CN113341042B - 一种与Aβ诱导构建的AD细胞模型相关的生物标志物的筛选与应用 - Google Patents

一种与Aβ诱导构建的AD细胞模型相关的生物标志物的筛选与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物标志物领域，尤其涉及一种与Aβ诱导构建的AD细胞模型相关的生物标志物的筛选与应用。所述的生物标志物包括如下一种或几种的组合：Cysteine desulfurase，mitochondrial，编码NFS1；NADH dehydrogenase[ubiquinone]1 alpha subcomplex subunit 9，mitochondrial，编码NDUFA9；3‑hydroxyacyl‑CoA dehydrogenase type‑2，编码HSD17B10；Cytochrome c oxidase subunit NDUFA4，编码NDUFA4；NADH‑ubiquinone oxidoreductase 75 kDa subunit，mitochondrial，编码NDUFS1；Succinate dehydrogenase[ubiquinone]iron‑sulfur subunit，mitochondrial，编码SDHB；NADH dehydrogenase[ubiquinone]iron‑sulfur protein 4，mitochondrial，编码NDUFS4；Lipoprotein lipase，编码LPL；NADH dehydrogenase[ubiquinone]1 alpha subcomplex subunit 5，编码NDUFA5。本发明采用蛋白质组学的方法，在Aβ诱导AD细胞模型中发现一组生物标志物，并且发现这些生物标志物在Aβ诱导的AD细胞模型中相互配合，共同发挥重要作用。本发明丰富了检测Aβ诱导构建的AD细胞模型的方法，为临床研究提供新的靶标。

Description

一种与Aβ诱导构建的AD细胞模型相关的生物标志物的筛选与 应用
技术领域
本发明涉及生物标志物领域。具体地，本发明涉及一种与Aβ诱导构建的AD细胞模型相关的生物标志物的筛选与应用。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是最常见的中枢神经系统退行性疾病，导致认知功能下降、记忆缺陷、神经精神症状等，占痴呆症的50%~75%。随着人类寿命的延长，AD的患病率在65岁以后大约每5年翻1倍。目前，AD患者的数量不断攀升，全球超过1.5亿人受到影响，给家庭和社会带来了巨大负担，已经成为公共卫生的全球性挑战。但由于其发病机制的复杂性，目前没有有效的治疗方法来治愈AD或阻止其发展。因此，AD的早期诊断已成为AD防治工作的重点。AD的临床诊断耗时繁琐，需要结合临床评估、心理测试、影像学检查等，以排除其他神经系统疾病。最新指南明确将生物标记物作为AD临床诊断的指标，尤其在AD发病早期，几乎是唯一手段。
大量的研究证明在临床诊断AD所致痴呆之前的数十年间AD的病理生理过程就已经开始，而能反映这一过程的生物学标志物在AD临床前期这一进程中基本没有变化，所以生物标记物将在AD的早期诊断、病情进展以及治疗效果的评价中发挥重要作用。蛋白质组学在筛选疾病相关生物标志物上显示出较大优势，在阐明AD的分子致病机制及其导致的病理生理变化方面具有广泛的应用前景。虽然近年来对于AD的生物标记物的的研究取得了突破性的进展，但目前各种生物标记物对AD的早期诊断都有其局限性，因此，开发新的生物标志物，建立标准化检测方法，提高AD的鉴别诊断效率是AD研究仍需努力的方向。
细胞模型是研究阿尔茨海默病( Alzheimer’s disease，AD)的有效方法之一，因其具有来源丰富、实验条件易控制、干扰因素小、评价机制灵活的特点而被广泛应用。AD细胞模型为AD发病机制微观层面的研究提供实验对象，并可根据不同的需求选择符合研究目的的细胞模型。Aβ是前体淀粉样蛋白前体蛋白( amy- loid precursor protein，APP)经β-和γ-分泌酶连续剪切后形成长度在39 -42个氨基酸的短肽。APP表达量上升，Aβ产量增加，积聚形成的老年斑是AD的病理学特征之一，目前研究常采用Aβ1-42、Aβ25-35 诱导细胞建立AD细胞模型。
综上所述，基于蛋白质组学方法，在Aβ诱导AD细胞模型中筛选生物标志物，对于AD的早期诊断与干预显得尤为重要。目前，基于蛋白质组学开发AD细胞模型中的新型生物标志物未见报道。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种基于蛋白质组学方法筛选Aβ诱导AD细胞模型中多个标志物，并对筛选出的生物标志物进行包括生物学进程、分子功能等分析发现其在Aβ诱导AD细胞模型中的多个信号通路中相互配合，共同发挥作用，为临床上对于AD预测、诊断、治疗及预后提供新的评估标志物及方法，具有重要意义。
为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案。
本发明提供了一种与Aβ诱导构建的AD细胞模型相关的生物标志物，其特征在于，所述标志物包括如下完整蛋白的一种或几种的组合：
蛋白名称为Cysteine desulfurase，mitochondrial，编码基因为NFS1、蛋白名称为NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 alpha subcomplex subunit 9，mitochondrial，编码基因为NDUFA9、蛋白名称为3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase type-2，编码基因为HSD17B10、蛋白名称为Cytochrome c oxidase subunit NDUFA4，编码基因为NDUFA4、蛋白名称为NADH-ubiquinone oxidoreductase 75 kDa subunit，mitochondrial，编码基因为NDUFS1、蛋白名称为Succinate dehydrogenase [ubiquinone] iron-sulfur subunit，mitochondrial，编码基因为SDHB、蛋白名称为NADH dehydrogenase [ubiquinone] iron-sulfur protein 4，mitochondrial，编码基因为NDUFS4、蛋白名称为Lipoprotein lipase，编码基因为LPL、蛋白名称为NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 alpha subcomplexsubunit 5，编码基因为NDUFA5。
进一步的，所述标志物包括所述完整蛋白的生物降解产物的一种或几种的组合。
