CN113376282A - 一种用于肺癌蛋白检测的试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种适用于肺癌蛋白检测的试剂盒及检测方法，所述检测方法包括将重标肽与肿瘤组织酶解后的肽段进行一定比例的混合，然后进行色谱分离以及质谱扫描采集质谱数据；其中，在所述质谱扫描采集过程中，采用DIA扫描模式结束后，并行进行PRM扫描采集；该方法可对目的蛋白进行高灵敏度的绝对定量分析的同时，获得整个肿瘤全谱蛋白质组的定性与定量信息。本发明方法具有方便快捷、高通量、高特异性及准确度高等优点；在保证检测结果中蛋白质数量的同时有效提高丰度较低目的蛋白质定量的可信度。本发明试剂盒所含试剂均为肽段干粉，无可挥发性、有毒、有害物质，安全性高，采用该方法得到的实验结果真实可靠，可重复性强。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种用于肺癌蛋白检测的试剂盒及检测方法。
背景技术
肺癌是恶性肿瘤中发病率和病死率最高的恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌(NSCLC)占肺癌的85％左右。近年来，分子靶向治疗已经成为肺癌研究热点，越来越多分子靶点的发现及靶向药物以及免疫治疗的研发给肺癌患者长期生存带来了希望。随着肿瘤个体化治疗理念的提倡、分子检测技术的进步和靶向治疗药物的不断推出，肺癌核酸标志物检测指导治疗方案引起了众多学者的关注和探讨，其研究热点主要集中于ALK、BRAF、EGFR、KRAS、NTRK、ROS1等靶点基因突变以及融合导致的基因组以及蛋白水平的扩增或过表达。
蛋白作为最终功能的执行者以及靶向药物的作用靶点，往往需要通过免疫组织化学(IHC)的方式检测蛋白质的过表达或缺失等，从而指导药物靶向治疗，减少无效治疗。质谱作为一种检测蛋白的技术手段，越来越多的应用于临床样本蛋白的检测，尤其是质谱靶向定量技术PRM/SRM/MRM等可以直接用来靶向定量来自癌症患者的生物样本中靶向目的蛋白质表达水平，避免单纯基因检测导致的药物靶标蛋白表达的不确定性。DIA(data-independent acquisition，非数据依赖采集)技术是近年来流行的一种新的质谱技术，属于非标记蛋白质组学方法。其采用分窗口扫描模式模式，对每一个窗口中的所有离子进行检测、破碎，无遗漏无差异的记录样本中所有离子的信息。其有效的降低了样本检测的缺失值，提高了定量准确性和重读性，广泛适用于大样本队列的蛋白质组定量分析中，保证了大规模样本的高度覆盖、稳定和可追溯分析，有利于疾病标志物的筛选。虽然DIA的定量能力接近靶向定量，但往往DIA寻找标志物之后会使用靶向定量或绝对定量的方法进行再次确认验证，而往往一些低丰度的蛋白也需要较长的色谱梯度检测才能够降低背景的干扰，准确的定性和定量目的蛋白，造成了很大的机时的浪费提升了成本。
发明内容
发明目的：为解决上述技术问题，本发明提供了一种用于肺癌蛋白检测的试剂盒及检测方法，所述检测方法是基于质谱靶向PRM与DIA并行的检测技术，能够有效对肺癌中的靶向蛋白以及全蛋白质组进行检测。
技术方案：一种用于肺癌蛋白检测的试剂盒，包括如下试剂：
重标同位素标记标准肽段，所述标准肽段包含来源于不同蛋白的unique肽段序列；重标肽段复溶储备液；稀释液。
优选的，所述不同蛋白包括ALK、BRAF、EGFR、HER2、MEK1、MET、MTOR、ROS1、PD-L1、PIK3CA、NTRK和Ras，其中包括对应基因的特有肽段序列和同家族基因共有序列以及基因特定突变之后的氨基酸序列，一些蛋白的氨基酸序列如编号SEQ ID NO:1-14所示，对应序列依次为：SEQ ID NO:1_ALK_DPEGVPPLLVSQQAK、SEQ ID NO:2_BRAF_LLFQGFR、SEQ ID NO:3_EGFR_TDLHAFENLEIIR、SEQ ID NO:4_ERBB2_GLQSLPTHDPSPLQR、SEQ ID NO:5_MAP2K1_IPEQILGK、SEQ ID NO:6_MET_ETSIFSYR、SEQ ID NO:7_MTOR_ALEWLGADR、SEQ ID NO:8_ROS1_THPHGVPETAPLIR、SEQ ID NO:9_CD274_NIIQFVHGEEDLK、SEQ ID NO:10_PIK3CA_EAGFSYSHAGLSNR、SEQ ID NO:11_NTRK1/2/3_IGDFGMSR、SEQ ID NO:12_RAS_VEDAFYTLVR、SEQ ID NO:13_BRAF_V600E_IGDFGLATEK、SEQ ID NO:14_KRAS_G12C_LVVVGACGVGK；
