CN113330932A - 一种用于瓜类作物砧穗识别信号研究的茎段嫁接方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于瓜类作物砧穗识别信号研究的茎段嫁接方法，属于农业种植技术领域。嫁接方法包括：培育瓜类幼苗A和瓜类幼苗B；将瓜类幼苗A斜切得到具有切口的接穗，将瓜类幼苗B的茎从植株上切下得到离体具有切口的砧木，将接穗和砧木进行嫁接得到嫁接茎段；置于愈合室内愈合培养；对嫁接茎段接口处、未嫁接的接穗A和未嫁接砧木B切口处进行取样后分别进行转录组测序收集三者的差异基因，通过并集分析筛选出瓜类砧穗早期识别信号基因。本发明方法排除了接穗叶片和砧木根系对嫁接界面信号的影响，只保留茎段，进行组织之间嫁接，有利于缩小基因筛选范围，筛选出早期信号识别关键基因，为瓜类作物嫁接不亲和性研究提供技术支撑。
Description
技术领域
本发明属于农业种植技术领域，特别是涉及一种用于瓜类作物砧穗识别信号研究的茎段嫁接方法。
背景技术
我国是甜瓜、西瓜和黄瓜等瓜类作物的生产与消费大国，在世界瓜类作物种植中占有十分重要的地位。而长年的土地固定栽培导致土壤连作障碍严重，土传病害蔓延，严重威胁产业的发展。嫁接作为一种有效的解决措施，现在已被广泛应用在甜瓜等瓜类作物生产上。
嫁接作为植物的一种无性繁殖技术，距今有3000年的应用历史，现被广泛用于蔬菜、果树和花卉的生产。嫁接技术能够提高作物抗土传病害的能力、增强非生物胁迫抗性、提高作物产量、调节开花时间和改善果树株型等。嫁接也是开展物种间遗传物质交换、长距离信号转运、地上部与地下部关系研究的良好系统。
嫁接即把一株植物的枝或芽，嫁接到另一株植物的茎或根上，使接在一起的两个部分长成一个完整的植株，实质上嫁接是利用植物受伤后具有愈伤的机能来进行的，影响嫁接成活率的主要因素是接穗和砧木的亲和力，其次是嫁接的技术和嫁接后的管理。所谓亲合力，就是接穗和砧木在内部组织结构上、生理和遗传上，彼此相同或相近，从而能互相结合在一起的能力，亲和力高，嫁接成活率高，反之，则成活率低。而且嫁接亲和力的大小还影响嫁接体的长势、抗性和寿命，以及产量和品质等。因此，嫁接亲和力是限制嫁接技术使用的重要障碍。
现有技术中，Yemon和Brown(1976)提出植物嫁接界面的砧穗细胞之间存在一种由细胞壁聚合物参与的异源识别机制；Cookson等(2014)分析了葡萄自体与异源嫁接组合愈合期不同时间点嫁接界面的基因表达，寻找到1105个与嫁接亲和相关的候选基因，并发现过氧化物和病程相关基因的上调，认为存在一种免疫识别机制影响着嫁接亲和性；烟草能够与38个科的73种被子植物嫁接成活，主要原因在于β-1，4-葡聚糖酶基因(GH9B3)通过促进功能性组织粘附的形成，促使接穗与砧木能够进行细胞间的共质体运输，解决了远缘嫁接坏死层积累的问题(Notaguchi et al 2020)，然而，在烟草科间嫁接系统中，木质部的重连较少，韧皮部几乎不发生重连，烟草嫁接不能解决植物嫁接不亲和问题，只是能与多种植物进行组织粘附，存活下来，但是生长并不正常。可见，现有技术中并没有解决嫁接亲和性低的问题，且现有技术中对于嫁接亲和性研究大都使用完整植株，缺乏环境高度可控下早期的信号识别机制与嫁接亲和性的研究，因此无法有效地解决嫁接亲和性低的问题，而如何筛选到嫁接早期的识别信号从而解决嫁接亲和性低的问题成为本领域技术人员亟待解决的难题。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于瓜类作物砧穗识别信号研究的茎段嫁接方法，以解决上述现有技术存在的问题，通过将砧木与接穗在离体环境下进行嫁接、取样，然后进行转录组测序，筛选出早期信号识别关键基因，为瓜类作物嫁接不亲和性研究提供技术支撑。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种用于瓜类作物砧穗识别信号研究的茎段嫁接方法，包括以下步骤：
