CN113341055A - 一种利用高效液相色谱流动相添加法测定苯乳酸异构体含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及利用高效液相色谱流动相添加法测定苯乳酸异构体含量的方法，可有效解决利用高效液相色谱流动相添加法测定苯乳酸异构体含量的问题，其解决的技术方案是，包括以下步骤：a）称取环糊精手性选择剂，将其溶解在100mL含有甲醇或者乙腈的柠檬酸缓冲液中，彻底溶解后，经滤膜进行过滤，再进行超声脱气；b)标准品的制备：分别用柠檬酸缓冲液将L‑苯乳酸、D‑苯乳酸和DL‑苯乳酸配制成浓度为lmg/mL浓度的标准溶液；c）将上述苯乳酸标准品分别进样，用高效液相色谱仪Agilent 1200系统进行分析；本发明操作简单方便，快速、拆分效果理想，灵敏度高，专属性强，成本不高，为苯乳酸异构体建立了一个准确可靠的定性拆分方法。
Description
技术领域
本发明涉及高效液相色谱分析领域，特别是一种利用高效液相色谱流动相添加法测定苯乳酸异构体含量的方法。
背景技术
食品的质量和安全已成为每个人关心的焦点话题之一，化学防腐剂将渐渐被市场所淘汰，因此苯乳酸（PLA）有望开发成为新一代的天然防腐剂，而被应用于食品工业或其他领域，PLA的研究与开发将为各领域的应用提供广阔的发展前景。PLA也称为2-羟基-3-苯基丙酸、β-苯乳酸以及3-苯基乳酸，PLA的第二个碳原子为手性碳原子，因此有D-PLA和L-PLA两种对映异构体。PLA具有广谱抑菌性，能够抑制多种食源性致病菌和腐败菌。是一种继乳酸、醋酸、nisin之后的新型抑菌物质。虽然PLA两种对映异构体的物理性质都相同，但因其各自对应的旋光活性不同，故对生物体作用以及在各领域的应用上存在很大差异，同时对其抑菌性质的报道也不一致，Dieuleveux等研究表明D-PLA抑菌效果稍优L-PLA。但目前对苯乳酸的研究通常是其D型与L型混合物的研究，对抑菌效果良好的D-苯乳酸的方面的研究却很罕见，因此如何定性拆分D或L-苯乳酸意义十分重大。
近二十多年来，手性技术的发展缓慢，拆分费用昂贵的现实尚未得到解决，开发操作相对简便、费用低的拆分方法，可有效降低制备对映体药物的成本，高效液相色谱法是对映体拆分中最常用和最有效的分析技术之一，直接用来拆分对映体是手性液相色谱当前的研究热点，具有简便、快捷、重复性好等优点，而已有的高效液相色谱检测方法是利用手性柱对其进行旋光异构体的拆分，但手性柱的价格较昂贵，并且适用范围较窄。因此，高效液相色谱检测方法的改进是目前亟需解决的问题。
发明内容
针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种利用高效液相色谱流动相添加法测定苯乳酸异构体含量的方法，可有效解决利用高效液相色谱流动相添加法测定苯乳酸异构体含量的问题。
本发明解决的技术方案是，包括以下步骤：
a）称取环糊精手性选择剂，将其溶解在100mL含有甲醇或者乙腈的柠檬酸缓冲液中，彻底溶解后，经滤膜进行过滤，再进行超声脱气；
b) 标准品的制备：分别用柠檬酸缓冲液将L-苯乳酸、D-苯乳酸和DL-苯乳酸配制成浓度为lmg/mL浓度的标准溶液；
c）将上述苯乳酸标准品分别进样，用高效液相色谱仪Agilent 1200系统进行分析，色谱柱是反相C18色谱柱(4.6 mm x250 mm)，流动相为步骤 a) 柠檬酸缓冲液。
所述的高效液相色谱条件为：柱温10-30℃；检测波长范围240-270nm，上样量10-20 μL，流速0.5-1.0mL/min；
所述的柠檬酸缓冲液与有机相体积比为（80：20）-（95：5）；添加的环糊精手性选择剂浓度为2-8mM；
所述的环糊精手性选择剂为α-环糊精衍生物、β--环糊精衍生物、γ-环糊精衍生物的一种；
所述的有机相为甲醇或乙腈；
所述的缓冲液为磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液或柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液的一种。