进一步地，所述生物标志物的蛋白质氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1~ SEQ IDNO.9所示。
进一步地，所述生物标志物在Aβ诱导AD细胞模型中的多个信号通路中相互配合，共同发挥作用。
本发明还提供一种如上所述任一种与Aβ诱导构建的AD细胞模型相关的生物标志物的应用，其特征在于，所述应用包括用于检测Aβ诱导AD细胞模型。
进一步次，所述应用还包括用于制备检测Aβ诱导AD细胞模型的试剂盒。
本发明还提供一种基于蛋白质组学方法筛选生物标志物的应用，其特征在于，所述应用为用于筛选Aβ诱导构建的AD细胞模型的生物标志物。
本发明还提供一种Aβ诱导构建的AD细胞模型相关的生物标志物的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法包括如下步骤：（1）构建Aβ诱导的AD细胞；（2）蛋白质提取；（3）蛋白质定量；（4）蛋白质酶解；（5）LC-MS/MS 分析；（6）数据库检索；（7）生物信息学分析分析。
进一步地，所述步骤(6)中，数据库为：Uniprot-Homo sapiens(Human)-173343-20191013.fasta，物种：人。
进一步地，所述步骤(7)中，生物信息学分析分析包括：差异蛋白质的GeneOntology(GO)富集分析、差异蛋白质显著性功能分析、差异蛋白KEGG通路分析以及蛋白质相互作用分析。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下。
本发明采用蛋白质组学的方法，研究筛选正常对照组和Aβ诱导AD细胞模型组的差异蛋白，发现了较为稳定的可用于检测Aβ诱导AD细胞模型的一组生物标志物。对筛选出的差异蛋白进行包括生物学进程、分子功能、细胞组分的GO富集分析、蛋白质相互作用以及KEGG信号通路分析，发现这些参与Metabolic pathways与Alzheimer's disease的生物标志物在Aβ诱导的AD细胞模型中相互配合，共同发挥重要作用。这一结果提供了一种检测Aβ诱导AD细胞模型的评估手段并为临床上对于AD预测、诊断、治疗及预后评估方法的研究提供新的技术手段。
附图说明
图1本发明的蛋白质组学技术实验流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例和附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施方式1。
细胞培养。
1.1细胞传代：实验前，超净台与细胞间紫外照射 30min 杀菌，通风10min。将配制好的完全培养液、PBS、胰酶由 4℃转移至室温。使用酒精棉球擦拭操作台后点燃酒精灯，将装有细胞的培养瓶从培养箱中取出，观察培养液颜色及清澈度，在显微镜下观察细胞形态、贴壁情况以及融合度，细胞融合度达到 80%左右可进行传代。将细胞转移至超净台内，吸出培养液，加入 PBS，晃动瓶身，吸掉PBS，反复洗涤三次后，加入胰酶，显微镜下可见细胞变圆，快速吸出胰酶，加入完全培养液终止消化。将细胞吹打成单细胞悬液后，转移至离心管中，2000 转离心 1min，缓慢吸去上清，加入 1ml 完全培养液将细胞吹打成单细胞悬液，将单细胞悬液转移至新的培养瓶中，加入 2ml 完全培养液吹匀，另取两个新培养瓶将 3ml单细胞悬液分装在三瓶中，每瓶再加入 2ml 完全培养液吹匀，瓶口过火后拧紧瓶盖，在瓶上做好标记，放入培养箱中继续培养。
1.2细胞冻存：在超净台内，吸去废弃的培养液，加入 PBS，反复三次洗涤，用移液器吸净瓶内 PBS 后，加入胰酶消化细胞，细胞消化成熟后加入完全培养液终止消化，将细胞吹打成单细胞悬液后转移至离心管内，2000 转离心 1min，吸去上清，缓慢滴入1ml 细胞冻存液，将细胞吹打为单细胞悬液后转移至冻存管内，盖紧瓶盖，用封口膜封口，在管壁上做好标记，放入梯度降温盒内，置于-80℃冰箱保存。
1.3细胞复苏：从液氮中取出装有细胞的冻存管，放入提前预热好的 37℃水浴锅内，不断摇动，使细胞在 1min 内溶解，细胞溶解后，1200 转离心 3min，用酒精轻轻擦拭冻存管消毒后转移至超净台内，缓慢吸掉上清，加入含 10%胎牛血清的完全培养液吹打细胞成单细胞悬液，将细胞转移至培养瓶中，加入含 10%胎牛血清的完全培养液，用移液器混匀细胞，瓶盖过火后盖紧，做好标记，放入培养箱内培养。
实验分组及Aβ诱导AD细胞模型构建。
将处于对数生长期的 SH-SY5Y 细胞分为2组：对照组和模型组。待细胞贴壁后，对照组给予含10%空白血清的完全培养液；模型组给予含 10%空白血清的完全培养液和终浓度为 20μmol/L的Aβ1-42寡聚体（根据前期预实验的结果，确定 Aβ1-42寡聚体的给药浓度）各组加药完成后培养48h。Aβ诱导AD细胞模型组VS正常对照组，为减少实验误差，Aβ诱导AD细胞模型组、正常对照组各设置3个组别。
实验技术流程(图1)。
3.1 .样本制备。
（1）取样本加入 300 µL SDT，沸水浴 5min，超声 2min，再沸水浴 5min，4℃20000g 离心取上清。
（2）使用 BCA 法进行蛋白定量。每例样品各取 300ug 蛋白进行 FASP 酶解，每例样品中分别加 DTT 至 100mM，沸水浴 5min，冷却至室温。
（3）加入 200µL UA buffer (8M Urea，150mM Tris-HCl，pH8.0)混匀，转入 10KD超滤离心管，离心 12000g 15min。
（4）加入 200µL UA buffer 离心 12000g 15min，弃滤液。
（5）加入 100µL IAA(50mM IAA in UA)，600rpm 振荡 1min，避光室温 30min，离心 12000g 10min。
（6）加入 100µL UA buffer，离心 12000g 10min 重复 2 次。
（7）加入 100µL NH4HCO3 buffer，离心 14000g 10min 重复 2 次。
（8）加入 40µL Trypsin buffer (6µg Trypsin in 40µL NH4HCO3 buffer)，600rpm 振荡 1min，37℃ 16-18h。换新收集管，离心 12000g 10min，收集滤液，加入适量0.1% TFA 溶液。
（9）酶解后的肽段使用 C18 Cartridge 脱盐，真空冻干。
（10）酶解后的肽段干燥后用 0.1% FA 复溶，肽段浓度测定，以备 LC-MS 分析。
3.2.LC-MS/MS 分析 。
（1）每例样品取适量肽段使用纳升流速 Easy nLC 1200 色谱系统(ThermoScientific) 进行色谱分离。
（2）色谱柱以95%的0.1%甲酸水溶液平衡。
（3）样品进样到 Trap Column后经过色谱分析柱进行梯度分离。
（4）肽段分离后用 Q-Exactive Plus 质谱仪（Thermo Scientific）进行 DDA（数据依赖采集）质谱分析。