优选的，所述重标肽段复溶储备液为0.1％甲酸水配置的50％乙腈溶液；所述稀释液为0.1％甲酸水溶液。
优选的，所述重标同位素标记位于所述标准肽段的C末端的氨基酸上；所述标准肽段等摩尔浓度混合；
所述的重标肽段为干粉，使用时需要配备储备液以及稀释至最终的使用浓度；优选的，所述的重标肽段稀释的最终使用浓度为100fmol/ul，使用时按照100fmol对应1ug的实际肽段样本的比例进行混合；
一种肺癌蛋白的检测方法，包括如下步骤：
将肺癌组织样本进行蛋白提取和酶解后，与iRT标肽和重标同位素标记标准肽段混合后进行色谱分离以及质谱扫描采集质谱数据；其中，在所述质谱扫描采集过程中，采用DIA扫描模式结束后，进行PRM扫描采集；对所述质谱数据中的蛋白进行定量分析，获得所述肺癌蛋白样本的绝对定量值。
作为优选方案：
所述色谱分离的流动相和梯度设置如下：
流动相A：100％色谱级水+0.1～0.2％甲酸；
流动相B：70-90％色谱级乙腈+0.1～0.2％甲酸；
色谱梯度：100-150分钟梯度。
采用色谱分离株进行所述色谱分离，色谱条件如下：
预柱外径350-370um，内径90-110um，填料是2-4um的C18，填料总长1-2cm；
色谱柱长度24-26cm，外径350-370um，内径140-160um，一体化色谱柱柱尖开口3～5um，填料是1.5-2.4um粒径的C18反相填料。
采用质谱仪Q-Exactive HF(Thermo)进行所述质谱扫描，设置一级质谱和二级扫描。
DIA扫描模式结束后，进行10个PRM的扫描事件，将目的肽段的序列加在DIA窗口之后，设定PRM目的肽段的扫描窗口，具体RT时间根据预扫目标肽段的RT时间来设定。
对质谱数据进行Spectronaut抽提处理，随后进行Skyline软件处理，内源性目的肽段和重标肽段的定量值，根据标准曲线计算目的蛋白的绝对定量值
本发明提供一种基于质谱靶向PRM与DIA并行的检测技术对肺癌中的目的蛋白以及全蛋白质组进行检测的方法及其应用。使用该方法，通过靶向定量目的蛋白特定肽段来测定患者肿瘤组织中ALK、BRAF、EGFR、HER2(ERBB2)、RAS、MEK1(MAP2K1)、MET、MTOR、ROS1、PD-L1(CD274)、PIK3CA、TrkA(NTRK1/2/3)等蛋白的表达，也可以对特定突变位点如BRAF_V600E、KRAS_G12C等在蛋白水平找到证据，此外通过PRM并行的DIA检测可以在准确靶向定量目的蛋白标志物的同时尽可能多的获取其他蛋白和肽段的定性和定量结果。通过实验对比发现添加了并行PRM的DIA检测(PRM+DIA)相对于传统的DIA检测结果约有15％肽段损失，但可定量蛋白数量损失只有5％左右(结果见对比例)；相对于常规的PRM(实施例2)，DIA+PRM对目的蛋白的检测灵敏度会有降低，但尤其是在对复杂样本进行相关低丰度靶向目的蛋白检测情况下，往往需要超过2小时甚至更长的色谱梯度来达到降低样本复杂程度，从而提高目的肽段检测灵敏度，这个时候DIA+PRM的优势在于既能获得目的蛋白的定量信息的同时也可以获得蛋白质组全谱的定量信息，这些数据的补充获得无疑将最终有利于指导肺癌临床治疗方案以及化疗预后等。
有益效果：可对目的蛋白进行高灵敏度的绝对定量分析的同时，获得整个肿瘤全谱蛋白质组的定性与定量信息。与现有技术相比，本发明通过使用PRM与DIA并行检测方法进行目的靶向蛋白的绝对定量分析，具有方便快捷、高通量、高特异性及准确度高等优点；在保证检测结果中蛋白质数量的同时有效提高丰度较低目的蛋白质定量的可信度。本发明试剂盒所含试剂均为肽段干粉，无可挥发性、有毒、有害物质，安全性高，采用该方法得到的实验结果真实可靠，可重复性强。
附图说明
图1：PRM+DIA扫描的inclusion list列表图；
图2：Spectronaut抽取PRM+DIA检测肺癌样本蛋白质组鉴定结果；
图3：DIA+PRM靶向定量目的蛋白定量值(单位：fmol/ug)；
图4：PRM扫描的inclusion list列表图；
图5：PRM鉴定肺癌组织中的目的蛋白定量值(单位：fmol/ug)。
图6：常规DIA检测与DIA+PRM检测对整个蛋白质组定性结果对比
具体实施方式
以下对本发明方案进行全面的描述，所述的实施案例是本发明中最优选实施方式，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1用于肺癌蛋白检测的试剂盒
1)配置50％乙腈并加入终浓度为0.1％甲酸，分别作为重标肽段的溶解试剂和稀释液。
