CN113387382A - 一种纳米氯化银的生物合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种纳米氯化银的生物合成方法。包括以下步骤：(1)培养获得大肠杆菌菌体物或金黄色葡萄球菌菌体物；(2)获得硝酸银、氯化钠和菌体物混合体系，将硝酸银、氯化钠和菌体物混合体系在光照条件下，经发酵培养生物合成纳米氯化银。本发明生物合成方法成功合成了纳米氯化银微粒(AgClNPs)。操作简便、无毒无害，且合成的纳米氯化银产物的水溶性好、稳定性强，能在水溶液中储存数月而不聚沉。并具有优异的抗菌性能，细胞毒力小。
Description
技术领域
本发明涉及生命复合材料研究领域，具体涉及将生物合成方法应用于材料合成。更具体涉及一种纳米氯化银的生物合成方法及其应用。
背景技术
纳米技术是近年来新兴的前沿技术，是近现代人类科学技术进步的里程碑之一。当材料尺寸到达纳米1-100nm时，其许多物理化学性能就会产生突变，诞生了纳米材料研究领域。
银离子作为一种强有力的杀菌剂，在中国，早在明代《本草纲目》中就有“银屑，安五脏，定心神，止惊悸，除邪气，久服可轻身”的记载；在公元前338年古希腊人就用银器保存饮用水以防止细菌污染。但同时，水中痕量的银离子即会对人体产生危害，《国家生活应用水卫生标准》GB5749-2006规定银离子的含量应≤0.05mg/L。因此如何在杀菌的同时减小对人体的伤害，成为银离子杀菌研究的关键问题。近年来许多科学家将银离子于纳米技术结合，通过化学方法将银制成纳米银微粒(AgNPs)，并利用各种生物相容性高的有机材料如石墨烯、聚丙烯酰胺、壳聚糖等包被，来降低其对人体的毒害作用同时增加其银离子的缓释能力。
而氯化银的抗菌性能很难被注意到，因其通常被认为是难溶于水的沉淀，其在水中的溶度积(Ksp)仅为1.56×10-10，水中的银离子含量更是寥寥无几。而纳米氯化银由于其粒径的减小，能在水溶液中形成胶体，克服了这些困难，成为一种理想的抗菌材料。纳米氯化银的制备方法现阶段主要包括化学合成方法，包括强还原剂法、表面活性剂法等，但其条件苛刻、操作繁琐，且合成的纳米粒子容易丧失溶胶性质而聚沉形成沉淀，难以长期储存。据我们所知，生物方法合成纳米氯化银的方法还未报道过。
发明内容
本发明的目的在于提供一种纳米氯化银的生物合成方法。其可成功合成纳米氯化银，合成的纳米氯化银稳定性好。
本发明采用的技术方案如下：
提供一种纳米氯化银的生物合成方法，包括以下步骤：
(1)培养获得大肠杆菌菌体物或金黄色葡萄球菌菌体物；(2)获得硝酸银、氯化钠和菌体物混合体系，将硝酸银、氯化钠和菌体物混合体系在光照条件下，经发酵培养生物合成纳米氯化银。
按上述方案，上述方案还包括：纳米氯化银的分离纯化：离心除去大肠杆菌生物质，取上清，洗涤重悬，即得到纳米氯化银。
按上述方案，所述的步骤(1)中大肠杆菌或金黄色葡萄球菌培养至体系OD600值到达2-2.5结束培养，离心分离，获得大肠杆菌菌体物或金黄色葡萄球菌菌体物。
按上述方案，所述的步骤(1)中大肠杆菌菌体物的培养方法：用接种环蘸取少量大肠杆菌菌菌液于LB培养基中37℃，220rpm孵育，至OD600值到达2-2.5，再通过离心分离菌体；
金黄色葡萄球菌菌体物的培养方法为：用接种环蘸取少量金黄色葡萄球菌菌液于LB培养基中37℃，220rpm孵育，至OD600值到达2-2.5，再通过离心分离菌体。
按上述方案，所述的离心分离菌体为：6000×g，4℃离心弃去上清液，将生物质沉淀用去离子水充分洗涤，重悬。
