CN113341009B - 一种广州管圆线虫病早期诊断尿液生物标志物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于广州管圆线虫病早期诊断的尿液生物标志物，所述尿液生物标志物为3,4,5‑三羟基‑6‑{[2‑(4‑羟基苯基)‑4‑氧代‑4H‑铬‑3‑基]氧基}氧烷‑2‑羧酸、2‑[3‑(磺氧基)苯基]乙酸、2‑辛烯基甘氨酸或赤霉素4’‑O‑葡糖醛酸3,4,5‑三羟基‑6‑{[2‑(4‑羟基苯基)‑4‑氧代‑4H‑铬‑3‑基]氧基}氧烷‑2‑羧酸、2‑[3‑(磺氧基)苯基]乙酸、2‑辛烯基甘氨酸或赤霉素4’‑O‑葡糖醛酸中的一种或多种；所述标志物的灵敏度及特异度均大于0.9，曲线下面积(AUC)均大于0.9，表明这四个指标预测性较好，可用于广州管圆线虫病早期诊断。本发明还公开了基于代谢组学的广州管圆线虫病早期诊断尿液生物标志物的筛选方法，所述筛选方法能够准确反映广州管圆线虫病感染小鼠与正常小鼠的代谢谱差异，特异性高。

Description

一种广州管圆线虫病早期诊断尿液生物标志物及其应用
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，更具体地，涉及一种广州管圆线虫病早期诊断尿液生物标志物及筛选方法和应用。
背景技术
广州管圆线虫病是由广州管圆线虫（Angiostrongylus cantonensis）感染而引起的一种重要的食源性人兽共患寄生虫病，主要分布于热带和亚热带地区，迄今全球已报道的病例超过3000例，被WHO列为21世纪新出现的全球威胁性传染病。
广州管圆线虫的生活史包括成虫、卵、幼虫3个发育阶段，成虫寄生于适宜宿主如褐家鼠和黑家鼠等大鼠的肺动脉内，而人和小鼠是其非适宜宿主，多因食生或半生含Ⅲ期幼虫的淡水螺肉或转续宿主以及污染的水和蔬菜等感染。幼虫随血流进入脑部后引起中枢神经系统的损害和炎性反应，如嗜酸粒细胞增多性脑膜炎和脑膜脑炎等，主要的临床表现为头痛、颈强直、发热、恶心、呕吐、下肢无力、肌肉痛、感觉异常、麻痹等，严重时可出现认知障碍、精神错乱、嗜睡、 昏迷甚至死亡。
目前广州管圆线虫病的诊断主要依据流行病学史、临床表现和实验室检查三方面综合判定。实验室检查包括病原学检查，即从患者脑脊液中查找虫体, 但检获率很低，约为10 %，另可见患者脑脊液压力升高，白细胞总数明显增多，外周血、脑脊液中嗜酸性粒细胞绝对值及比例均显著增高；尿液免疫学检查，如ELISA检测尿液中抗体；影像学检查也具有辅助诊断的意义。然而，上述诊断方法或特异度较低，或灵敏度较低，且不适于早期诊断；因此，亟需找寻可用于早期诊断广州管圆线虫病的方法。
代谢组学（metabolomics）是继基因组学和蛋白质组学后发展起来的一门关于生物体系受刺激或扰动后其小分子代谢产物（分子量<1200 Da）种类、数量及其变化规律的系统生物学学科，通过对机体的整个代谢谱进行分析，探寻代谢物与生理病理变化之间的对应关系，从而为疾病诊断提供依据，找寻与疾病相关的生物标志物（Biomarker）。代谢组学的分析手段主要包括核磁共振（NMR）、气相色谱-质谱（GS/MS）联用技术、液相色谱-质谱（LC/MS）联用技术等，其中超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-Q-TOF/MS）技术作为一种先进的分离分析技术，已被广泛应用于代谢组学领域的研究当中，其强大的分析能力被公认为是复杂样品最好的分析技术之一。虽然现有报道中关于利用代谢组学获得了疾病相关生物标志物的报道很多，比如，通过对糖尿病肾病患者血清及尿液进行代谢组学观察，分析特异性代谢物质，筛选出血清棕榈酸、尿液尿嘧啶二磷酸等生物标志物（王旭方, 李梦婕, 葛永纯,等. 糖尿病肾病患者血清及尿液代谢组学特点及临床意义[J]. 肾脏病与透析肾移植杂志, 2012(3):201-209.），但是目前还未见有通过代谢组学去找寻用于广州管圆线虫病早期诊断的生物标志物的研究报道，现有报道的可用于诊断的尿液生物标志物也未涉及广州管圆线虫病相关或类似疾病。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中广州管圆线虫病早期诊断方法或方式的不足，提供一种广州管圆线虫病早期诊断尿液生物标志物及筛选方法和应用。
