CN113372406A - 一种齐墩果酸衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种齐墩果酸衍生物及其制备方法和应用 Download PDF

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CN113372406A CN202110644088.0A CN202110644088A CN113372406A CN 113372406 A CN113372406 A CN 113372406A CN 202110644088 A CN202110644088 A CN 202110644088A CN 113372406 A CN113372406 A CN 113372406A
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Abstract

本申请提供一种齐墩果酸衍生物，所述齐墩果酸衍生物如式I或式II结构所示：

Description

一种齐墩果酸衍生物及其制备方法和应用
技术领域
本申请涉及医药领域，具体涉及一种齐墩果酸衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本申请的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
齐墩果酸广泛分布于草本植物中。已经报道的齐墩果酸具有许多生物活性，包括保肝，消炎，抗肿瘤活性(Liu,J."Oleanolic acid and ursolic acid:Researchperspectives".Journal of Ethnopharmacology,Vol.100,(2005):92–94.)。齐墩果酸的抗肿瘤活性已经被证实可用于多种癌症治疗中，包括但不限于乳腺癌、骨肉瘤、肝癌和肺癌。但齐墩果酸直接使用往往受制于水溶性差，生物相容性低等问题，使得齐墩果酸相对于现今临床使用抗肿瘤药物存在一定差距，为了提高其在临床治疗上的治疗功效，常对齐墩果酸进行结构修饰，以克服齐墩果酸本身存在的问题。齐墩果酸C-3的羟基和C-28的羧基以及C-12和C-13的双键都是可以作为结构改造的位点。为提高齐墩果酸的水溶性，Medina在齐墩果酸的C-3和C-28位引入乙二醇/胺片段，以及聚乙二醇/胺片段连接两分子齐墩果酸，合成了一系列齐墩果酸衍生物，这些衍生物均进行了细胞毒性检测，其中聚乙二醇-胺齐墩果酸衍生物显示出最好的结果，IC50为0.22-3.78μM，相对于齐墩果酸提高28-963倍(Medina-O’Donnell,M.et al."Semi-synthesis and antiproliferative evaluation ofPEGylated pentacyclic triterpenes".European Journal of Medicinal Chemistry,Vol.118,(2016):64–78.)。Jie-Ping Fan使用胆碱，四乙胺以及1-(2-羟乙基)-3-甲基咪唑与齐墩果酸反应合成齐墩果酸离子衍生物。在相同的实验条件下，衍生物在水中，模拟胃液以及模拟肠液中相比齐墩果酸本身有更好的溶解性，同时细胞毒性检测中，衍生物使得HepG2细胞存活性显著降低(Fan,J.-P.et al."Synthesis and evaluation of thecancer cell growth inhibitory activity of the ionic derivatives of oleanolicacid and ursolic acid with improved solubility".Journal of Molecular Liquids,Vol.332,(2021):115837.)。
发明内容
为了改善现有技术的不足，同时尽可能的提高齐墩果酸的抗肿瘤活性、对肿瘤细胞的选择性，以及减少对正常细胞的毒性，本申请提供了一种齐墩果酸衍生物(共两个系列)及其制备方法和应用。本发明选择齐墩果酸C-3位羟基通过酯化反应连接上含溴碳链以及C-28位羧基通过亲核取代反应连接上含溴碳链，通过溴原子与三苯基膦成盐反应得到所需衍生物，同时，考虑到位点封闭对活性的影响以及羧基端未保护时反应体系混乱的原因，在C-3位羟基端修饰时，用含一个溴原子碳链反应物进行亲核取代反应从而达到保护基团的作用。
具体地，本发明提供了下述的技术特征，以下技术特征的一个或多个的结合构成本发明的技术方案。
在本发明的第一方面，本发明提供了一种齐墩果酸衍生物，其结构如式I或式II所示：
Figure BDA0003108353100000021
其中，n为2、3或4。
具体地，在本发明的实施方式中，所述衍生物分别命名为：