2)使用50％乙腈0.1％FA溶解重标肽段干粉并分装至-80度冰箱保存；取一管分装重标肽段标品，使用0.1％的FA溶解至终浓度为100fmol/ul的工作液浓度；
3)根据实际检测肽段样本量，取合适的重标肽段标品进行混合，建议为1ug的实际检测肽段混合100fmol即1ul的工作液标肽以备后续质谱的检测；
实施例2肺癌蛋白PRM+DIA检测方法
利用实施例1所述的试剂盒，对肺癌蛋白样本进行如下检测：
步骤S1，取10ug样本蛋白酶解肽段加入25ul上样缓冲液，震荡混匀离心备用；
步骤S2，取5uL步骤S1制成的肿瘤样本肽段溶液置于96孔上样板进行色谱进样加入适量的iRT标肽以及200fmol实施例1试剂盒的重标肽段进行色谱进样；
色谱分离梯度设置如下:
流动相A：100％色谱级水+0.2％甲酸
流动相B：80％色谱级乙腈+0.2％甲酸
色谱梯度:135分钟梯度，其中质谱采集时间为0～120分钟；
| 时间 | 持续时间 | 流速(纳升/分钟) | B％ |
| 0 | 0 | 600 | 8 |
| 35 | 35 | 600 | 16 |
| 100 | 65 | 600 | 35 |
| 115 | 15 | 600 | 45 |
| 116 | 1 | 600 | 95 |
| 130 | 14 | 600 | 95 |
| 131 | 1 | 600 | 5 |
| 135 | 4 | 600 | 5 |
液相使用纳升级色谱仪Easy-nLC和串联高分辨质谱仪Q-Exactive系列，色谱条件为：预柱外径360um，内径100um，填料是3um的C18，填料总长2cm；色谱柱长度25cm，外径360um，内径150um，一体化色谱柱柱尖开口3～5um，填料是1.9um粒径的C18反相填料；
质谱仪Q-Exactive HF(Thermo)设置如下:
一级质谱，扫描范围:350-1500m/z，分辨率:120000(@m/z 200)，AGC target:1e6，Maximum IT:20ms；
二级扫描，Isolation window:400～1000m/z分为40个动态窗口，分辨率:30000(@m/z200)，AGC target:1e6，Maximum IT:auto，MS2 Activation Type:HCD，NCE:28；二级扫描个数Top40。
DIA扫描模式结束后，进行10个PRM的扫描事件，将目的肽段的序列加在DIA窗口之后，PRM目的肽段的扫描窗口设定为2min，具体RT时间根据预扫目标肽段的RT时间来设定，Isolation window:1.6Da，分辨率:15000(@m/z 200)，AGC target:5e4，Maximum IT:40ms，Microscans:1，MS2 Activation Type:HCD，NCE:28。
目的蛋白靶向定量inclusion list设置，如图1所示。
步骤S3，对质谱数据进行Spectronaut抽提处理，得到批量蛋白质组定量数据如图2；随后进行Skyline软件处理得到内源性目的肽段定量值，根据标准曲线计算目的蛋白的绝对定量值。计算结果如图3：
对比例1：肺癌蛋白常规PRM检测方法
步骤S1，取10ug样本蛋白酶解肽段加入25ul上样缓冲液，震荡混匀离心备用；
步骤S2，取5uL步骤S1制成的肿瘤样本肽段溶液置于96孔上样板进行色谱进样加入适量的iRT标肽以及200fmol重标肽段进行色谱进样；
色谱分离梯度设置如下:
流动相A：100％色谱级水+0.2％甲酸
流动相B：80％色谱级乙腈+0.2％甲酸
色谱梯度:135分钟梯度，其中质谱采集时间为0～120分钟；
| 时间 | 持续时间 | 流速(纳升/分钟) | B％ |
| 0 | 0 | 600 | 8 |
| 35 | 35 | 600 | 16 |
| 100 | 65 | 600 | 35 |
| 115 | 15 | 600 | 45 |
| 116 | 1 | 600 | 95 |
| 130 | 14 | 600 | 95 |
| 131 | 1 | 600 | 5 |
| 135 | 4 | 600 | 5 |
液相使用纳升级色谱仪Easy-nLC和串联高分辨质谱仪Q-Exactive系列，色谱条件为：预柱外径360um，内径100um，填料是3um的C18，填料总长2cm；色谱柱长度25cm，外径360um，内径150um，一体化色谱柱柱尖开口3～5um，填料是1.9um粒径的C18反相填料；
质谱仪Q-Exactive HF(Thermo)设置如下:
一级质谱，扫描范围:350-1500m/z，分辨率:120000(@m/z 200)，AGC target:1e6，Maximum IT:20ms；