本发明的目的在于提供一种可用于广州管圆线虫病早期诊断的尿液生物标志物。
本发明的另一目的在于提供一种基于代谢组学的广州管圆线虫病早期诊断尿液生物标志物的筛选方法。
本发明的另一目的在于提供上述广州管圆线虫病早期诊断尿液生物标志物的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
一种用于广州管圆线虫病早期诊断的尿液生物标志物，所述尿液生物标志物为3,4,5-三羟基-6-{[2-（4-羟基苯基）-4-氧代-4H-铬-3-基]氧基}氧烷-2-羧酸、2- [3-（磺氧基）苯基]乙酸、2-辛烯基甘氨酸或赤霉素4’-O-葡糖醛酸中的一种或多种。
本发明基于代谢组学，研究分析正常小鼠和广州管圆线虫感染小鼠之间的特征性差异代谢物，最终获得所述的基于代谢组学的广州管圆线虫病早期诊断尿液生物标志物：3,4,5-三羟基-6-{[2-（4-羟基苯基）-4-氧代-4H-铬-3-基]氧基}氧烷-2-羧酸、2- [3-（磺氧基）苯基]乙酸、2-辛烯基甘氨酸或赤霉素4’-O-葡糖醛酸中的一种或多种，所述标志物的灵敏度及特异度均大于0.9，曲线下面积（AUC）均大于0.9，提示这四个指标预测性较好，可用于广州管圆线虫病早期诊断。因此可将3,4,5-三羟基-6-{[2-（4-羟基苯基）-4-氧代-4H-铬-3-基]氧基}氧烷-2-羧酸、2- [3-（磺氧基）苯基]乙酸、2-辛烯基甘氨酸或赤霉素4’-O-葡糖醛酸作为广州管圆线虫病早期诊断的尿液生物标志物。
3,4,5-三羟基-6-{[2-（4-羟基苯基）-4-氧代-4H-铬-3-基]氧基}氧烷-2-羧酸、2-[3-（磺氧基）苯基]乙酸、2-辛烯基甘氨酸或赤霉素4’-O-葡糖醛酸中的一种或多种作为广州管圆线虫病早期诊断尿液生物标志物的应用。
本发明还请求保护所述尿液生物标志物在制备广州管圆线虫病早期诊断产品中的应用；所述尿液生物标志物在制备和/或筛选治疗广州管圆线虫病药物中的应用。
一种广州管圆线虫病早期诊断产品，所述产品通过检测受试者尿液中3,4,5-三羟基-6-{[2-（4-羟基苯基）-4-氧代-4H-铬-3-基]氧基}氧烷-2-羧酸、2- [3-（磺氧基）苯基]乙酸、2-辛烯基甘氨酸或赤霉素4’-O-葡糖醛酸中的一种或多种标志物的浓度来判断受试者是否患有广州管圆线虫病。
一种广州管圆线虫病早期诊断产品，包含检测受试者尿液中3,4,5-三羟基-6-{[2-（4-羟基苯基）-4-氧代-4H-铬-3-基]氧基}氧烷-2-羧酸、2- [3-（磺氧基）苯基]乙酸、2-辛烯基甘氨酸或赤霉素4’-O-葡糖醛酸中的一种或多种标志物的含量浓度的试剂。
本发明还请求保护一种基于代谢组学的广州管圆线虫病早期诊断尿液生物标志物的筛选方法，构建小鼠广州管圆线虫病模型，利用超高效液相色谱-串联质谱技术对小鼠尿液进行代谢组学分析，发现并分析正常小鼠和广州管圆线虫感染小鼠之间的特征性差异代谢物，即为广州管圆线虫病早期诊断生物标志物。
作为一种优选地实施方式，所述基于代谢组学的广州管圆线虫病早期诊断尿液生物标志物的筛选方法具体包括如下步骤：
（1）将健康小鼠分成十个实验组：广州管圆线虫感染1天组、正常对照1天组、广州管圆线虫感染3天组、正常对照3天组、广州管圆线虫感染7天组、正常对照7天组、广州管圆线虫感染14天组、正常对照14天组、广州管圆线虫感染21天组及正常对照21天组；正常对照组不做处理，感染组小鼠通过人工灌胃的方法感染广州管圆线虫；
（2）使用代谢笼分别收集十个实验组小鼠的尿液样本，加入超纯水1：10稀释，4 ℃下10000 g离心10 min，取上清液即得供试品溶液；
（3）使用超高效液相色谱-串联质谱法检测供试品溶液，获得十个实验组小鼠尿液样本的指纹图谱；
