CN113372342B - 蛋白降解靶向嵌合体及其应用 - Google Patents

蛋白降解靶向嵌合体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了具有通式(I)所示结构的蛋白降解靶向嵌合体及其应用。本发明提供的蛋白降解靶向嵌合体可有效抑制Bcr‑Abl以及Bcr‑AblT315I突变体的激酶活性，可以抑制肿瘤细胞中Bcr‑AblT315I的表达，具有降解Bcr‑AblT315I的功能，对携带Bcr‑Abl或者Bcr‑AblT315I的肿瘤细胞都具有较好的抗增殖作用，可作为抗肿瘤治疗的潜在药物。
Figure DDA0002406266340000011

Description

蛋白降解靶向嵌合体及其应用
技术领域
本发明涉及化学医药技术领域，具体涉及一种蛋白降解靶向嵌合体及其应用。
背景技术
肿瘤是目前人类健康和生命的头号杀手，发病率呈快速上升趋势。近年来，虽有一些新型的酪氨酸蛋白抑制剂等靶向新药的开发上市，但仍远远无法满足日益增长的临床癌症病人的需要。抗肿瘤药物研发也仍是目前药物研发界的重要研究方向。截止2019年10月，已有52个小分子蛋白酪氨酸激酶被FDA批准上市，并取得了较好的肿瘤治疗效果。
Bcr-Abl小分子抑制剂imatinib是第一个在了解癌症的病因后合理设计开发，并取得了显著成效的肿瘤治疗药物，证实了蛋白酪氨酸激酶是关键性的治疗靶点，它的成功是癌症治疗的一个里程碑。但由Bcr-Abl突变诱发的临床耐药已成为当今肿瘤医学的重要问题。第二代药物nilotinib和dasatinib仅能克服部分基因突变引起的耐药，但对Bcr-AblT315I这一发生率最高的耐药突变无效。2012年12月，克服Bcr-AblT315I耐药的ponatinib才在美国批准上市，但其对Bcr-AblE255K/V等P-Loop区突变的效果不佳。同时，由于该药物可以诱发在病人的循环系统中形成致命性血栓，美国FDA于2013年10月要求该药暂停销售。由于临床无有效针对Bcr-AblT315I突变的有效治疗药物，ponatinib恢复在临床使用，但被黑框警告。因此，全新的可有效克服Bcr-AblT315I抑制剂的研究具有重要的临床意义和科学价值。
研究表明，Bcr-Abl发生T315I突变后，315位异亮氨酸(Ile315)无法与imatinib形成一个重要的氢键；同时，Ile315中空间较大的异丁基残基可以阻碍imatinib进入蛋白的一个疏水性后口袋，从而引发耐药。因此，Ile315是设计新型Bcr-AblT315I抑制剂时的需要重点关注的一个关键氨基酸。基于315位氨基酸突变前后的空间变化，基于合理药物设计策略获得一类杂环炔类Bcr-ABlT315I小分子抑制剂(J.Med.Chem.2013,56,879-894)。代表化合物GZD824已进入中国II期临床研究。然而，靶向激酶的小分子抑制剂无法避免再次发生继发性突变，导致临床耐药，进而影响药效。因此，研究具备降解Bcr-AblT315I功能的抑制剂具有重要临床意义。
发明内容
基于此，本发明提供了一种蛋白降解靶向嵌合体，能够有效抑制Bcr-Abl以及Bcr-AblT315I突变体的激酶活性，可以抑制肿瘤细胞中Bcr-AblT315I的表达，具有降解Bcr-AblT315I的功能，对携带Bcr-Abl或者Bcr-AblT315I的肿瘤细胞都具有较好的抗增殖作用。
具技术方案如下：
具有式(Ⅰ)所示结构的蛋白降解靶向嵌合体或者其药学上可接受的盐或者其立体异构体或者其前药分子：
Figure BDA0002406266320000021
其中：
L选自：
Figure BDA0002406266320000022
或者
Figure BDA0002406266320000023
A为E3连接酶的配体；
n、m为正整数。
在其中一些实施例中，A选自：CRBN配体、VHL配体、ClAP配体、或者金刚烷胺疏水性标签分子。
在其中一些实施例中，A为CRBN配体。
在其中一些实施例中，A选自：
Figure BDA0002406266320000024
Figure BDA0002406266320000025
或者
Figure BDA0002406266320000026
在其中一些实施例中，A选自：
Figure BDA0002406266320000031
或者
Figure BDA0002406266320000032
在其中一些实施例中，A为
Figure BDA0002406266320000033
在其中一些实施例中，n选自1-15之间的正整数；m选自1-7之间的正整数。
在其中一些实施例中，n选自：4、6或8；m选自：2或3。
在其中一些实施例中，L选自：
Figure BDA0002406266320000034
或者
Figure BDA0002406266320000035
本发明还提供了上述的蛋白降解靶向嵌合体或者其药学上可接受的盐或者其立体异构体或者其前药分子的应用。
具体技术方案如下：
上述的蛋白降解靶向嵌合体或者其药学上可接受的盐或者其立体异构体或者其前药分子在制备Bcr-Abl抑制剂中的应用。
上述的蛋白降解靶向嵌合体或者其药学上可接受的盐或者其立体异构体或者其前药分子在制备Bcr-AblT315I抑制剂中的应用。
上述的蛋白降解靶向嵌合体或者其药学上可接受的盐或者其立体异构体或者其前药分子在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
在其中一些实施例中，所述肿瘤为携带Bcr-AblT315I基因突变的肿瘤。
在其中一些实施例中，所述肿瘤为：白血病、胃肠间质瘤和/或肝癌。
本发明还提供了一种预防和/或治疗肿瘤的药用组合物。
具体技术方案如下：
一种预防和/或治疗肿瘤的药物组合物，包括活性成分以及药学上可接受的载体，所述活性成分包括有上述的蛋白降解靶向嵌合体或者其药学上可接受的盐或者其立体异构体或者其前药分子。
本发明根据蛋白降解靶向嵌合体(Proteolysis targeting chimaera,PROTAC)技术，将Bcr-Abl蛋白配体和E3连接酶的配体(E3 Ligase)用L连接起来合成杂双功能化合物，从而可以将Bcr-Abl蛋白招募到细胞内一个叫做泛素/蛋白酶体(UPS)的蛋白降解系统，E3泛素连接酶通过这种小分子化合物与目标结合后，可以启动强大的泛素水解过程，利用人体本身的蛋白质降解机制选择性地降解Bcr-Abl蛋白，从而达到抑制该蛋白活性的作用。本发明的化合物跟传统的小分子Bcr-Abl抑制剂相比，与靶蛋白具有更大的结合空间，在催化剂量下即可诱导靶蛋白降解，全面拮抗Bcr-Abl的生物学功能。
本发明提供的化合物可有效抑制Bcr-Abl以及Bcr-AblT315I突变体的激酶活性，可以抑制肿瘤细胞中Bcr-AblT315I的表达，具有降解Bcr-AblT315I的功能，对携带Bcr-Abl或者Bcr-AblT315I的肿瘤细胞都具有较好的抗增殖作用，可作为抗肿瘤治疗的潜在药物。
附图说明
图1为实施例中化合物对Ba-F3 Bcr-AblT315I细胞中Bcr-AblT315I的降解作用图。
具体实施方式
本发明所述化合物中，当任何变量(例如A等)在任何组分中出现超过一次，则其每次出现的定义独立于其它每次出现的定义。同样，允许取代基及变量的组合，只要这种组合使化合物稳定。自取代基划入环系统的线表示所指的键可连接到任何能取代的环原子上。如果环系统为多环，其意味着这种键仅连接到邻近环的任何适当的碳原子上。要理解本领域普通技术人员可选择本发明化合物的取代基及取代型式而提供化学上稳定的并可通过本领域技术和下列提出的方法自可容易获得的原料容易的合成的化合物。如果取代基自身被超过一个基团取代，应理解这些基团可在相同碳原子上或不同碳原子上，只要使结构稳定。
本发明包括式Ⅰ化合物的游离形式，也包括其药学上可接受的盐及立体异构体。本文中一些特定的示例性化合物为胺类化合物的质子化了的盐。术语“游离形式”指以非盐形式的胺类化合物。包括在内的药学上可接受盐不仅包括本文所述特定化合物的示例性盐，也包括所有式Ⅰ化合物游离形式的典型的药学上可接受的盐。可使用本领域已知技术分离所述化合物特定盐的游离形式。例如，可通过用适当的碱稀水溶液例如NaOH稀水溶液、碳酸钾稀水溶液、稀氨水及碳酸氢钠稀水溶液处理该盐使游离形式再生。游离形式在某些物理性质例如在极性溶剂中溶解度上与其各自盐形式多少有些区别，但是为发明的目的这种酸盐及碱盐在其它药学方面与其各自游离形式相当。
可通过常规化学方法自含有碱性部分或酸性部分的本发明化合物合成本发明的药学上可接受的盐。通常，通过离子交换色谱或通过游离碱和化学计算量或过量的所需盐形式的无机或有机酸在适当溶剂或多种溶剂的组合中反应制备碱性化合物的盐。类似的，通过和适当的无机或有机碱反应形成酸性化合物的盐。
因此，本发明化合物的药学上可接受的盐包括通过碱性本发明化合物和无机或有机酸反应形成的本发明化合物的常规无毒盐。例如，常规的无毒盐包括得自无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等的盐，也包括自有机酸例如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、扑酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、对氨基苯磺酸、2-乙酰氧基-苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、草酸、羟乙基磺酸、三氟乙酸等制备的盐。
如果本发明化合物为酸性的，则适当的“药学上可接受的盐”指通过药学上可接受的无毒碱包括无机碱及有机碱制备的盐.得自无机碱的盐包括铝盐、铵盐、钙盐、铜盐、铁盐、亚铁盐、锂盐、镁盐、锰盐、亚锰盐、钾盐、钠盐、锌盐等。特别优选铵盐、钙盐、镁盐、钾盐和钠盐。得自药学上可接受的有机无毒碱的盐，所述碱包括伯胺、仲胺和叔胺的盐，取代的胺包括天然存在的取代胺、环状胺及碱性离子交换树脂例如精氨酸、甜菜碱、咖啡因、胆碱、N,N'-二苄基乙二胺、二乙胺、2-二乙基氨基乙醇、2-二甲基氨基乙醇、氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-乙基吗啉、N-乙基哌啶、葡萄糖胺、氨基葡萄糖、组氨酸、羟钴胺、异丙基胺、赖氨酸、甲基葡萄糖胺、吗啉、哌嗪,哌啶、呱咤、多胺树脂、普鲁卡因、嘌呤、可可碱、三乙胺、三甲胺、三丙胺、氨基丁三醇等。
Berg等，“Pharmaceutical Salts，”J.Pharm.Sci.’1977：66：1－19更详细描述了上文所述药学上可接受的盐及其它典型的药学上可接受的盐的制备。
由于在生理条件下化合物中脱质子化的酸性部分例如羧基可为阴离子的，而这种带有的电荷然后可被内部带有阳离子的质子化了的或烷基化的碱性部分例如四价氮原子平衡抵消，所以应注意本发明化合物是潜在的内盐或两性离子。
在一个实施方案中，本申请提供了一种利用具有式Ⅰ的化合物及其药学可接受的盐治疗人或其它哺乳动物肿瘤等过渡增殖性疾病或症状。
在一个实施方案中，本申请的化合物及其药学可接受的盐可以用于治疗或控制白血病、胃肠间质瘤和肝癌。
