CN113318220A - 杜拉鲁肽在治疗和预防宫腔粘连药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种杜拉鲁肽在治疗和预防宫腔粘连药物中的应用。该杜拉鲁肽配制成12~15ml杜拉鲁肽药液。本发明采用“机械损伤+感染”联合造模的方法建立IUA小鼠模型，该IUA模型经历刮宫和LPS双重诱导后，子宫内膜的腺体数量减少，纤维化程度增加，ECM和EMT累积增加，从而证实炎症介导的子宫内膜损伤对于激活IUA发挥重要作用。

Description

杜拉鲁肽在治疗和预防宫腔粘连药物中的应用

技术领域

本发明涉及生殖内分泌技术领域，尤其涉及杜拉鲁肽在治疗和预防宫腔粘连药物中的应用。

背景技术

子宫内膜纤维化又称为宫腔粘连（intrauterine adhesion, IUA），是子宫内膜损伤的结果。1894年Heinrich Fritsch报告了第一例IUA病例，1948年Joseph Asherman对IUA病例进行全面描述，首次描述子宫腔和（或）子宫颈管完全或部分闭塞，认为IUA是子宫内膜创伤的结果。IUA的主要病理改变是炎症和细胞外基质（extracellular matrix, ECM）的纤维蛋白原的积累，致使子宫内膜纤维化，最终导致月经过少、闭经、生育力低下、不孕等。IUA通常因为创伤、感染、先天性子宫畸形和遗传易感性等，导致子宫内膜和血管无法自发恢复和再生，进一步导致子宫内膜粘连。子宫内膜损伤程度与IUA症状不直接相关，约90%的病例都是刮宫或感染引起的，尤其是在妊娠后。尽管目前没有临床数据明确无症状患者IUA的患病率，但有产后刮宫史的IUA患病率高达21.5%，早孕流产后IUA患病率高达19.1%，并随着医学影像学和宫腔镜检查的迅速发展，IUA的诊断率也在逐年增加。

通常临床检查不能及时发现IUA，需要依靠其他的检查方法来进行诊断，包括宫腔镜、经阴道超声、生殖系统造影和磁共振成像等。其中宫腔镜是IUA诊断的金标准，与影像学检查相比，宫腔镜能更准确地评估子宫的大小、形态，内膜厚度以及IUA的程度、性质、部位和范围，也为后续的治疗和预后提供参考。IUA的治疗旨在促进内膜修复再生，恢复子宫腔大小与形态，预防再粘连，并对症处理。目前宫腔镜下宫腔粘连分离术（transcervicalresection of adhesion, TCRA）是首选治疗方法。临床还应用宫内节育器、宫腔支撑球囊、生物材料以及药物等改善IUA的症状。尽管临床医生在宫腔镜手术及其他的治疗方法中取得了进展，但是仍无有效的方法治疗中、重度IUA并预防IUA的复发。

子宫内膜纤维化参与了IUA病理的形成和发展，其特征是炎症和纤维蛋白原在ECM中聚集。在炎症和伤口愈合过程中，ECM过度积累会导致纤维化。损伤的子宫内膜内基质细胞产生大量ECM，并诱发炎症反应，导致子宫内膜丧失再生能力。上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT）被认为在外伤引起的器官损伤和纤维化生成中起着至关重要的作用。病理条件下，EMT可能导致子宫内膜功能障碍。转化生长因子（transforming growth factor, TGF）-β是促纤维化的中枢调节因子和ECM的调节因子，在组织纤维化形成和器官功能障碍的中发挥关键作用。TGF-β可以促进成纤维细胞和炎性细胞聚集，加速胶原蛋白和纤维蛋白合成，导致ECM沉积和降解，从而促进细胞分化和凋亡。大量研究表明，TGF-β在妇科手术后修复过程中起主导作用，参与了术后粘连的发病机制。Yao等也报道了骨髓干细胞来源的外泌体能够通过TGF-β1/Smad信号转导逆转EMT，促进子宫内膜恢复。因此，预防纤维化对于IUA治疗至关重要，可以最大程度地减少粘连复发的风险。

胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1, GLP-1）可以刺激胰腺β细胞分泌胰岛素（insulin, InS），并调节葡萄糖（glucose, GLU）代谢。GLP-1通过与GLP-1受体（GLP-1 receptor, GLP-1R）结合发挥作用，GLP-1 R是一种G蛋白偶联受体，在许多组织中广泛表达。GLP-1 R激动剂（GLP-1 RAs）是一类肠促InS类药物，通过促进依赖性InS的释放，抑制胰高血糖素的分泌来改善GLU代谢。它们可以分为源自爬行类动物的药物Exendin-4和由人源GLP-1活性片段进行修饰合成的GLP-1 RAs。根据其药动学特点，GLP-1 RAs也可以分为短效和长效激动剂。2006年以后，全球已批准至少6种GLP-1 RAs治疗2型糖尿病（type 2diabetes mellitus, T2DM），均通过皮下注射。