按上述方案，所述的硝酸银和氯化钠的物质的量比为1：1-1：2。
按上述方案，所述的生物合成时间为6-24小时。
按上述方案，步骤(b)所述的分离方法为：先用4000-6000×g，离心除去大肠杆菌生物质，取上清，将上清液过滤膜过滤，取滤液，高于13000×g(13000g-13400g)，离心，收集沉淀，用去离子水洗涤，相同条件重悬，即得到纳米氯化银。
按上述方案，离心温度为0-4℃。
按上述方案，上述方法合成的纳米氯化银的粒径在10-30nm之间。
按上述方案，硝酸银、氯化钠和菌体物混合体系中硝酸银和氯化钠形成悬浮液。
按上述方案，体系中硝酸银含量以银离子计低于1mM，氯化钠以氯离子含量计低于2mM。
本发明通过大肠杆菌或金黄色葡萄球菌为合成载体，基于细菌表面分散度高的带负电的脂多糖(如革兰氏阴性菌大肠杆菌)或磷壁酸(如革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌)，银离子和氯离子在水中形成不稳定、表面带正电的胶束结构，这些带正电的胶束分散在带负电的细胞外膜(革兰氏阴性菌大肠杆菌)或细胞壁(革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌)上而形成稳定的纳米溶胶，由此最终成功合成了纳米氯化银微粒(AgClNPs)。
化学合成法主要是通过加入还原剂(如硫代硫酸钠)、稳定剂(如表面活性剂)；或通过降低银离子的滴加速率等方法降低银离子在水中的成核速度，而产生纳米粒子。胶体溶液主要依靠溶液中金属阳离子层之间的静电排斥作用而分散，这种作用力小，且环境pH过高或过低时，其胶体体系容易被破坏。
相比化学合成方法，本发明经细菌细胞壁介导，带正电的氯化银胶束分散在带负电的细胞外膜(革兰氏阴性菌大肠杆菌)或细胞壁(革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌)上而形成稳定的纳米溶胶，进而合成得到的纳米氯化银产物分散度高、稳定性好，本发明提供的纳米氯化银在光束通过的条件下下可观察到明显的、光亮的通路(丁达尔现象)(图1)，表明其粒径在胶体范畴，且在水溶液中可保持数月而不聚沉；细胞壁介导合成，有许多多肽附着在纳米氯化银粒子表面，合成的纳米氯化银水溶性好。良好的水溶性性也赋予了很多应用上的优势：作为涂料时，水溶性材料以水作为分散介质，可以减少有毒有机溶剂的使用，更加安全环保；作为药物载体时生物相容性好，能随尿液排出，不易沉积在体内；作为电极材料时，易于成膜、涂装。同时天然产物具有构象上的优势，因而相比于各种人工包被的纳米粒子，其稳定性更加出众。
合成过程无毒无害、简单可控、成本低廉。
本发明的有益效果：
本发明生物合成方法成功合成了纳米氯化银微粒(AgClNPs)。
本发明生物合成方法操作简便、无毒无害，且合成的纳米氯化银产物的水溶性好、稳定性强，能在水溶液中储存数月而不聚沉。并具有优异的抗菌性能，细胞毒力小。
附图说明
图1：丁达尔效应；A：光束通过纳米氯化银溶胶。B：光束通过硝酸银溶液。
图2：紫外可见吸收光谱：随反应时间增加(2小时以后)，454nm出现明显的吸收峰且吸收值逐渐变大，说明纳米氯化银微粒的产生。
图3：傅里叶变换红外吸收光谱：A：普通氯化银固体粉末，其在400-4000nm基本无吸收(透过率为100％)；B：经过分离纯化了的纳米氯化银，其表面大部分有机物已被洗去(对比C线透过率明显上升)；C：未处理的纳米氯化银与细菌混合物，在近红外区有很强吸收的宽峰，且在1600nm附近有多重强吸收峰，说明有大量有机物残留。绿色箭头：空气中二氧化碳干扰。
