CN102156164B - 核仁磷酸蛋白可变剪接体的质谱鉴定方法和胃癌诊断试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种核仁磷酸蛋白可变剪接体的质谱学鉴定方法以及胃癌诊断试剂盒。所述方法是Glu-C酶切方法与Q-TOF质谱方法的结合，可应用于临床胃癌的诊断和治疗评价中，与已有的方法相比，本发明的上述方法能够获得快速而可靠的鉴定结果。

Description

核仁磷酸蛋白可变剪接体的质谱鉴定方法和胃癌诊断试剂盒

技术领域

本发明涉及生物样品的检测领域，特别涉及突变蛋白的质谱学鉴定方法。

背景技术

核仁磷酸蛋白(nucleophosmin，NPM、B23、N038或NPM1)是位于核仁颗粒区的主要蛋白分子之一，人类B23基因位于染色体5q35，基因全长约23kb(Chan，P.K.，1986，Zhang，X.X，1989；Cochrane，A.W，1990)，包含有12个外显子，编码由294个氨基酸组成的蛋白质。在正常情况下核仁磷酸蛋白主要位于核仁颗粒区，但是可以穿梭于核仁、核质和胞质而发挥重要作用(Charles G，2008)。

核仁磷酸蛋白的12个外显子(Exon1-12)序列分别如下：

目前公认的B23基因有两个转录剪接体。B23蛋白最早于1989年由Chen W-Y等报道，该基因及蛋白序列也就是被认为野生型，实际上是跳过10号外显子编码294氨基酸残基的版本；Dalenc F于2002年报道了另一个剪接体，即保留10号外显子但在10号外显子末终止，也就是把11、12号外显子切除，这个剪接体共编码259个氨基酸残基；这两个版本表明，B23基因mRNA成熟过程中在10号外显子处存在一个选择机制，即要么把10号外显子剪切掉，要么在10号外显子末终止。

B23基因在所有类型的组织细胞中广泛表达，但在增殖活跃的细胞包括肿瘤细胞和干细胞中高表达。但在血液细胞恶性增殖的疾病中，B23表达并不高，而是发生了大量的基因突变和重排。

在白血病中，B23基因展现了两种突变，即参与基因重排和B23基因自身突变。前者最常见为B23与其它基因(RARa、MLF1、ALK)形成致癌性的融合蛋白，促进急性早幼粒细胞白血病(M3)、骨髓增生异常综合征(MDS)和淋巴瘤的发生。后者即B23自身基因突变则要复杂一些。

在实体瘤的研究中发现，B23基因通常表现为过表达，产生大量的B23蛋白。Yun J-P等检测了103例肝细胞癌(hepatocellular careinoma，HCC)，12例肝局灶性结节状增生(hepatic focal nodular hyperplasia)，17例肝血管瘤(hepatic haemangioma)旁肝脏组织和正常人器官等，发现HCC中B23的表达要比非恶性肝细胞多得多(1ncreased expression of nucleophosmin/B23inhepatocellular carcinoma and correlation with clinicopathological parameters.Br JCancer.2007Feb 12；96(3)：477-84).。但是，在实体瘤研究中，还没有任何关于B23基因突变以及可变剪接体的研究和报道。

本发明人首次发现了实体瘤(具体为胃癌)样本中B23基因转录本出现突变，进一步研究发现，在胃癌样本中存在一种典型的跳过8号外显子的剪接体B23-T和大量散在突变，同时通过细胞实验证明上述可变剪接体B23-T与野生型B23蛋白的功能不同，可导致细胞多核，因此该可变剪接体B23-T可以作为临床诊断的指标使用。

在对突变的检测中，通常会用到核酸水平的检测。但是，一方面，混杂在大量正常样本中的少量异常样本的检测并不容易，另一方面，核酸水平的检测并不能代替蛋白水平的直接检测。

