CN113354101A - 一种恶臭假单胞菌胞外聚合物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种恶臭假单胞菌胞外聚合物及其制备方法和用途。本发明提供的制备方法具有环境友好、经济高效的特点，通过胁迫培养P.putida，改变胞外聚合物的蛋白质和多糖的含量，制备出对重金属具备高效吸附能力的胞外聚合物，作为生物吸附剂，可用于处理低浓度重金属废水，从而减少重金属废水对环境的影响，实现人类与水资源的可持续发展。

Description

一种恶臭假单胞菌胞外聚合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种恶臭假单胞菌胞外聚合物及其制备方法和用途。

背景技术

随着城市化和工业化的迅速发展，大量含有重金属的废水排放到环境中。由于重金属的生物毒性和不可降解性而在环境中积累，对生态环境和人类健康造成巨大威胁。因此重金属废水的处理刻不容缓。

重金属废水通常采用化学沉淀法、离子交换法等技术处理，但处理过程中容易产生二次污染的问题，费用较高、操作不易，且对低浓度废水处理效果较差。而生物吸附法主要利用微生物及其衍生物，是一种可以应用于低浓度重金属废水处理的技术，该方法操作简便、经济高效、适用范围广、反应周期短，具有广阔的应用前景。

胞外聚合物(Extracellular Polymeric Substances，简称EPS)主要是由多糖、蛋白质、核酸等组成，含有丰富的官能团，如羧基、羟基、氨基、羰基等，使EPS可以和重金属离子进行络合、螯合，从而去除重金属。不同微生物具有不同的氧化活性和代谢能力，EPS的产量也存在着差异，而选用氧化活性高和代谢能力强的细菌有望提高EPS的产量。恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida，简称P.putida)是一种广泛存在的根际细菌和土壤定植菌，属于荧光假单胞菌属。它易于培养，生长繁殖快，且EPS产量高，是一种极佳的胞外聚合物生物吸附剂生产原料。

但由P.putida菌液直接提取得到的EPS用于重金属处理能力较弱，需要采取胁迫培养以提高EPS对重金属的吸附性能。因此，研发出一种P.putida生物吸附剂的制备方法，用于重金属废水的高效处理，成为本领域技术人员亟待解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在提出一种恶臭假单胞菌胞外聚合物及其制备方法和用途。本发明提供的制备方法具有环境友好、经济高效的特点，通过胁迫培养P.putida，改变胞外聚合物的蛋白质和多糖的含量，制备出对重金属具备高效吸附能力的胞外聚合物，作为生物吸附剂，可用于处理低浓度重金属废水，从而减少重金属废水对环境的影响，实现人类与水资源的可持续发展。

为实现上述目的，所采取的技术方案：一种恶臭假单胞菌胞外聚合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将恶臭假单胞菌在营养琼脂培养基(NA)上进行活化培养，活化成功后转接到LB液体培养基中进行富集培养；

(2)将所述步骤(1)中富集培养后的恶臭假单胞菌菌悬液接入LB液体培养基中，添加重金属溶液，对恶臭假单胞菌进行胁迫培养；

(3)提取所述步骤(2)中胁迫培养后的恶臭假单胞菌菌悬液中的胞外聚合物。

优选地，所述步骤(1)中活化培养包括以下步骤：将恶臭假单胞菌冻干粉用无菌水溶解后，接种在灭菌后的营养琼脂培养基平板上，在25-35℃下培养18-36h；

优选地，所述步骤(1)中富集培养条件为：置于恒温振荡器中，培养时间为18-36h，培养温度为25-35℃、振荡速率为150-200rpm。

优选地，所述步骤(2)中按体积百分比为1-10％将富集培养后的恶臭假单胞菌菌液接入LB液体培养基中。

优选地，所述步骤(2)中添加重金属溶液后的液体培养基中重金属的浓度为1-100mg/L。

优选地，所述步骤(2)中重金属为铜、铅、锌、锡、镍、钴、铬、汞、镉中的至少一种；更优选地，所述步骤(2)中重金属溶液为硝酸铅溶液或硝酸镉溶液。

优选地，所述步骤(2)中胁迫培养时间为18-36h。

优选地，所述步骤(3)中，在提取胞外聚合物前，通过离心清洗去除培养基和重金属；优选地，所述离心清洗包括以下步骤：将胁迫培养后的菌悬液在温度为2-6℃、转速为4000-10000rpm条件下离心10-20min，倒掉上清液以去除培养基；将去除培养基后的菌悬液加入至25-50mL的0.1-1％NaCl溶液，旋涡振荡使混合物分散均匀，在温度为2-6℃、转速为4000-10000rpm下离心10-20min，倒掉上清液；在此条件下离心清洗三次，以彻底清洗残留的培养基和重金属。