Ⅰ.培育瓜类幼苗A和瓜类幼苗B；
Ⅱ.将瓜类幼苗A斜切得到具有切口的接穗，将瓜类幼苗B的茎从植株上切下得到离体具有切口的砧木；
Ⅲ.将接穗和砧木进行嫁接得到嫁接茎段；
Ⅳ.将步骤Ⅱ中未进行嫁接的具有切口接穗和砧木以及步骤Ⅲ得到的嫁接茎段以嫁接夹固定后，置于愈合室内进行愈合培养。
Ⅴ.对步骤Ⅳ都得到愈合培养后的嫁接茎段接口处、未进行嫁接的接穗和未进行嫁接砧木切口处进行取样后分别进行转录组测序收集三者的差异基因，得到瓜类作物砧穗早期识别信号；
所述瓜类幼苗A和瓜类幼苗B相同或不同。
进一步地，所述瓜类包括葫芦和甜瓜中的至少一种。
进一步地，所述瓜类幼苗A和瓜类幼苗B的培育过程具体包括：将瓜类A和瓜类B的种子浸泡8～48h后催芽处理至胚根露白，播种，培养；所述播种密度为700～900粒/m2。
有利于瓜苗适当的徒长，保证嫁接时下胚轴长度约为6～8cm。
进一步地，所述瓜类A和瓜类B的种子浸泡前还包括用1‰高锰酸钾溶液消毒10min。
进一步地，所述愈合室由不透明KT板、保鲜膜和托盘组成。
进一步地，所述步骤Ⅱ包括：
(1)将瓜类幼苗A和瓜类幼苗B提前放入嫁接愈合所需的条件下培养；
(2)在瓜类幼苗A子叶下方0.8～1.2cm处斜向下切出斜面得到具有切口的接穗；
(3)从瓜类幼苗B子叶下方0.8～1.2cm处，向下切取4.5～5.5cm长度的茎段，得到离体的具有切口的砧木。
进一步地，所述步骤(2)所述切口角度为30°。
进一步地，所述步骤(3)所述切口角度为30～60°。
进一步地，所述步骤(1)中培养温度为26℃，培养时间为2d。
减少因温度变化导致的植株转录本的变化。
进一步地，所述步骤(2)接穗获取时间为瓜类幼苗A培养至1叶1心期；所述步骤(3)砧木获取时间为瓜类幼苗B培养至第1片真叶半展，胚轴长度为6～8cm。
进一步地，每个嫁接茎段的嫁接时间小于5min。
进一步地，所述取样的位置为：
未嫁接的接穗切口处5mm的组织，未嫁接的砧木切口处5mm的组织，嫁接茎段接口处接穗部分和/或砧木部分5mm的组织。
进一步地，所述愈合培养的时间为0.5h。
本发明公开了以下技术效果：
本发明开发了一种用于研究瓜类作物砧穗早期识别信号的离体茎段嫁接及候选基因筛选技术，排除了接穗叶片和砧木根系对嫁接界面信号的影响，只保留茎段，进行组织之间嫁接，有利于缩小基因筛选范围，筛选出早期信号识别关键基因，为瓜类作物嫁接亲和性研究提供技术支撑。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1愈合室结构示意图，1为不透明KT板，2为第一保鲜膜，3为嫁接茎段、接穗或砧木，4为第二保鲜膜，5为托盘；
图2为本发明实施例1砧木获取及砧木切口示意图；
图3为本发明实施例1接穗、砧木及嫁接茎段取样部位示意图，A为接穗，B为砧木，C为嫁接茎段；
图4为本发明实施例1甜瓜接穗与葫芦物种识别的候选基因图，M_h_Svs MM_S为甜瓜接穗切口与甜瓜接穗/甜瓜砧木嫁接茎段的接穗部分，M_h_S vs MB_S为甜瓜接穗切口与瓜接穗/葫芦砧木嫁接茎段的接穗部分，MM_S vs MB_S为甜瓜接穗/甜瓜砧木嫁接茎段的接穗部分与甜瓜接穗/葫芦砧木嫁接茎段的接穗部分；
图5为本发明实施例1葫芦砧木与甜瓜物种识别的候选基因图，B_h_Rvs B/B_R为葫芦砧木切口与葫芦接穗/葫芦砧木嫁接茎段的砧木部分，B_h_R vs MB_R为葫芦砧木切口与甜瓜接穗/葫芦砧木嫁接茎段的砧木部分，B/B_R vs MB_R为葫芦接穗/葫芦砧木嫁接茎段的砧木部分与甜瓜接穗/葫芦砧木嫁接茎段的砧木部分。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
一种用于瓜类作物砧穗识别信号研究的茎段嫁接方法：