检测与野生型蛋白不一样的剪接体蛋白，通常的方法是开发一个能特异识别突变位点的抗体，通过特异的抗原-抗体反应来达到区分野生型蛋白/突变蛋白的目的。但是，得到这样一种具备区分度的抗体，不仅费时费力，而且还不一定能够筛选得到。具体来说，特异性抗体的一般筛选方法是通过设计突变位点附近的多肽序列并通过该多肽免疫获得多抗血清或者筛选相应的单抗；或者直接用整个突变蛋白免疫小鼠，通过杂交瘤技术得到多株单克隆抗体。这些抗体都需要再通过与两种蛋白(野生型和突变型)进行抗原-抗体反应如ELISA，来鉴别这些抗体中哪些可以在与两种蛋白反应时有差别，其差别是否达到能明显区分的程度，而且不会产生假阳性的信号。理想的抗体是对突变型蛋白有阳性反应，但是对于野生型蛋白完全没有反应的抗体。从理论推理来说，做到这一点是困难的；而从实践来说，对初步试验合格的抗体，即对野生型蛋白和突变型蛋白具有一定区分度的抗体，由于初步筛选时一般使用纯的野生型或突变型蛋白进行试验，因此需要对初步合格抗体进行其他蛋白的干扰试验，这也增加了最终获得合格抗体的难度。

鉴于在胃癌样本中的典型的跳过8号外显子的剪接体B23-T为缺失突变，本发明人设计了两条针对剪接接头位点的多肽，希望通过免疫多肽而获得特异性不同的抗体，即其中一种抗体只和突变蛋白反应而不与野生型蛋白反应。实验结果发现，通过该法得到的抗体没有区分度，两种抗体都能与两种蛋白反应。因此，达到区分突变和野生型蛋白的目的只能通过筛选单克隆抗体的途径才有可能实现。但单克隆抗体筛选的周期很长，花费很大，而且也不能保证一定能得到符合要求的具有高度区分度的理想的抗体。

此外，突变蛋白的多肽新序列也是由野生型蛋白的原有序列组合成的，只是正常情况下该多肽的前后两部分本不结合在一起罢了。而抗体的产生往往可能只针对两到数个氨基酸残基，因此该多肽的前后两个部分单独已经足以能产生抗体，而这些抗体也能与野生型蛋白反应。如果把前后部分切短，那么可能无法形成有效识别从而无法产生针对该多肽的抗体。因此，从方法学上来说，针对缺失位点筛选抗体以区分野生型蛋白和缺失突变蛋白是更加困难的。

对于质谱学鉴定方法而言，目前能采用的质谱方法也有数种。较常用的为Maldi-TOF和Q-TOF。虽然Maldi-TOF应用广泛，但在具体实施中，由于受到其原理的限制，对所激发的片段有很大的选择性，很多片段不会出现在质谱结果中，同时这个特性还造成了试验的随机性高而重复性差，所以在某些情况下，即使采取了正确的酶切方法，也不能通过Maldi-TOF得到想要的结果。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于：找到一个能稳定地表征B23新剪接体B23-T的特征片段，并能通过实验直接检测；该检测方法具有高度准确性和重复性；该片断还能被开发运用到其他可能更为简便的检测方法中。

为解决上述问题，本发明人提出一种新思路，即利用完全酶切法与质谱法的结合高度可靠地鉴定突变蛋白，特别是缺失突变的蛋白。本发明人通过深入刻苦的研究完成了本发明。

因此，一方面，本发明提供一种核仁磷酸蛋白可变剪接体B23-T的质谱学鉴定方法，该方法是Glu-C酶切方法与Q-TOF质谱方法的结合。所述Glu-C酶切方法包括用Glu-C酶对核仁磷酸蛋白可变剪接体进行完全切割的步骤；所述Q-TOF质谱方法包括用ESI电离源的Q-TOF方法检测目的肽的步骤；所述Q-TOF质谱方法还包括直接对所述目的肽测序验证目的肽的步骤。通过上述鉴定方法确定的目的肽从N端到C端的氨基酸序列为KAPVKKGQE。