（4）通过数据前处理、多元统计分析并筛选差异代谢物，将这些差异代谢物的精确分子量与网络数据库进行比对，最终获得所述的基于代谢组学的广州管圆线虫病早期诊断尿液生物标志物。
优选地，所述超高效液相色谱-串联质谱中液相色谱条件为：色谱柱：ACQUITYUPLC C18 BEH色谱柱（2.1 × 100 mm，1.7 μm）；液相色谱条件：流动相：A-H2O（0 .1%甲酸），B-乙腈（0 .1%甲酸）；流速：400 μL/min；柱温：40～45℃；进样量：0.600 μL；梯度洗脱程序：0-1 min（1% B），1-4 min（1%-10% B），4-5 min（10% B），5-9 min（10%-50% B），9-11min（50%-95% B），11-12.5 min（95% B），12.6-15 min（5% B）。
质谱条件：氮气作为脱溶剂和锥孔气；毛细管电压2.5 kV，ESI电喷雾离子源，检测模式为MS和MSE，锥孔电压35 V，反向锥孔气流为30 L/h，离子源温度为120 ℃，脱溶剂气温度为350 ℃，脱溶剂气流量为700～750 L/h；在碰撞能量为20-50 eV情况下离子扫描时间为1.0 s，数据采集范围为50-1200m/z。准确质量测定采用亮氨酸-脑啡肽溶液，m/ z556.2771(+)/554.2615(-)。
进一步优选地，所述超高效液相色谱-串联质谱中液相色谱条件为：色谱柱：ACQUITY UPLC C18 BEH色谱柱（2.1 × 100 mm，1.7 μm）；液相色谱条件：流动相：A-H2O（0.1%甲酸），B-乙腈（0 .1%甲酸）；流速：400 μL/min；柱温：40℃；进样量：0.600 μL；梯度洗脱程序：0-1 min（1% B），1-4 min（1%-10% B），4-5 min（10% B），5-9 min（10%-50% B），9-11min（50%-95% B），11-12.5 min（95% B），12.6-15 min（5% B）。
质谱条件：氮气作为脱溶剂和锥孔气；毛细管电压2.5 kV，ESI电喷雾离子源，检测模式为MS和MSE，锥孔电压35 V，反向锥孔气流为30 L/h，离子源温度为120 ℃，脱溶剂气温度为350 ℃，脱溶剂气流量为750 L/h；在碰撞能量为20-50 eV情况下离子扫描时间为1.0s，数据采集范围为50-1200m/z。准确质量测定采用亮氨酸-脑啡肽溶液，m/z556.2771(+)/554.2615(-)。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
（1）本发明提供了一种用于广州管圆线虫病早期诊断的尿液生物标志物，所述尿液生物标志物为3,4,5-三羟基-6-{[2-（4-羟基苯基）-4-氧代-4H-铬-3-基]氧基}氧烷-2-羧酸、2- [3-（磺氧基）苯基]乙酸、2-辛烯基甘氨酸或赤霉素4’-O-葡糖醛酸中的一种或多种，所述标志物的灵敏度及特异度均大于0.9，曲线下面积（AUC）均大于0.9，表明这四个指标预测性较好，可用于广州管圆线虫病早期诊断。
（2）本发明通过超高效液相色谱-串联质谱技术对小鼠尿液进行代谢组学分析，对所有样本中物质的峰的响应强度数据进行模型构建及判别分析，从而发现正常小鼠和广州管圆线虫感染小鼠之间的特征性差异代谢物，并进一步分析特征性差异代谢物的含量变化，找到由广州管圆线虫病引起的特异性差异代谢产物，即广州管圆线虫病的早期诊断分子标志物。本发明所提供的方法具有无创、方便快捷的特点，并且能够准确反映广州管圆线虫病感染小鼠与正常小鼠的代谢谱差异，特异性高。
附图说明
图1为正离子模式下十个实验组基峰强度（BPI）色谱图。
图2为负离子模式下十个实验组基峰强度（BPI）色谱图。
图3为正离子模式下十个实验组的OPLS-DA得分图。
图4为负离子模式下十个实验组的OPLS-DA得分图。