药物代谢物及前药：本申请所涉及的化合物及其药学可接受的盐的代谢产物，以及可以在体内转变为本申请所涉及的化合物及其药学可接受的盐的结构的前药，也包含在本申请的权利要求中。
联合用药：式Ⅰ化合物可以与已知的治疗或改进相似病状的其它药物联用。联合给药时，原来药物的给药方式&剂量保持不变，而同时或随后服用式Ⅰ化合物。当式Ⅰ化合物与其它一种或几种药物同时服用时，优选使用同时含有一种或几种已知药物和式I化合物的药用组合物。药物联用也包括在重叠的时间段服用式Ⅰ化合物与其它一种或几种已知药物。当式Ⅰ化合物与其它一种或几种药物进行药物联用时，式Ⅰ化合物或已知药物的剂量可能比它们单独用药时的剂量较低。
以下为具体实施例：
以下实施例中所用试剂与原料如无特别说明，均可市售可得，试剂的英文简称对应的中文含义如下：
NBS：N-溴代丁二酰亚胺；AIBN：偶氮二异丁腈；DCM：二氯甲烷；PE：石油醚；EA：乙酸乙酯；TMSA：三甲基硅基乙炔；DMF：N,N-二甲基甲酰胺；PMBCl：对甲氧基苯甲基氯；THF：四氢呋喃；TFA：三氟乙酸；HATU：2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯；DIEA：N,N-二异丙基乙胺；TsCl：4-甲苯磺酰氯。
实施例1：3-((1-(4-甲氧基苄基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)乙炔基)-4-甲基-N-(4-(哌嗪-1-基甲基)-3-(三氟甲基)苯基)苯甲酰胺(化合物8)的制备
Figure BDA0002406266320000061
步骤a：1-(溴甲基)-4-硝基-2-(三氟甲基)苯(化合物1)的制备
Figure BDA0002406266320000071
向1-甲基-4-硝基-2-(三氟甲基)苯(30g，146.3mmol，1equiv)的1,2-二氯乙烷溶液中添加NBS(31.2g，175.5mmol，1.2equiv)和AIBN(2.4g，14.63mmol，0.1equiv)。将反应混合物在90℃加热反应过夜。冷却后，向混合物中加入水，分离有机层，水层用DCM萃取。合并有机层后再用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。除去溶剂后，将残余物在硅胶上进行快速色谱纯化(PE:EA＝50:1)，得到浅黄色油状物(6.1g,68％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.54(dd,J＝8.5,2.5Hz,1H),8.42(d,J＝2.4Hz,1H),8.05(d,J＝8.5Hz,1H),4.88(s,2H).
步骤b：1-环丙基甲基-4-(4-硝基-2-三氟甲基-苄基)-哌嗪(化合物2)的制备
Figure BDA0002406266320000072
向化合物1(20g，70.4mmol，1equiv)的无水CH2Cl2(300mL)和Et3N(10.8g，105.7mmol，1.5equiv)的溶液中加入叔丁基哌嗪-1-羧酸盐(14.5g，77.5mmol，1.1equiv)。将反应物在室温搅拌5小时，然后加入饱和NaHCO3溶液，并将混合物用EtOAc(2×300mL)萃取。将有机相用饱和食盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥并在真空下蒸发，将残余物在硅胶上进行快速色谱纯化(PE:EA＝5:1)，得到产物黄色油状物(21.5g,78％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.51(dd,J＝8.6,2.4Hz,1H),8.41(d,J＝2.3Hz,1H),8.11(d,J＝8.6Hz,1H),3.75(s,2H),3.35(t,J＝4.8Hz,4H),2.38(t,J＝5.0Hz,4H),1.39(s,9H).
步骤c：4-(4-氨基-2-(三氟甲基)苄基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(化合物3)的制备
Figure BDA0002406266320000073
向化合物2(20g，55.5mmol，1equiv)的EtOH(120mL)和H2O(60mL)的混合溶液中加入Fe粉(15.4g，277.5mmol，5equiv)和NH4Cl(8.8g，165.9mmol，3equiv)。将反应物在80℃下加热10h，然后在室温下冷却，并通过硅藻土过滤，用EtOH洗涤。真空蒸发溶液，残余物用EtOA(200mL)溶解，并用NaHCO3饱和溶液洗涤。将有机相用饱和食盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥并在真空下蒸发，将残余物在硅胶上进行快速色谱纯化(PE:EA＝5:1)，得到黄色产物(12.7g，63.6％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.30(d,J＝8.3Hz,1H),6.86(d,J＝2.3Hz,1H),6.75(dd,J＝8.4,2.3Hz,1H),5.45(s,2H),3.40(s,2H),3.29(t,J＝4.9Hz,4H),2.27(t,J＝5.0Hz,4H),1.38(s,9H).
步骤d：3-乙炔基-4-甲基苯甲酸甲酯(化合物4)的制备
Figure BDA0002406266320000081
向3-碘-4-甲基苯甲酸甲酯(25g，100mmol，1equiv)的MeCN(300mL)溶液中添加Pd(PPh3)2Cl2(0.7g，1mmol,0.01equiv)，CuI(0.17g，1mmol，0.01equiv)和Et3N(64.6g，633mmol，6.33equiv)，并在混合物用氩气置换三次后将TMSA(49.1g，500mmol,5equiv)注射到反应混合物中。反应混合物在氩气保护下于室温搅拌过夜。通过硅藻土垫过滤反应混合物，并在真空下浓缩。将残余物重新溶解在MeOH(200mL)中，并加入K2CO3(37.5g，271.5mmol，3equiv)。将混合物在室温下搅拌1小时。通过硅藻土垫过滤反应混合物，并在真空下浓缩。得到的残余物通过硅胶柱纯化(PE:EA＝50:1)，得到白色固体(13g,83％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.94(d,J＝1.7Hz,1H),7.86(dd,J＝8.0,1.9Hz,1H),7.45(d,J＝8.0Hz,1H),4.51(s,1H),3.84(s,3H),2.45(s,3H).
步骤e：1-(4-甲氧基苄基)-5-溴-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶(化合物5)的制备
Figure BDA0002406266320000082
在0℃向化合物5-溴-1H-吡唑并[3，4-b]吡啶(15g，75.8mmol，1equiv)的干燥DMF(180mL)溶液中加入分批加入NaOH(4.6g，113.6mmol,1.5equiv)。添加后，将所得混合物在0℃下搅拌1h。然后在0℃下逐滴加入PMBCl(35.8g，227.4mmol，3equiv)。将所得混合物在室温搅拌过夜。将反应混合物倒入H2O(200mL)中，并用EtOAc(300mL×2)萃取。合并的有机层用H2O(300mL×2)和饱和NaCl水溶液(300mL)洗涤，经Na2SO4干燥并真空浓缩。通过柱色谱硅胶(PE:EA＝5:1)纯化得到黄色固体(7.7g,32％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.66(d,J＝2.2Hz,1H),8.55(d,J＝2.1Hz,1H),8.16(s,1H),7.22(d,J＝8.6Hz,2H),6.86(d,J＝8.6Hz,2H),5.59(s,2H),3.69(s,3H).
步骤f：3-((1-(4-甲氧基苄基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶基-5-基)乙炔基)-4-甲基苯甲酸甲酯(化合物6)的制备
Figure BDA0002406266320000091
化合物4(10.4g，58.2mmol，1equiv)，化合物5(15.4g，48.4mmol，0.82equiv)，CuI(1.1g，5.8mmol，0.1equiv)，Pd(PPh3)2Cl2(2.2g，2.9mmol，0.05equiv)的混合物添加到两颈瓶中。抽空两颈瓶并用氩气回充3次。在室温下通过注射器加入CH3CN(300mL)和Et3N(34.2g，338mmol，5.8equiv)。在82℃下搅拌约20h后，将反应混合物过滤并浓缩。残余物通过硅胶快速柱色谱纯化(PE:EA＝8:1)，得到黄色固体产物(13.5g,56.4％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.80(d,J＝1.9Hz,1H),8.54(d,J＝2.0Hz,1H),8.24(s,1H),8.07(d,J＝1.8Hz,1H),7.88(dd,J＝7.9,1.9Hz,1H),7.50(d,J＝8.0Hz,1H),7.24(d,J＝8.6Hz,2H),6.87(d,J＝8.6Hz,2H),5.62(s,2H),3.86(s,3H),3.70(s,3H),2.57(s,3H).
步骤g：叔丁基4-(4-(3-((1-(4-甲氧基苄基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶基-5-基)乙炔基)-4-甲基苯甲酰胺基)-2-(三氟甲基)哌嗪-1-羧酸苄酯(化合物7)的制备
Figure BDA0002406266320000092
向化合物3(7g，19.4mmol，1equiv)和化合物6(8g，19.4mmol，1equiv)的无水THF(200.0mL)溶液中加入叔丁醇钾(13.1g，116.4mmol，6equiv),反应混合物在-20℃下搅拌1小时。然后将反应混合物缓慢温热至室温，并再搅拌3小时。通过TLC显示反应完成后，将混合物在搅拌下倒入1L水中，然后静置过夜。过滤沉淀的棕色固体，并在减压下干燥。残余物通过硅胶快速柱色谱法纯化(DCM:CH3OH＝100:1)，得到白色固体(6g,41.8％)。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.70(d,J＝1.9Hz,1H),8.19(d,J＝1.9Hz,1H),8.14(s,1H),8.03(s,1H),8.01(d,J＝2.0Hz,1H),7.91–7.89(m,1H),7.88(s,1H),7.78(dd,J＝7.9,2.0Hz,2H),7.37(d,J＝8.1Hz,1H),7.33(d,J＝8.6Hz,2H),6.83(d,J＝8.6Hz,2H),5.65(s,2H),3.76(s,3H),3.63(s,2H),3.43(t,J＝5.0Hz,4H),2.59(s,3H),2.41(t,J＝5.1Hz,4H),1.46(s,9H).