二级扫描进行30个PRM的扫描事件，PRM目的肽段的扫描窗口设定为2min，具体RT时间根据预扫目标肽段的RT时间来设定，Isolation window:1.6Da，分辨率:15000(@m/z200)，AGC target:1e5，Maximum IT:40ms，Microscans:1，MS2 Activation Type:HCD，NCE:28。
目的蛋白靶向定量inclusion list设置，如图4所示。
步骤S3，对质谱数据进行Skyline软件处理，分别得到内源性目的肽段和重标肽段的定量值，根据标准曲线计算目的蛋白的绝对定量值如图5。
对比例2肺癌蛋白常规DIA检测对比实施例2中DIA+PRM检测方法分别使用实施例1以及常规DIA检测方法对同一例肺癌样本进行检测对比，常规DIA检测方法如下：
步骤S1，取10ug样本蛋白酶解肽段加入25ul上样缓冲液，震荡混匀离心备用；
步骤S2，取5uL步骤S1制成的肿瘤样本肽段溶液置于96孔上样板进行色谱进样加入适量的iRT标肽以及200fmol试剂盒的重标肽段进行色谱进样；
色谱分离梯度设置如下:
流动相A：100％色谱级水+0.2％甲酸
流动相B：80％色谱级乙腈+0.2％甲酸
色谱梯度:135分钟梯度，其中质谱采集时间为0～120分钟；
| 时间 | 持续时间 | 流速(纳升/分钟) | B％ |
| 0 | 0 | 600 | 8 |
| 35 | 35 | 600 | 16 |
| 100 | 65 | 600 | 35 |
| 115 | 15 | 600 | 45 |
| 116 | 1 | 600 | 95 |
| 130 | 14 | 600 | 95 |
| 131 | 1 | 600 | 5 |
| 135 | 4 | 600 | 5 |
液相使用纳升级色谱仪Easy-nLC和串联高分辨质谱仪Q-Exactive系列，色谱条件为：预柱外径360um，内径100um，填料是3um的C18，填料总长2cm；色谱柱长度25cm，外径360um，内径150um，一体化色谱柱柱尖开口3～5um，填料是1.9um粒径的C18反相填料；
质谱仪Q-Exactive HF(Thermo)设置如下:
一级质谱，扫描范围:350-1500m/z，分辨率:120000(@m/z 200)，AGC target:1e6，Maximum IT:20ms；
二级扫描，Isolation window:400～1000m/z分为40个动态窗口，分辨率:30000(@m/z200)，AGC target:1e6，Maximum IT:auto，MS2 Activation Type:HCD，NCE:28；二级扫描个数Top40。
步骤S3，对质谱数据进行Spectronaut抽提处理，常规DIA检测与DIA+PRM检测对整个蛋白质组定性结果对比，如图6：
通过实验对比发现添加了并行PRM的DIA检测(PRM+DIA)相对于传统的DIA检测结果约有15％肽段损失，但可定量蛋白数量损失只有5％左右
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，比如扩展到其他肿瘤进行检测，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种用于肺癌蛋白检测的试剂盒，其特征在于，包括如下试剂：
重标同位素标记标准肽段，所述标准肽段包含来源于不同蛋白的unique肽段序列；重标肽段复溶储备液；稀释液。
2.根据权利要求1所述的用于肺癌蛋白检测的试剂盒，其特征在于，所述不同蛋白包括ALK、BRAF、EGFR、HER2、MEK1、MET、MTOR、ROS1、PD-L1、PIK3CA、NTRK和Ras，其中包括对应基因的特有肽段序列和同家族基因共有序列以及基因特定突变之后的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的用于肺癌蛋白检测的试剂盒，其特征在于，所述重标肽段复溶储备液为0.1％甲酸水配置的50％乙腈溶液；所述稀释液为0.1％甲酸水溶液。
4.根据权利要求1所述的用于肺癌蛋白检测的试剂盒，其特征在于，所述重标同位素标记位于所述标准肽段的C末端的氨基酸上；所述标准肽段等摩尔浓度混合。
5.一种肺癌蛋白的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