杜拉鲁肽（Dulaglutide）是一种长效GLP-1 RAs，与人源GLP-1 RAs具有90％同源性，并与人IgG4-Fc重链共价连接，2014年由FDA批准治疗T2DM。Dulaglutide与蛋白质载体的重组降低了药物清除率并限制其潜在的肾脏排泄，增加了药物的血浆半衰期，可以允许每周一次给药。杜拉鲁肽被证明在糖尿病小鼠模型中可以抑制炎症和纤维化，也可以有效抑制肥胖引起的小鼠气道高反应性，具有抗纤维化和抗炎作用。但目前尚无关于杜拉鲁肽治疗子宫内膜纤维化的研究。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种杜拉鲁肽在治疗和预防宫腔粘连药物中的应用。

为解决上述问题，本发明所述的杜拉鲁肽在治疗和预防宫腔粘连药物中的应用。

该杜拉鲁肽配制成12 ~15ml杜拉鲁肽药液。

所述杜拉鲁肽药液的制备是指使用无菌1x PBS溶液依据相应浓度溶解杜拉鲁肽进行配制。所述杜拉鲁肽用量为150μg/Kg~600μg/Kg。

所述杜拉鲁肽药液的给药周期为1次/周，连续给药14天。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明采用“机械损伤+感染”联合造模的方法建立IUA小鼠模型，该IUA模型经历刮宫和LPS双重诱导后，子宫内膜的腺体数量减少，纤维化程度增加，ECM和EMT累积增加，从而证实炎症介导的子宫内膜损伤对于激活IUA发挥重要作用。

2、本发明杜拉鲁肽能够改善IUA模型小鼠宫腔的损伤情况、增加子宫内膜的厚度和腺体数量，降低子宫内膜纤维化程度和ECM沉积。同时本发明杜拉鲁肽通过抑制M1巨噬细胞极化和炎性因子的释放而发挥抗炎活性，从而减轻了IUA子宫内膜的损伤，对IUA小鼠具有保护作用。因此，杜拉鲁肽在未来治疗IUA疾病中具有潜在的临床实用价值。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1为本发明Dulaglutide对IUA小鼠子宫形态学的影响。（A）IUA小鼠子宫内膜H&E染色结果（40倍和200倍）；（B）各组子宫腺体数量。

图2为本发明Dulaglutide对IUA小鼠子宫内膜纤维化的影响。（A）IUA小鼠子宫Masson染色结果（40倍和200倍）和α-SMA免疫组化结果（200倍）；（B-C）小鼠子宫内膜纤维化和α-SMA免疫组化及阳性面积统计。

图3为本发明Dulaglutide对IUA小鼠炎症反应的影响。（A-C）IUA小鼠子宫内膜中，与炎症相关基因mRNA相对表达含量。（D-G）IUA小鼠子宫内膜中，IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白相对表达含量及WB灰度统计。

图4为本发明 Dulaglutide对M1巨噬细胞极化的影响。（A-B）IUA小鼠子宫内膜中，与M1巨噬细胞极化相关基因mRNA相对表达含量。（C-D）IUA小鼠子宫内膜中，F4/ 80蛋白相对表达含量及WB灰度统计。

图5为本发明 Dulaglutide对IUA小鼠子宫内膜纤维化和ECM的影响。（A-F）IUA小鼠子宫内膜中，纤维化基因和ECM成分的相对表达含量。（G-J）IUA小鼠子宫内膜中，α-SMA、Collagen 1a和TIMP-1蛋白相对表达含量及WB灰度统计。

图6为本发明Dulaglutide对IUA小鼠子宫内膜纤维化EMT的影响。（A）IUA小鼠子宫内膜中，与EMT相关基因mRNA相对表达含量。（B-D）IUA小鼠子宫内膜中，E-cadherin和vimentin蛋白相对表达含量及WB灰度统计。

图7为本发明Dulaglutide对子宫内膜TGF-β1和Smad表达的影响。（A）IUA小鼠子宫内膜中，TGF-β1基因mRNA相对表达含量。（B-D）IUA小鼠子宫内膜中，TGF-β1、p-Samd2、Smad2/ 3的蛋白相对表达含量及WB灰度统计。