步骤h：3-((1-(4-甲氧基苄基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)乙炔基)-4-甲基-N-(4-(哌嗪-1-基甲基)-3-(三氟甲基)苯基)苯甲酰胺(化合物8)的制备
Figure BDA0002406266320000101
0℃，向化合物7(6g，8.1mmol)的CH2Cl2(60mL)溶液中加入TFA(20mL)。1小时原料消耗完后(通过TLC监测)，将混合物蒸发，然后加入饱和NaHCO3水溶液。将水层用CH2Cl2(100mL)萃取两次，并将有机层用盐水洗涤，并用无水Na2SO4干燥。真空除去溶剂。残余物通过硅胶快速柱色谱纯化(DCM:CH3OH＝15:1)，得到黄色固体(4.6g,88％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.59(s,1H),8.79(d,J＝1.9Hz,1H),8.53(d,J＝1.9Hz,1H),8.24(s,1H),8.22(d,J＝2.2Hz,1H),8.19(d,J＝1.9Hz,1H),8.09(dd,J＝8.6,2.2Hz,1H),7.93(dd,J＝8.0,2.0Hz,1H),7.72(d,J＝8.5Hz,1H),7.51(d,J＝8.1Hz,1H),7.24(d,J＝8.6Hz,2H),6.86(d,J＝8.6Hz,2H),5.62(s,2H),3.69(s,3H),3.56(s,2H),2.84(t,J＝5.0Hz,4H),2.57(s,3H),2.40(s,4H).
实施例2：化合物11和12的制备
Figure BDA0002406266320000111
步骤i：叔丁基3-(2-(2-(4-(4-(3-((1-(4-甲氧基苄基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶基-5-基)乙炔基)-4-甲基苯甲酰胺基)-2-(三氟甲基)苄基)哌嗪-1-基)乙氧基)乙氧基)丙酸酯(化合物9)的制备
Figure BDA0002406266320000112
向化合物8(400mg，0.62mmol，1equiv)和3-(2-(2-(甲苯磺酰氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸叔丁酯(316mg，0.82mmol，1.3equiv)的乙腈(30ml)溶液中加入无水碳酸钾(173mg，1.25mmol，2equiv)，并将混合物在回流温度下磁力搅拌10小时。反应结束后，抽滤，并用CH2Cl2(2×25mL)洗涤，将滤液真空蒸发并将残余物减压蒸馏，将残余物通过硅胶快速柱色谱法纯化(DCM:CH3OH＝15:1)得到白色固体产物(270mg,51％)。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.67(d,J＝1.9Hz,1H),8.40(s,1H),8.15(d,J＝1.9Hz,1H),8.02–7.99(m,2H),7.90(dd,J＝8.4,2.3Hz,1H),7.86(d,J＝2.2Hz,1H),7.77(dd,J＝8.0,2.0Hz,1H),7.73(d,J＝8.4Hz,1H),7.33(d,J＝8.1Hz,1H),7.31(d,J＝8.6Hz,2H),6.81(d,J＝8.6Hz,2H),5.62(s,2H),3.74(s,3H),3.68(t,J＝6.6Hz,2H),3.61–3.57(m,8H),2.60–2.54(m,6H),2.51–2.44(m,6H),1.42(s,9H).
步骤j：3-(2-(2-(4-(4-(3-(((1H-吡唑并[3,4-b]吡啶基-5-基]乙炔基)-4-甲基苯甲酰胺基)-2-(三氟甲基)苄基哌嗪-1-基)乙氧基乙氧基丙酸(化合物10)的制备
Figure BDA0002406266320000121
化合物9(260mg，0.3mmol)溶解在纯的TFA(10mL)中，并将反应混合物在70℃搅拌5小时，然后将反应混合物浓缩成油状，将粗产物在EtOAc和饱和NaHCO3之间分配。分离各相，并用EtOAc(1×)再次萃取水层。合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤并浓缩，得到所需的固体产物，不经纯化直接投入下一步使用(产率合并计算)。
步骤k：3-((1H-吡唑并[3,4-b]吡啶基-5-基)乙炔基)-N-(4-((4-(2-(2-(3-((((2S)-1-)((2R，4S)-4-羟基-2-(((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨基甲酰基)环戊基)-3,3-二甲基-1-氧丁烷-2-基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙氧基)乙基)哌嗪-1-基)甲基)-3-(三氟甲基)苯基)-4-甲基苯甲酰胺(化合物11)的制备
Figure BDA0002406266320000122
向化合物10(50mg，0.073mmol，1equiv)的DMF(5mL)溶液中加入HATU(55mg，0.15mmol，2equiv)，并将所得溶液在室温下搅拌10分钟，然后将VHL配体(66mg，0.15mmol，2.1equiv)和DIEA(66mg，0.52mmol，7equiv)分别加入。将所得混合物在室温下搅拌10小时。将产物用EA萃取两次，然后将残余物通过硅胶快速柱色谱法纯化(DCM:CH3OH＝10:1)，得到白色固体(25mg,31％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.57(s,1H),8.97(s,1H),8.73(d,J＝2.0Hz,1H),8.57(t,J＝6.1Hz,1H),8.52(d,J＝2.0Hz,1H),8.22(s,1H),8.21(s,1H)8.19(d,J＝1.9Hz,1H),8.07(dd,J＝8.4,2.2Hz,1H),7.95–7.93(m,1H),7.92–7.90(m,1H),7.71(d,J＝8.5Hz,1H),7.53(d,J＝8.2Hz,1H),7.43–7.35(m,4H),5.15(s,1H),4.55(d,J＝9.4Hz,1H),4.48–4.37(m,2H),4.34(s,1H),4.21(dd,J＝15.9,5.5Hz,1H),3.70–3.52(m,6H),3.51–3.42(m,6H),2.59(s,3H),2.55(d,J＝7.6Hz,1H),2.47–2.29(m,13H),2.07–1.96(m,1H),1.93–1.85(m,1H),1.23(s,2H),0.93(s,9H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ172.41,170.45,169.99,165.19,151.90,151.51,148.16,144.20,139.94,138.65,133.51,132.62,131.69,131.62,131.00,130.44,130.09,129.09,127.87,123.96,122.64,114.49,112.25,92.38,88.76,70.07,69.90,69.34,67.38,59.18,56.84,56.77,53.46,42.11,38.40,36.12,35.83,26.78,20.92,16.39.HRMS(ESI)calcd for C57H65N10O7F3S[M+H]+,1091.4883；found,1091.4777.HPLC purity＝99.39％,Rt 11.05min。
步骤l：3-((1H-吡唑并[3,4-b]吡啶基-5-基)乙炔基)-N-(4-((4-(2-(2-(3-(金刚烷-1-基氨基)-3-氧代丙氧基)乙氧基)乙基)哌嗪-1-基)甲基)-3-(三氟甲基)苯基)-4-甲基苯甲酰胺(化合物12)的制备
Figure BDA0002406266320000131
向化合物10(50mg，0.073mmol，1equiv)的DMF(5mL)溶液中加入HATU(55mg，0.15mmol，2equiv)，并将所得溶液在室温下搅拌10分钟之后，分别添加金刚烷-1-胺(23mg，0.15mmol，2.1equiv)和DIEA(66mg，0.52mmol，7equiv)。反应液在室温下于室温搅拌10小时。结束后，将反应液用EA萃取两次，残余物通过硅胶快速柱色谱法纯化(DCM:CH3OH＝20:1)，得到白色固体化合物(13mg,22％)。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.75(d,J＝2.1Hz,1H),8.60(s,1H),8.17(d,J＝2.1Hz,1H),8.06(s,1H),8.05(d,J＝2.0Hz,1H),7.95(d,J＝2.2Hz,1H),7.92(d,J＝2.2Hz,1H),7.80(dd,J＝8.0,2.0Hz,1H),7.74(d,J＝8.4Hz,1H),7.34(d,J＝8.0Hz,1H),6.00(s,1H),3.66(t,J＝5.8Hz,2H),3.62–3.59(m,3H),3.59–3.56(m,5H),2.61–2.55(m,6H),2.55–2.41(m,6H),2.34(t,J＝5.8Hz,2H),2.09–2.00(m,4H),1.98–1.94(m,6H),1.66–1.62(m,6H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ170.65,165.34,156.57,153.19,144.22,137.03,133.37,132.55,132.25,131.27,130.49,130.01,129.24,128.94,127.43,125.48,123.46,123.28,119.68,113.22,112.76,92.43,88.65,70.34,70.18,68.73,67.62,61.44,57.81,53.71,52.93,51.68,41.57,38.15,36.38,29.92,29.41,20.91.HRMS(ESI)calcd for C49H60N7O4F3[M+H]+,812.4106；found 812.4112.HPLCpurity＝99.56％,Rt 12.00min.
实施例3：化合物19的制备
Figure BDA0002406266320000141
步骤m：(乙烷-1,2-二基双(氧基))双(乙烷-2,1-二基)双(4-甲基苯磺酸盐)(化合物13)的制备
Figure BDA0002406266320000142
向2,2'-(乙烷-1,2-二基双(氧基))双(乙烷-1-醇)(8g，53.2mmol，1equiv)和TsCl(30g，159.8mmol，3equiv)的DCM(300mL)溶液中加入Et3N(1.62g，159.8mmol，3equiv)。将反应混合物在室温搅拌12h，并用水洗涤。有机相经无水Na2SO4干燥。除去溶剂后，残余物通过快速柱色谱法纯化(PE:EA＝2:1)，得到白色固体产物(9.17g,79％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.80–7.74(m,4H),7.50–7.43(m,4H),4.12–4.05(m,4H),3.57–3.50(m,4H),3.37(s,4H),2.40(s,6H).
步骤n：4-甲基苯磺酸2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙基(化合物14)的制备
Figure BDA0002406266320000151
将化合物13(1.5g，3.2mmol，1equiv)和NaN3(106mg，1.6mmol，0.5equiv)的混合物在DMF(30mL)溶液中室温搅拌24小时。用水洗涤反应混合物，有机相用无水Na2SO4干燥。除去溶剂后，将残余物通过快速柱色谱法纯化(PE:EA＝3:1)，得到浅黄色油状的产物(586mg，40％)。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.80(d,J＝8.3Hz,2H),7.35(d,J＝7.9Hz,2H),4.19–4.14(m,2H),3.72–3.69(m,2H),3.66–3.62(m,2H),3.60(s,4H),3.37(t,J＝5.0Hz,2H),2.45(s,3H).