图4：X射线衍射图谱；AgCl：普通氯化银固体粉末，对应标准氯化银卡片的(111)，(200).(220)，(311)晶型衍射角。AgClNPs：纳米氯化银。PDF2：00-031-1238：标准比色卡。每个峰都对应标准氯化银，证明了本产品的组成。
图5：能量弥散X射线谱：对目标视野进行了元素分析，显示了Ag+和Cl-明显的吸收峰，且摩尔比为1：1，证明了本产品的组成。
图6：扫描电子显微镜图：A：纳米氯化银在大肠杆菌表面生长。B：经纯化处理后的纳米氯化银微粒。
图7：透射电子显微镜图：纳米氯化银粒径约为10-30nm。
图8：本发明合成的纳米氯化银的抑菌活性。
图9：本发明合成的纳米氯化银的抑制生物膜形成的性能。
图10：本发明合成的纳米氯化银的的细胞毒性。
具体实施方式
为使本领域普通技术人员充分理解本发明的技术方案和有益效果，以下结合具体实施例进一步说明。
实施例1：
(1)纳米氯化银的生物合成
用接种环蘸取少量大肠杆菌(本实施例选择大肠杆菌BL21)菌液于3mL LB培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH＝7.4)中37℃，220rpm过夜培育。取1mL菌液加入400mL LB培养基中37℃，220rpm孵育16小时。6000×g，4℃离心10分钟后弃去上清液，将生物质沉淀用去离子水充分洗涤5-6次，完全清除培养基中的干扰离子，重悬。将0.0338g硝酸银和0.0232g氯化钠依次加入到200mL去离子水中，这时溶液中的硝酸银浓度为1mmol/L，氯化钠的浓度为2mmol/L，摇匀。这时溶液将从透明变为乳白色，说明生成了氯化银混悬液。再把重悬的细菌生物质加入其中，盖上封口膜。将其放入37℃恒温摇床中，220rpm、光照条件下孵育24小时。在6小时内即可看到溶液颜色明显变红，即说明此时纳米氯化银已在细菌表面产生。反应终点溶液颜色为深紫色且呈透明状，细菌沉淀较少。
(2)无菌对照
为排除光催化氯化银混悬液使颜色变深的可能，对照组设置为不加细菌，其他条件相同。实验表明72h相同情况下无颜色变化。证明细菌在纳米氯化银的合成过程中不可或缺。
(3)纳米氯化银的分离纯化
收集反应液，4000×g，4℃离心10分钟除去大肠杆菌生物质，取上清。将直径6cm，孔径为0.22μm的微孔滤膜装于抽滤瓶口，利用抽滤装置将上清液通过0.22μm直径微孔过滤膜过滤。在过滤细菌之前必须先将反应液在4000×g离心除去大部分细菌，否则大量细菌体沉积在滤膜上，滤液将难以通过滤膜造成抽滤失败。取滤液，于13400×g，4℃离心20分钟，收集沉淀。用去离子水洗涤3次，相同条件重悬，即得到纳米氯化银。
实施例2：
同例1方法培养、分离得到相同质量的细菌菌体。将0.0338g硝酸银和0.0116g氯化钠依次加入到200mL去离子水中，这时溶液中的硝酸银浓度为1mmol/L，氯化钠的浓度为1mmol/L，摇匀。将其放入37℃恒温摇床中，220rpm、光照条件下孵育24小时。在6小时时肉眼可观察到红色，光照孵育24小时后454nm出现明显的吸收峰，相较实施例1不明显。
对比例：
同实施例1、实施例2方法培养、分离得到相同质量的细菌菌体，分别加入1mmol/L硝酸银、2mmol/L氯化钠，黑暗条件下孵育24小时。观察不到明显的颜色变化，在黑暗孵育24小时后取上清测量OD454的值接近于0。表明光照在该法中不可或缺。