（5）肽段二级质谱分析按照下列方法采集：每次全扫描（full scan）后触发采集15 个最高强度母离子的二级质谱图谱（MS2 scan），二级质谱分辨率：17,500 @ m/z 200，AGC target: 1e5，二级 Maximum IT：100 ms，MS2 Activation Type: HCD，Isolationwindow：1.6 Th，Normalized collision energy：27。
3.3.质谱鉴定、分析。
项目采用的质谱数据库检索软件为 MaxQuant 1.6.0.16。使用Uniprot datebase，蛋白质数据库：Uniprot-Homo sapiens(Human)-173343-20191013.fasta，物种：人。
结果分析。
步骤3.3的分析结果对模型组和正常对照组进行对比实验，定量蛋白质组学研究结果显示：鉴定2232个蛋白；与正常对照组相比，其中符合表达差异倍数大于 2 倍（上、下调）且 P-value 小于 0.05 的显著性差异表达蛋白质共336个，其中上调蛋白172个，下调蛋白164，两个比较组中差异蛋白的变化倍数为上下调20倍及以上的为有无差异蛋白，有无差异的蛋白共173个。
实施方式2。
2.1生物信息学分析。
利用Panther Classificition System对筛选出的差异蛋白进行包括生物学进程、分子功能和细胞组分的GO富集分析；利用STRING分析软件对差异蛋白进行蛋白质相互作用分析；对差异蛋白进行KEGG信号通路分析。
结果分析 。
差异蛋白质的Gene Ontology(GO)富集分析。
对AD细胞模型和正常对照组表达蛋白分别从细胞生物学过程、细胞组分以及分子功能进行GO功能富集分析。发现差异蛋白在生物学过程中，cellular process、single-organism process、metabolic process、single-organism cellular process、cellularmetabolic process等显示了较良好的富集效果；在细胞组分中，cell、cell part、intracellular、intracellular part、organelle等显示了较良好的富集效果；在分子功能中，binding、protein binding、organic cyclic compound binding、heterocycliccompound binding、ion binding等显示了较好的富集效果。
差异蛋白质显著性功能分析。
利用PANTHER蛋白相关通路分析软件对AD模型组和正常对照组差异表达蛋白进行GO功能聚类注释分析，分别从差异蛋白参与的生物学过程、所属的细胞组分及其分子功能，三个发面进行具体分析。分子共发现差异蛋白在细胞参与的生物学过程富集中，在Cellular componet organization or biogenesis、cellular component organization、organelle organization、macromolecular complex subunit organization、organelleorganization、macromolecular complex subunit organization、cellular metabolicprocess、protein complex subunit organization 等过程中有较好的富集效果。在细胞组分富集中，membrane-bounded organelle、extracellular membrane-boundedorganelle、cytoplasm、extracellular exosome、extracellular vesicle、extracellularorganelle、cytoplasmic part、intracellular part、intracellular organelle part、organelle part等显示了较好的富集结果。在分子功能富集中，protein binding、poly（A）RNA binding、binding、identical protein binding、RNA binding、enzyme binding、protein N-terminus binding、small molecule binding、macromolecular complexbinding、protein dimerization activity等显示了较好的富集效果。
差异蛋白KEGG通路分析。
通过查阅KEGG有关Pathway的主要公共数据库对所鉴定得到的差异蛋白进行KEGG通路注释，共发现186例差异蛋白主要参与的信号通路：Metabolic pathways、Carbonmetabolism、Biosynthesis of amino acids、Valine, leucine and isoleucinedegradation、Parkinson's disease、Citrate cycle (TCA cycle)、Fatty aciddegradation、2-Oxocarboxylic acid metabolism、Propanoate metabolism、Fatty acidmetabolism、PPAR signaling pathway、Huntington's disease、Pentose phosphatepathway、Other glycan degradation、Alzheimer's disease、RNA transport、Oocytemeiosis、Terpenoid backbone biosynthesis、Glycine, serine and threoninemetabolism、Pyruvate metabolism等。其中Metabolic pathways发生显著性变化，在本研究鉴定到的差异蛋白中，NFS1是参与该通路的重要蛋白；LPL、NDUFA9、HSD17B10、NDUFA4、NDUFS1、SDHB、NDUFS4、NADUFA5都在Alzheimer's disease通路中发生显著性改变，其中NDUFA9、HSD17B10、NDUFA4、NDUFS1、SDHB、NDUFS4也参与了Metabolic pathways。以此提示，这些参与Metabolic pathways与Alzheimer's disease的差异蛋白在Aβ诱导SH-SY5Y细胞构建AD细胞模型中起着重要作用。
蛋白质相互作用分析。
为了研究AD模型组和正常对照组差异表达蛋白之间的相互作用我们对差异表达蛋白进行了STRING分析。结果显示NDUFA9（SDHB、NDUFA5、NDUFS4、NDUFA4）、NDUFS1（NDUFA5）、NDUFS4（SDHB、NDUFA5、NDUFA4）连接程度较高，它们之间形成了紧密相连。以此提示，这些蛋白在Aβ诱导SH-SY5Y细胞构建AD细胞膜型中，相互配合，共同发挥重要作用。