步骤o：3-((1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)乙炔基)-N-(4-((4-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙基)哌嗪-1-基)甲基)-3-(三氟甲基)苯基)-4-甲基苯甲酰胺(化合物15)的制备
Figure BDA0002406266320000152
向化合物8(400mg，0.62mmol，1equiv)和化合物14(275mg，0.82mmol，1.3equiv)的乙腈(30ml)溶液中加入无水碳酸钾(173mg，1.25mmol，2equiv)，并将混合物在回流温度下反应10小时。反应结束后，抽滤，并用二氯甲烷(2×25ml)洗涤，将滤液真空蒸发并将残余物减压蒸馏，将残余物通过硅胶快速柱色谱法纯化(DCM:CH3OH＝20:1)得到白色固体(300mg,61％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.56(s,1H),8.80(d,J＝1.9Hz,1H),8.56(d,J＝2.0Hz,1H),8.25(s,1H),8.22(d,J＝2.2Hz,1H),8.19(d,J＝1.9Hz,1H),8.07(dd,J＝8.5,2.2Hz,1H),7.93(dd,J＝7.9,2.0Hz,1H),7.71(d,J＝8.6Hz,1H),7.53(d,J＝8.2Hz,1H),7.25(d,J＝8.8Hz,2H),6.87(d,J＝8.8Hz,2H),5.63(s,2H),3.70(s,3H),3.59(t,J＝4.8Hz,2H),3.57–3.53(m,4H),3.53–3.47(m,4H),3.38(t,J＝5.2Hz,2H),2.58(s,3H),2.48–2.21(m,10H).
步骤p：3-((1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)乙炔基)-N-(4-((4-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙基)哌嗪-1-基)甲基)-3-(三氟甲基)苯基)-4-甲基苯甲酰胺(化合物16)的制备
Figure BDA0002406266320000161
化合物15(300mg，0.37mmol，1equiv)溶于纯TFA(10mL)中，并将反应混合物在70℃下搅拌5h。随后浓缩成油状，将粗产物在EtOAc和饱和NaHCO3之间分配。分离各相，并用EtOAc再次萃取水层。合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤并浓缩，残余物通过硅胶快速柱色谱法纯化(DCM:CH3OH＝20:1)，得到白色固体产物(200mg,79％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.97(s,1H),10.57(s,1H),8.75(d,J＝2.0Hz,1H),8.55(d,J＝2.0Hz,1H),8.24(s,1H),8.22(d,J＝2.2Hz,1H),8.20(d,J＝2.0Hz,1H),8.08(dd,J＝8.6,2.2Hz,1H),7.93(dd,J＝8.0,2.0Hz,1H),7.72(d,J＝8.5Hz,1H),7.54(d,J＝8.1Hz,1H),3.60(t,J＝4.8Hz,2H),3.58–3.54(m,4H),3.53–3.47(m,4H),3.39(t,J＝4.8Hz,2H),2.60(s,3H),2.49–2.26(m,10H).
步骤q：3-((1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)乙炔基)-N-(4-((4-(2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)哌嗪-1-基)甲基)-3-(三氟甲基)苯基)-4-甲基苯甲酰胺(化合物17)的制备
Figure BDA0002406266320000162
向化合物16(118mg，0.175mmol，1equiv)的10mLTHF中加入1mLH2O和PPh3(140mg，0.53mmol，3equiv)。将所得溶液在室温搅拌过夜，真空浓缩，残余物通过硅胶快速柱色谱纯化(DCM:CH3OH＝10:1)，得到白色固体(58mg,51％)。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.66(d,J＝1.9Hz,1H),8.57(s,1H),8.20(d,J＝1.9Hz,1H),8.11(s,1H),8.02(d,J＝2.0Hz,1H),7.91(d,J＝9.6Hz,2H),7.78(dd,J＝8.0,2.0Hz,1H),7.73(d,J＝8.3Hz,1H),7.32(d,J＝8.1Hz,1H),3.64–3.54(m,8H),3.51(t,J＝5.2Hz,2H),2.87(t,J＝5.2Hz,2H),2.60(t,J＝5.8Hz,2H),2.57–2.39(m,11H).
步骤r：叔丁基((11S，14S，15R)-1-(4-(4-(3-(((1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基]乙炔基)-4-甲基苯甲酰胺基]-((三氟甲基)苄基)哌嗪-1-基)-14-羟基-11-异丁基-10,13-二氧杂-16-苯基-3,6-二氧杂-9,12-二氮杂十六烷-15-基)氨基甲酸酯(化合物18)的制备
Figure BDA0002406266320000171
向((2S，3R)-3-((叔丁氧基羰基)氨基)-2-羟基-4-苯基丁酰基)-L-亮氨酸的溶液(35mg，0.085mmol，1equiv)的DMF(5mL)溶液中加入HATU(65mg，0.17mmol，2equiv)，并将得到的溶液在室温搅拌10分钟，之后分别加入化合物17(116mg，0.18mmol，2.1equiv)和DIEA(77mg，0.59mmol，7equiv)。将所得混合物在室温下搅拌10小时。产物用EA萃取两次，并浓缩得到粗产物直接用于下步反应(粗产物31mg)。
步骤s：3-((1H-吡唑并[3,4-b]吡啶基-5-基)乙炔基)-N-(4-((4-((11S，14S，15R)-15-氨基-14-羟基-11-异丁基-10,13-二氧杂-16-苯基-3,6-二氧杂-9,12-二氮杂十六烷基)哌嗪-1-基)甲基)-3-(三氟甲基)苯基)-4-甲基苯甲酰胺(化合物19)的制备
Figure BDA0002406266320000172
向化合物18(25mg，0.024mmol)的CH2Cl2(6mL)溶液中，冷却至0℃，加入TFA(2mL)。1小时的原料消耗完后(通过TLC监测)，将混合物蒸发，加入饱和NaHCO3水溶液。将水层用CH2Cl2(30mL)萃取两次，并将有机层用盐水洗涤，无水Na2SO4干燥。真空除去溶剂。残余物通过硅胶快速柱色谱纯化(DCM:CH3OH＝15:1)，得到白色固体(13mg,57％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.56(s,1H),8.74(d,J＝2.1Hz,1H),8.53(d,J＝2.0Hz,1H),8.26(t,J＝5.6Hz,1H),8.23(s,1H),8.22(d,J＝2.2Hz,1H),8.20(d,J＝1.9Hz,1H),8.07(dd,J＝8.4,2.2Hz,1H),7.93(dd,J＝8.0,2.0Hz,1H),7.75–7.68(m,2H),7.53(d,J＝8.1Hz,1H),7.28(t,J＝7.4Hz,2H),7.24–7.14(m,3H),5.39–5.24(m,1H),4.34–4.24(m,1H),3.76(d,J＝2.8Hz,1H),3.56(s,2H),3.52–3.46(m,8H),3.22–3.08(m,4H),2.77(dd,J＝13.2,6.5Hz,1H),2.59(s,3H),2.48–2.27(m,10H),2.04–1.93(m,2H),1.64–1.52(m,1H),1.50–1.40(m,2H),0.88–0.78(m,6H).HRMS(ESI)calcd for C50H60N9O6F3[M+H]+,940.4691；found,1091.4675.HPLCpurity＝95.91％,Rt 12.33min。
实施例4：化合物23a-23h的制备
Figure BDA0002406266320000181
步骤t：3-溴-N-(2-(2,6-二氧杂哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基-丙酰胺(化合物20a)的制备
Figure BDA0002406266320000182
3-溴-N-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)丙酰胺(700mg，4.6mmol，1equiv)在SOCl2(10mL)的溶液中加热回流1小时后使反应混合物冷却至室温，减压浓缩得到3-溴丙酰氯(直接投下步使用)。将3-溴丙酰氯溶解在THF(30ml)中，然后向该混合物溶液中加入4-氨基-2-(2，6-二氧杂(3-哌啶基))异吲哚啉-1，3-二酮(1.05g，3.6mmol，0.8equiv)。所得悬浮液回流4小时。真空蒸发溶剂，并将所得固体通过快速色谱法(DCM:EA＝5:1)部分纯化，得到灰白色固体(826mg,44％)。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.46(s,1H),8.83(dd,J＝8.5,0.8Hz,1H),8.30(s,1H),7.73(dd,J＝8.5,7.3Hz,1H),7.58(dd,J＝7.4,0.8Hz,1H),5.00–4.90(m,1H),3.70(t,J＝6.5Hz,2H),3.06(t,J＝6.4Hz,2H),2.97–2.85(m,1H),2.84–2.73(m,2H),2.22–2.14(m,1H).
步骤u：N-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)-3-碘丙酰胺(化合物21a)的制备
Figure BDA0002406266320000183
向3-溴-N-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3二氧异吲哚-4-基)丙酰胺(300mg，0.73mmol，1equiv)的丙酮(20ml)溶液中加入NaI(1.35g，7.3mmol，10equiv)。将反应混合物在回流温度下搅拌5小时，然后在真空下除去溶剂，并将粗产物溶解于EtOAc(50mL)和Na2SO3水溶液(10％，30mL)中，分离有机层，用水(30mL)洗涤，经Na2SO4干燥并在真空下蒸发的粗产物，无需进一步纯化直接用于下一步反应。
步骤w：3-((1H-吡唑并[3,4-b]吡啶基-5-基)乙炔基)-N-(4-((4-(3-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚-4-基)氨基)-3-氧丙基)哌嗪-1-基)甲基)-3-(三氟甲基)苯基)-4-甲基苯甲酰胺(化合物23a)的制备
Figure BDA0002406266320000191
向化合物8(200mg，0.31mmol，1equiv)和化合物21a(186mg，0.41mmol，1.3equiv)的乙腈(30ml)溶液中加入无水碳酸钾(86mg，0.62mmol，2equiv)，并将该混合物在回流温度下磁力搅拌10小时。然后，将其抽滤，并用二氯甲烷(2×25ml)洗涤，将滤液真空蒸发并将残余物减压蒸馏，得粗产物化合物22a(直接用于下步反应)。将上述化合物22a(102mg)溶于纯TFA(10mL)，并将反应混合物在70℃下搅拌5小时。然后将反应混合物浓缩成油，将粗产物在CH2Cl2和饱和NaHCO3之间分配。分离各相，并用CH2Cl2(1×)再次萃取水层。合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤并浓缩，残余物通过硅胶快速柱色谱法纯化(DCM:CH3OH＝15:1)，得到白色固体产物(43mg,51％)1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ10.61(s,1H),8.82(s,1H),8.75(d,J＝8.4Hz,1H),8.67(d,J＝1.9Hz,1H),8.21(d,J＝1.9Hz,1H),8.09(s,1H),8.04(d,J＝2.0Hz,1H),7.96(dd,J＝8.5,2.2Hz,1H),7.90(d,J＝2.2Hz,1H),7.79(dd,J＝7.9,2.0Hz,1H),7.72(d,J＝8.6Hz,1H),7.67(dd,J＝8.5,7.3Hz,1H),7.56–7.48(m,1H),7.32(d,J＝8.1Hz,1H),4.96(dd,J＝12.1,5.3Hz,1H),3.58(s,2H),2.95–2.85(m,1H),2.85–2.77(m,2H),2.76–2.71(m,2H),2.58(d,J＝28.8Hz,13H),2.19–2.13(m,1H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ171.90,171.48,168.44,167.88,166.97,165.32,151.60,150.41,144.29,137.25,137.09,135.94,134.09,133.17,132.83,132.16,131.50,131.42,130.58,130.04,128.99,128.69,127.63,126.69,125.58,123.54,123.04,118.61,116.42,114.55,113.28,91.45,88.75,57.74,53.50,52.95,52.42,49.29,34.30,31.47,22.69,20.91.HRMS(ESI)calcd for C44H38F3N9O6[M+H]+,846.2970；found,846.2968.HPLC purity＝99.23％,Rt5.49min.