Figure BDA0003108353100000022
化合物OA-1,3C-TPP(n＝3)
化合物OA-1,4C-TPP(n＝4)
化合物OA-1,5C-TPP(n＝5)；
Figure BDA0003108353100000031
化合物OA-3C-TPP(n＝2)
化合物OA-4C-TPP(n＝3)
化合物OA-5C-TPP(n＝4)。
在本发明的实施方式中，发明人发现，针对齐墩果酸的修饰，对不同部位的修饰对化合物的活性具有较大的影响，该影响的程度可以是活性的高与低，也可以是活性的有或无。在本发明的一些实施方式中，发明人发现对C-28位羧基进行结构修饰以及同时对C-3位羟基和C-28位羧基进行修饰会使化合物的活性往更有利的方向发展，但这种情况局限于三苯基膦的结合位置。根据实验发现，C-3位羟基端以特定溴代羧酸(溴戊酸)酯化后与三苯基膦成盐，同时C-28位羧基端成酯(碳链长度不超过5为宜)可以较好地改善化合物的抗肿瘤活性、减小对正常细胞毒副作用；以及，C-28位羧基端与碳链长度不超过5的溴代烷成酯后与三苯基膦成盐，其他结构不做任何修饰时，能够极大地改善化合物的抗肿瘤活性，同时降低对正常细胞的毒副作用。而且，上述处理中，仅对于C-28位进行修饰的化合物的活性会更好，而且是特别好，除了对乳腺癌细胞、肺癌细胞、肝癌细胞的毒性作用大大提升之外(与阳性药多柔比星活性基本相当，但是对正常肝细胞的毒性作用更小)，对于白血病细胞具有特别优异的毒性作用，针对这一点而言是极大地出乎意料的，因为其比阳性对照药吉非替尼(治疗慢性粒细胞性白血病的原研药)的效果还要好的多，这为慢性粒细胞性白血病的药物开发提供了更大的可能性。
在本发明的第二方面，本发明提供了一种制备上述衍生物式I的方法，所述方法包括：以齐墩果酸为原料，分别对其C-3位羟基和C-28位羧基进行修饰，包括将齐墩果酸与溴代烷
Figure BDA0003108353100000032
进行成酯反应生成化合物A，化合物A与溴代羧酸
Figure BDA0003108353100000033
反应生成化合物B，化合物B与三苯基膦进行成盐反应生成式I化合物，其中，n为2、3或4；
Figure BDA0003108353100000041
以及，本发明提供了一种制备上述衍生物式II的方法，所述方法包括：以齐墩果酸为原料，对其C-28位羧基进行修饰，包括将齐墩果酸与溴代烷
Figure BDA0003108353100000042
进行成酯反应生成化合物C，化合物C与三苯基膦进行成盐反应生成式II化合物，其中，n为2、3或4；
Figure BDA0003108353100000043
在本发明的实施方式中，发明人发现中间体与TPP反应比例不同，反应完成度及产率相差很大，比如在1:1的反应条件下，反应进行24h后仍然未反应完全，且产率极低，无法分离。因此，本发明提供了较优的反应比例，即化合物B或化合物C与三苯基膦的1:3-1:5。在该反应比例下，反应可在10-20h反应完全，且收率较高，可达到40％-80％
在本发明的实施方式中，能够较好的监控反应进程才能够较好的了解及对反应进行调控同时也关系到最终反应液中物质的组成情况进而影响到产物的分离纯化。因此，在本发明的实施方式中，上述提及的制备方法中，本发明采用TLC监测化合物A、化合物B、化合物C、式I、式II化合的反应进程，并采用正己烷/乙酸乙酯为展开剂。尤其是1，在本发明的一些实施方式中，展开剂采用正己烷与乙酸乙酯的比例为20:1、10:1、8:1、6:1、4:1、2:1进行分离，依据Rf值发现，展开剂比例为8:1、6:1、4:1时监测的物质的Rf在0.2-0.8之间，且待分离产物与杂质及过量反应物之间可明显分离。比如，在一些实施方式中，采用上述展开剂及8:1、6:1、4:1的比例，化合物C的收率在60％-90％，化合物A的收率在40％-70％，同样较好的结果也出现在化合物B的实施中。在本发明的一些实施方式中，监测式I或式II化合物的反应进程时，发明人发现虽然式I或式II化合物是盐，但是采用极性大的二氯甲烷/甲醇时，发现原料点和产物点重合，无法判断反应是否完全，而采用正己烷/乙酸乙酯可以较好监测反应进程。
在本发明的实施方式中，终产物齐墩果酸衍生物的分离是尤为重要的关键。发明人也做了较多尝试，然而很多常规的方法效果并不是很好。因此，在本发明中，提供了一些较为优选的处理方式来作为上述制备方法产物的分离步骤，所述分离采用硅胶柱色谱分离法或淋洗法；其中，所述硅胶柱色谱分离法包括先使用乙酸乙酯进行洗脱然后以二氯甲烷/甲醇进行洗脱，即可得到纯净产物，收率在40-80％；所述淋洗法包括：将旋干除去溶剂后，将沉淀物用热的正己烷或者石油醚淋洗，淋洗后将固体溶于乙酸乙酯中，再加入石油醚或者正己烷将固体析出，最后用乙醚洗涤、干燥即得纯净产物。