筛选结果
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
本发明能够可靠、快速的基于蛋白质组学技术方案来发现Aβ诱导SH-SY5Y细胞构建AD细胞模型的特异性蛋白标记物，为检测Aβ诱导SH-SY5Y细胞构建AD细胞模型是否成功建立了一种简便、实用的监测评估手段；本发明发现的生物标记物Aβ诱导AD细胞模型中的多个信号通路中相互配合，共同发挥作用。
如上所述的实施方式的目的在于对本发明的具体实施方式作进一步的说明，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术方案所作的任何简单修改、变更及等效变化，均仍落入本发明技术方案的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 辽宁中医药大学
<120> 一种与Aβ诱导构建的AD细胞模型相关的生物标志物的筛选与应用
<130> 2021.6.18
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 457
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Leu Leu Arg Ala Ala Trp Arg Arg Ala Ala Val Ala Val Thr Ala
1 5 10 15
Ala Pro Gly Pro Lys Pro Ala Ala Pro Thr Arg Gly Leu Arg Leu Arg
20 25 30
Val Gly Asp Arg Ala Pro Gln Ser Ala Val Pro Ala Asp Thr Ala Ala
35 40 45
Ala Pro Glu Val Gly Pro Val Leu Arg Pro Leu Tyr Met Asp Val Gln
50 55 60
Ala Thr Thr Pro Leu Asp Pro Arg Val Leu Asp Ala Met Leu Pro Tyr
65 70 75 80
Leu Ile Asn Tyr Tyr Gly Asn Pro His Ser Arg Thr His Ala Tyr Gly
85 90 95
Trp Glu Ser Glu Ala Ala Met Glu Arg Ala Arg Gln Gln Val Ala Ser
100 105 110
Leu Ile Gly Ala Asp Pro Arg Glu Ile Ile Phe Thr Ser Gly Ala Thr
115 120 125
Glu Ser Asn Asn Ile Ala Ile Lys Gly Val Ala Arg Phe Tyr Arg Ser
130 135 140
Arg Lys Lys His Leu Ile Thr Thr Gln Thr Glu His Lys Cys Val Leu
145 150 155 160
Asp Ser Cys Arg Ser Leu Glu Ala Glu Gly Phe Gln Val Thr Tyr Leu
165 170 175
Pro Val Gln Lys Ser Gly Ile Ile Asp Leu Lys Glu Leu Glu Ala Ala
180 185 190
Ile Gln Pro Asp Thr Ser Leu Val Ser Val Met Thr Val Asn Asn Glu
195 200 205
Ile Gly Val Lys Gln Pro Ile Ala Glu Ile Gly Arg Ile Cys Ser Ser
210 215 220
Arg Lys Val Tyr Phe His Thr Asp Ala Ala Gln Ala Val Gly Lys Ile
225 230 235 240
Pro Leu Asp Val Asn Asp Met Lys Ile Asp Leu Met Ser Ile Ser Gly
245 250 255
His Lys Ile Tyr Gly Pro Lys Gly Val Gly Ala Ile Tyr Ile Arg Arg
260 265 270
Arg Pro Arg Val Arg Val Glu Ala Leu Gln Ser Gly Gly Gly Gln Glu
275 280 285
Arg Gly Met Arg Ser Gly Thr Val Pro Thr Pro Leu Val Val Gly Leu
290 295 300
Gly Ala Ala Cys Glu Val Ala Gln Gln Glu Met Glu Tyr Asp His Lys
305 310 315 320
Arg Ile Ser Lys Leu Ser Glu Arg Leu Ile Gln Asn Ile Met Lys Ser
325 330 335
Leu Pro Asp Val Val Met Asn Gly Asp Pro Lys His His Tyr Pro Gly
340 345 350
Cys Ile Asn Leu Ser Phe Ala Tyr Val Glu Gly Glu Ser Leu Leu Met
355 360 365
Ala Leu Lys Asp Val Ala Leu Ser Ser Gly Ser Ala Cys Thr Ser Ala
370 375 380
Ser Leu Glu Pro Ser Tyr Val Leu Arg Ala Ile Gly Thr Asp Glu Asp
385 390 395 400
Leu Ala His Ser Ser Ile Arg Phe Gly Ile Gly Arg Phe Thr Thr Glu
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Leu Arg Glu Met Ser Pro Leu Trp Glu Met Val Gln Asp Gly Ile Asp
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Leu Lys Ser Ile Lys Trp Thr Gln His
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Ser Ser Val Ser Gly Ile Val Ala Thr Val Phe Gly Ala Thr Gly Phe
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Leu Gly Arg Tyr Val Val Asn His Leu Gly Arg Met Gly Ser Gln Val