用本实施例合成23a相同的方法合成23b-23h：
3-((1H-吡唑并[3,4-b]吡啶基-5-基)乙炔基)-N-(4-((4-(5-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧杂异吲哚-4-基)氨基)-5-氧戊基)哌嗪-1-基)甲基)-3-(三氟甲基)苯基)-4-甲基苯甲酰胺(化合物23b)
Figure BDA0002406266320000201
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.98(s,1H),11.19(s,1H),10.59(s,1H),9.73(s,1H),8.74(d,J＝2.0Hz,1H),8.52(d,J＝2.0Hz,1H),8.45(d,J＝8.4Hz,1H),8.27–8.15(m,3H),8.10(d,J＝8.5Hz,1H),7.93(d,J＝8.0Hz,1H),7.82(t,J＝7.9Hz,1H),7.70(d,J＝8.5Hz,1H),7.61(d,J＝7.3Hz,1H),7.52(d,J＝8.2Hz,1H),5.15(dd,J＝12.7,5.4Hz,1H),3.59(s,2H),2.96–2.82(m,1H),2.74–2.25(m,17H),2.11–2.00(m,1H),1.70–1.50(m,4H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ173.22,172.25,170.24,168.14,167.11,165.16,151.48,151.03,144.18,138.80,136.95,136.54,134.17,133.45,132.58,132.02,131.89,131.73,131.01,130.39,128.61,128.04,127.75,126.78,126.13,123.95,122.65,118.79,117.46,114.47,112.25,92.38,88.75,57.57,52.56,49.38,46.05,36.51,31.41,22.79,22.47,20.91.HRMS(ESI)calcd for C46H42F3N9O6[M+H]+,874.3283；found,874.3280.HPLC purity＝97.74％,Rt 5.60min。
3-((1H-吡唑并[3,4-b]吡啶基-5-基)乙炔基)-N-(4-((4-(6-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧杂异吲哚-4-基)氨基)-6-氧己基)哌嗪-1-基)甲基)-3-(三氟甲基)苯基)-4-甲基苯甲酰胺(化合物23c)
Figure BDA0002406266320000202
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.95(s,1H),11.16(s,1H),10.53(s,1H),9.68(s,1H),8.73(d,J＝2.0Hz,1H),8.51(d,J＝2.0Hz,1H),8.47(d,J＝8.4Hz,1H),8.22(s,1H),8.19(dd,J＝7.4,2.1Hz,2H),8.06(dd,J＝8.4,2.2Hz,1H),7.92(dd,J＝8.0,2.0Hz,1H),7.85–7.78(m,1H),7.69(d,J＝8.5Hz,1H),7.59(d,J＝7.3Hz,1H),7.51(d,J＝8.2Hz,1H),5.14(dd,J＝12.7,5.5Hz,1H),3.53(s,2H),2.95–2.80(m,1H),2.65–2.52(m,6H),2.48–2.29(m,9H),2.26(t,J＝7.2Hz,2H),2.10–1.98(m,1H),1.62(p,J＝7.5Hz,2H),1.44(p,J＝7.3Hz,2H),1.36–1.25(m,2H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ173.21,172.47,170.24,168.17,167.11,165.15,151.50,151.03,144.18,138.61,137.02,136.56,134.20,133.48,132.63,132.53,131.88,131.65,130.99,130.42,128.62,127.97,127.68,126.68,126.15,123.95,123.43,122.64,118.73,117.35,114.48,112.25,92.38,88.76,58.10,57.93,53.25,49.36,36.96,31.40,26.86,26.43,25.19,22.45,20.92.HRMS(ESI)calcd for C47H44N9O6F3[M+H]+,888.3439；found,888.3469.HPLC purity＝100.00％,Rt 9.70min。
3-((1H-吡唑并[3,4-b]吡啶基-5-基)乙炔基)-N-(4-((4-(7-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧异异吲哚-4-基)氨基)-7-氧庚基)哌嗪-1-基)甲基)-3-(三氟甲基)苯基)-4-甲基苯甲酰胺(化合物23d)
Figure BDA0002406266320000211
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.96(s,1H),11.17(s,1H),10.60(s,1H),9.68(s,1H),8.73(d,J＝2.0Hz,1H),8.51(d,J＝2.0Hz,1H),8.46(d,J＝8.4Hz,1H),8.24–8.20(m,2H),8.19(d,J＝2.0Hz,1H),8.10(dd,J＝8.5,2.2Hz,1H),7.93(dd,J＝8.0,2.0Hz,1H),7.81(dd,J＝8.5,7.3Hz,1H),7.70(d,J＝8.6Hz,1H),7.60(d,J＝7.3Hz,1H),7.51(d,J＝8.2Hz,1H),5.15(dd,J＝12.7,5.4Hz,1H),3.62(s,2H),2.96–2.68(m,6H),2.67–2.51(m,8H),2.48–2.32(m,4H),2.11–2.02(m,1H),1.67–1.50(m,4H),1.40–1.24(m,4H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ173.27,172.47,170.29,168.15,167.12,165.12,151.49,150.99,144.18,138.62,136.98,136.55,134.19,133.48,132.57,132.42,131.86,131.62,130.98,130.41,128.63,127.94,127.65,126.68,126.13,123.92,123.41,122.61,118.74,117.32,114.47,112.23,92.36,88.74,58.12,57.85,53.15,49.34,36.93,31.39,28.90,27.09,25.21,22.45,20.92.HRMS(ESI)calcd for C48H46F3N9O6[M+H]+,902.3596；found,902.3582.HPLC purity＝99.87％,Rt 7.29min.
3-((1H-吡唑并[3,4-b]吡啶基-5-基)乙炔基)-N-(4-((4-(9-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧异异吲哚-4-基)氨基)-9-氧羰基)哌嗪-1-基)甲基)-3-(三氟甲基)苯基)-4-甲基苯甲酰胺(化合物23e)
Figure BDA0002406266320000212
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.96(s,1H),11.18(s,1H),10.55(s,1H),9.68(s,1H),8.74(d,J＝2.0Hz,1H),8.52(d,J＝2.0Hz,1H),8.48(d,J＝8.4Hz,1H),8.22(d,J＝4.2Hz,2H),8.20(d,J＝2.0Hz,1H),8.08(dd,J＝8.4,2.2Hz,1H),7.93(dd,J＝7.9,2.0Hz,1H),7.82(t,J＝7.9Hz,1H),7.70(d,J＝8.6Hz,1H),7.60(d,J＝7.2Hz,1H),7.52(d,J＝8.3Hz,1H),5.16(dd,J＝12.7,5.4Hz,1H),3.56(s,2H),2.90–2.81(m,1H),2.66–2.51(m,6H),2.47–2.21(m,11H),2.11–2.00(m,1H),1.62(p,J＝7.3Hz,2H),1.34–1.15(m,10H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ173.21,172.46,170.24,168.18,167.11,165.13,151.49,151.03,144.17,138.66,137.03,136.55,134.18,133.46,132.61,132.43,131.88,131.65,130.99,130.40,128.62,127.99,127.69,126.63,126.15,123.93,123.43,122.64,118.71,117.31,114.48,112.25,92.38,88.76,58.16,57.86,53.13,49.37,37.00,31.41,29.26,29.17,28.94,27.29,26.80,25.22,22.47,20.92.HRMS(ESI)calcd for C50H50F3N9O6[M+H]+,930.3909；found,930.3898.HPLC purity＝99.83％,Rt 8.97min.
3-((1H-吡唑并[3,4-b]吡啶基-5-基)乙炔基)-N-(4-((4-(11-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚-4-基)氨基)-11-氧杂基)哌嗪-1-基)甲基)-3-(三氟甲基)苯基)-4-甲基苯甲酰胺(化合物23f)
Figure BDA0002406266320000221
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.97(s,1H),11.20(s,1H),10.55(s,1H),9.67(s,1H),8.72(s,1H),8.48(dd,J＝21.8,8.1Hz,2H),8.20(t,J＝8.5Hz,3H),8.06(d,J＝8.4Hz,1H),7.91(d,J＝7.9Hz,1H),7.81–7.73(m,1H),7.69(d,J＝8.9Hz,1H),7.58(t,J＝6.4Hz,1H),7.52–7.47(m,1H),5.14(dd,J＝12.6,5.5Hz,1H),3.56(s,2H),3.00–2.81(m,1H),2.66–2.51(m,6H),2.45–2.16(m,11H),2.12–1.98(m,1H),1.63–1.51(m,2H),1.45–1.08(m,14H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ173.27,172.48,170.28,168.18,167.11,165.12,151.49,150.98,144.18,138.60,136.99,136.54,134.19,133.48,132.55,132.45,131.84,131.60,130.97,130.40,128.61,127.94,127.64,126.62,126.13,123.89,123.40,122.61,118.71,117.62,114.46,112.24,92.35,88.74,58.26,57.88,53.18,49.33,36.97,31.39,29.44,29.37,29.21,28.98,27.40,26.66,25.22,22.45,20.91.HRMS(ESI)calcd for C52H54F3N9O6[M+H]+,958.4222；found,958.4210.HPLC purity＝99.00％,Rt 12.25min.