在本发明的第三方面，本发明提供了一种药物组合物，其包括上述第一方面中所述的齐墩果酸衍生物。
在本发明的第四方面，本发明提供了一种药物制剂，其包括上述第一方面中所述的齐墩果酸衍生物和至少一种药学上可接受的辅料或载体。
所述药物载体可以为液体或固体；所述药物制剂可以为口服制剂和肠胃外给药制剂，比如可以为片剂、丸剂、胶囊或注射剂。
可使用本领域技术人员公知的技术将本发明的化合物配制成药物组合物或药物制剂。除本文提到以外，合适的药用辅料是本领域已知的，例如参见2005年版的药用辅料手册(原著第四版)，作者(英)R.C.罗(RaymondCRowe)(美)P.J.舍斯基(PaulJSheskey)。
在本发明的第五方面，本发明提供了上述第一方面中所述的齐墩果酸衍生物或上述第三方面中所述的药物组合物或上述第四方面所述的药物制剂在制备抗癌药物中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述癌症选自乳腺癌、肺癌、肝癌、血液癌，所述血液癌尤其为慢性粒细胞白血病。
在本发明的第六方面，本发明提供了一种治疗癌症的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本发明上述第一方面所述的齐墩果酸衍生物或包含所述衍生物的药物组合物或药物制剂。所述癌症选自乳腺癌、肺癌、肝癌、血液癌，所述血液癌尤其为慢性粒细胞白血病。
所述受试者是指已经是治疗、观察或实验的对象的动物，优选指哺乳动物，最优选指人。
所述“治疗有效量”是指包括本发明化合物在内的活性化合物或药剂的量，该量可引起研究者、兽医、医生或其他医疗人员所追求的组织系统、动物或人的生物学或医学响应，这包括减轻或部分减轻受治疗的疾病、综合征、病症或障碍的症状。
相较于现有技术，本发明的优势在于：
本发明提供了两系列靶向于线粒体的齐墩果酸衍生物，这些化合物具有更优异的抗肿瘤活性和对正常细胞的更低的毒性，表现出较好的对肿瘤细胞的选择性，尤其是，本申请的化合物对于乳腺癌、肝癌、肺癌、血液类癌症的MTT或CCK细胞活性的评价实验中IC50均在15μM以下，特别是，OA-1,n-TPP(n＝3,4,5)系列化合物，其具有比阳性药多柔比星和吉非替尼更好的抗肿瘤效果和对正常肝细胞的更低的毒性，具有较好的药用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本申请。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本申请所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本申请所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本申请方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例化合物的制备
1、合成路线：
(1)羟基端成盐合成路线：
Figure BDA0003108353100000061
反应试剂与条件：
(a)K2CO3、1-溴丙烷(或1-溴丁烷或1-溴戊烷)、DMF，r.t.；
(b)EDCI、DMAP、5-溴戊酸、DCM，r.t.；
(c)TPP(三苯基膦)、MeCN，reflux。
(2)羧基端成盐合成路线：
Figure BDA0003108353100000071
反应试剂与条件：
(a)K2CO3、1,3-二溴丙烷(或1,4-二溴丁烷或1,5-二溴戊烷)、DMF，r.t.；
(b)TPP(三苯基膦)、MeCN，reflux。
2.实验部分
2.1实验试剂与设备
仪器：旋转蒸发仪(HD-N-1100V-W(WD))；循环水式多用真空泵(SHB-Ⅲ)；电子天平(千分之一)(AMPUT)；加热磁力搅拌器(CJJ78-1)；核磁共振仪(Bruker400MHz)；GF254硅胶板(新诚硅胶材料有限公司)；
实验试剂：齐墩果酸97％AR；1-溴丙烷AR；1-溴丁烷AR；1-溴戊烷AR；1,3-二溴丙烷AR；1,4-二溴丁烷AR；1,5-二溴戊烷AR；三苯基膦AR；5-溴戊酸AR；K2CO3AR；NaHCO3 AR；NaClAR；无水硫酸钠AR；EDCI AR；DMAP AR；DMF AR；二氯甲烷AR；乙酸乙酯AR；正己烷AR；乙腈色谱纯；甲醇色谱纯；氘代氯仿99.99％。
2.2化合物合成方法及表征
按照如上所示的合成路线，以齐墩果酸为起始原料合成下列化合物。
化合物A1,A2,A3的合成：将齐墩果酸1.0g，1.08g K2CO3，0.8ml的1-溴丙烷(0.94ml的1-溴丁烷；1.08ml的1-溴戊烷)，5mlDMF加入100ml圆底烧瓶中，磁力搅拌下室温反应，用TLC监测反应进程。反应结束后用乙酸乙酯萃取两次，取上层有机相，饱和NaHCO3洗三次，水洗三次，用无水硫酸钠干燥后抽滤，旋蒸除去乙酸乙酯。硅胶柱色谱分离纯化得到A1,A2,A3。