优选地，所述步骤(3)中提取方法包括以下步骤：离心清洗后，加入5-10mL的0.1-1％NaCl溶液，旋涡振荡使混合物分散均匀，在40-60℃温度下水浴加热20-40min，然后在2-6℃、10000-12000rpm的条件下离心10-20min，离心后上清液用滤膜过滤，将滤液转移至透析袋中透析，透析后得到所述恶臭假单胞菌胞外聚合物。

本发明提供了一种恶臭假单胞菌胞外聚合物，所述恶臭假单胞菌胞外聚合物是采用上述所述的制备方法制备而成的。

本发明提供了一种处理重金属废水的方法，所述方法包括采用上述所述的恶臭假单胞菌胞外聚合物投加到重金属废水中进行吸附处理的步骤。

优选地，所述恶臭假单胞菌胞外聚合物的投加量为6.7-26.7mg/L。

优选地，所述重金属废水含有铜、铅、锌、锡、镍、钴、铬、汞、镉中的至少一种。

优选地，所述重金属废水为低浓度重金属废水。更优选地，所述低浓度重金属废水的浓度为1-20mg/L。

本发明提供了上述所述的恶臭假单胞菌胞外聚合物在制备生物吸附剂中的用途。

有益效果：

本发明提供的恶臭假单胞菌胞胞外聚合物的制备方法操作简便、经济高效、环境友好，作为生物吸附剂，对低浓度重金属废水具有高效、快速的吸附能力。

本发明利用重金属溶液进行胁迫培养，可以有效诱导P.putida分泌胞外聚合物，改变其产生胞外聚合物的各组分含量，胁迫后产生的胞外聚合物对重金属的吸附性能提高，可以针对性去除重金属。

本发明提供的胞外聚合物中化学组成成分比例因胁迫重金属种类和浓度而异。

附图说明

图1为本发明实施例1中恶臭假单胞菌胞外聚合物产量随Pb²⁺胁迫浓度变化的柱状图。

图2为本发明实施例1中恶臭假单胞菌产生的胞外聚合物对重金属吸附性能测定图。

图3为本发明实施例2中恶臭假单胞菌胞外聚合物产量随Cd²⁺胁迫浓度变化的柱状图。

图4为本发明实施例2中恶臭假单胞菌产生的胞外聚合物对重金属吸附性能测定图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合实例对本发明进行进一步的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例且并不用于限定本发明。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供的胞外聚合物、生物吸附剂及重金属处理方法中所用菌株、金属化合物、培养基、其他试剂等均可由市场购得。如无特殊说明，本实验所用试剂均为常规生化试剂。

本发明所使用的器皿和试剂均需灭菌处理，所用溶液均用无菌水配制。

下面结合实施例，对本发明作进一步的说明。

实施例1Pb²⁺胁迫产生的胞外聚合物的制备及其吸附性能的测定

本实施例中选用恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida，属于好氧异养菌，购自市场)。胞外聚合物的具体制备步骤如下：

(1)配制营养琼脂培养基(NA)，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装至锥形瓶，121℃高压灭菌15min，备用。将含有1×10⁸cell/g P.putida的冻干粉用0.1-0.4mL无菌水溶解，接种在营养琼脂培养基平板上，置于30℃恒温生化培养箱中培养24h。活化成功后通过划平板操作三次，最后刮取单菌落转接到LB液体培养基中富集培养，在振荡速率为150-200rpm、30℃下恒温培养24h后，制成恶臭假单胞菌悬液。

(2)在无菌条件下，按体积百分比5％将菌悬液分别接种到100mL LB液体培养基中(已在121℃下高温灭菌20min)，同时注入一定体积的已灭菌的Pb²⁺母液，使9瓶培养基中的Pb²⁺浓度分别为0、5、10、20、40、50、60、80、100mg/L，并于30℃、170rpm条件下进行Pb²⁺胁迫培养24h。

(3)将上述不同Pb²⁺浓度胁迫培养后的P.putida菌悬液在温度为4℃、离心转速为5000rpm条件下离心15min，倒掉上清液以去除培养基。将去除培养基后的P.putida菌悬液加入至30mL的0.9％NaCl溶液，旋涡振荡使混合物均匀，使用冷冻高速离心机在温度为4℃、转速为5000rpm下离心15min，倒掉上清液。在此条件下离心冲洗三次，以彻底清洗残留的培养基和重金属。重复三次离心冲洗后，加入10mL的0.9％NaCl溶液，旋涡振荡使混合物分散均匀，置于60℃水浴加热30min，之后在温度为4℃、转速为10000rpm条件下离心15min。离心后收集上清液用0.45μm聚醚砜滤膜过滤，将滤液转移至透析袋中，并在纯水中透析24h后，得到恶臭假单胞菌在不同Pb²⁺胁迫浓度培养后产生的特异胞外聚合物，储存于冰箱中。