实施例3：
同实施例1、实施例2方法培养、分离得到相同质量的细菌菌体，分别加入1mmol/L硝酸银、4mmol/L氯化钠，光照条件下孵育24小时后，OD454值低于实施例1，表明纳米粒子合成量较少。
表征与性能测试
为表征本方法合成的纳米氯化银，利用了紫外可见分光光度计(UV-visspectrum)、傅里叶变换红外吸收光谱(FTIR)、X射线衍射(XRD)、能量弥散X射线谱(EDS)、扫描电子显微镜(SEM)、透射电子显微镜(TEM)等方法。以实施例1合成产物为例，其结果见附图1-7。
图1：丁达尔效应；A：光束通过纳米氯化银溶胶。B：光束通过硝酸银溶液。
图2：紫外可见吸收光谱：随反应时间增加(2小时以后)，454nm出现明显的吸收峰且吸收值逐渐变大，说明纳米氯化银微粒的产生。
图3：傅里叶变换红外吸收光谱：A：普通氯化银固体粉末，其在400-4000nm基本无吸收(透过率为100％)；B：经过分离纯化了的纳米氯化银，其表面大部分有机物已被洗去(对比C线透过率明显上升)；C：未处理的纳米氯化银与细菌混合物，在近红外区有很强吸收的宽峰，且在1600nm附近有多重强吸收峰，说明有大量有机物残留。绿色箭头：空气中二氧化碳干扰。
图4：X射线衍射图谱；AgCl：普通氯化银固体粉末，对应标准氯化银卡片的(111)，(200).(220)，(311)晶型衍射角。AgClNPs：纳米氯化银。PDF2：00-031-1238：标准比色卡。每个峰都对应标准氯化银，证明了本产品的组成。
图5：能量弥散X射线谱：对目标视野进行了元素分析，显示了Ag+和Cl-明显的吸收峰，且摩尔比为1：1，证明了本产品的组成。
图6：扫描电子显微镜图：A：纳米氯化银在大肠杆菌表面生长。B：经纯化处理后的纳米氯化银微粒。
图7：透射电子显微镜图：纳米氯化银粒径约为10-30nm。
为测试纳米氯化银的性能和对哺乳细胞的毒力，分别进行了三组抗菌a，抗生物膜b，细胞毒力c实验。
a.将对数生长期的四种细菌:大肠杆菌(E.c)，金黄色葡萄球菌(S.a)，枯草芽孢杆菌(B.c)，恶臭假单胞菌(P.p)稀释100倍，取100μL加入到96孔板中，再加入100μL pH＝7.4磷酸盐缓冲液(PBS)稀释的纳米氯化银溶胶，37℃孵育24h后，用酶标仪测量OD595值。结果如图8所示，纳米氯化银对两种革兰氏阴性菌(E.c、P.p)的最小抑菌浓度(MIC)为5μg/mL；对两种革兰氏阳性菌(S.a、B.c)的最小抑菌浓度为10μg/mL。说明本发明生物合成的纳米氯化银具有优异的抑菌活性。据相关文献报道，纳米银的最小抑菌浓度随其粒径的改变差异较大，但MIC普遍在10-50μg/mL之间。
b.于96孔板中加入上述四种菌液，加入1％麦芽糖，37℃孵育24小时。PBS洗涤后加入梯度浓度的氯化银溶胶，继续孵育2小时。水洗三次，吹干孔板，加入1％结晶紫染色剂，静置10分钟，倒去染色剂，水洗，吹干。每孔加入200μL二甲亚砜(DMSO)溶解结晶紫。用酶标仪测量OD595值。结果如图9所示，纳米氯化银对4种细菌的生物膜形成均有抑制作用。