化合物B1,B2,B3的合成：取化合物上述所得A1,A2,A3产物于100mL圆底烧瓶中，并加入4倍当量EDCI，0.4当量DMAP，4倍当量5-溴戊酸，20ml二氯甲烷，室温下磁力搅拌反应，TLC监测反应进程。反应结束后，用饱和NaHCO3洗三次，水洗三次后用无水硫酸钠干燥，减压抽滤，旋干除去二氯甲烷。硅胶柱色谱分离得到B1,B2,B3。
化合物OA-3C-TPP的合成：取化合物B10.31g于100ml圆底烧瓶中，加入0.61g三苯基膦，用5ml乙腈溶解，于80℃油浴磁力搅拌反应12h后TLC监测反应完全，减压旋干除去溶剂，硅胶柱色谱分离得到0.14g白色固体。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.00–7.61(m,15H,Ph-H),5.29(d,J＝3.2Hz,1H,H-12),4.39(dd,J＝10.8,5.2Hz,1H,H-3),4.03–3.94(m,2H,-COO-CH2),3.94–3.83(m,2H,CH2-P),2.98–2.77(m,1H,H-15),2.38(t,J＝6.7Hz,2H,CH2-COO-),2.09–1.16(m,27H,CH,CH2,五环骨架或所接碳链),1.13(s,3H,-CH3-27),0.98(d,J＝4.5Hz,1H),0.95(t,J＝5.0Hz,3H,-COO(CH2)2CH3),0.93(s,3H,-CH3-23),0.90(s,3H,-CH3-30),0.89(s,3H,-CH3-29),0.77(s,3H,-CH3-24),0.74(s,3H,-CH3-25),0.73(s,3H,-CH3-26).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ177.86,172.99,143.99,135.94,135.09,133.87,133.77,130.63,130.50,122.27,118.84,117.99,80.95,65.90,55.36,47.63,46.76,45.98,41.78,41.41,39.42,38.17,37.74,36.98,33.98,33.89,33.21,32.76,32.56,30.80,28.18,27.67,25.93,23.71,23.63,23.50,23.08,22.47,22.39,22.09,18.28,17.05,16.84,15.45,14.21,10.68.
化合物OA-4C-TPP的合成：取中间体B2 0.41g加入100ml圆底烧瓶中，加入0.80g三苯基膦，5ml乙腈溶解，于80℃油浴下磁力搅拌反应14h，TLC监测反应完全。减压旋干除去溶剂。硅胶柱色谱分离得到0.41g白色固体。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.01–7.54(m,15H,Ph-H),5.28(s,1H,H-15),4.40(dd,J＝10.7,5.3Hz,1H,H-3),4.13–3.92(m,2H,-COO-CH2),3.85(t,J＝14.0Hz,2H,CH2-P),2.88(dd,J＝13.6,3.7Hz,1H,H-15),2.47–2.32(m,2H,CH2-COO-),2.24-1.17(m,28H,CH,CH2,CH3,五环骨架或所接碳链),1.13(s,3H,-CH3-27),1.06(d,J＝7.9Hz,1H),1.05–0.97(m,2H),0.95(s,1H),0.93(s,3H，-CH3-23),0.90(s,6H,-CH3-30,-CH3-29),0.87(d,J＝7.1Hz,1H),0.77(s,3H,-CH3-24),0.75(s,3H,-CH3-25),0.73(s,3H,-CH3-26).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ177.74,172.80,143.85,135.05,135.02,133.72,133.62,130.56,130.44,122.15,118.62,117.77,80.84,63.95,55.23,53.50,47.50,46.61,45.85,41.66,41.29,39.29,38.04,37.62,36.86,33.85,33.79,33.09,32.64,32.42,31.54,30.67,30.64,28.07,27.58,25.80,25.67,25.50,23.59,23.50,23.39,22.95,22.61,22.30,21.98,19.21,18.16,16.95,16.73,15.33,14.10,13.70.