(1)植物幼苗培育：将甜瓜(阿克可口奇)与葫芦(H23)种子分别用1‰高锰酸钾溶液消毒10min，自来水清洗3遍，浸泡在自来水中，甜瓜种子浸泡8h，葫芦种子浸泡36h；然后在30℃下进行催芽处理至胚根露白，播种于平盘中，播种密度为800粒/m2，作为接穗的幼苗培养至1叶1心期，作为砧木的幼苗培养至第1片真叶半展，下胚轴长度约为6～8cm时进行嫁接，并且提前2d将幼苗放在26℃的恒温培养室内培养。
(2)接穗、柘木和嫁接茎段的制备方法：
步骤a：取生长至1叶1心期的甜瓜幼苗，用刀片从幼苗叶子下方1cm左右处斜向下切出30°斜面得到具有切口的甜瓜接穗；
步骤b：取第1片真叶半展、下胚轴长度约为6～8cm的甜瓜幼苗，从幼苗子叶以下1cm左右处横向切断；之后，以断口处为上端，向下切取5cm左右的茎段得到砧木，从5cm的茎段中部斜向60°左右斜切，切面长度约1cm，一刀完成，保证切面平滑，得到具有切口的甜瓜砧木；
步骤c：取生长至1叶1心期的葫芦幼苗，用刀片从幼苗叶子下方1cm左右处斜向下切出30°斜面得到具有切口的葫芦接穗；
步骤d：取第1片真叶半展、下胚轴长度约为6～8cm的葫芦幼苗，从幼苗子叶以下1cm左右处横向切断；之后，以断口处为上端，向下切取5cm左右的茎段得到砧木，从5cm的茎段中部斜向60°左右斜切，切面长度约1cm，一刀完成，保证切面平滑，得到具有切口的葫芦砧木；
步骤e：将步骤a和步骤b制备得到的具有切口的甜瓜接穗和甜瓜砧木的切口紧密贴，夹上嫁接夹，制备甜瓜/甜瓜嫁接茎段。
步骤f：将步骤a和步骤d制备得到具有切口的甜瓜接穗和葫芦砧木的切口紧密贴，夹上嫁接夹，制备甜瓜/葫芦嫁接茎段。
步骤g：将步骤c和步骤d制备得到具有切口的葫芦接穗和葫芦砧木的切口紧密贴，夹上嫁接夹，制备葫芦/葫芦嫁接茎段。
(3)愈合培养：
Ⅰ：将步骤a中的方法制备得到20株具有切口的甜瓜接穗，切口处夹上嫁接夹愈合培养0.5h，以上操作在5min之内完成，将接穗放在盖有保鲜膜的托盘上，喷上微量的水雾，使整个托盘内不出现明显水滴为准，然后用保鲜膜包裹托盘，盖上不透光的KT板，立即放入提前1d设定的26℃恒温黑暗培养箱内进行愈合培养；刀片、嫁接夹、愈合室、培养箱均经过75％的酒精消毒处理；
Ⅱ：同步骤Ⅰ，区别在于，将步骤e的方法制备得到20株甜瓜/甜瓜嫁接茎段进行愈合培养0.5h；
Ⅲ：同步骤Ⅰ，区别在于，将步骤f的方法制备得到40株甜瓜/葫芦嫁接茎段进行愈合培养0.5h；
Ⅳ：同步骤Ⅰ，区别在于，将步骤d的方法制备得到20株具有切口的葫芦砧木进行愈合培养0.5h。
Ⅴ：同步骤Ⅰ，区别在于，将步骤g的方法制备得到20株葫芦/葫芦嫁接茎段进行愈合培养0.5h；
愈合室见图1、嫁接方法见图2。
(4)将步骤Ⅰ～Ⅴ愈合培养得到的样品进行取样，具体的：
取步骤Ⅰ中甜瓜接穗切口处组织，每株取5mm，混合均匀后用液氮迅速冷冻，-80℃冰箱保存备用；
取步骤Ⅱ中甜瓜/甜瓜嫁接茎段甜瓜接穗部位的组织，每株取5mm，混合均匀后用液氮迅速冷冻，-80℃冰箱保存备用；
分别取步骤Ⅲ中甜瓜/葫芦嫁接茎段甜瓜接穗部位和砧木部分的组织，每株取5mm，混合均匀后用液氮迅速冷冻，-80℃冰箱保存备用；
取步骤Ⅳ中葫芦砧木切口处组织，每株取5mm，混合均匀后用液氮迅速冷冻，-80℃冰箱保存备用；
取步骤Ⅴ中葫芦/葫芦嫁接茎段葫芦砧木部位的组织，每株取5mm，混合均匀后用液氮迅速冷冻，-80℃冰箱保存备用；
取样部位见图3。
(5)将步骤(3)中得到的6组样品分别进行转录组测序(由上海美吉生物医药科技有限公司完成)。
测序的文库构建采用Illumina TruseqTM RNA sample prep Kit方法，使用SeqPrep与Sickle进行质控；使用HiSat2工具将质控后的数据与参考基因组比对，甜瓜参考基因组为甜瓜基因组(http://cucurbitgenomics.org/organism/3)，葫芦参考基因组为葫芦基因组(http://cucurbitgenomics.org/organism/13)。使用DESeq2鉴定出样本间差异表达的基因，设定参数为显著性水平p-adjust<0.05且上下调倍数|log2FC|≥1。
