc actctcctgg taaa 1404

<210> 4

<211> 468

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala

1 5 10 15

Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn

20 25 30

Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val

35 40 45

Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser

50 55 60

Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val

65 70 75 80

Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp

85 90 95

Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln

100 105 110

Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr

115 120 125

Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly

130 135 140

Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys

145 150 155 160

Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr

165 170 175

Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser

180 185 190

Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val

195 200 205

Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly

210 215 220

Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Ala

225 230 235 240

Ser Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro

245 250 255

Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu

260 265 270

Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser

275 280 285

Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu

290 295 300

Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

305 310 315 320

Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn

325 330 335

Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro

340 345 350

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln

355 360 365

Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val

370 375 380

Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val

385 390 395 400

Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln

405 410 415

Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn

420 425 430

Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val

435 440 445

Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His

450 455 460

Ser Pro Gly Lys

465

<210> 5

<211> 2742

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

atgtttgtgt tcctggtgct gctgccactg gtgtccagcc agtgtgtgaa cctgaccacc 60

aggacccaac ttcctcctgc ctacaccaac tccttcacca ggggagtcta ctaccctgac 120

aaggtgttca ggtcctctgt gctgcacagc acccaggacc tgttcctgcc attcttcagc 180

aatgtgacct ggttccatgc catccatgtg tctggcacca atggcaccaa gaggtttgac 240

aaccctgtgc tgccattcaa tgatggagtc tactttgcca gcacagagaa gagcaacatc 300

atcaggggct ggatttttgg caccaccctg gacagcaaga cccagtccct gctgattgtg 360

aacaatgcca ccaatgtggt gattaaggtg tgtgagttcc agttctgtaa tgacccattc 420

ctgggagtct actaccacaa gaacaacaag tcctggatgg agtctgagtt cagggtctac 480

tcctctgcca acaactgtac ctttgaatat gtgagccaac cattcctgat ggacttggag 540

ggcaagcagg gcaacttcaa gaacctgagg gagtttgtgt tcaagaacat tgatggctac 600

ttcaagattt acagcaaaca cacaccaatc aacctggtga gggacctgcc acagggcttc 660

tctgccttgg aaccactggt ggacctgcca attggcatca acatcaccag gttccagacc 720

ctgctggctc tgcacaggtc ctacctgaca cctggagact cctcctctgg ctggacagca 780

ggagcagcag cctactatgt gggctacctc caaccaagga ccttcctgct gaaatacaat 840

gagaatggca ccatcacaga tgctgtggac tgtgccctgg acccactgtc tgagaccaag 900

tgtaccctga aatccttcac agtggagaag ggcatctacc agaccagcaa cttcagggtc 960

caaccaacag agagcattgt gaggtttcca aacatcacca acctgtgtcc atttggagag 1020

gtgttcaatg ccaccaggtt tgcctctgtc tatgcctgga acaggaagag gattagcaac 1080

tgtgtggctg actactctgt gctctacaac tctgcctcct tcagcacctt caagtgttat 1140

ggagtgagcc caaccaaact gaatgacctg tgtttcacca atgtctatgc tgactccttt 1200

gtgattaggg gagatgaggt gagacagatt gcccctggac aaacaggcaa gattgctgac 1260

tacaactaca aactgcctga tgacttcaca ggctgtgtga ttgcctggaa cagcaacaac 1320

ctggacagca aggtgggagg caactacaac tacctctaca gactgttcag gaagagcaac 1380

ctgaaaccat ttgagaggga catcagcaca gagatttacc aggctggcag cacaccatgt 1440

aatggagtgg agggcttcaa ctgttacttt ccactccaat cctatggctt ccaaccaacc 1500

aatggagtgg gctaccaacc atacagggtg gtggtgctgt cctttgaact gctccatgcc 1560

cctgccacag tgtgtggacc aaagaagagc accaacctgg tgaagaacaa gtgtgtgaac 1620

ttcaacttca atggactgac aggcacagga gtgctgacag agagcaacaa gaagttcctg 1680

ccattccaac agtttggcag ggacattgct gacaccacag atgctgtgag ggacccacag 1740

accttggaga ttctggacat cacaccatgt tcctttggag gagtgtctgt gattacacct 1800

ggcaccaaca ccagcaacca ggtggctgtg ctctaccagg atgtgaactg tactgaggtg 1860

cctgtggcta tccatgctga ccaacttaca ccaacctgga gggtctacag cacaggcagc 1920

aatgtgttcc agaccagggc tggctgtctg attggagcag agcatgtgaa caactcctat 1980

gagtgtgaca tcccaattgg agcaggcatc tgtgcctcct accagaccca gaccaacagc 2040

ccaaggaggg caagggctag cgtgcccagg gattgtggtt gtaagccttg catatgtaca 2100

gtcccagaag tatcatctgt cttcatcttc cccccaaagc ccaaggatgt gctcaccatt 2160

actctgactc ctaaggtcac gtgtgttgtg gtagacatca gcaaggatga tcccgaggtc 2220

cagttcagct ggtttgtaga tgatgtggag gtgcacacag ctcagacgca accccgggag 2280

gagcagttca acagcacttt ccgctcagtc agtgaacttc ccatcatgca ccaggactgg 2340