化合物OA-5C-TPP的合成：取0.46g B3中加入0.87g三苯基膦，5ml乙腈溶解，于80℃油浴下磁力搅拌反应14h,TLC监测反应完全。旋干除去乙腈。硅胶柱色谱分离得到0.51g白色固体。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.93–7.63(m,15H，Ph-H),5.28(s,1H,H-12),4.47–4.33(m,1H,H-3),4.10–3.94(m,2H,COO-CH2),3.87(t,J＝14.0Hz,2H,CH2-P),2.96(s,1H,H-15),2.44–2.32(m,2H,CH2-COO),2.09–1.15(m,29H,CH,CH2,五环骨架或所接碳链),1.13(s,3H，-CH3-27),1.09–0.97(m,3H),0.95(m,3H,-COO(CH2)4CH3),0.93(s,3H,-CH3-23),0.87(s,6H,-CH3-30,-CH3-29),0.78(s,3H,-CH3-24),0.75(s,3H,-CH3-25),0.74(s,3H,-CH3-26).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ177.70,172.78,143.88,135.01,134.98,133.75,133.65,130.55,130.42,122.16,118.67,117.82,80.81,64.23,55.27,47.53,46.61,45.88,41.65,41.29,39.31,38.06,37.62,36.87,33.86,33.77,33.06,32.65,32.43,31.56,30.66,28.28,28.23,28.05,27.59,25.78,25.66,25.49,23.54,23.38,22.95,22.80,22.61,22.25,21.95,18.16,16.95,16.71,15.29,14.05,13.97.
化合物C1,C2,C3的合成：取1,0g齐墩果酸，1,09g K2CO3，5mlDMF和0,92ml1,3-二溴丙烷(1ml1,4-二溴丁烷；1.2ml1,5-二溴戊烷)加入100ml圆底烧瓶中，室温下磁力搅拌反应，TLC监测反应进程。反应结束后，饱和NaCl溶液淬灭，乙酸乙酯萃取，有机相用饱和NaHCO3洗三次，水洗三次后有机相用无水硫酸钠干燥，减压抽滤，旋干除去溶剂。硅胶柱色谱分离得到均为白色固体。
化合物OA-1,3C-TPP的合成：取0.75g C1于圆底烧瓶中，加入1.02g三苯基膦，5ml乙腈于圆底烧瓶中，油浴升温至80℃反应20h后TLC监测反应完全。旋干除去乙腈，硅胶柱色谱分离得到0.46g白色固体。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.08–7.58(m,15H，Ph-H),5.17(s,1H,H-12),4.37(d,J＝5.7Hz,2H,-COO-C-H),4.01–3.72(m,2H,CH2-P),3.21(dd,J＝10.7,4.5Hz,1H,H-3),2.76(d,J＝11.2Hz,1H,H-15),2.03-1.13(m,22H，CH,CH2,五环骨架和所接碳链)，1.10(s,3H,-CH3-27),1.02(s,1H),0.98(s,3H,-CH3-23),0.92(d,J＝6.5Hz,1H),0.89(s,6H,-CH3-29,-CH3-30),0.83(s,3H,-CH3-24),0.78(s,3H,-CH3-25),0.70(d,J＝11.4Hz,1H),0.53(s,3H,-CH3-26).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ177.29,143.64,135.21,135.19,133.66,133.56,130.64,130.51,122.27,118.29,117.43,78.69,63.02,55.05,47.39,46.64,45.68,41.60,41.21,39.18,38.67,38.35,36.90,35.95,33.72,32.96,32.58,32.44,30.60,28.09,27.53,27.07,25.76,23.60,23.26,22.88,22.28,20.07,19.55,18.23,17.03,15.66,15.34.