另一方面，本发明提供一种Glu-C酶在制备用于胃癌诊断的试剂盒中的新用途以及由此获得的用于胃癌诊断的试剂盒，该试剂盒含有Glu-C酶，还含有与所述Glu-C酶分开包装的肽和/或酶切处理用试剂，所述肽从N端到C端的氨基酸序列为KAPVKKGQE。本发明的试剂盒可用于质谱学方法鉴定以及其他鉴定方法，例如电泳和色谱鉴定方法等。

本发明还提供一种肽，该肽含有从N端到C端的氨基酸序列为KAPVKKGQE的肽段，特别是本发明提供从N端到C端的氨基酸序列为KAPVKKGQE的肽；以及该肽在制备用于胃癌诊断的试剂盒中的用途。

通过本发明，可以快速、可靠地确定突变蛋白B23-T在实体肿瘤特别是胃癌中的存在，从而可以应用于临床诊断中。质谱法重复性很好，这是由质谱仪器的精密性决定的；其次，采用的Q-TOF2质谱法能直接对目的片段测定氨基酸残基序列，因此能得到终极鉴定结果。这个结果不需要其他试验结果来佐证，其自身就是最可靠的鉴定结果。

附图说明

图1表示野生型B23与本发明人在胃癌中发现的B23-T的核酸序列的比较。

图2表示蛋白进行SDS-PAGE电泳结果和切胶图。Trizol试剂盒提取胃癌样本总蛋白，并用B23抗体做免疫沉淀。图中样品从左到右依次为：泳道1为低分子量蛋白Marker，购自上海生化所；泳道2、3为免疫沉淀样品电泳结果，泳道2中为正常胃全层样本，泳道3中为肿瘤胃全层样本。分子量大小见图中标示。

图3表示含B23野生型蛋白样本在ESI源下Glu-C酶切的一级质谱，是从图2所示正常胃全层样本来源胶条上切取25～40kDa区域，并作Glu-C酶切-质谱分析获得。

图4表示含B23-T突变蛋白样本在ESI源下Glu-C酶切的一级质谱，是从图2所示肿瘤胃全层样本来源胶条上切取25～40kDa区域，并作Glu-C酶切-质谱分析获得。

图5表示对目的肽测序的二级质谱，是以图4中特征峰492.81为母离子，进行MS/MS测序分析获得。

具体实施方式

在本发明中，利用质谱法的高度可靠性来鉴定突变蛋白时，关键的问题是：

1、使用何种蛋白酶对目的蛋白进行酶切分解？因为不同酶的酶切位点不同，切割的效率也不同，因此对酶的选择将影响到实验的可靠性以及最后的成功。

2、采用何种具体的质谱法检测酶切得到的特征肽段？

目前，最常用的方案为胰蛋白酶(Trypsin)酶切后用Maldi-Tof检测。因此，在本发明人的研究中也实施了该方法，但得到的片段是具有6个漏切点的片段，因此其可靠性不高。具体细节如下：

针对突变蛋白B23-T，Trypsin酶切后可能产生的特征肽段如下表：

突变后的可能产生的差异片段([M+H]⁺)

可能的特征肽段	理论分子量	Trypsin漏切点数
			A PVKK	542.366	1
A PVKKGQESFK	1218.684	2
			A PVKKGQESFKK	1346.779	3
A PVKKGQESFKKQEK	1731.975	4
			A PVKKGQESFKKQEKTPK	2058.171	5
A PVKKGQESFKKQEKTPKTPK	2384.384	6

注：所谓漏切点，即酶可能会随机或者因为位置原因等不能把所有理论位点全部切割，因此会漏过部分切割位点，从而产生比理论预测大的肽段。从表中可看出，其完全酶切后应该产生分子量为542.366的肽段。但实际结果只检测到漏切点6的片断，即理论分子量2384.384的肽段。由于漏切点数太多，因此该方法随机性强，作为检测手段容易产生假阴性结果。