3-((1H-吡唑并[3,4-b]吡啶基-5-基)乙炔基)-N-(4-((4-(13-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧杂异吲哚-4-基)氨基)-13-氧十三烷基)哌嗪-1-基)甲基)-3-(三氟甲基)苯基)-4-甲基苯甲酰胺(化合物23g)
Figure BDA0002406266320000231
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.95(s,1H),11.16(s,1H),10.54(s,1H),9.67(s,1H),8.73(d,J＝1.9Hz,1H),8.52(d,J＝1.9Hz,1H),8.47(d,J＝8.4Hz,1H),8.21(d,J＝3.9Hz,2H),8.19(d,J＝1.8Hz,1H),8.07(dd,J＝8.5,2.1Hz,1H),7.92(dd,J＝8.0,1.9Hz,1H),7.81(t,J＝7.9Hz,1H),7.69(d,J＝8.5Hz,1H),7.59(d,J＝7.3Hz,1H),7.52(d,J＝8.1Hz,1H),5.14(dd,J＝12.7,5.4Hz,1H),3.56(s,2H),2.96–2.80(m,1H),2.66–2.53(m,6H),2.47–2.19(m,11H),2.11–1.99(m,1H),1.60(p,J＝7.2Hz,2H),1.31–1.17(m,18H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ173.20,172.46,170.23,168.17,167.12,165.13,151.49,151.03,144.17,138.66,137.03,136.55,134.19,133.47,132.61,132.44,131.88,131.65,131.00,130.41,128.62,126.65,123.94,122.64,118.71,117.32,114.48,112.25,92.38,88.76,58.14,57.88,53.14,49.37,36.99,31.41,29.39,29.20,28.97,27.33,26.52,25.23,22.46,20.92.HRMS(ESI)calcd for C54H58F3N9O6[M+H]+,986.4535；found,986.4522.HPLCpurity＝98.84％,Rt 7.40min.
3-((1H-吡唑并[3,4-b]吡啶基-5-基)乙炔基)-N-(4-((4-(15-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧杂异吲哚-4-基)氨基)-15-氧十五烷基)哌嗪-1-基)甲基)-3-(三氟甲基)苯基)-4-甲基苯甲酰胺(23h)
Figure BDA0002406266320000232
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.40(s,1H),8.81(d,J＝8.4Hz,1H),8.68(d,J＝1.9Hz,1H),8.40(s,1H),8.22(d,J＝1.8Hz,1H),8.12(s,1H),8.01(d,J＝1.9Hz,1H),7.91(d,J＝9.5Hz,2H),7.79(dd,J＝8.1,1.9Hz,1H),7.74(d,J＝8.3Hz,1H),7.68(t,J＝7.9Hz,1H),7.51(d,J＝7.3Hz,1H),7.33(d,J＝8.2Hz,1H),4.96(dd,J＝12.2,5.4Hz,1H),3.61(s,2H),2.95–2.85(m,1H),2.84–2.69(m,2H),2.60–2.38(m,11H),2.34(t,J＝7.9Hz,2H),2.20–2.12(m,1H),1.72(p,J＝7.5Hz,2H),1.53–1.42(m,2H),1.37–1.14(m,22H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ172.54,171.37,169.19,168.44,166.77,165.08,151.59,150.39,144.39,137.87,136.70,136.42,134.21,133.69,132.92,132.11,131.38,131.05,130.34,130.17,127.50,125.27,123.31,123.15,118.40,115.23,114.64,113.38,91.43,88.73,58.70,57.80,53.20,53.03,49.32,38.02,31.48,29.71,29.50,29.45,29.37,29.22,29.11,27.58,26.59,25.24,22.71,20.89.HRMS(ESI)calcd for C56H62F3N9O6[M+H]+,1014.4848；found,1014.4826.HPLC purity＝99.05％,Rt 9.62min.
实施例5：化合物28a-28g的制备
Figure BDA0002406266320000241
步骤x：3-(2-羟基乙氧基)丙酸叔丁酯(化合物24a)的制备
Figure BDA0002406266320000242
向无水乙烷-1,2-二醇(15g，205.4mmol，3equiv)的无水THF(100mL)溶液中加入金属钠(Na)(40mg，2.05mmol，0.01equiv)并在室温下搅拌1h。然后往反应液中加入丙烯酸叔丁酯(8.78g，68.5mmol，1equiv)，并搅拌10h。将反应后的混合物真空浓缩，并用乙酸乙酯和H2O萃取。分离有机层，用盐水洗涤，用Na2SO4干燥。过滤并蒸发后，将残余物通过硅胶柱色谱法纯化(PE:EA＝3:1)，得到无色油状物(5.6g,43％)。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ3.66–3.60(m,4H),3.49(t,J＝4.6Hz,2H),2.90(s,1H),2.43(t,J＝6.2Hz,2H),1.37(s,9H).
步骤y：3-(2-(甲苯磺酰氧基)乙氧基)丙酸叔丁酯(化合物25a)的制备
Figure BDA0002406266320000243
在0℃下，将甲苯磺酰氯(3.6g，18.9mmol，1.2equiv)的无水CH2Cl2(10mL)溶液滴加到24a(3g，15.7mmol，1equiv)的无水CH2Cl2(20mL)和NEt3(3.17g，31.4mmol，2equiv)的混合物中。将反应混合物在室温搅拌10小时。所得混合物用饱和NaHCO3处理，水相用CH2Cl2萃取。分离有机层，用盐水洗涤，用Na2SO4干燥。过滤并蒸发后，将残余物通过硅胶柱色谱法纯化(PE:EA＝5:1)，得到无色油状物(4.37g,81％)。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.80–7.75(m,2H),7.37–7.30(m,2H),4.18–4.05(m,2H),3.67–3.56(m,4H),2.43(s,3H),2.40(t,J＝6.4Hz,2H),1.42(s,9H).
步骤z：2-(3-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚-4-基)氨基)-3-氧代丙氧基)4-甲基苯磺酸乙酯(化合物26a)的制备
Figure BDA0002406266320000251
在室温下，将25a(1g，2.9mmol，1equiv)在DCM/TFA(15ml/5mL)中的溶液搅拌2小时。结束后浓缩得到的混合物3-(2-(甲苯磺酰氧基)乙氧基)丙酸，为油状物。无需进一步纯化即可使用该油状物。将3-(2-(甲苯磺酰氧基)乙氧基)丙酸的亚硫酰氯(10ml)溶液加热至回流1h。使反应混合物冷却至室温，并真空蒸发溶剂，得到油状的4-甲基苯磺酸2-(3-氯-3-氧代丙氧基)乙基酯。将该油状物溶于THF(30ml)。向该溶液中加入4-氨基-2-(2,6-二氧杂(3-哌啶基))异吲哚啉-1,3-二酮(671mg，2.32mmol，0.8equiv)。所得悬浮液回流4小时。真空蒸发溶剂，并将所得固体通过快速色谱法(DCM:EA＝5:1)部分纯化，得到灰白色固体(1.15g,73％)。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.79(s,1H),9.02(s,1H),8.77(d,J＝8.5Hz,1H),7.70–7.61(m,3H),7.50(d,J＝7.3Hz,1H),7.22(d,J＝8.0Hz,2H),5.00–4.93(m,1H),4.21(t,J＝4.7Hz,2H),3.75–3.67(m,4H),2.88–2.78(m,1H),2.79–2.69(m,2H),2.67–2.57(m,2H),2.31(s,3H),2.19–2.08(m,1H).
步骤z2：N-(4-((4-(2-(3-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚啉-4-基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙基))哌嗪-1-基)甲基)-3-(三氟甲基)苯基)-3-((1-(4-甲氧基苄基)-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)乙炔基)-4-甲基苯甲酰胺(化合物27a)的制备
Figure BDA0002406266320000252
向化合物8(610mg，0.96mmol，1equiv)和化合物26a(678mg，1.25mmol，1.3equiv)的乙腈(30ml)溶液中加入无水碳酸钾(265mg，1.92mmol，2equiv)，并将该混合物在回流温度下搅拌10h。反应结束后，抽滤，并用二氯甲烷(2×25ml)洗涤，将滤液真空蒸发并将残余物减压蒸馏，得粗产物直接用于下一步反应。
步骤z3：3-((1H-吡唑并[3,4-b]吡啶基-5-基)乙炔基)-N-(4-((4-(2-(3-((2-(2,6-二氧杂哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚-4-基)氨基)-3-氧代丙氧基)乙基)哌嗪-1-基)甲基)-3-(三氟甲基)苯基)-4-甲基苯甲酰胺(化合物28a)的制备
Figure BDA0002406266320000261
将化合物27a(300mg，0.3mmol)溶于纯TFA(10mL)中，并将反应混合物在70℃下搅拌5小时。然后将反应混合物浓缩成油，将粗产物在CH2Cl2和饱和NaHCO3之间分配。分离各相，并用CH2Cl2(1×)再次萃取水层。合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤并浓缩，残余物通过硅胶快速柱色谱法纯化(DCM:CH3OH＝15:1)，得到白色固体(91mg,34％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.96(s,1H),11.16(s,1H),10.55(s,1H),9.88(s,1H),8.75(d,J＝2.0Hz,1H),8.56–8.51(m,2H),8.23(s,1H),8.21(t,J＝1.9Hz,2H),8.07(dd,J＝8.5,2.2Hz,1H),7.94(dd,J＝8.0,2.0Hz,1H),7.80(dd,J＝8.5,7.3Hz,1H),7.66(d,J＝8.6Hz,1H),7.59(d,J＝7.3Hz,1H),7.53(d,J＝8.2Hz,1H),5.15(dd,J＝12.9,5.4Hz,1H),3.72(t,J＝5.8Hz,2H),3.57(t,J＝5.6Hz,2H),3.49(s,2H),2.96–2.82(m,1H),2.69(t,J＝5.9Hz,2H),2.65–2.54(m,7H),2.47–2.34(m,4H),2.34–2.21(m,4H),2.09–1.99(m,1H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ173.17,170.97,170.19,168.14,167.06,165.16,151.50,151.03,144.18,138.61,136.96,136.58,134.23,133.49,132.65,132.45,131.86,131.62,131.00,130.42,128.64,127.95,127.66,126.36,126.12,123.95,123.40,122.64,118.70,117.01,114.48,112.25,92.39,88.76,66.47,57.89,57.30,53.52,53.18,49.36,38.09,31.39,22.47,20.93.HRMS(ESI)calcd for C46H42F3N9O7[M+H]+,890.3232；found,890.3213.HPLC purity＝97.36％,Rt 5.09min.