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85 90 95
Ala Ser Lys Thr Tyr Asn Leu Lys Lys Gly Gln Thr His Thr Leu Glu
100 105 110
Asp Phe Gln Arg Val Leu Asp Val Asn Leu Met Gly Thr Phe Asn Val
115 120 125
Ile Arg Leu Val Ala Gly Glu Met Gly Gln Asn Glu Pro Asp Gln Gly
130 135 140
Gly Gln Arg Gly Val Ile Ile Asn Thr Ala Ser Val Ala Ala Phe Glu
145 150 155 160
Gly Gln Val Gly Gln Ala Ala Tyr Ser Ala Ser Lys Gly Gly Ile Val
165 170 175
Gly Met Thr Leu Pro Ile Ala Arg Asp Leu Ala Pro Ile Gly Ile Arg
180 185 190
Val Met Thr Ile Ala Pro Gly Leu Phe Gly Thr Pro Leu Leu Thr Ser
195 200 205
Leu Pro Glu Lys Val Cys Asn Phe Leu Ala Ser Gln Val Pro Phe Pro
210 215 220
Ser Arg Leu Gly Asp Pro Ala Glu Tyr Ala His Leu Val Gln Ala Ile
225 230 235 240
Ile Glu Asn Pro Phe Leu Asn Gly Glu Val Ile Arg Leu Asp Gly Ala
245 250 255
Ile Arg Met Gln Pro
260
<210> 4
<211> 81
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Met Leu Arg Gln Ile Ile Gly Gln Ala Lys Lys His Pro Ser Leu Ile
1 5 10 15
Pro Leu Phe Val Phe Ile Gly Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Leu Tyr
20 25 30
Leu Leu Arg Leu Ala Leu Phe Asn Pro Asp Val Cys Trp Asp Arg Asn
35 40 45
Asn Pro Glu Pro Trp Asn Lys Leu Gly Pro Asn Asp Gln Tyr Lys Phe
50 55 60
Tyr Ser Val Asn Val Asp Tyr Ser Lys Leu Lys Lys Glu Arg Pro Asp
65 70 75 80
Phe
<210> 5
<211> 727
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Met Leu Arg Ile Pro Val Arg Lys Ala Leu Val Gly Leu Ser Lys Ser
1 5 10 15
Pro Lys Gly Cys Val Arg Thr Thr Ala Thr Ala Ala Ser Asn Leu Ile
20 25 30
Glu Val Phe Val Asp Gly Gln Ser Val Met Val Glu Pro Gly Thr Thr
35 40 45
Val Leu Gln Ala Cys Glu Lys Val Gly Met Gln Ile Pro Arg Phe Cys
50 55 60
Tyr His Glu Arg Leu Ser Val Ala Gly Asn Cys Arg Met Cys Leu Val
65 70 75 80
Glu Ile Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ala Ala Cys Ala Met Pro Val
85 90 95
Met Lys Gly Trp Asn Ile Leu Thr Asn Ser Glu Lys Ser Lys Lys Ala
100 105 110
Arg Glu Gly Val Met Glu Phe Leu Leu Ala Asn His Pro Leu Asp Cys
115 120 125
Pro Ile Cys Asp Gln Gly Gly Glu Cys Asp Leu Gln Asp Gln Ser Met
130 135 140
Met Phe Gly Asn Asp Arg Ser Arg Phe Leu Glu Gly Lys Arg Ala Val
145 150 155 160
Glu Asp Lys Asn Ile Gly Pro Leu Val Lys Thr Ile Met Thr Arg Cys
165 170 175
Ile Gln Cys Thr Arg Cys Ile Arg Phe Ala Ser Glu Ile Ala Gly Val
180 185 190
Asp Asp Leu Gly Thr Thr Gly Arg Gly Asn Asp Met Gln Val Gly Thr
195 200 205
Tyr Ile Glu Lys Met Phe Met Ser Glu Leu Ser Gly Asn Ile Ile Asp
210 215 220
Ile Cys Pro Val Gly Ala Leu Thr Ser Lys Pro Tyr Ala Phe Thr Ala
225 230 235 240
Arg Pro Trp Glu Thr Arg Lys Thr Glu Ser Ile Asp Val Met Asp Ala
245 250 255
Val Gly Ser Asn Ile Val Val Ser Thr Arg Thr Gly Glu Val Met Arg
260 265 270
Ile Leu Pro Arg Met His Glu Asp Ile Asn Glu Glu Trp Ile Ser Asp
275 280 285
Lys Thr Arg Phe Ala Tyr Asp Gly Leu Lys Arg Gln Arg Leu Thr Glu
290 295 300
Pro Met Val Arg Asn Glu Lys Gly Leu Leu Thr Tyr Thr Ser Trp Glu
305 310 315 320
Asp Ala Leu Ser Arg Val Ala Gly Met Leu Gln Ser Phe Gln Gly Lys