(6)将6组样经测序得到的基因进行分析比对；
将甜瓜接穗切口(M_h_S)vs甜瓜接穗/甜瓜砧木嫁接茎段的接穗部分(MM_S)、甜瓜接穗切口(M_h_S)vs甜瓜接穗/葫芦砧木嫁接茎段的接穗部分(MB_S)、甜瓜接穗/甜瓜砧木嫁接茎段的接穗部分(MM_S)vs甜瓜接穗/葫芦砧木嫁接茎段的接穗部分(MB_S)三者的差异基因进行Veen分析，取并集：从1312个差异基因中，共筛选出8个参与物种识别的甜瓜候选基因，见图4；
将葫芦砧木切口(B_h_R)vs葫芦接穗/葫芦砧木的嫁接茎段的砧木部分(B/B_R)、葫芦砧木切口(B_h_R)vs甜瓜接穗/葫芦砧木嫁接茎段的砧木部分(MB_R)、葫芦接穗/葫芦砧木嫁接茎段的砧木部分(B/B_R)vs甜瓜接穗/葫芦砧木嫁接茎段的砧木部分(MB_R)三者的差异基因进行Veen分析，取并集：从3903个差异基因中，共筛选出80个参与物种识别的葫芦候选基因，见图5。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种用于瓜类作物砧穗识别信号研究的茎段嫁接方法，其特征在于，包括以下步骤：
Ⅰ.培育瓜类幼苗A和瓜类幼苗B；
Ⅱ.将瓜类幼苗A斜切得到具有切口的接穗，将瓜类幼苗B的茎从植株上切下得到离体具有切口的砧木；
Ⅲ.将接穗和砧木进行嫁接得到嫁接茎段；
Ⅳ.将步骤Ⅱ中未进行嫁接的具有切口接穗和砧木以及步骤Ⅲ得到的嫁接茎段以嫁接夹固定后，置于愈合室内进行愈合培养；
Ⅴ.对步骤Ⅳ都得到愈合培养后的嫁接茎段接口处、未进行嫁接的接穗和未进行嫁接砧木切口处进行取样后分别进行转录组测序收集三者的差异基因，得到瓜类作物砧穗早期识别信号；
所述瓜类幼苗A和瓜类幼苗B相同或不同。
2.根据权利要求1所述的用于瓜类作物砧穗识别信号研究的茎段嫁接方法，其特征在于，所述瓜类包括葫芦和甜瓜中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的用于瓜类作物砧穗识别信号研究的茎段嫁接方法，其特征在于，所述瓜类幼苗A和瓜类幼苗B的培育过程具体包括：将瓜类A和瓜类B的种子浸泡8～48h后催芽处理至胚根露白，播种，培养；所述播种密度为700～900粒/m2。
4.根据权利要求1所述的用于瓜类作物砧穗识别信号研究的茎段嫁接方法，其特征在于，所述愈合室由不透明KT板、保鲜膜和托盘组成。
5.根据权利要求1所述的用于瓜类作物砧穗识别信号研究的茎段嫁接方法，其特征在于，所述步骤Ⅱ包括：
(1)将瓜类幼苗A和瓜类幼苗B提前放入嫁接愈合所需的条件下培养；
(2)在瓜类幼苗A子叶下方0.8～1.2cm处斜向下切出斜面得到具有切口的接穗；
(3)从瓜类幼苗B子叶下方0.8～1.2cm处，向下切取4.5～5.5cm长度的茎段，得到离体的具有切口的砧木。
6.根据权利要求5所述的用于瓜类作物砧穗识别信号研究的茎段嫁接方法，其特征在于，所述步骤(1)中培养温度为26℃，培养时间为2d。
7.根据权利要求5所述的用于瓜类作物砧穗识别信号研究的茎段嫁接方法，其特征在于，所述步骤(2)接穗获取时间为瓜类幼苗A培养至1叶1心期；所述步骤(3)砧木获取时间为瓜类幼苗B培养至第1片真叶半展，胚轴长度为6～8cm。
8.根据权利要求5所述的用于瓜类作物砧穗识别信号研究的茎段嫁接方法，其特征在于，每个嫁接茎段的嫁接时间小于5min。
9.根据权利要求1所述的用于瓜类作物砧穗识别信号研究的茎段嫁接方法，其特征在于，所述取样的位置为：
未嫁接的接穗切口处5mm的组织，未嫁接的砧木切口处5mm的组织，嫁接茎段接口处接穗部分和/或砧木部分5mm的组织。
10.根据权利要求1所述的用于瓜类作物砧穗识别信号研究的茎段嫁接方法，其特征在于，所述愈合培养的时间为0.5h。
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