ctcaatggca aggagttcaa atgcagggtc aacagtgcag ctttccctgc ccccatcgag 2400

aaaaccatct ccaaaaccaa aggcagaccg aaggctccac aggtgtacac cattccacct 2460

cccaaggagc agatggccaa ggataaagtc agtctgacct gcatgataac agacttcttc 2520

cctgaagaca ttactgtgga gtggcagtgg aatgggcagc cagcggagaa ctacaagaac 2580

actcagccca tcatggacac agatggctct tacttcgtct acagcaagct caatgtgcag 2640

aagagcaact gggaggcagg aaatactttc acctgctctg tgttacatga gggcctgcac 2700

aaccaccata ctgagaagag cctctcccac tctcctggta aa 2742

<210> 6

<211> 914

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val

1 5 10 15

Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe

20 25 30

Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu

35 40 45

His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp

50 55 60

Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp

65 70 75 80

Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu

85 90 95

Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser

100 105 110

Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile

115 120 125

Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr

130 135 140

Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr

145 150 155 160

Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu

165 170 175

Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe

180 185 190

Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr

195 200 205

Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu

210 215 220

Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr

225 230 235 240

Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser

245 250 255

Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro

260 265 270

Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala

275 280 285

Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys

290 295 300

Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val

305 310 315 320

Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys

325 330 335

Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala

340 345 350

Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu

355 360 365

Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro

370 375 380

Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe

385 390 395 400

Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly

405 410 415

Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys

420 425 430

Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn

435 440 445

Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe

450 455 460

Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys

465 470 475 480

Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly

485 490 495

Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val

500 505 510

Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys

515 520 525

Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn

530 535 540

Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu

545 550 555 560

Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val

565 570 575

Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe

580 585 590

Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val

595 600 605

Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile

610 615 620

His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser

625 630 635 640

Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val

645 650 655

Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala

660 665 670

Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ala Ser Val

675 680 685

Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val

690 695 700

Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile

705 710 715 720

Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp

725 730 735

Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His

740 745 750

Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg

755 760 765

Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

770 775 780

Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu

785 790 795 800

Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr

805 810 815

Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu

820 825 830

Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp

835 840 845

Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile

850 855 860

Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln

865 870 875 880

Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His

885 890 895

Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro

900 905 910

Gly Lys

<210> 7

<211> 2547

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

atgtcaagct cttcctggct ccttctcagc cttgttgctg taactgctgc tcagtccacc 60

attgaggaac aggccaagac atttttggac aagtttaacc acgaagccga agacctgttc 120

tatcaaagtt cacttgcttc ttggaattat aacaccaata ttactgaaga gaatgtccaa 180

aacatgaata atgctgggga caaatggtct gcctttttaa aggaacagtc cacacttgcc 240