化合物OA-1,4C-TPP的合成：将0.83g C2加入100ml圆底烧瓶中，加入1.67g三苯基膦，5ml乙腈在80℃下磁力搅拌反应20h，TLC监测反应完成。旋干溶剂后取部分进行硅胶柱色谱分离得到0.24g白色固体。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.25–7.60(m,15H，Ph-H),5.14(s,1H,H-12),4.08(dt,J＝11.6,5.7Hz,2H，COO-CH2),4.00(dd,J＝13.8,6.4Hz,2H,CH2-P),3.20(d,J＝7.6Hz,1H,H-3),2.73(d,J＝10.2Hz,1H,H-15),2.16–1.17(m,24H,CH,CH2,五环骨架或所接碳链),1.09(s,3H，-CH3-27),0.98(s,3H,-CH3-23),0.95(s,1H),0.92(s,1H),0.88(s,3H,-CH3-30),0.87(s,3H,-CH3-29),0.85(s,3H,-CH3-24),0.78(s,3H,-CH3-25),0.70(d,J＝11.0Hz,1H),0.63(s,3H,-CH3-26).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ177.73,135.09,133.95,133.85,130.64,130.52,122.47,118.93,118.08,79.09,63.18,55.28,53.56,47.68,46.75,45.86,41.75,38.87,38.55,37.12,33.94,33.75,33.20,32.80,32.54,32.25,31.57,30.78,29.43,27.76,27.31,25.98,23.87,23.02,21.79,18.45,17.09,15.73,15.46.
化合物OA-1,5C-TPP的合成：将0.89gC3,1.93g三苯基膦，5ml乙腈加入100ml圆底烧瓶中，于80℃下反应14hTLC监测反应完全。旋干溶剂。取部分硅胶柱色谱分离得0.13g白色固体。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.00–7.63(m,15H),5.24(t,J＝3.2Hz,1H，H-12),3.95(t,J＝6.5Hz,2H,-COO-CH2),3.84(dd,J＝18.0,10.1Hz,2H,CH2-P),3.21(dd,J＝10.8,4.5Hz,1H,H-3),2.81(dd,J＝13.7,3.8Hz,1H,H-15),2.01-1.13(m,27H,CH,CH2,五环骨架或所接碳链),1.11(s,3H,-CH3-27),1.04(s,1H),0.98(s,3H,-CH3-23),0.89(s,3H,-CH3-29),0.89(s,3H,-CH3-30),0.85(s,3H,-CH3-24),0.77(s,3H,-CH3-25),0.71(d,J＝11.2Hz,1H),0.65(s,3H,-CH3-26).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ177.74,143.81,135.11,135.08,133.82,133.72,130.64,130.51,122.33,118.80,117.95,78.93,63.53,55.22,53.54,47.61,46.67,45.89,41.73,41.34,39.34,38.79,38.47,37.06,33.93,33.14,32.78,32.50,30.73,29.74,28.19,28.11,27.70,27.23,26.74,26.58,25.87,23.70,23.45,23.04,22.53,22.28,18.38,17.12,15.71,15.42.
3、实验结果与分析
本实施例合成了6个齐墩果酸-三苯基膦衍生物，其中三个在羟基端形成，另三个在羧基端形成，反应产物均用1HNMR和13CNMR进行结构表征。在上述合成过程中，发明人发现反应进程的监控、反应无比例的选择以及终产物的分离是影响合成反应并获得最终产物的重要因素。
(1)TLC监测反应进程时展开剂(淋洗剂)的选择：
首先对于A和C系列中间体的展开剂中，发明人尝试了正己烷比乙酸乙酯比例分别为20:1,10:1,8:1,6:1,4:1,2:1进行分离，依据Rf值发现比例为8:1,6:1,4:1时产物在0.2-0.8之间，且待分离产物与杂质及过量反应物之间可明显分离。由于A和C系列采用相同的方法，故整个实验过程中，均采用这三个比例进行TLC监测以及硅胶柱色谱分离，均得到纯产物，且C系列收率在60％-90％，A系列收率在40％-70％。对于B系列酯化产物，同样使用正己烷比乙酸乙酯，尝试各个比例，发现对于不同碳链长度及极性相差较大，随着碳链增长，极性依次减小。对于终产物系列，由于考虑到产物是盐，初期用极性大的二氯甲烷比甲醇，结果发现原料点和产物点重合，无法判断反应是否完全，后改用正己烷比乙酸乙酯可以较好监测反应进程。