此外，用Maldi-TOF法对肽段的激发方法造成质谱结果中出现的肽段较少，而且重复性不高。Maldi-TOF的结果只能用分子量来进行匹配分析。也就是说，质谱结果中有接近理论分析分子量的肽段，可认为有某个蛋白；但是通常需要3至5条以上匹配分子量的肽段，才能认为某个蛋白存在。对于B23-T而言，能与野生型蛋白B23区分开的部分只有突变剪接处的一个位点，因此，能表征的特征肽段就只有这一个。由于在检测中所用样本中含有大量杂蛋白，其产生的大量无关肽段将干扰试验的结果，特别是可能产生与目的分子量类似的片段，所以通过Maldi-TOF法从原理上而言可能得不到完全确认的结果。

本发明的可变剪接体突变中，比较典型的是缺失583-669bp部分的B23-T剪接体。使用DNAMAN软件与NCBI的报道的正常型B23序列进行比对，可以看出，该克隆序列比报道的正常型B23序列缺失了中间一段87bp的序列，见图1。

对比B23基因信息发现，上述缺失的583-669bp部分实际为B23基因的8号外显子。因此该缺失突变体应该是跳过8号外显子直接将7、9号外显子连接起来的产物。这与现有技术中已经确认的B23剪接体不同：野生型B23转录本是跳过10号外显子，因此编码区总长882bp，编码294氨基酸残基；其可变剪接体不跳过10号外显子，但在10号外显子末终止，因此剪切掉了11、12号外显子，编码区全长777bp，编码259氨基酸残基。上述缺失583-669bp的突变体实际为同时跳过8，10号外显子，编码区全长795bp，编码265氨基酸残基，比野生型少了29个氨基酸残基。

因此，本发明所涉及的鉴定对象为一个可变剪接体，是一个与正常蛋白非常相似的蛋白，该蛋白比正常蛋白少了29个氨基酸残基。该缺失的一段序列并不在蛋白序列的两端，而在靠近C-末端的中间，这给蛋白水平的检测带来困难，并且，该蛋白通常混杂于样本的野生型蛋白中，因此检测技术需要避开野生型蛋白对检测的干扰。

本发明的目的是通过酶切得到一个能表征B23可变剪接体的特征肽段作为鉴定其存在的标准，因此，本发明的关键在于选用Glu-C酶切，并通过Q-TOF方法直接对目的肽段进行检测和测序验证；Glu-C酶切方法漏切数为零，所以非常可靠。

本发明方法的基本流程为：临床病理样本-分离提取细胞核蛋白-实施免疫沉淀-切胶酶切-质谱鉴定。下面将具体说明。

取组织蛋白(提取RNA时的蛋白层)，加入适量缓冲液，加入1μg抗体和10-50μl protein A/G-beads后进行免疫沉淀，取所得蛋白进行SDS-PAGE，电泳结果如图2。

将如图2所示切胶后得到的样本进行Glu-C酶切分解，并进行ESI电离源的Q-Tof分析发现含B23-T蛋白的样本的一级质谱(MS)图谱(图4)展现出目的特征峰“492.81”(m/z＝492.81)，这与理论预测492.29非常接近。作为对比，图3所示的野生型蛋白的一级质谱图谱中没有相应的肽段。

在含B23-T蛋白的图谱(图4)中发现含有492.81肽段，与理论预测(492.29)非常接近，疑似为B23-T蛋白在Glu-C酶完全切割(即漏切点为0)情况下产生的特征片段。正如上述，这仍然不能最后确证该片段就是目的片段，所以Glu-C酶切与Q-TOF质谱方法的结合(Glu-C+Q-TOF方案)可行性还需要对该片断进行二级质谱(MS/MS)测序结果来验证。