caaatgtatc cactacaaga aattcagaat ctcacagtca agcttcagct gcaggctctt 300

cagcaaaatg ggtcttcagt gctctcagaa gacaagagca aacggttgaa cacaattcta 360

aatacaatga gcaccatcta cagtactgga aaagtttgta acccagataa tccacaagaa 420

tgcttattac ttgaaccagg tttgaatgaa ataatggcaa acagtttaga ctacaatgag 480

aggctctggg cttgggaaag ctggagatct gaggtcggca agcagctgag gccattatat 540

gaagagtatg tggtcttgaa aaatgagatg gcaagagcaa atcattatga ggactatggg 600

gattattgga gaggagacta tgaagtaaat ggggtagatg gctatgacta cagccgcggc 660

cagttgattg aagatgtgga acataccttt gaagagatta aaccattata tgaacatctt 720

catgcctatg tgagggcaaa gttgatgaat gcctatcctt cctatatcag tccaattgga 780

tgcctccctg ctcatttgct tggtgatatg tggggtagat tttggacaaa tctgtactct 840

ttgacagttc cctttggaca gaaaccaaac atagatgtta ctgatgcaat ggtggaccag 900

gcctgggatg cacagagaat attcaaggag gccgagaagt tctttgtatc tgttggtctt 960

cctaatatga ctcaaggatt ctgggaaaat tccatgctaa cggacccagg aaatgttcag 1020

aaagcagtct gccatcccac agcttgggac ctggggaagg gcgacttcag gatccttatg 1080

tgcacaaagg tgacaatgga cgacttcctg acagctcatc atgagatggg gcatatccag 1140

tatgatatgg catatgctgc acaacctttt ctgctaagaa atggagctaa tgaaggattc 1200

catgaagctg ttggggaaat catgtcactt tctgcagcca cacctaagca tttaaaatcc 1260

attggtcttc tgtcacccga ttttcaagaa gacaatgaaa cagaaataaa cttcctgctc 1320

aaacaagcac tcacgattgt tgggactctg ccatttactt acatgttaga gaagtggagg 1380

tggatggtct ttaaagggga aattcccaaa gaccagtgga tgaaaaagtg gtgggagatg 1440

aagcgagaga tagttggggt ggtggaacct gtgccccatg atgaaacata ctgtgacccc 1500

gcatctctgt tccatgtttc taatgattac tcattcattc gatattacac aaggaccctt 1560

taccaattcc agtttcaaga agcactttgt caagcagcta aacatgaagg ccctctgcac 1620

aaatgtgaca tctcaaactc tacagaagct ggacagaaac tgttcaatat gctgaggctt 1680

ggaaaatcag aaccctggac cctagcattg gaaaatgttg taggagcaaa gaacatgaat 1740

gtaaggccac tgctcaacta ctttgagccc ttatttacct ggctgaaaga ccagaacaag 1800

aactcttttg tgggatggag taccgactgg agtccatatg cagacgctag cgagcccaaa 1860

tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 1920

tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 1980

gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 2040

gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 2100

acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 2160

tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 2220

gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ctccatctcg ggatgagctg 2280

accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 2340

gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 2400

gactccgacg gctccttctt cctctatagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 2460

caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 2520

aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 2547

<210> 8

<211> 649

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

Met Ser Ser Ser Ser Trp Leu Leu Leu Ser Leu Val Ala Val Thr Ala

1 5 10 15

Ala Gln Ser Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe

20 25 30

Asn His Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser Trp

35 40 45

Asn Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met Asn Asn

50 55 60

Ala Gly Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu Ala

65 70 75 80

Gln Met Tyr Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu Thr Val Lys Leu Gln

85 90 95

Leu Gln Ala Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp Lys

100 105 110

Ser Lys Arg Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met Ser Thr Ile Tyr Ser

115 120 125

Thr Gly Lys Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln Glu Cys Leu Leu Leu

130 135 140

Glu Pro Gly Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser Leu Asp Tyr Asn Glu

145 150 155 160

Arg Leu Trp Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu Val Gly Lys Gln Leu

165 170 175

Arg Pro Leu Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala Arg

180 185 190

Ala Asn His Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Gly Asp Tyr Glu

195 200 205

Val Asn Gly Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Gly Gln Leu Ile Glu

210 215 220

Asp Val Glu His Thr Phe Glu Glu Ile Lys Pro Leu Tyr Glu His Leu

225 230 235 240

His Ala Tyr Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr Ile

245 250 255

Ser Pro Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly

260 265 270

Arg Phe Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val Pro Phe Gly Gln Lys

275 280 285

Pro Asn Ile Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp Ala

290 295 300

Gln Arg Ile Phe Lys Glu Ala Glu Lys Phe Phe Val Ser Val Gly Leu

305 310 315 320

Pro Asn Met Thr Gln Gly Phe Trp Glu Asn Ser Met Leu Thr Asp Pro

325 330 335

Gly Asn Val Gln Lys Ala Val Cys His Pro Thr Ala Trp Asp Leu Gly

340 345 350

Lys Gly Asp Phe Arg Ile Leu Met Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp

355 360 365

Phe Leu Thr Ala His His Glu Met Gly His Ile Gln Tyr Asp Met Ala

370 375 380

Tyr Ala Ala Gln Pro Phe Leu Leu Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly Phe