图8为本发明Dulaglutide对子宫内膜ER和PR表达的影响。（A-B）IUA小鼠子宫内膜中，ER-α、PR基因mRNA相对表达含量。

具体实施方式

杜拉鲁肽在治疗和预防宫腔粘连药物中的应用。

该杜拉鲁肽配制成12 ~15ml杜拉鲁肽药液。杜拉鲁肽药液的给药周期为1次/周，连续给药14天。

其中：杜拉鲁肽药液的制备是指使用无菌1x PBS溶液依据相应浓度溶解杜拉鲁肽进行配制。

杜拉鲁肽用量为150μg/Kg~600μg/Kg。

【Dulaglutide对于小鼠IUA的组织形态学的影响】

采用“机械损伤+感染”联合造模的方法建立IUA小鼠模型，通过观察子宫的大体形态和组织病理染色结果，来确定Dulaglutide对于小鼠IUA的组织形态学的影响。

⑴实验动物模型：

C57BL/ 6J 小鼠，8周，16克至18克，共36只。购自北京维通利华实验动物技术有限公司，于兰州大学东校区GLP楼饲养，环境恒温恒湿（25℃），12h光照/黑暗周期，自由食水。本次实验研究方案已经过兰州大学实验动物中心使用委员会批准，所有动物护理及实验操作均符合相关操作规范。

⑵主要实验试剂及仪器，参见表1~2。

表1 主要实验试剂

表2 主要仪器

⑶实验方法：

①建立动物模型：

购买C57BL/ 6J 小鼠进入兰州大学东校区GLP楼饲养平衡7天。将36只小鼠随机分为正常组（Normal组）、假手术组（Sham组）、模型组（IUA组）、低剂量给药组（D1组）、中剂量给药组（D2组)、高剂量给药组（D3组），每组6只。在造模前36h分别给予小鼠孕马血清促性腺激素20IU（腹腔注射）。使用戊巴比妥钠（30μg/ Kg）常规麻醉小鼠（腹腔注射），备皮固定。局部消毒腹部后，使用无菌剪刀逐层开腹，找到“Y”字形子宫，观察子宫及附件情况，排除生殖器畸形。在两侧子宫下方1/3处剪一长度约0.2 cm切口，置入刮勺，用相同的力度及手法前后反复搔刮子宫壁（约3-4次），直至子宫壁水肿、毛糙后结束操作。随后将含6mg/L的脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）手术缝线由上而下置于整个宫腔，缝线两端延长至腹壁外侧打结固定（待48h后缓慢抽出缝合线）。随后还纳脏器，在腹腔内滴注青霉素和链霉素双抗溶液100μL，关腹。Normal组不做任何干预，Sham组仅做开腹+缝合。造模后第2天开始对IUA小鼠模型进行药物干预，给药低剂量D1组、给药中剂量D2组、给药高剂量D3组分别给予Dulaglutide 150μg/ Kg、300μg/ Kg、600μg/ Kg，皮下注射，每周一次。连续给药14天结束实验，收集各组小鼠的双侧子宫。

②组织包埋切片：

将小鼠子宫组织置于甲醇溶液中固定后，依次放入50%、70%、85%、90%、100%的乙醇中脱水，二甲苯浸泡透明。随后置于石蜡和二甲苯混合溶液中，62℃温育2h，将石蜡置于模具中冷却凝结。使用切片机将所得样本切薄（5μm厚），小心转移至载玻片保存。

③苏木精-伊红（hematoxylin-eosin staining, H&E）染色：

ⅰ烘片：切片置于65℃烘箱中1h。

ⅱ脱蜡：二甲苯Ⅰ、Ⅱ，20min；无水乙醇Ⅰ、Ⅱ，15min；95%、90%、80%乙醇各5min。

ⅲ染色：苏木素染色7min，流水冲洗；1%盐酸乙醇分化数秒，流水冲洗；伊红染色25s、流水冲洗。

ⅳ脱水透明：75%、85%、95%、100%乙醇，各1s，二甲苯Ⅰ、Ⅱ，1s。晾干封片。

④Masson染色：

ⅰ烘片：切片置于65℃烘箱中1h。

ⅱ脱蜡：二甲苯Ⅰ、Ⅱ，20min；无水乙醇Ⅰ、Ⅱ，15min；95%、90%、80%乙醇各5min。

ⅲMasson染色：Bouin液媒染后，用流水冲洗至透明；天青石蓝染色液2-3min，流水冲洗；Mayer苏木素染色液2-3min，流水冲洗；酸性乙醇分化液1s，流水冲洗。再依次浸入丽春红品红染液10min、磷钼酸溶液10min、苯胺蓝染液12h。最后用弱酸溶液处理2min。