将上述492.81片段提交MS/MS分析，根据肽段测序发现，在Glu-C酶切下B23-T样本产生的492.81片段就是特征肽段N-KAPVKKGQE-C，表征了样本因缺失序列“SIRDTP AKNAQKSNQN GKDSKPSSTP RS”后产生的特征肽段，序列在测序过程中为反向分析，如图5中箭头所示。该测序结果可以确证Glu-C酶切与Q-Tof质谱方法的结合的可行性，由于没有漏切点，因此，在Glu-C+Q-Tof方案下可以稳定可靠地检测B23-T样本的存在。

上述结果说明，本案中提供的Glu-C酶切方法所产生的特征肽段492.81即为B23-T剪接体蛋白的特征肽段，可用于表征任何样本中B23-T剪接体蛋白。该肽段可以用本领域的常规方法合成，并可作为检测B23-T样本的存在的标志物，用于胃癌的诊断等。

肽段“KAPVKKGQE”在质谱分析(毛细管液相色谱-电喷雾-四极杆飞行时间串联质谱仪，LC-ESI-MS-MS；m/z扫描分辨率为0.05unit)中出现的形式为：

A.ESI一级质谱为双电荷峰，形式为[M+H]²⁺，m/z492.81；

B.二级质谱分析时作为母离子(单电荷峰)，形式为[M+H]⁺，m/z984.65(492.81×2-1)

特征峰A在ESI源中特异展现(双电荷峰)，而在Maldi源中被掩盖。因此，可以用高分辨率的ESI源质谱分析酶切后的样本，而不用每次都对样本进行测序确证。可以加快样本的分析速度，降低成本。由于高分辨率质谱的引入，可以对肽段m/z精确到0.01Da，可以最大限度避免假阳性结论的出现。

下面通过具体的实施例来说明本发明的技术方案。

实施例

标本的采集和处理：

手术切除后10分钟内，将标本立刻放入液氮，-80℃储存直至蛋白提取。取自同一患者的未被肿瘤侵犯的胃全层组织(距肿瘤边缘6cm以上)做正常对照，在采集过程中使用不同的器械以防止交叉污染标本。

1、蛋白提取

采用Trizol试剂盒，按说明书抽提蛋白。具体步骤如下：

(1)在50mg冷冻组织中加入1ml Trizol试剂进行裂解，剧烈震荡以裂解细胞；

(2)将上述Trizol裂解液转入离心管中，在室温15℃～30℃下放置5分钟；

(3)在上述离心管中，每1ml Trizol裂解液加0.2ml氯仿，盖上管盖，用力震荡15秒，在室温下(15℃～30℃)放置2～3分钟后，12000转(2℃～8℃)离心15分钟；

(4)取上层水相置于离心管中，提取RNA用；

(5)取两层液相中间层的白色沉淀物质，即为变性的组织蛋白，用1ml氯仿洗涤沉淀，用于去除残留的Trizol，弃上清；

(6)再用75％酒精洗涤沉淀。

2、免疫沉淀实验

在收获的蛋白中，加入适量EBC裂解液，将1μg羊抗B23抗体和20μlprotein A/G-beads加入到蛋白裂解液中，于4℃缓慢摇晃孵育过夜，免疫沉淀反应后，在4℃以3，000转速度离心5分钟，将protein A/G-beads离心至管底；将上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml NETN缓冲液洗3-4次；最后加入15μl的2×SDS加样缓冲液，沸水煮10分钟，上清部分用于电泳。

所述EBC缓冲液的组成：

50mM Tris-HCl(pH 8.0)

120mMNaCl

0.5％NP-40

10μg/μl抑蛋白酶肽(用前加入)

1μg/μl亮抑酶肽(用前加入)

50μg/ml PMSF(用前加入)

100mMNaF。

所述NETN缓冲液：

20mM Tris-HCl(pH 8.0)