(2)反应物比例的选择
中间体(化合物B系列或C系列)与TPP反应比例不同，反应完成度及产率相差很大，初始未考虑到平衡因素，采用1:1进行反应，发现反应进行24h后仍然未反应完全，且产率极低，无法分离。当采用1:3至1:5的反应比例时，反应可在10-20h反应完全，且收率较高，可达到40％-80％。本发明以较为便宜、易得的反应物TPP过量于中间体，促进了反应向正向进行，并且实现了更高的收率。
(3)终产物齐墩果酸-三苯基膦盐的分离
本发明衍生物的制备过程中，分离获得终产物的步骤较为关键，发明人进行了较多研究。盐的极性较大，且一开始受反应比例影响，产率较低，故采用制备板分离，但分离效果差，制备板承重量小，上样过多时造成严重拖尾，且因制备板与TLC板硅胶颗粒大小差别，比移值存在不同，刮板时区域选取错误，以及可能制备板硅胶对TPP有一定吸附，故分离得到的产物中仍然含有TPP。后改用硅胶柱色谱分离，用相对于产物体系较小极性的展开剂乙酸乙酯，发现只有三苯基膦和三苯基氧膦可以移动，其他物质均留在原点，采用二氯甲烷:甲醇大极性溶剂可以很好地分离产物及其他较大极性杂质，故硅胶柱色谱分离时先用小极性洗去小极性杂质，后改用大极性溶剂分离，得到纯产物，收率在40％-80％。同时，将乙腈旋干除去后，将沉淀物用热的正己烷或者石油醚淋洗，淋洗后将固体溶于乙酸乙酯中，再加入石油醚或者正己烷将固体析出，最后用乙醚再洗一次，干燥后得到纯固体。本实验组设计合成TPP和5-溴戊酸反应作为对照，并用此淋洗方法进行分离，得到白色固体。两种方法均可，硅胶柱色谱更适用于产物无法直接得出固体，以及混合体系中有与产物极性相近的物质，而后者直接淋洗，类似重结晶，适用于产物混合体系杂质较少，且极性，溶解度相差较大，同时，可直接生成较多固体的体系。
实验例1化合物活性实验
MTT筛选实验
1目的：测试样品对种乳腺癌细胞株、肺癌细胞株、人肝癌细胞株、人正常肝细胞的IC50初筛
2主要仪器：酶标仪(VERSA max microplate reader,MD,USA)
3细胞系：人乳腺癌细胞：MDA-MB-231；人肺癌细胞：A549；人肝癌细胞：HEPG-2；人正常肝细胞：LO2。
4药液与试剂配制
1)化合物：10mM储备液，分装，-20℃储存备用，化合物取自上述实施例制备得到的6个化合物OA-1,3C-TPP、OA-1,4C-TPP、OA-1,5C-TPP、OA-3C-TPP、OA-4C-TPP和OA-5C-TPP。
2)阳性对照：多柔比星用细胞级DMSO溶解为10mM储备液，-20℃储存备用。
3)其他试剂：MTT(M2128,Sigma,USA)，DMSO(细胞培养级CAS-NO:67-68-5，Applichem,德国)，DMSO(分析纯，批号：20151102，国药集团，中国)；胎牛血清(Gibco，SouthAmerica)；培养基(Hyclone,USA)；多柔比星(Doxorubicin，Sigma，美国)。
5实验方法:
细胞接种于96孔板，细胞密度为3-4×103/孔。置于5％CO2、37℃的细胞培养箱中培养，待细胞贴壁后，加入指定浓度的待测样品，阴性对照组为相同浓度的DMSO，同一浓度的药物设三个平行孔。加药培养48h后，每孔加入20μL MTT(5mg/mL)，继续培养4h，用抽泵吸去上清液后，加入150μL DMSO，用酶标仪在570nm下检测各孔的OD值，并用IC50软件(Prism5.0)计算IC50值。实验重复三次。
6统计分析
3次独立计算的IC50进行统计,用均数土标准差(S.D)表示。
7实验结果见表1。
表1：样品对四种细胞株的细胞毒性(IC50/μM)
Figure BDA0003108353100000121
Dox(Adr)：Doxorubicin，多柔比星
CCK8筛选实验
1目的：测试样品对种人血液病细胞株的IC50
2主要仪器：酶标仪(VERSA max microplate reader,MD,USA)
3细胞系：人血液病细胞：K562
4药液与试剂配制
1)化合物：10mM储备液，分装，-20℃储存备用，化合物取自上述实施例制备得到的6个化合物OA-1,3C-TPP、OA-1,4C-TPP、OA-1,5C-TPP、OA-3C-TPP、OA-4C-TPP和OA-5C-TPP。
2)阳性对照：多柔比星用细胞级DMSO溶解为10mM储备液，-20℃储存备用。
3)其他试剂：CCK8，DMSO(细胞培养级CAS-NO:67-68-5，Applichem,德国)；胎牛血清(Gibco，South America)；培养基(Hyclone,USA)；多柔比星(Doxorubicin，Sigma，美国)。