用本实施例合成28a相同的方法合成28b-28g：
3-((1H-吡唑并[3,4-b]吡啶基-5-基)乙炔基)-N-(4-((4-(2-(2-(3-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)氨基)-3-氧丙氧基)乙氧基)乙基哌嗪-1-基)甲基)-3-(三氟甲基)苯基)-4-甲基苯甲酰胺(化合物28b)
Figure BDA0002406266320000262
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.82(s,1H),9.12(s,1H),8.72(d,J＝8.4Hz,1H),8.54(s,1H),8.08(s,1H),8.04(s,1H),7.96(s,1H),7.91(d,J＝10.0Hz,2H),7.74(d,J＝7.6Hz,1H),7.59(q,J＝8.6,6.5Hz,2H),7.43(d,J＝7.2Hz,1H),7.18(d,J＝8.0Hz,1H),4.94(dd,J＝11.2,5.8Hz,1H),3.86–3.31(m,10H),2.88–2.63(m,6H),2.63–2.48(m,4H),2.48–2.18(m,8H),2.18–2.04(m,1H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ172.36,170.99,169.28,168.51,166.88,165.44,151.31,150.22,144.09,137.31,137.15,136.10,133.95,132.98,132.01,131.17,130.51,129.91,128.97,128.66,125.58,125.44,123.46,122.77,118.42,115.63,114.57,113.12,91.28,88.75,70.41,69.87,68.29,66.49,57.64,57.17,53.31,52.41,49.25,38.47,31.59,22.67,20.77.HRMS(ESI)calcd for C48H46F3N9O8[M+H]+,934.3494；found,934.3468。HPLC purity＝99.53％,Rt 5.28min。
3-((1H-吡唑并[3,4-b]吡啶基-5-基)乙炔基)-N-(4-((4-(2-(2-(2-(3-((2-(2,6-二氧杂哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)氨基)-3-氧丙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)哌嗪-1-基)甲基)-3-(三氟甲基)苯基)-4-甲基苯甲酰胺(化合物28c)
Figure BDA0002406266320000271
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.88(s,1H),8.87(s,1H),8.77(d,J＝8.5Hz,1H),8.60(t,J＝1.9Hz,1H),8.15(d,J＝1.9Hz,1H),8.08(s,1H),8.00(d,J＝1.8Hz,1H),7.96–7.88(m,2H),7.78(dd,J＝7.9,1.9Hz,1H),7.70–7.55(m,2H),7.48(d,J＝7.3Hz,1H),7.25(d,J＝1.9Hz,0H),4.95(dd,J＝12.0,5.4Hz,1H),3.77(t,J＝6.7Hz,2H),3.73–3.68(m,2H),3.68–3.59(m,4H),3.59–3.46(m,6H),2.90–2.82(m,1H),2.82–2.72(m,2H),2.71–2.65(m,2H),2.63–2.34(m,13H),2.18–2.10(m,1H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ172.02,171.13,168.83,168.52,166.98,165.27,151.44,150.30,144.23,137.43,137.01,136.11,134.07,133.16,132.91,132.05,131.27,131.23,130.45,130.04,127.71,125.67,123.37,122.92,118.43,114.62,113.25,88.78,70.83,70.40,70.24,68.01,66.63,57.69,57.58,53.28,52.49,49.36,38.61,31.60,29.72,22.78,20.84.HRMS(ESI)calcd forC50H50F3N9O9[M+H]+,978.3756；found,978.3726.HPLC purity＝99.17％,Rt 5.38min.
1-(4-(4-(3-((1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)乙炔基)-4-甲基苯甲酰胺基)-2-(三氟甲基)苄基)哌嗪-1-基)-N-(2-(2,6-二氧杂哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)-3,6,9,12-四氧十五烷-15-酰胺(化合物28d)
Figure BDA0002406266320000281
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.83(s,1H),8.79(d,J＝8.5Hz,1H),8.68(s,1H),8.52(s,1H),8.22(s,1H),8.11(s,1H),8.03(s,1H),7.91(d,J＝9.8Hz,2H),7.80(d,J＝8.0Hz,1H),7.74–7.59(m,2H),7.50(d,J＝7.3Hz,1H),7.33(d,J＝8.1Hz,1H),4.99–4.88(m,1H),3.80(t,J＝5.7Hz,2H),3.72–3.48(m,16H),2.93–2.82(m,1H),2.82–2.74(m,2H),2.74–2.38(m,15H),2.18–2.10(m,1H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ171.64,170.96,168.60,166.86,165.11,151.63,150.38,144.36,137.48,136.96,136.18,134.23,133.16,132.88,132.07,131.40,131.24,130.43,130.14,127.59,125.63,123.33,123.10,118.46,115.67,114.60,113.39,91.43,88.77,70.65,70.53,70.45,70.25,68.11,66.57,57.69,57.45,53.39,52.30,49.32,38.58,31.51,22.76,20.88.HRMS(ESI)calcd for C52H54F3N9O10[M+H]+,1022.4018；found,1022.3999.
1-(4-(4-(3-((1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)乙炔基)-4-甲基苯甲酰胺基)-2-(三氟甲基)苄基)哌嗪-1-基)-N-(2-(2,6-二氧杂哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)-3,6,9,12,15-五氧十八烷基-18-酰胺(化合物28e)
Figure BDA0002406266320000282
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.82(s,1H),8.78(d,J＝8.6Hz,1H),8.68(d,J＝19.3Hz,2H),8.20(s,1H),8.09(s,1H),8.04(s,1H),7.92(d,J＝7.5Hz,2H),7.80(d,J＝8.0Hz,1H),7.73–7.59(m,2H),7.49(d,J＝7.4Hz,1H),7.32(t,J＝10.2Hz,1H),5.04–4.82(m,1H),3.80(t,J＝5.8Hz,2H),3.75–3.44(m,20H),2.93–2.81(m,1H),2.81–2.74(m,2H),2.73–2.28(m,15H),2.18–2.10(m,1H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ171.69,170.94,168.62,168.56,166.86,165.18,151.52,150.35,144.27,137.46,137.02,136.15,134.11,133.20,132.89,132.12,131.22,130.48,130.08,127.65,125.62,123.35,123.03,118.44,115.66,114.61,113.31,91.40,88.78,70.63,70.50,70.45,70.25,68.37,66.56,57.72,57.46,53.39,52.52,49.30,38.55,31.51,22.75,20.87.HRMS(ESI)calcd for C54H58F3N9O11[M+H]+,1066.4281；found,1066.4259.
1-(4-(4-(3-((1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-5-基)乙炔基)-4-甲基苯甲酰胺基)-2-(三氟甲基)苄基)哌嗪-1-基)-N-(2-(2,6-二氧杂哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)-3,6,9,12,15,18-六氧苯并呋喃-21-酰胺(化合物28f)
Figure BDA0002406266320000291
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.82(s,1H),8.84(s,1H),8.78(d,J＝8.5Hz,1H),8.69(d,J＝1.9Hz,1H),8.24(d,J＝1.9Hz,1H),8.12(s,1H),8.10(d,J＝2.0Hz,1H),8.03(d,J＝2.2Hz,1H),7.95(dd,J＝8.4,2.2Hz,1H),7.85(dd,J＝7.9,2.0Hz,1H),7.66(dt,J＝8.2,3.7Hz,2H),7.51(d,J＝7.3Hz,1H),7.33(d,J＝8.2Hz,1H),5.03–4.93(m,1H),3.81(t,J＝5.8Hz,2H),3.77(t,J＝4.9Hz,2H),3.70(s,4H),3.67–3.46(m,18H),2.99–2.74(m,9H),2.75–2.60(m,6H),2.55(s,3H),2.25–2.08(m,1H).13C NMR(101MHz,Chloroform-d)δ171.88,170.90,168.79,168.54,166.85,165.34,151.45,150.28,144.17,137.41,137.37,136.14,134.02,132.93,132.43,131.98,131.30,131.17,130.67,129.97,129.09,128.79,127.81,125.58,123.55,122.90,122.76,118.44,115.65,114.58,113.25,91.36,88.82,70.56,70.37,70.32,70.19,67.37,66.52,57.57,57.22,53.25,51.60,49.30,38.44,31.49,22.71,20.83.HRMS(ESI)calcd for C56H68N9O12F3[M+H]+,1110.4669；found,1110.4618.HPLC purity＝100.00％,Rt 5.23min.
3-((1H-吡唑并[3,4-b]吡啶基-5-基)乙炔基)-N-(4-((4-(2-(2-(3-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1-氧异吲哚-4-基)氨基)-3-氧丙氧基)乙氧基)乙基)哌嗪-1-基)甲基)-3-(三氟甲基)苯基)-4-甲基苯甲酰胺(化合物28g)
Figure BDA0002406266320000292
1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ8.67(d,J＝2.0Hz,1H),8.40(d,J＝2.0Hz,1H),8.14(s,1H),8.12(d,J＝2.1Hz,2H),7.92(dd,J＝8.4,2.2Hz,1H),7.86–7.84(m,1H),7.73(d,J＝8.0Hz,1H),7.69(d,J＝8.6Hz,1H),7.62(d,J＝7.5Hz,1H),7.48(t,J＝7.7Hz,1H),7.42(d,J＝8.1Hz,1H),5.17(dd,J＝13.3,5.2Hz,1H),4.60–4.39(m,2H),3.82(t,J＝5.8Hz,2H),3.69–3.50(m,8H),2.95–2.83(m,1H),2.81–2.71(m,1H),2.67(t,J＝5.9Hz,2H),2.59(s,3H),2.57–2.28(m,11H),2.24–2.08(m,1H).13C NMR(101MHz,Methanol-d4)δ173.22,171.00,170.61,169.63,166.32,151.32,150.38,144.10,137.79,134.87,133.55,133.16,132.95,132.53,132.19,131.12,130.68,129.62,128.67,127.46,126.26,123.62,122.94,120.06,114.45,113.04,91.11,88.10,69.96,69.86,67.88,66.63,57.46,57.14,53.09,52.19,52.11,36.54,30.95,22.83,19.59.HRMS(ESI)calcd for C48H48N9O7F3[M+H]+,920.3702；found,920.3750.HPLC purity＝98.10％,Rt 6.05min.
实施例6.3-((1H-吡唑并[3,4-b]吡啶基-5-基)乙炔基)-N-(4-((4-(2-(2-(2-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚基-4-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)哌嗪-1-基)甲基)-3-(三氟甲基)苯基)-4-甲基苯甲酰胺(化合物28h)的制备
Figure BDA0002406266320000301
步骤z4：4-甲基苯磺酸2-(2-(2-氯乙氧基)乙氧基)乙酯(化合物29)的制备
Figure BDA0002406266320000302
向2-(2-(2-氯乙氧基)乙氧基)乙烷-1-醇(900mg，5.35mmol，1equiv)和TsCl(1225mg，6.42mmol，1.2equiv)的DCM(25mL)溶液中加入Et3N(1082mg，10.7mmol，2equiv)，然后在常温下搅拌3h。然后将反应混合物用DCM稀释，并用氯化铵和盐水洗涤。有机层经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。残余物通过硅胶柱色谱法纯化(PE∶EtOAc＝10∶1)，得到所需产物化合物29，为无色油状物(1364mg，79％收率)。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.82–7.75(m,2H),7.34(d,J＝8.1Hz,2H),4.18–4.13(m,2H),3.73–3.65(m,4H),3.63–3.55(m,6H),2.44(s,3H).