将肺癌组织样本进行蛋白提取和酶解后，与iRT标肽和重标同位素标记标准肽段混合后进行色谱分离以及质谱扫描采集质谱数据；其中，在所述质谱扫描采集过程中，采用DIA扫描模式结束后，进行PRM扫描采集；对所述质谱数据中的蛋白进行定性与定量分析，获得所述肺癌蛋白质组定性与相对定量信息的同时，得到目的蛋白的绝对定量值。
6.根据权利要求5所述的肺癌蛋白的检测方法，其特征在于，所述色谱分离的流动相和梯度设置如下：
流动相A：100％色谱级水+0.1～0.2％甲酸；
流动相B：70-90％色谱级乙腈+0.1～0.2％甲酸；
色谱梯度：100-150分钟梯度。
7.根据权利要求5所述的肺癌蛋白的检测方法，其特征在于，采用色谱分离柱进行所述色谱分离，色谱条件如下：
预柱外径350-370um，内径90-110um，填料是2-4um的C18，填料总长1-2cm；
色谱柱长度24-26cm，外径350-370um，内径140-160um，一体化色谱柱柱尖开口3～5um，填料是1.5-2.4um粒径的C18反相填料。
8.根据权利要求5所述的肺癌蛋白的检测方法，其特征在于，采用质谱仪Q-ExactiveHF(Thermo)进行所述质谱扫描，设置一级质谱和二级扫描。
9.根据权利要求5所述的肺癌蛋白的检测方法，其特征在于，DIA扫描模式结束后，进行10个PRM的扫描事件，将目的肽段的序列加在DIA窗口之后，设定PRM目的肽段的扫描窗口，具体RT时间根据预扫目标肽段的RT时间来设定。
10.根据权利要求5所述的肺癌蛋白的检测方法，其特征在于，对质谱数据进行Spectronaut抽提处理，随后进行Skyline软件处理，内源性目的肽段和重标肽段的定量值，根据标准曲线计算目的蛋白的绝对定量值。
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3185014A1 (en) * | 2015-12-23 | 2017-06-28 | Polyquant GmbH | Bladder cancer biomarker proteins |
| CN108152430A (zh) * | 2017-12-21 | 2018-06-12 | 上海中科新生命生物科技有限公司 | 基于prm检测的卵巢癌标志物检测试剂盒及检测方法 |
| CN110133170A (zh) * | 2019-04-28 | 2019-08-16 | 北京谷海天目生物医学科技有限公司 | 复杂样本的蛋白检测方法 |
| CN111220690A (zh) * | 2018-11-27 | 2020-06-02 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种低丰度蛋白质翻译后修饰组的直接质谱检测方法 |
-
2021
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3185014A1 (en) * | 2015-12-23 | 2017-06-28 | Polyquant GmbH | Bladder cancer biomarker proteins |
| CN108152430A (zh) * | 2017-12-21 | 2018-06-12 | 上海中科新生命生物科技有限公司 | 基于prm检测的卵巢癌标志物检测试剂盒及检测方法 |
| CN111220690A (zh) * | 2018-11-27 | 2020-06-02 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种低丰度蛋白质翻译后修饰组的直接质谱检测方法 |
| CN110133170A (zh) * | 2019-04-28 | 2019-08-16 | 北京谷海天目生物医学科技有限公司 | 复杂样本的蛋白检测方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| CHEN J 等: "Serum sCD14, PGLYRP2 and FGA as potential biomarkers for multidrug-resistant tuberculosis based on data-independent acquisition and targeted proteomics", 《J CELL MOL MED.》 * |
| 张美娟 等: "高分辨质谱-非信息依赖数据采集-后靶向筛查策略在不明原因食物中毒鉴定中的应用", 《分析化学》 * |
| 杨光 等: "冠心病痰瘀互结证的组学研究进展与思考", 《中医杂志》 * |
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