5实验方法:
细胞接种于96孔板，细胞密度为3-4×103/孔。置于5％CO2、37℃的细胞培养箱中培养，待细胞贴壁后，加入指定浓度的待测样品，阴性对照组为相同浓度的DMSO，同一浓度的药物设三个平行孔。加药培养48h后，每孔加入20μL CCK8，继续培养4h，用酶标仪在450nm下检测各孔的OD值，并用IC50软件(Prism 5.0)计算IC50值。实验重复三次。
6统计分析
3次独立计算的IC50进行统计,用均数土标准差(S.D)表示。
7实验结果见表2。
表2：样品对K562细胞株的细胞毒性(IC50/μM)
Figure BDA0003108353100000131
Gifitinib：吉非替尼
结果分析：
6个化合物从人乳腺癌细胞、人肺癌细胞、人肝癌细胞和人血液病细胞以及人正常肝细胞中评估了MTT细胞活性，分别以多柔比星和吉非替尼作为阳性对照物。IC50值(诱导50％细胞凋亡所需浓度)见表1、表2筛选结果。从筛选结果中可以看出6个衍生物IC50值均小于15Μm，即6个衍生物均具有优良抗肿瘤活性。对比两系列化合物，OA-1,n-TPP(n＝3,4,5)的抗肿瘤活性明显优于OA-nC-TPP(n＝3,4,5)，说明C-28羧基端引入酯基可以有效提高抗肿瘤活性；另外，注意到人肺癌细胞以及人血液病细胞的IC50值，OA-1,n-TPP系列抗肿瘤活性分别优于阳性对照物多柔比星和吉非替尼；6个化合物在正常肝细胞中的IC50值显著高于多柔比星得IC50值，说明获得的6个化合物在正常肝细胞中的细胞毒性小于多柔比星的细胞毒性，对于肿瘤细胞具有选择性。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，尽管参照前述实施例对本申请进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种齐墩果酸衍生物，其结构如式I或式II所示：
Figure FDA0003108353090000011
其中，n为2、3或4。
2.权利要求1所述的齐墩果酸衍生物的制备方法，其特征在于，所述方法包括：以齐墩果酸为原料，分别对其C-3位羟基和C-28位羧基进行修饰，包括将齐墩果酸与溴代烷
Figure FDA0003108353090000012
进行成酯反应生成化合物A，化合物A与溴代羧酸
Figure FDA0003108353090000013
反应生成化合物B，化合物B与三苯基膦进行成盐反应生成式I化合物，其中，n为2、3或4；
Figure FDA0003108353090000014
3.根据权利要求1所述的齐墩果酸衍生物的制备方法，其特征在于，所述方法包括：以齐墩果酸为原料，对其C-28位羧基进行修饰，包括将齐墩果酸与溴代烷
Figure FDA0003108353090000015
进行成酯反应生成化合物C，化合物C与三苯基膦进行成盐反应生成式II化合物，其中，n为2、3或4；
Figure FDA0003108353090000016
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，化合物B或化合物C与三苯基膦的1:3-1:5；
优选地，所述方法中，采用TLC监测化合物A、化合物B、化合物C、式I、式II化合的反应进程，并采用正己烷/乙酸乙酯为展开剂；
优选地，展开剂正己烷与乙酸乙酯的比例为20:1、10:1、8:1、6:1、4:1、2:1。
5.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述方法还包括产物的分离，分离采用硅胶柱色谱分离法或淋洗法；
其中，所述硅胶柱色谱分离法包括先使用乙酸乙酯进行洗脱然后以二氯甲烷/甲醇进行洗脱，即可得到纯净产物；
所述淋洗法包括：将旋干除去溶剂后，将沉淀物用热的正己烷或者石油醚淋洗，淋洗后将固体溶于乙酸乙酯中，再加入石油醚或者正己烷将固体析出，最后用乙醚洗涤、干燥即得纯净产物。
6.一种药物组合物，其特征在于，其包括权利要求1所述的齐墩果酸衍生物。
7.一种药物制剂，其特征在于，其包括权利要求1所述的齐墩果酸衍生物和至少一种药学上可接受的辅料或载体。
8.权利要求1所述的齐墩果酸衍生物或权利要求6所述的药物组合物或权利要求7所述的药物制剂在制备抗癌药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述癌症选自乳腺癌、肺癌、肝癌、血液癌。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述血液癌为慢性粒细胞白血病。
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