325 330 335
Asp Val Ala Ala Ile Ala Gly Gly Leu Val Asp Ala Glu Ala Leu Val
340 345 350
Ala Leu Lys Asp Leu Leu Asn Arg Val Asp Ser Asp Thr Leu Cys Thr
355 360 365
Glu Glu Val Phe Pro Thr Ala Gly Ala Gly Thr Asp Leu Arg Ser Asn
370 375 380
Tyr Leu Leu Asn Thr Thr Ile Ala Gly Val Glu Glu Ala Asp Val Val
385 390 395 400
Leu Leu Val Gly Thr Asn Pro Arg Phe Glu Ala Pro Leu Phe Asn Ala
405 410 415
Arg Ile Arg Lys Ser Trp Leu His Asn Asp Leu Lys Val Ala Leu Ile
420 425 430
Gly Ser Pro Val Asp Leu Thr Tyr Thr Tyr Asp His Leu Gly Asp Ser
435 440 445
Pro Lys Ile Leu Gln Asp Ile Ala Ser Gly Ser His Pro Phe Ser Gln
450 455 460
Val Leu Lys Glu Ala Lys Lys Pro Met Val Val Leu Gly Ser Ser Ala
465 470 475 480
Leu Gln Arg Asn Asp Gly Ala Ala Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Ile
485 490 495
Ala Gln Lys Ile Arg Met Thr Ser Gly Val Thr Gly Asp Trp Lys Val
500 505 510
Met Asn Ile Leu His Arg Ile Ala Ser Gln Val Ala Ala Leu Asp Leu
515 520 525
Gly Tyr Lys Pro Gly Val Glu Ala Ile Arg Lys Asn Pro Pro Lys Val
530 535 540
Leu Phe Leu Leu Gly Ala Asp Gly Gly Cys Ile Thr Arg Gln Asp Leu
545 550 555 560
Pro Lys Asp Cys Phe Ile Ile Tyr Gln Gly His His Gly Asp Val Gly
565 570 575
Ala Pro Ile Ala Asp Val Ile Leu Pro Gly Ala Ala Tyr Thr Glu Lys
580 585 590
Ser Ala Thr Tyr Val Asn Thr Glu Gly Arg Ala Gln Gln Thr Lys Val
595 600 605
Ala Val Thr Pro Pro Gly Leu Ala Arg Glu Asp Trp Lys Ile Ile Arg
610 615 620
Ala Leu Ser Glu Ile Ala Gly Met Thr Leu Pro Tyr Asp Thr Leu Asp
625 630 635 640
Gln Val Arg Asn Arg Leu Glu Glu Val Ser Pro Asn Leu Val Arg Tyr
645 650 655
Asp Asp Ile Glu Gly Ala Asn Tyr Phe Gln Gln Ala Asn Glu Leu Ser
660 665 670
Lys Leu Val Asn Gln Gln Leu Leu Ala Asp Pro Leu Val Pro Pro Gln
675 680 685
Leu Thr Ile Lys Asp Phe Tyr Met Thr Asp Ser Ile Ser Arg Ala Ser
690 695 700
Gln Thr Met Ala Lys Cys Val Lys Ala Val Thr Glu Gly Ala Gln Ala
705 710 715 720
Val Glu Glu Pro Ser Ile Cys
725
<210> 6
<211> 200
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Met Phe Asn Leu Thr Leu Val His Tyr Lys Ala Ser Arg Gly Ala Gln
1 5 10 15
Thr Ala Ala Ala Thr Ala Pro Arg Ile Lys Lys Phe Ala Ile Tyr Arg
20 25 30
Trp Asp Pro Asp Lys Ala Gly Asp Lys Pro His Met Gln Thr Tyr Glu
35 40 45
Val Asp Leu Asn Lys Cys Gly Pro Met Val Leu Asp Ala Leu Ile Lys
50 55 60
Ile Lys Asn Glu Val Asp Ser Thr Leu Thr Phe Arg Arg Ser Cys Arg
65 70 75 80
Glu Gly Ile Cys Gly Ser Cys Ala Met Asn Ile Asn Gly Gly Asn Thr
85 90 95
Leu Ala Cys Thr Arg Arg Ile Asp Thr Asn Leu Asn Lys Val Ser Lys
100 105 110
Ile Tyr Pro Leu Pro His Met Tyr Val Ile Lys Asp Leu Val Pro Asp
115 120 125
Leu Ser Asn Phe Tyr Ala Gln Tyr Lys Ser Ile Glu Pro Tyr Leu Lys
130 135 140
Lys Lys Asp Glu Ser Gln Glu Gly Lys Gln Gln Tyr Leu Gln Ser Ile
145 150 155 160
Glu Glu Arg Glu Lys Leu Asp Gly Leu Tyr Glu Cys Ile Leu Cys Ala
165 170 175
Cys Cys Ser Thr Ser Cys Pro Ser Tyr Trp Trp Asn Gly Asp Lys Tyr
180 185 190
Leu Gly Pro Ala Val Leu Met Gln
195 200
<210> 7
<211> 175