本发明高效液相色谱手性流动相添加剂法为苯乳酸异构体建立了一个准确可靠的定性拆分方法，采用的分析方法操作简便，检测快速，定量准确，重现性好，是一种适于工业化快速分析的方法。
附图说明
图1为本发明L-苯乳酸标准样品的色谱图。
图2为本发明D-苯乳酸标准样品的色谱图。
图3为本发明DL-苯乳酸标准样品的色谱图。
具体实施方式
以下结合具体实施例和附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1：L-苯乳酸标准样品的检测
将aladdin公司生产的L-苯乳酸用流动相溶液配制成1mg/mL浓度的标准溶液，上样进行高效液相色谱检测分析。
高效液相色谱条件为：高效液相色谱仪Agilent 1200系统；色谱柱：反相C18色谱柱(4.6 mm x250 mm)；流动相；PH4.8，含2mM2-羟丙基-γ-环糊精的柠檬酸缓冲液-乙腈溶液，缓冲液：乙腈体积比90:10，柱温30℃；检测波长范围260nm，上样量20μL，流速：1.0mL/min；
图1是L-苯乳酸标准样品的检测结果图，L-苯乳酸在该层析条件下保留时间约为13.590min，通过积分软件进行L-苯乳酸的峰面积计算，并对样品中L-苯乳酸的定量分析。
实施例2： D-苯乳酸标准样品的检测
将aladdin公司生产的D-苯乳酸用流动相溶液配制成lmg/mL浓度的标准溶液，上样进行高效液相色谱检测分析。
高效液相色谱条件为：高效液相色谱仪Agilent 1200系统；色谱柱：反相C18色谱柱(4.6 mm x250 mm)；流动相；PH4.8，含2mM2-羟丙基-γ-环糊精的柠檬酸缓冲液-乙腈溶液，缓冲液：乙腈体积比90:10，柱温30℃；检测波长范围260nm，上样量20μL，流速：1.0mL/min；
图2 是D-苯乳酸标准样品的检测结果图，D-苯乳酸在该条件下保留时间约为19.017min，通过积分软件进行D-苯乳酸的峰面积计算，并对样品中D-苯乳酸的定量分析。
实施例3： DL-苯乳酸标准样品的检测
将aladdin公司生产的 DL-苯乳酸用流动相溶液配制成lmg/mL浓度的标准溶液，上样进行高效液相色谱检测分析。
高效液相色谱条件为：高效液相色谱仪Agilent 1200系统；色谱柱：反相C18色谱柱(4.6 mm x250 mm)；流动相；PH4.8，含2mM2-羟丙基-γ-环糊精的柠檬酸缓冲液-乙腈溶液，缓冲液：乙腈体积比90:10，柱温30℃；检测波长范围260nm，上样量20μL，流速：1.0mL/min；
图 3 是 DL-苯乳酸标准样品的检测结果图。
L-苯乳酸在该条件下保留时间约为13.786min，D-苯乳酸在该条件下保留时间约为14.956min，通过积分软件进行L-苯乳酸和D-苯乳酸的峰面积计算，并对样品中L-苯乳酸和 D-苯乳酸的定量分析。
本发明的使用情况是，本发明通过L-苯乳酸或D-苯乳酸在该层析条件下测得的保留时间，用积分软件进行L-苯乳酸或D-苯乳酸峰面积的计算，对样品中L-苯乳酸或D-苯乳酸进行定量分析，本发明中的环糊精衍生物无毒，水溶性好，具有较好的立体选择性和较强的手性识别能力，药物对映体进入其空腔与之作用，可以形成色谱行为差异较大的非对映体包合物，实现药物对映体的分离，本发明以α-环糊精衍生物、β--环糊精衍生物、γ-环糊精衍生物作为手性流动相添加剂，采用高效液相色谱手性流动相添加剂法，对DL-苯乳酸进行了拆分，在最佳色谱条件下，苯乳酸的对映异构体分离效果良好。
本发明利用的高效液相色谱手性流动相添加剂法操作简单方便，快速、拆分效果理想，灵敏度高，专属性强，成本不高，不必事先将样品制备成衍生物，而只须将手性试剂加入流动相中，之前有研究报道采用的添加剂大都是环糊精，环糊精在手性分离中表现出独特的手性选择性，它的价格相对便宜，使用方式比较灵活，环糊精分子具有截锥式的圆筒形空腔构型-笼状结构，其分子空腔内径不同,其所能包含的分子大小和类型有差异，为了实现手性分离,手性化合物分子必须进入环糊精分子疏水性空腔，而其极性基团必须与环糊精分子空腔边缘的羟基发生氢键作用，因此选择性与对应异构体分子大小极性等密切相关，限制了天然环糊精的应用范围。