(4)胞外聚合物主要组成成分的测定：以牛血清蛋白为标准物质，使用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量；以无水葡萄糖为标准物质，使用蒽酮-硫酸法分析胞外聚合物中多糖含量；以小牛胸腺DNA为标准物质，通过二苯胺法测定核酸含量。测定结果如图1所示。

(5)由图1可以看出，随着Pb²⁺胁迫浓度的增加，P.putida提取的胞外聚合物产量变化呈现先增加后减少的趋势，且蛋白质含量在Pb²⁺胁迫浓度为10mg/L最高，而EPS中多糖和核酸含量的变化趋势并不明显。

(6)取上述Pb²⁺胁迫培养后提取的胞外聚合物0.2mg到15mL、浓度为20mg/L的Pb²⁺溶液中，在30℃、170rpm条件下振荡吸附2h，之后将混合物转移到截留分子量为4000D的透析袋中用纯水透析12h。使用火焰原子吸收光谱仪测定透析后液体中的Pb²⁺的浓度。以未胁迫培养提取的胞外聚合物为空白对照，设置3个平行样，实验数据取其平均值。吸附结果见图2所示。

(7)取上述Pb²⁺胁迫培养后提取的胞外聚合物0.2mg到15mL浓度为20mg/L的Cd²⁺溶液中，在30℃、170rpm条件下振荡吸附2h，之后将混合物转移到截留分子量为4000D的透析袋中用纯水透析12h。使用火焰原子吸收光谱仪测定透析后液体中的Cd²⁺的浓度。以未胁迫培养提取的胞外聚合物为空白对照，设置3个平行样，实验数据取其平均值。吸附结果见图2所示。

(8)由图2可以看出，对比无胁迫培养处理的样品，P.putida在Pb²⁺胁迫培养后制成的生物吸附剂可以对Pb²⁺进行高效去除，对重金属的吸附效果显著提高。且在Pb²⁺胁迫浓度为10mg/L时，制备的生物吸附剂对Pb²⁺吸附量达到最高。而随着胁迫浓度升高，制备的生物吸附剂对吸附量Cd²⁺变化趋势并不明显。

(9)由图2可以看出，恶臭假单胞菌在Pb²⁺胁迫培养后产生的胞外聚合物制成的生物吸附剂对Pb²⁺、Cd²⁺实现高效去除，相对于无胁迫培养处理而提取的胞外聚合物对重金属的吸附效果显著提高。

实施例2Cd²⁺产生的胞外聚合物的制备及其吸附性能的测定

(1)在无菌条件下，按5％接种量将实施例1步骤(1)得到的菌悬液分别接种到100mL LB液体培养基中(已在121℃下高温灭菌20min)，同时注入一定体积的已灭菌的Cd²⁺母液，使9个锥形瓶中的Pb²⁺浓度分别为0、5、10、20、40、50、60、80、100mg/L，并于30℃、170rpm条件下进行Cd²⁺胁迫培养24h。

(2)将上述不同Cd²⁺浓度胁迫培养后的P.putida菌悬液在温度为4℃、离心转速为5000rpm条件下离心15min，倒掉上清液以去除培养基。将去除培养基后的P.putida菌悬液加入至30mL的0.9％NaCl溶液，旋涡振荡使混合物均匀，使用冷冻高速离心机在温度为4℃、转速为5000rpm下离心15min，倒掉上清液。在此条件下离心冲洗三次，以彻底清洗残留的培养基和重金属。重复三次离心冲洗后，加入10mL的0.9％NaCl溶液，旋涡振荡使混合物分散均匀，置于60℃水浴加热30min，之后在温度为4℃、转速为10000rpm条件下离心15min。离心后收集上清液用0.45μm聚醚砜滤膜过滤，将滤液转移至透析袋中，并在纯水中透析24h后，得到恶臭假单胞菌在不同Cd²⁺胁迫浓度培养后产生的特异胞外聚合物，储存于4℃冰箱中。

(3)胞外聚合物主要组成成分的测定：以牛血清蛋白为标准物质，使用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量；以无水葡萄糖为标准物质，使用蒽酮-硫酸法分析胞外聚合物中多糖含量；以小牛胸腺DNA为标准物质，通过二苯胺法测定核酸含量。测定结果如图3所示。