步骤z5：4-(2-(2-(2-氯乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(化合物30)的制备
Figure BDA0002406266320000303
在圆底烧瓶中，将沙利度胺(200mg,0.73mmol,1equiv)溶解在DMF(10mL)中，然后加入化合物29(306mg,0.95mmol,1.3equiv)，KI(12mg,0.073mmol,0.1equiv)和KHCO3(146mg,1.46mmol,2equiv)。将反应混合物于90℃下搅拌20h后冷却至室温。再将反应混合物溶于乙酸乙酯，用饱和食盐水洗涤，再用无水Na2SO4干燥，通过柱色谱法纯化，得到灰白色固体(152mg，49％产率)。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.68(s,1H),7.64(dd,J＝8.5,7.3Hz,1H),7.42(d,J＝7.2Hz,1H),7.24(d,J＝8.6Hz,1H),4.99–4.90(m,1H),4.33(t,J＝4.7Hz,2H),3.97–3.92(m,2H),3.79–3.75(m,2H),3.72(t,J＝5.9Hz,2H),3.68–3.65(m,2H),3.60–3.58(m,2H),2.86–2.80(m,1H),2.80–2.68(m,2H),2.10–2.03(m,2H).
步骤z6：2-(2,6-二氧杂哌啶-3-基)-4-(2-(2-(2-碘乙氧基)乙氧基)乙氧基)异吲哚啉-1,3-二酮(化合物31)的制备
Figure BDA0002406266320000311
向化合物30(120mg,0.28mmol,1equiv)的丙酮(15ml)溶液中添加NaI(420mg,2.8mmol,10equiv)。将反应混合物在回流温度下搅拌24h，然后在真空下除去溶剂，并将粗产物溶解在乙酸乙酯中，并用10％NaHSO3水溶液，饱和食盐水洗涤，用Na2SO4干燥有机相并在真空下蒸发。粗产物无需进一步纯化即可用于下一步。
步骤z7：3-((1H-吡唑并[3,4-b]吡啶基-5-基)乙炔基)-N-(4-((4-(2-(2-(2-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚基-4-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)哌嗪-1-基)甲基)-3-(三氟甲基)苯基)-4-甲基苯甲酰胺(化合物28h)的制备
Figure BDA0002406266320000312
向化合物8(120mg，0.18mmol，1equiv)和化合物31(125mg，0.24mmol，1.3equiv)的乙腈(20ml)溶液中加入无水碳酸钾(50mg，0.36mmol，2equiv)，并将该混合物在回流温度下搅拌10小时。然后，将其抽滤，并用二氯甲烷(2×25ml)洗涤滤饼，将滤液真空蒸发并将残余物减压蒸馏，得到的粗产物化合物直接全部溶于纯TFA(10mL)，并将反应混合物在70℃下搅拌5小时。然后将反应混合物浓缩成油，将粗产物在CH2Cl2和饱和NaHCO3水溶液之间分配。分离各相，并用CH2Cl2(1×)再次萃取水层。合并的有机相经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩，残余物通过硅胶快速柱色谱法纯化(DCM:CH3OH＝20:1)，得到白色固体产物化合物28h(39mg,24％)。
1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ8.68(d,J＝1.9Hz,1H),8.41(d,J＝2.0Hz,1H),8.15(s,1H),8.13(d,J＝2.1Hz,1H),8.12(d,J＝2.4Hz,1H),7.91(dd,J＝8.6,2.2Hz,1H),7.87(dd,J＝8.0,2.0Hz,1H),7.73–7.65(m,2H),7.44(d,J＝8.1Hz,1H),7.41(d,J＝3.1Hz,1H),7.39(d,J＝1.9Hz,1H),5.08(dd,J＝12.4,5.5Hz,1H),4.33(t,J＝4.4Hz,2H),3.94–3.87(m,2H),3.79–3.74(m,2H),3.72–3.67(m,2H),3.66–3.62(m,2H),3.60(s,2H),2.92–2.62(m,9H),2.60(s,3H),2.51(s,4H),2.15–2.05(m,1H).13C NMR(101MHz,Methanol-d4)δ173.16,170.04,167.06,166.37,165.90,156.28,151.32,144.12,137.92,136.55,133.63,133.54,132.97,132.22,132.17,131.13,130.70,129.64,129.44,127.48,123.64,122.95,119.29,116.77,115.34,114.46,113.03,91.12,88.09,70.58,69.97,69.12,68.97,66.62,57.25,56.77,52.73,51.37,49.04,43.09,30.77,22.30,19.59.HRMS(ESI)calcd forC47H45N8O8F3[M+H]+,907.3385；found,907.3387.HPLC purity＝100.00％,Rt 6.97min.
实施例7.本发明的化合物对K562细胞及BaF3T315I型突变细胞的抑制活性评价
本实验使用的细胞K562(Bcr-Abl融合表达的慢性粒细胞性白血病细胞系)购买自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，BaF3-BCR-ABL-T315I稳定细胞模使用质粒转染法构建获得(具体方法参见文献GZD824JMC)。3000-10000个上述细胞接种到96孔板中，然后加入不同浓度的本发明化合物(0-3μM，1：3稀释)连续处理72小时。然后加入CCK8试剂，继续孵育1-3小时，接着用超级酶标仪测定其在450nm及650nm的吸光值。首先根据OD450和OD650数据，计算得到每孔的实际吸光度值A(A＝OD450-OD650)，再根据各孔的实际吸光度值A，计算得到各处理孔的细胞存活率，计算公式如下：
细胞存活率(％)＝[(As-Ac)/(Ab-Ac)]×100％]
As：实验孔(含有细胞、不同浓度药物处理孔)
Ab：溶媒对照孔(含有细胞、药物浓度为0的溶媒处理孔)
Ac：空白孔(不含细胞和药物的孔)
然后将细胞存活率数据及其对应受试物的浓度输入GraphPad Prism 5 Demo软件，使用非线性回归模型计算IC50值。
测试结果如表1所示：本发明化合物对K562细胞及BaF3T315I型突变细胞都具有很好的抑制活性。
表1本发明的化合物对K562细胞及BaF3T315I型突变细胞的抑制活性
Figure BDA0002406266320000321
Figure BDA0002406266320000331
注：表中化合物编号同实施例1-6中的化合物编号。
实施例8.本发明的化合物对BaF3T315I细胞中Bcr-AblT315I蛋白的降解活性研究
使用蛋白质免疫印迹法在imatinib耐药模型细胞(BaF3-BCR-ABL-T315I)中研究本发明化合物对靶蛋白Bcr-AblT315I的降解情况。将合适浓度(3x105个/孔)的BaF3T315I细胞接种到6孔板，然后用不同浓度的化合物(0、3.7、11.1、33.3、100、300nM)处理细胞24小时，使用SDS裂解液(CST推荐具体配方)裂解并抽提蛋白。进行SDS-PAGE电泳，转膜，一抗4℃过夜，二抗室温2小时，然后使用ECL试剂盒显影。一抗c-Abl(#2862)抗体购买自CST(CellSignaling Technology，美国)，二抗(Anti-Rabbit IgG,HRP-linked Antibody，#7074S)购买自life公司(Life Technologies Corporation，美国)。使用ImageJ对Western blotting实验结果分别进行灰度处理，得到灰度值(Mean gray value，G)，使用下面的公式计算降解率(Degradation rate，DR)：
DR＝(Gb-Gd)/Gb×100％
Gd：药物处理组的灰度值；
Gb：空白对照细胞的灰度值。
结果如表2和图1所示，结果表明，本发明化合物可以一定程度地降解BaF3-BCR-ABL-T315I细胞中靶标蛋白BCR-ABL-T315I，其中，化合物23d的降解效果最显著。
表2.本发明化合物对BaF3T315I细胞中靶标蛋白Bcr-AblT315I的降解率
Figure BDA0002406266320000341
注：表中化合物编号同实施例1-6中的化合物编号。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以下实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.具有式（Ⅰ）所示结构的蛋白降解靶向嵌合体或者其药学上可接受的盐或者其立体异构体：
Figure 583828DEST_PATH_IMAGE002
（Ⅰ）
其中：
L选自：
Figure 580603DEST_PATH_IMAGE004
、
Figure 901863DEST_PATH_IMAGE006
；
A为
Figure 125034DEST_PATH_IMAGE008
；
n选自：4、6或8；m为3。
2.根据权利要求1所述的蛋白降解靶向嵌合体或者其药学上可接受的盐或者其立体异构体，其特征在于，L选自：
Figure 455521DEST_PATH_IMAGE009
、或者
Figure 182169DEST_PATH_IMAGE010
。
3.根据权利要求1所述的蛋白降解靶向嵌合体或者其药学上可接受的盐或者其立体异构体，其特征在于，选自如下化合物：
Figure 205489DEST_PATH_IMAGE011
Figure 915956DEST_PATH_IMAGE012
Figure 518975DEST_PATH_IMAGE013
。
4.一种蛋白降解靶向嵌合体或者其药学上可接受的盐或者其立体异构体，其特征在于，选自如下化合物：
Figure 755922DEST_PATH_IMAGE014
。
5.权利要求1-4任一项所述的蛋白降解靶向嵌合体或者其药学上可接受的盐或者其立体异构体在制备Bcr-Abl抑制剂中的应用。
6.权利要求1-4任一项所述的蛋白降解靶向嵌合体或者其药学上可接受的盐或者其立体异构体在制备Bcr-AblT315I抑制剂中的应用。
7.权利要求1-4任一项所述的蛋白降解靶向嵌合体或者其药学上可接受的盐或者其立体异构体在制备预防或治疗肿瘤的药物中的应用，所述肿瘤为携带Bcr-Abl的肿瘤。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为携带Bcr-AblT315I基因突变的肿瘤。
9.权利要求1-4任一项所述的蛋白降解靶向嵌合体或者其药学上可接受的盐或者其立体异构体在制备预防或治疗白血病的药物中的应用。
10.一种预防或治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于，包括活性成分以及药学上可接受的载体，所述活性成分包括有权利要求1-4任一项所述的蛋白降解靶向嵌合体或者其药学上可接受的盐或者其立体异构体。
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"Identification of GZD824 as an Orally Bioavailable Inhibitor That Targets Phosphorylated and Nonphosphorylated Breakpoint Cluster Region-Abelson (Bcr-Abl) Kinase and Overcomes Clinically Acquired Mutation-Induced Resistance against Imatinib";Ren,Xiaomei，et al.;《JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY》;20130109;第56卷(第3期);摘要 *

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