c.向96孔板中加入100μL 105个/mL DmEm培养基稀释的小鼠视网膜神经细胞(RGC-5)，加入100μL梯度浓度的氯化银溶胶和硝酸银。37℃、5％CO2培育24小时。加入10μL5mg/mL四甲基偶氮唑蓝(MTT),继续孵育4小时。倒去培养基，每孔加入200μL DMSO溶解结晶物，用酶标仪测量OD570值。结果如图10所示，纳米氯化银对小鼠视网膜神经细胞的半抑制浓度(IC50)为50μg/mL，明显大于硝酸银的IC50值，由此可反应出本发明合成的纳米氯化银的极低的细胞毒力。IC50是衡量药物对真核细胞毒力作用的重要指标，其值越高代表该药物对人的毒害作用越小。
实施例4：
用接种环蘸取少量金黄色葡萄球菌KW7菌液于3mL LB培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH＝7.0)中37℃，220rpm过夜培育。取1mL菌液加入400mL LB培养基中37℃，220rpm孵育16小时。同实施例1方法离心、洗去培养基成分得到菌体，加入1mmol/L硝酸银，2mmol/L氯化钠，光照下孵育24小时。同样在6小时内即可看到溶液颜色明显变红。反应终点溶液颜色为深紫色且呈透明状，细菌沉淀较少。经X射线衍射(XRD)、能量弥散X射线谱(EDS)、扫描电子显微镜(SEM)、透射电子显微镜(TEM)等表征，说明成功合成了纳米氯化银。
Claims (10)
1.一种纳米氯化银的生物合成方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)培养获得大肠杆菌菌体物或金黄色葡萄球菌菌体物；(2)获得硝酸银、氯化钠和菌体物混合体系，将硝酸银、氯化钠和菌体物混合体系在光照条件下，经发酵培养生物合成纳米氯化银。
2.根据权利要求1所述的生物合成方法，其特征在于：还包括纳米氯化银的分离纯化:离心除去大肠杆菌或金黄色葡萄球菌生物质，取上清，洗涤重悬，即得到纳米氯化银。
3.根据权利要求1所述的生物合成方法，其特征在于：所述的步骤(1)中大肠杆菌或金黄色葡萄球菌培养至体系OD600值到达2-2.5结束培养，离心分离，获得大肠杆菌菌体物或金黄色葡萄球菌菌体物。
4.根据权利要求1所述的生物合成方法，其特征在于：所述的步骤(1)中大肠杆菌菌体物的培养方法：用接种环蘸取少量大肠杆菌菌菌液于LB培养基中37℃，220rpm孵育，至OD600值到达2-2.5，再通过离心分离菌体；
金黄色葡萄球菌菌体物的培养方法为：用接种环蘸取少量金黄色葡萄球菌菌液于LB培养基中37℃，220rpm孵育，至OD600值到达2-2.5，再通过离心分离菌体；
所述的离心分离菌体为：6000×g，4℃离心弃去上清液，将生物质沉淀用去离子水充分洗涤，重悬。
5.根据权利要求1所述的生物合成方法，其特征在于：所述的硝酸银和氯化钠的物质的量比为1：1-1：2。
6.根据权利要求1所述的生物合成方法，其特征在于：所述的生物合成时间为6-24小时。
7.根据权利要求2所述的生物合成方法，其特征在于：分离方法为：先用4000-6000×g，离心除去大肠杆菌生物质，取上清，将上清液过滤膜过滤，取滤液，高于13000×g离心，收集沉淀，用去离子水洗涤，相同条件重悬，即得到纳米氯化银。
8.根据权利要求1所述的生物合成方法，其特征在于：合成的纳米氯化银的粒径在10-30nm之间。
9.根据权利要求1所述的生物合成方法，其特征在于：硝酸银、氯化钠和菌体物混合体系中硝酸银和氯化钠形成悬浮液。
10.根据权利要求1所述的生物合成方法，其特征在于：体系中硝酸银含量以银离子计低于1mM，氯化钠以氯离子含量计低于2mM。
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