385 390 395 400

His Glu Ala Val Gly Glu Ile Met Ser Leu Ser Ala Ala Thr Pro Ala

405 410 415

Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

420 425 430

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

435 440 445

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

450 455 460

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

465 470 475 480

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

485 490 495

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

500 505 510

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

515 520 525

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

530 535 540

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

545 550 555 560

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

565 570 575

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

580 585 590

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

595 600 605

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

610 615 620

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

625 630 635 640

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

645

<210> 9

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Ser Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Ile Pro Val Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Glu Val

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Thr Thr Asp Arg Phe Val Glu Pro Ala Thr Gly Pro Phe Phe Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 10

<211> 369

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 10

gaggtgcagc tggtgcagtc cggtgccgag gtgaagaagc ctggctcctc cgtgaaggtg 60

tcctgcaagg cctctggagg caccttctcc tccttctcca tctcctgggt gcggcaggct 120

cctggccagg gactggagtg gatgggacgg atcatccctg tgctgggcat cgccaactac 180

gcccaggagg tgcagggacg ggtgaccatc accgccgaca agtccacctc caccgcctac 240

atggagctgt cctccctgcg gtccgaggac accgccgtgt acttctgcac caccgaccgg 300

ttcgtggagc ctgccacagg acccttcttc gactactggg gccagggcac cctggtgacc 360

gtgtcctcc 369

<210> 11

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 11

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Asn Trp Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 12

<211> 318

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 12

gagatcgtga tgacccagtc tcctgccacc ctgtccgtgt ctcctggcga gagagccacc 60

ctgtcctgca gagcctccca gtccgtgtcc tccaacctgg cctggtacca gcagaagcct 120

ggccaggctc ctcggctgct gatctacggt gcctccacca gagccacagg catccctgct 180

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gaggacttcg ccgtgtacta ctgccagcag tactccaact ggctgacctt cggaggaggc 300

accaaggtgg agatcaag 318

<210> 13

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 13

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Phe Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Val His Val Asp Thr Ala Met Asp Ala Tyr Phe Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 14

<211> 369

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 14

gaggtgcagc tggtggagtc tggaggtggc ctggtgaagc ctggaggctc cctgaggctg 60

tcctgcgctg cctctggctt caccttctcc tcctactcca tgaactgggt gcggcaggct 120

cctggcaagg gcctggagtg ggtgtcctcc atctcctcct cctcctcctt catctactac 180

gccgactccg tgaagggacg gttcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtac 240

ctgcagatga actccctgag agccgaggac acagctgtgt actactgcgc cagagaggtg 300

cacgtggaca ccgccatgga cgcctacttc gactactggg gacagggcac cctggtgacc 360

gtgtcctcc 369

<210> 15

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 15

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Phe Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Asn Pro Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Glu

100 105

<210> 16

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 16

gacatccaga tgacccagtc tccctcctcc ctgtctgcct ccgtgggaga cagagtgacc 60

atcacctgca gagcctccca gaccatctcc tcctacctga actggtacca gcagaagcct 120

ggcaaggctc ccaagctgct gatcttcgct gcctcctccc tgcagtctgg cgtgccctcc 180

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gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tcctactcca accctcctct gaccttcgga 300

ggtggcacca aggtggagat cgag 324

<210> 17

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 17

Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser

20 25 30

Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Glu Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg His Ile Thr Gly Thr Thr Phe Ser Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 18

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 18

cagctgcagc tgcaggagtc tggacctgga ctggtgaagc cctccgagac cctgtccctg 60

acctgcaccg tgtctggagg ctccatctcc tcctcctcct actactgggg ctggatcagg 120

cagcctccag gcaagggact ggagtggatc ggctccatct actactctgg ctccacctac 180

tacaacccct ccctggagtc cagagtgacc atctccgtgg acacctccaa gaaccagttc 240

tccctgaagc tgtcctccgt gacagctgcc gacacagctg tgtactactg cgctcggcac 300

atcacaggca ccaccttctc cgactactgg ggacagggca ccctggtgac cgtgtcctcc 360

<210> 19

<211> 104

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 19

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Ala Thr Phe Gly

85 90 95

Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100

<210> 20

<211> 312

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 20

gagatcgtgc tgacccagtc tcctgccacc ctgtccctgt ctcctggcga gagagccacc 60

ctgtcctgca gagcctccca gtccgtgtcc tcctcctacc tggcctggta ccagcagaag 120

cctggacagg ctcctcggct gctgatctac ggagcctcct ccagagccac aggcatccct 180

gaccggttct ctggctccgg atctggcacc gacttcaccc tgaccatctc cagactggag 240

cccgaggact tcgccgtgta ctactgccag cagttcgcca ccttcggcca gggcaccaag 300

gtggagatca ag 312

<210> 21

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 21

Ser Phe Ser Ile Ser

1 5

<210> 22

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 22

Arg Ile Ile Pro Val Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Glu Val Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 23