100mMNaCl

1mM EDTA

0.5％NP-40

所述2×SDS加样缓冲液：

60mM Tris-HCl(pH 6.8)；

2％SDS；

0.1％溴酚蓝；

25％甘油；

14.4mM β-巯基乙醇。

3、SDS-PAGE电泳

按常规蛋白质SDS-PAGE电泳，上样15μl。电泳完毕，蛋白胶用考马斯亮蓝染色液染色，再使用脱色液脱色。电泳结果如图2。

所述电泳条件：

浓缩胶：5％丙烯酰胺，125mM Tris-HCl(pH 6.8)，1％SDS，0.1％过硫酸铵，5μl TEMED；

分离胶：12％丙烯酰胺，38mM Tris-HCl(pH 8.8)，0.1％SDS，0.1％过硫酸铵，5μl TEMED；

恒流15mA电泳，至溴酚蓝迁移至玻璃板底部。

所述考马斯亮蓝染色液染色：

0.1％Coomassie blue G-250；

40％乙醇；

10％冰醋酸。

所述脱色液：

40％乙醇；

10％冰醋酸。

4、切胶脱色

取充分清洗干净的玻璃板，将胶片置于其上。以手术刀片将目的蛋白区域的胶块切成1mm³大小的胶粒。也可用剪刀将200μl Eppendorf吸头尖端剪断约1cm，孔的直径大约为1mm。然后用其在目的蛋白区域(25～40kDa区域)均匀戳取胶粒。

将蛋白胶粒转移至离心管中，用纯水反复冲洗2～3遍。弃去洗涤液，用含50％乙腈的25mM碳酸氢铵溶液200μl浸泡胶粒，于37℃水浴保温20分钟，振荡5分钟，弃去溶液。重复上述步骤2～3次，直至胶粒中的蓝色褪尽，呈无色通明状。干胶

将脱色后的胶粒真空干燥30分钟，使其充分脱水。此时体积将缩小，胶粒呈乳白色。

5、胶内酶切

蛋白酶的使用量及缓冲液可参考制造厂商提供的说明适当调整。本实验中，蛋白酶切溶液的加入量标准为，每5粒胶粒，加入新鲜配制的15μl蛋白酶切溶液，并以碳酸氢铵为酶切缓冲体系，然后，置于4℃冰箱充分溶胀后，酶溶液应有少量剩余。如胶粒未溶胀充分(呈无色通明状)，则补加酶溶液；如胶粒完全泡胀后酶液仍有剩余，则将多余的酶液吸出。

补充20～30μl 25mM碳酸氢铵缓冲液，密封离心管，置于培养箱中保温12～16小时。酶切时间延长可能产生较多蛋白酶的自切峰，但不会对试验结果产生影响；酶切时间不足则有可能产生漏切现象，影响试验结果。

所述蛋白酶切溶液：

25mM碳酸氢铵缓冲液；

0.1μg/μl蛋白酶(Trypsin/Glu-C)。

所述培养箱保温条件：

Trypsin酶切时，恒温37℃；

Glu-C酶切时，恒温30℃。

6、肽段抽提

将上述经胶内酶切且离心的样品取出，吸取上清液(为酶解原液)置于无菌PCR管中；

然后将样品做如下处理：

(1)在样品管中加入抽提液1至刚好没过胶粒，密封后置于超声清洗仪中超声(300W，超声5s，间隔5s)，共1～2分钟，37℃培养箱中保温30～60分钟，离心后吸取上清液，置于上述PCR管中；

(2)在样品管中加入抽提液2至刚好没过胶粒，密封后置于上述(1)相同条件下超声清洗仪中超声1～2分钟，37℃培养箱中保温30～60分钟，离心后吸取上清液，置于上述PCR管中；

(3)在样品管中加入10～20μl抽提液3于室温下放置至胶粒脱水变白，离心后，吸取上清液，置于上述PCR管中；

合并酶解原液和抽提液1-3于PCR管中，用Millipore公司的Ziptip C18Tip对样品进行脱盐浓缩，获得质谱分析样品，用于Maldi-tof-MS分析和Q-tof2分析。