(4)由图3可以看出，随着Cd²⁺胁迫浓度的增加，恶臭假单胞菌提取的胞外聚合物产量变化呈现先略增加后减少的趋势，蛋白质含量也呈现同样的趋势，而EPS中多糖含量逐渐减少，核酸含量的变化趋势并不明显。

(5)取上述Cd²⁺胁迫培养后提取的胞外聚合物0.2mg添加到15mL浓度为20mg/L的Cd²⁺溶液中，在30℃、170rpm条件下振荡吸附2h，之后将混合物转移到截留分子量为4000D的透析袋中用纯水透析12h。使用火焰原子吸收光谱仪测定透析后液体中的Cd²⁺的浓度。以未胁迫培养提取的胞外聚合物为空白对照，设置3个平行样，实验数据取其平均值。吸附结果见图4所示。

(6)取上述Cd²⁺胁迫培养后提取的胞外聚合物0.2mg到15mL、浓度为20mg/L的Pb²⁺溶液中，在30℃、170rpm条件下振荡吸附2h，之后将混合物转移到截留分子量为4000D的透析袋中用纯水透析12h。使用火焰原子吸收光谱仪测定透析后液体中的Pb²⁺的浓度。以未胁迫培养提取的胞外聚合物为空白对照，设置3个平行样，实验数据取其平均值。吸附结果见图4所示。

由图4可以看出，恶臭假单胞菌在Cd²⁺胁迫培养后产生的胞外聚合物制成的生物吸附剂对Cd²⁺、Pb²⁺实现高效去除，相对于无胁迫培养处理而提取的胞外聚合物对重金属的吸附效果显著提高。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种恶臭假单胞菌胞外聚合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将恶臭假单胞菌在营养琼脂培养基上进行活化培养，活化成功后转接到LB液体培养基中进行富集培养；

(2)将所述步骤(1)中富集培养后的菌悬液接入LB液体培养基中，添加重金属溶液，对恶臭假单胞菌进行胁迫培养；

(3)提取所述步骤(2)中胁迫培养后的菌悬液中的胞外聚合物。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中活化培养包括以下步骤：将恶臭假单胞菌冻干粉用无菌水溶解后，接种在灭菌后的营养琼脂培养基平板上，在25-35℃下培养18-36h；

所述步骤(1)中富集培养条件为：置于恒温振荡器中，培养时间为18-36h，培养温度为25-35℃、振荡速率为150-200rpm。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中按体积百分比为1-10％将富集培养后的菌悬液接入LB液体培养基中。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中添加重金属溶液后的液体培养基中重金属的浓度为1-100mg/L；

所述步骤(2)中重金属为铜、铅、锌、锡、镍、钴、铬、汞、镉中的至少一种；优选地，所述步骤(2)中重金属溶液为硝酸铅溶液或硝酸镉溶液。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中胁迫培养时间为18-36h。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，在提取胞外聚合物前，通过离心清洗去除培养基和重金属；优选地，所述离心清洗包括以下步骤：将胁迫培养后的菌悬液在温度为2-6℃、转速为4000-10000rpm条件下离心10-20min，倒掉上清液以去除培养基；将去除培养基后的菌悬液加入至25-50mL的0.1-1％NaCl溶液，旋涡振荡使混合物分散均匀，在温度为2-6℃、转速为4000-10000rpm下离心10-20min，倒掉上清液；在此条件下离心清洗三次，以彻底清洗残留的培养基和重金属。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中提取方法包括以下步骤：离心清洗后，加入5-10mL的0.1-1％NaCl溶液，旋涡振荡使混合物分散均匀，在40-60℃温度下水浴加热20-40min，然后在2-6℃、10000-12000rpm的条件下离心10-20min，离心后上清液用滤膜过滤，将滤液转移至透析袋中透析，透析后得到所述恶臭假单胞菌胞外聚合物。

8.一种恶臭假单胞菌胞外聚合物，其特征在于，所述恶臭假单胞菌胞外聚合物是采用如权利要求1-7任一所述的制备方法制备而成的。

9.一种处理重金属废水的方法，其特征在于，所述方法包括将如权利要求8所述的恶臭假单胞菌胞外聚合物投加到重金属废水中进行吸附处理的步骤；

优选地，所述恶臭假单胞菌胞外聚合物的投加量为6.7-26.7mg/L；

优选地，所述重金属废水为低浓度重金属废水。

10.如权利要求8所述的恶臭假单胞菌胞外聚合物在制备生物吸附剂中的用途。

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