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Met Ala Ala Val Ser Met Ser Val Val Leu Arg Gln Thr Leu Trp Arg
1 5 10 15
Arg Arg Ala Val Ala Val Ala Ala Leu Ser Val Ser Arg Val Pro Thr
20 25 30
Arg Ser Leu Arg Thr Ser Thr Trp Arg Leu Ala Gln Asp Gln Thr Gln
35 40 45
Asp Thr Gln Leu Ile Thr Val Asp Glu Lys Leu Asp Ile Thr Thr Leu
50 55 60
Thr Gly Val Pro Glu Glu His Ile Lys Thr Arg Lys Val Arg Ile Phe
65 70 75 80
Val Pro Ala Arg Asn Asn Met Gln Ser Gly Val Asn Asn Thr Lys Lys
85 90 95
Trp Lys Met Glu Phe Asp Thr Arg Glu Arg Trp Glu Asn Pro Leu Met
100 105 110
Gly Trp Ala Ser Thr Ala Asp Pro Leu Ser Asn Met Val Leu Thr Phe
115 120 125
Ser Thr Lys Glu Asp Ala Val Ser Phe Ala Glu Lys Asn Gly Trp Ser
130 135 140
Tyr Asp Ile Glu Glu Arg Lys Val Pro Lys Pro Lys Ser Lys Ser Tyr
145 150 155 160
Gly Ala Asn Phe Ser Trp Asn Lys Arg Thr Arg Val Ser Thr Lys
165 170 175
<210> 8
<211> 475
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Met Glu Ser Lys Ala Leu Leu Val Leu Thr Leu Ala Val Trp Leu Gln
1 5 10 15
Ser Leu Thr Ala Ser Arg Gly Gly Val Ala Ala Ala Asp Gln Arg Arg
20 25 30
Asp Phe Ile Asp Ile Glu Ser Lys Phe Ala Leu Arg Thr Pro Glu Asp
35 40 45
Thr Ala Glu Asp Thr Cys His Leu Ile Pro Gly Val Ala Glu Ser Val
50 55 60
Ala Thr Cys His Phe Asn His Ser Ser Lys Thr Phe Met Val Ile His
65 70 75 80
Gly Trp Thr Val Thr Gly Met Tyr Glu Ser Trp Val Pro Lys Leu Val
85 90 95
Ala Ala Leu Tyr Lys Arg Glu Pro Asp Ser Asn Val Ile Val Val Asp
100 105 110
Trp Leu Ser Arg Ala Gln Glu His Tyr Pro Val Ser Ala Gly Tyr Thr
115 120 125
Lys Leu Val Gly Gln Asp Val Ala Arg Phe Ile Asn Trp Met Glu Glu
130 135 140
Glu Phe Asn Tyr Pro Leu Asp Asn Val His Leu Leu Gly Tyr Ser Leu
145 150 155 160
Gly Ala His Ala Ala Gly Ile Ala Gly Ser Leu Thr Asn Lys Lys Val
165 170 175
Asn Arg Ile Thr Gly Leu Asp Pro Ala Gly Pro Asn Phe Glu Tyr Ala
180 185 190
Glu Ala Pro Ser Arg Leu Ser Pro Asp Asp Ala Asp Phe Val Asp Val
195 200 205
Leu His Thr Phe Thr Arg Gly Ser Pro Gly Arg Ser Ile Gly Ile Gln
210 215 220
Lys Pro Val Gly His Val Asp Ile Tyr Pro Asn Gly Gly Thr Phe Gln
225 230 235 240
Pro Gly Cys Asn Ile Gly Glu Ala Ile Arg Val Ile Ala Glu Arg Gly
245 250 255
Leu Gly Asp Val Asp Gln Leu Val Lys Cys Ser His Glu Arg Ser Ile
260 265 270
His Leu Phe Ile Asp Ser Leu Leu Asn Glu Glu Asn Pro Ser Lys Ala
275 280 285
Tyr Arg Cys Ser Ser Lys Glu Ala Phe Glu Lys Gly Leu Cys Leu Ser
290 295 300
Cys Arg Lys Asn Arg Cys Asn Asn Leu Gly Tyr Glu Ile Asn Lys Val
305 310 315 320
Arg Ala Lys Arg Ser Ser Lys Met Tyr Leu Lys Thr Arg Ser Gln Met
325 330 335
Pro Tyr Lys Val Phe His Tyr Gln Val Lys Ile His Phe Ser Gly Thr
340 345 350
Glu Ser Glu Thr His Thr Asn Gln Ala Phe Glu Ile Ser Leu Tyr Gly
355 360 365
Thr Val Ala Glu Ser Glu Asn Ile Pro Phe Thr Leu Pro Glu Val Ser
370 375 380
Thr Asn Lys Thr Tyr Ser Phe Leu Ile Tyr Thr Glu Val Asp Ile Gly
385 390 395 400
Glu Leu Leu Met Leu Lys Leu Lys Trp Lys Ser Asp Ser Tyr Phe Ser
405 410 415
Trp Ser Asp Trp Trp Ser Ser Pro Gly Phe Ala Ile Gln Lys Ile Arg
420 425 430