本发明用到的手性流动相添加剂为环糊精衍生物，环糊精衍生物是在环糊精表面的羟基上引入其他基团，一定程度上改变CD的水溶性、疏水性及立体选择性，进而增强其手性选择性，在HPLC法中，手性流动相添加剂法利用手性选择剂与药物消旋体中各对映异构体结合的稳定常数不同，以及药物与结合物在固定相上分配的差异，实现对药物对映异构体的分离，本发明高效液相色谱手性流动相添加剂法为苯乳酸异构体建立了一个准确可靠的定性拆分方法，具有良好的应用和推广价值，社会效益显著。
Claims (6)
1.一种利用高效液相色谱流动相添加法测定苯乳酸异构体含量的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
a）称取环糊精手性选择剂，将其溶解在100mL含有甲醇或者乙腈的柠檬酸缓冲液中，彻底溶解后，经滤膜进行过滤，再进行超声脱气；
b) 标准品的制备：分别用柠檬酸缓冲液将L-苯乳酸、D-苯乳酸和DL-苯乳酸配制成浓度为lmg/mL浓度的标准溶液；
c）将上述苯乳酸标准品分别进样，用高效液相色谱仪Agilent 1200系统进行分析，色谱柱是反相C18色谱柱，流动相为步骤 a) 柠檬酸缓冲液。
2.根据权利要求1所述的利用高效液相色谱流动相添加法测定苯乳酸异构体含量的方法，其特征在于，所述的柠檬酸缓冲液与有机相体积比为（80：20）-（95：5）；添加的环糊精手性选择剂浓度为2-8mM；
所述的环糊精手性选择剂为α-环糊精衍生物、β--环糊精衍生物、γ-环糊精衍生物的一种；
所述的有机相为甲醇或乙腈；
所述的缓冲液为磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液或柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液的一种。
3.根据权利要求1所述的利用高效液相色谱流动相添加法测定苯乳酸异构体含量的方法，其特征在于，高效液相色谱条件为：柱温10-30℃；检测波长范围240-270nm，上样量10-20 μL，流速0.5-1.0mL/min。
4.根据权利要求2所述的利用高效液相色谱流动相添加法测定苯乳酸异构体含量的方法，其特征在于，L-苯乳酸标准样品检测高效液相色谱条件为：高效液相色谱仪Agilent1200系统；色谱柱：4.6 mm x250 mm反相C18色谱柱；流动相：PH4.8，含2mM 2-羟丙基-γ-环糊精的柠檬酸缓冲液-乙腈溶液，缓冲液：乙腈体积比90:10，柱温30℃；检测波长范围260nm，上样量20μL，流速：1.0mL/min。
5.根据权利要求2所述的利用高效液相色谱流动相添加法测定苯乳酸异构体含量的方法，其特征在于，D-苯乳酸标准样品检测高效液相色谱条件为：高效液相色谱仪Agilent1200系统；色谱柱：4.6 mm x250 mm反相C18色谱柱；流动相：PH4.8，含2mM2-羟丙基-γ-环糊精的柠檬酸缓冲液-乙腈溶液，缓冲液：乙腈体积比90:10，柱温30℃；检测波长范围260nm，上样量20μL，流速：1.0mL/min。
6.根据权利要求2所述的利用高效液相色谱流动相添加法测定苯乳酸异构体含量的方法，其特征在于，DL-苯乳酸标准样品检测高效液相色谱条件为：高效液相色谱仪Agilent1200系统；色谱柱：4.6 mm x250 mm反相C18色谱柱；流动相：PH4.8，含2mM2-羟丙基-γ-环糊精的柠檬酸缓冲液-乙腈溶液，缓冲液：乙腈体积比90:10，柱温30℃；检测波长范围260nm，上样量20μL，流速：1.0mL/min。
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