所述抽提液1：

5％三氟乙酸(TFA)。

所述抽提液2：

2.5％三氟乙酸(TFA)；

50％乙腈(ACN)。

所述抽提液3：

100％乙腈。

7、肽谱分析

Maldi-tof-MS分析

将基质α-氰基-4-羟基肉桂酸(α-CCA)溶于含0.1％TFA的50％乙腈溶液中，制成饱和溶液。离心，取1μl上清与1μl上述获得的质谱分析样品等体积混合，取1μl点在SCOUT 384靶上，送入离子源中进行检测。结果未检测到与理论预测492.29非常接近的特征峰。

Q-TOF2肽序列测定

多肽测序在英国Micromass公司(现Waters公司)的电喷雾四级杆正交加速-飞行时间串联质谱仪Q-TOF2上进行，仪器配备纳升喷雾源及毛细管液相色谱。

样品处理：前述获得的质谱分析样品用0.1％TFA稀释20倍，12000转离心20分钟，取上清进样。选用毛细管液相色谱(CapLC)对样本作分离，(流速1μl/min，A：0.1％TFA B：0.1％TFA/CH₃CN)，再进入ESI离子源。(这种机理无需像Maldi-tof-MS中的基质。样品液中含有TFA等挥发性气体)。由于选用ESI源，所有测定均在正离子方式下进行。质谱仪用Glu-fib(ESI Positive CID)的串联质谱碎片校正，质量准确度小于0.1，作为内标物，该肽N端到C端的氨基酸序列为“EGVNDNEEGFFSAR”。雾化气为氮气，碰撞气体为氩气。源温80℃，锥孔电压50V。毛细管电压为3kV，碰撞气体为氩气。碰撞能量根据离子电荷与质量大小由软件自动选择。TOF加速电压为9.1kV。MCP检测器电压为2280V。对MS/MS谱的分析软件为MaxEnt3，Biolynx及MasSeq。

8、检测结果

标本为随机从北京肿瘤医院1995年的30例年龄33-74岁之间的胃癌患者中选取3例A、B和C，并且以取自同一患者的未被肿瘤侵犯的胃全层组织作为正常对照组A’、B’和C’。采用上述Q-TOF2方法测定的结果如下：

标本	肽段KAPVKKGQE
		肿瘤样本A	+
正常对照样本A’	-
		肿瘤样本B	+
正常对照样本B’	-
		肿瘤样本C	+
正常对照样本C’	-

由上述结果显示，在胃癌患者的肿瘤组织样本中均检测到了B23-T剪接体蛋白的特征肽段，即检测结果为阳性“+”，而在同一患者的正常对照样本中均未检测到B23-T剪接体蛋白，即检测结果为阴性“-”。

可见，本发明的方法可以可靠地应用于剪接体蛋白的检测，进而应用于胃癌肿瘤的诊断和治疗中。

Claims (7)

1.Glu-C酶和目的肽的结合在制备用于检测核仁磷酸蛋白可变剪接体的试剂盒中的应用，其中，用所述Glu-C酶对所述核仁磷酸蛋白可变剪接体进行完全切割能够得到所述目的肽，其中所述目的肽从N端到C端的氨基酸序列为KAPVKKGQE，且所述目的肽能够用Q-TOF质谱方法检测和/或验证。

2.如权利要求1所述的应用，其中，所述Q-TOF质谱方法采用ESI电离源。

3.一种用于胃癌诊断的试剂盒，该试剂盒含有Glu-C酶和目的肽，所述Glu-C酶与所述目的肽分开包装，所述目的肽从N端到C端的氨基酸序列为KAPVKKGQE。

4.如权利要求3所述的用于胃癌诊断的试剂盒，该试剂盒还包含酶切处理用试剂。

5.如权利要求3或4所述的用于胃癌诊断的试剂盒，该试剂盒用于Q-TOF质谱学方法鉴定。

6.如权利要求5所述的用于胃癌诊断的试剂盒，其中，所述质谱学方法为ESI电离源的Q-TOF方法。

7.一种肽，该肽从N端到C端的氨基酸序列为KAPVKKGQE。

Images