Val Lys Ala Gly Glu Thr Gln Lys Lys Val Ile Phe Cys Ser Arg Glu
435 440 445
Lys Val Ser His Leu Gln Lys Gly Lys Ala Pro Ala Val Phe Val Lys
450 455 460
Cys His Asp Lys Ser Leu Asn Lys Lys Ser Gly
465 470 475
<210> 9
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Met Ala Gly Val Leu Lys Lys Thr Thr Gly Leu Val Gly Leu Ala Val
1 5 10 15
Cys Asn Thr Pro His Glu Arg Leu Arg Ile Leu Tyr Thr Lys Ile Leu
20 25 30
Asp Val Leu Glu Glu Ile Pro Lys Asn Ala Ala Tyr Arg Lys Tyr Thr
35 40 45
Glu Gln Ile Thr Asn Glu Lys Leu Ala Met Val Lys Ala Glu Pro Asp
50 55 60
Val Lys Lys Leu Glu Asp Gln Leu Gln Gly Gly Gln Leu Glu Glu Val
65 70 75 80
Ile Leu Gln Ala Glu His Glu Leu Asn Leu Ala Arg Lys Met Arg Glu
85 90 95
Trp Lys Leu Trp Glu Pro Leu Val Glu Glu Pro Pro Ala Asp Gln Trp
100 105 110
Lys Trp Pro Ile
115

Claims (5)

1.一种与Aβ诱导构建的AD细胞模型相关的生物标志物的应用，其特征在于，所述应用包括用于检测Aβ1-42寡聚体诱导SH-SY5Y细胞构建AD细胞模型是否成功，所述标志物包括如下完整蛋白：
蛋白名称为Cysteine desulfurase，mitochondrial，编码基因为NFS1、蛋白名称为NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 alpha subcomplex subunit 9，mitochondrial，编码基因为NDUFA9、蛋白名称为3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase type-2，编码基因为HSD17B10、蛋白名称为Cytochrome c oxidase subunit NDUFA4，编码基因为NDUFA4、蛋白名称为NADH-ubiquinone oxidoreductase 75 kDa subunit，mitochondrial，编码基因为NDUFS1、蛋白名称为Succinate dehydrogenase [ubiquinone] iron-sulfur subunit，mitochondrial，编码基因为SDHB、蛋白名称为NADH dehydrogenase [ubiquinone] iron-sulfur protein 4，mitochondrial，编码基因为NDUFS4、蛋白名称为Lipoprotein lipase，编码基因为LPL以及蛋白名称为NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 alpha subcomplexsubunit 5，编码基因为NDUFA5；
与正常对照组相比，AD细胞模型中，Cysteine desulfurase，mitochondrial、NADHdehydrogenase [ubiquinone] 1 alpha subcomplex subunit 9，mitochondrial、3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase type-2、Cytochrome c oxidase subunit NDUFA4、NADH-ubiquinone oxidoreductase 75 kDa subunit，mitochondrial、Succinatedehydrogenase [ubiquinone] iron-sulfur subunit，mitochondrial、NADHdehydrogenase [ubiquinone] iron-sulfur protein 4，mitochondrial以及Lipoproteinlipase上调，NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 alpha subcomplex subunit 5下调；
所述生物标志物的蛋白质氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1~ SEQ ID NO.9所示；
所述AD为阿尔茨海默病。
2.根据权利要求1所述一种与Aβ诱导构建的AD细胞模型相关的生物标志物的应用，其特征在于，所述应用还包括用于制备检测Aβ诱导AD细胞模型的试剂盒。
3.如权利要求1所述的一种与Aβ诱导构建的AD细胞模型相关的生物标志物的应用，其特征在于，其中相关生物标志物的筛选方法包括如下步骤：（1）构建Aβ诱导的AD细胞；（2）蛋白质提取；（3）蛋白质定量；（4）蛋白质酶解；（5）LC-MS/MS 分析；（6）数据库检索；（7）生物信息学分析。
4.根据权利要求3所述的一种与Aβ诱导构建的AD细胞模型相关的生物标志物的应用，其特征在于，步骤(6)中，数据库为：Uniprot-Homo sapiens Human-173343-20191013.fasta，物种：人。
5.根据权利要求3所述的一种与Aβ诱导构建的AD细胞模型相关的生物标志物的应用，其特征在于，步骤(7)中，生物信息学分析包括：差异蛋白质的Gene Ontology富集分析、差异蛋白质显著性功能分析、差异蛋白KEGG通路分析以及蛋白质相互作用分析。
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基于组学数据整合分析的阿尔兹海默病研究;白周现;《中国博士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》;20161115(第11期);第E071-9页 *
氧应激、线粒体DNA突变与阿尔茨海默病发生发展关系的研究;邱小忠;《中国优秀博硕士学位论文全文数据库 (博士)医药卫生科技辑》;20020615(第01期);第E071-2页 *

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