图5为四种尿液生物标志物在十个实验组的丰度（A）及对应的ROC曲线（B）；图A和B中2-phenyl acetic acid代表2- [3-（磺氧基）苯基]乙酸；图A和B中2-octenoylglycine代表2-辛烯基甘氨酸；图A和B中O-glucuronide代表赤霉素4’-O-葡糖醛酸；图A和B中2-carboxylic acid代表3,4,5-三羟基-6-{[2-（4-羟基苯基）-4-氧代-4H-铬-3-基]氧基}氧烷-2-羧酸。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1 广州管圆线虫感染小鼠模型建立及样品收集处理
1. 广州管圆线虫感染小鼠模型建立
健康SPF级6-8周龄BALB/c小鼠随机分为10组：广州管圆线虫感染1天组、正常对照1天组、广州管圆线虫感染3天组、正常对照3天组、广州管圆线虫感染7天组、正常对照7天组、广州管圆线虫感染14天组、正常对照14天组、广州管圆线虫感染21天组及正常对照21天组，每组10只小鼠。正常对照组不做处理，感染组小鼠按常规方法进行感染：将含广州管圆线虫Ⅲ期幼虫的光滑双脐螺压碎，剥离外壳，将螺肉置于加有消化液的EP管内剪碎，于37℃培养箱内消化40 min，消化完毕后将消化液倒入培养皿内，加入适量PBS终止消化，在体视镜下用移液枪吸取并计数广州管圆线虫Ⅲ期幼虫，通过人工灌胃方法感染小鼠，每只感染30条。
2.样本收集及前处理
使用代谢笼收集各实验组小鼠剖杀前一天尿液至少0.5 mL，-80 ℃分装冻存。采用超高效液相色谱-串联质谱法分析尿液样本前，将50 μL尿液样本于4 ℃解冻，加入450 μL超纯水进行稀释，涡旋混匀后于4 ℃下10000 g离心10 min，取上清液200 μL加入内衬管，用于代谢组学分析。
实施例2 广州管圆线虫感染小鼠尿液代谢物超高效液相色谱-串联质谱分析
对实施例1所得100个样本进行超高效液相色谱-串联质谱分析，具体分析条件如下：
1. 仪器设备
液相色谱：Waters ACQUITY UPLC-I Class System
质谱：Waters SYNAPT G2-Si HDMS
色谱柱：ACQUITY UPLC C18 BEH色谱柱（2.1 × 100 mm，1.7 μm）
2. 液相色谱条件
流动相：A-H2O（0 .1%甲酸），B-乙腈（0 .1%甲酸）
流速：400 μL/min；柱温：40℃；进样量：0.600 μL
梯度洗脱程序：0-1 min（1% B），1-4 min（1%-10% B），4-5 min（10% B），5-9 min（10%-50% B），9-11 min（50%-95% B），11-12.5 min（95% B），12.6-15 min（5% B）。
3. 质谱条件
质谱条件：氮气作为脱溶剂和锥孔气；毛细管电压2.5 kV，ESI电喷雾离子源，检测模式为MS和MSE，锥孔电压35 V，反向锥孔气流为30 L/h，离子源温度为120 ℃，脱溶剂气温度为350 ℃，脱溶剂气流量为750 L/h；在碰撞能量为20-50 eV情况下离子扫描时间为1.0s，数据采集范围为50-1200m/z。准确质量测定采用亮氨酸-脑啡肽溶液，m/z556.2771(+)/554.2615(-)。
实施例3 广州管圆线虫感染小鼠尿液代谢物超高效液相色谱-串联质谱分析
对实施例1所得100个样本进行超高效液相色谱-串联质谱分析，具体分析条件如下：
2. 仪器设备
液相色谱：Waters ACQUITY UPLC-I Class System
质谱：Waters SYNAPT G2-Si HDMS
色谱柱：ACQUITY UPLC C18 BEH色谱柱（2.1 × 100 mm，1.7 μm）
3. 液相色谱条件
流动相：A-H2O（0 .1%甲酸），B-乙腈（0 .1%甲酸）
流速：400 μL/min；柱温：45 ℃；进样量：0.600 μL
梯度洗脱程序：0-1 min（1% B），1-4 min（1%-10% B），4-5 min（10% B），5-9 min（10%-50% B），9-11 min（50%-95% B），11-12.5 min（95% B），12.6-15 min（5% B）。