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 23

Thr Thr Asp Arg Phe Val Glu Pro Ala Thr Gly Pro Phe Phe Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 24

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 24

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala

1 5 10

<210> 25

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 25

Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr

1 5

<210> 26

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 26

Gln Gln Tyr Ser Asn Trp Leu Thr

1 5

<210> 27

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 27

Ser Tyr Tyr Trp Gly

1 5

<210> 28

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 28

Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu Ser

1 5 10 15

<210> 29

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 29

His Ile Thr Gly Thr Thr Phe Ser Asp Tyr

1 5 10

<210> 30

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 30

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 31

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 31

Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr

1 5

<210> 32

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 32

Gln Gln Phe Ala Thr

1 5

<210> 33

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 33

Ser Tyr Ser Met Asn

1 5

<210> 34

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 34

Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Phe Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 35

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 35

Glu Val His Val Asp Thr Ala Met Asp Ala Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 36

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 36

Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Ser Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 37

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 37

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 38

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 38

Gln Gln Ser Tyr Ser Asn Pro Pro Leu Thr

1 5 10

Claims (14)

1.一种特异性结合冠状病毒受体结合域(RBD)的人源抗体或其片段，其特征在于：在同等测试条件下，所述人源抗体或其片段对SARS-CoV-2RBD的亲和力高于人ACE2对SARS-CoV-2RBD的亲和力。

2.如权利要求1所述的人源抗体或其片段，其特征在于，对SARS-CoV-2RBD的亲和力KD值小于1E-08M，并且能够抑制SARS-CoV-2RBD与ACE2的结合，最大抑制率>90％。

3.如权利要求1所述的人源抗体或其片段，其特征在于所述人源抗体或其片段与ACE2，在SARS-CoV-2S1蛋白上具有相同的结合位点；或者所述人源抗体或其片段结合到SARS-CoV-2S1蛋白后，通过空间位阻效应抑制ACE2与SARS-CoV-2S1的结合。

4.如权利要求3所述的人源抗体或其片段，其特征在于与ACE2在SARS-CoV-2S1蛋白上具有相同结合位点的抗体的重链可变区选自SEQ ID NO:9、13，轻链可变区选自SEQ ID NO:11、15。

5.如权利要求3所述的人源抗体或其片段，其特征在于通过空间位阻效应抑制ACE2与SARS-CoV-2S1结合的抗体重链可变区为SEQ ID NO:17，轻链可变区为SEQ ID NO:19。

6.一种特异性结合冠状病毒受体结合域(RBD)的抗体或其片段，其特征在于：所述抗体的6个超变区(又称互补性决定区或CDRs区)与权利要求4-5任一所述人源抗体或其片段的6个CDRs区具有100％的氨基酸序列同源性。

7.一种特异性结合冠状病毒受体结合域(RBD)的抗体或其片段，其特征在于：通过ForteBio表位竞争结合实验检测，所述抗体或其片段与权利要求4-5任一所述人源抗体或其片段具有竞争关系。

8.如权利要求7所述特异性结合冠状病毒受体结合域(RBD)的抗体或其片段，其特征在于所述抗体或其片段与权利要求4-5任一所述人源抗体或其片段具有相同的抗原表位。

9.抗体或其片段在制备治疗冠状病毒感染药物中的应用，其特征在于：所述药物包含一种或多种抗体或其片段，所述抗体或其片段选自由权利要求1-8中任一所述抗体或其片段组成的组。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述冠状病毒感染为人冠状病毒感染，包括SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV等。

11.一种多核苷酸，其编码权利要求1-8中任一所述的抗体或其抗原结合片段。

12.载体，其包含权利要求11所述的多核苷酸。

13.宿主细胞，其包含权利要求11所述的多核苷酸或权利要求12所述的载体。

14.药物组合物，其包含一种或多种选自由权利要求1-8中任一所述抗体或其片段组成的组，以及任选的药学上可接受的载体。

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