（3）质谱条件
质谱条件：氮气作为脱溶剂和锥孔气；毛细管电压2.5 kV，ESI电喷雾离子源，检测模式为MS和MSE，锥孔电压35 V，反向锥孔气流为30 L/h，离子源温度为120 ℃，脱溶剂气温度为350 ℃，脱溶剂气流量为700 L/h；在碰撞能量为20-50 eV情况下离子扫描时间为1.0s，数据采集范围为50-1200m/z。准确质量测定采用亮氨酸-脑啡肽溶液，m/z556.2771(+)/554.2615(-)。
实施例4 广州管圆线虫感染小鼠尿液特征性差异代谢物分析
1. 数据预处理
使用Masslynx软件采集原始数据，将获得的原始数据导入Progenesis QI进行去噪音、质谱峰提取、峰排列、峰对齐和归一化等处理，得到各组样品正负离子模式下基峰强度（BPI）色谱图，实施例2各组样品正负离子模式下基峰强度（BPI）色谱图如图1和图2所示。
2. 多元统计分析
使用SIMCA-P和MetaboAnalyst进行多元统计分析，为了考察不同时间点感染组与对照组相比代谢的变化，采用正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）方法来表征差异，见图3和图4。
从图3和图4的OPLS-DA得分图可以看出，不同时间点感染组与对照组均可以完全区分，模型的解释能力和预测能力均良好。
3. 发现并分析鉴定特征性差异代谢物
使用OPLS-DA筛选差异代谢物，并通过单因素方差分析（one-way ANOVA）对两组间的差异变量进行统计学分析，p<0.05表明差异有统计学意义。当投影中的变量重要性（VIP）>2，p<0.05且最小变异系数（CV）<30时，被认为是差异代谢物。
将广州管圆线虫感染1天组和正常对照1天组差异代谢物的精确分子量和保留时间与人类代谢组数据库（HMDB，http://www.hmdb.ca）和LipidMaps数据库（https://www.lipidmaps.org/）进行对比，将已鉴定的物质作为潜在生物标志物（见表1）。
表1广州管圆线虫感染小鼠和正常对照小鼠间的尿液特征性差异代谢物
最后，使用受试者工作特征曲线（ROC曲线）分析评估生物标志物的诊断能力。3,4,5-三羟基-6-{[2-（4-羟基苯基）-4-氧代-4H-铬-3-基]氧基}氧烷-2-羧酸、2- [3-（磺氧基）苯基]乙酸、2-辛烯基甘氨酸或赤霉素4’-O-葡糖醛酸的灵敏度和特异度均大于0.9，曲线下面积（AUC）均大于0.9，提示这四个指标预测性较好，见图5。表明3,4,5-三羟基-6-{[2-（4-羟基苯基）-4-氧代-4H-铬-3-基]氧基}氧烷-2-羧酸、2- [3-（磺氧基）苯基]乙酸、2-辛烯基甘氨酸或赤霉素4’-O-葡糖醛酸可作为广州管圆线虫病早期诊断的尿液生物标志物。

Claims (3)

1.尿液生物标志物3,4,5-三羟基-6-{[2-(4-羟基苯基)-4-氧代-4H-苯并呋喃-3-基]氧基}氧烷-2-羧酸、2-[3-(磺氧基)苯基]乙酸、2-辛烯酰甘氨酸或雌马酚4’-O-葡糖苷酸中的一种或多种在制备广州管圆线虫病早期诊断产品中的应用。
2.尿液生物标志物3,4,5-三羟基-6-{[2-(4-羟基苯基)-4-氧代-4H-苯并呋喃-3-基]氧基}氧烷-2-羧酸、2-[3-(磺氧基)苯基]乙酸、2-辛烯酰甘氨酸或雌马酚4’-O-葡糖苷酸中的一种或多种在制备和/或筛选治疗广州管圆线虫病药物中的应用。
3.检测尿液生物标志物3,4,5-三羟基-6-{[2-(4-羟基苯基)-4-氧代-4H-苯并呋喃-3-基]氧基}氧烷-2-羧酸、2-[3-(磺氧基)苯基]乙酸、2-辛烯酰甘氨酸或雌马酚4’-O-葡糖苷酸中的一种或多种标志物的含量的试剂在制备广州管圆线虫病早期诊断产品中的应用。
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