ⅳ脱水透明：75%、85%、95%、100%乙醇，各1s，二甲苯Ⅰ、Ⅱ，1s。晾干封片。

⑤免疫组化（Immunohistochemistry, IHC）：

a烘片：切片置于65℃烘箱中1h。

b脱蜡：二甲苯Ⅰ、Ⅱ，20min；无水乙醇Ⅰ、Ⅱ，15min；95%、90%、80%乙醇各5min。

c修复：将切片置于柠檬酸缓冲液（pH 6.0），高压锅高温高压15min后，晾至室温。

d阻断内源性H2O2酶。

e封闭：滴注1%BSA后，置于37℃烘箱孵育1h。

f一抗孵育：按说明书配制一抗溶液，4℃冰箱过夜。

g复温：室温30min。PBS洗涤。

h二抗孵育：按配制对应二抗溶液，37℃，1h。PBS洗涤。

i DAB显色：避光滴加DAB。

j苏木素复染细胞核：在切片上滴加苏木素染色液4min，稍水洗后再滴加苏木素分化液3s，稍水洗。最后滴加苏木素返蓝液3s，稍水洗。

k脱水透明：分别依次置入75%、85%、95%、100%酒精溶液1s，二甲苯Ⅰ、Ⅱ溶液1s。晾干后封片。

其中：IHC染色的抗体信息如表3所示：

表3

⑥统计学分析：

所有组织病理结果均使用Image J 1.52p软件进行分析，所有数据均使用Graphpad Prism 8.0软件进行统计。两组间及组内比较采用t检验（t-test），三组组以上组间比较使用单向方差分析（one-way ANOVA）。所有计量资料均以平均值±标准差值表示。P<0.05被认为统计学上有显著意义（无显著性，P > 0.05；*P < 0.05；**P < 0.01；***P <0.001；****P < 0.0001）。

⑷结果：

①小鼠一般情况及大体形态：

手术后立即进行治疗，D1给药组、D2给药组、D3给药组小鼠分别给予低剂量、中剂量和高剂量的Dulaglutide进行皮下注射，每周一次。所有小鼠均毛色明亮、行为正常、体重平稳增加（P > 0.05）。IUA小鼠无手术并发症。治疗14天后，收集各组的子宫样本观察大体形态。Normal组和Sham组的子宫大小正常，粗细均匀，左右对称，血供正常，子宫组织呈淡粉色，子宫表面光滑有弹性；IUA组的子宫僵硬挛缩，左右不对称，粗细不均匀，子宫组织呈暗红色，子宫腔充血水肿，局部有血凝块或炎性渗出，子宫表面粗糙、薄厚不一。低剂量给药D1组、中剂量给药D2组、高剂量给药D3组的子宫大小基本正常，大小色泽较正常，局部充血水肿情况较轻，子宫表面略光滑，弹性尚可。

②H&E染色结果：

使用H&E染色观察小鼠子宫的组织形态变化。结果发现，Normal组和Sham组的子宫腔表面光滑，结构完整，被覆上皮细胞，腺体丰富且功能正常。IUA组光滑的腔体已损坏，上皮细胞缺失，子宫壁粗糙，薄厚不一，部分小鼠的IUA子宫腔出现粘连甚至闭锁（见图1 A）。IUA组的腺体受损萎缩，数量明显减少，具有统计学意义（P < 0.05）（见图1 B）。经过不同剂量的Dulaglutide治疗14天后，D1组、D2组、D3组的子宫腔形态得到了改善，子宫内膜厚度增加，出现更多的腺体。并且随着药物剂量的增加，腺体数量也随之增加，与IUA组相比差异具有统计学意义（见图1 B）。

③Masson染色结果：

使用Masson染色试剂盒检测，染色产生的蓝色区域显示ECM胶原蛋白沉积和纤维化程度。结果观察到，Normal组和Sham组正常的子宫内膜胶原纤维含量少，排列整齐，子宫内膜间质和血管呈红色。IUA组观察到大量蓝染的胶原纤维，伴随着新生血管的增加，部分IUA小鼠子宫腔内中呈现粘连和闭塞，蓝染区域纤维化较正常小鼠显著增加（P< 0.0001），提示IUA组的子宫内膜间质被纤维性瘢痕组织所取代或覆盖（见图2 A-B）。Dulaglutide治疗14天后，与IUA组相比，子宫内膜间质中的蓝色胶原蛋白纤维面积明显减少，提示Dulaglutide治疗后纤维化和ECM沉积明显减少。其中，中剂量D2组和高剂量D3组较IUA组纤维化蓝染面积显著减少，差异具有统计学意义（P< 0.05，P< 0.0001）（见图2 A-B）。

④IHC染色结果：

α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin, α-SMA）的IHC染色结果显示，Normal组和Sham组的子宫内膜中，α-SMA仅少量散在分布在血管周围（棕黄色区域）。与正常的子宫内膜中的阳性面积相比，损伤的子宫内膜切片中，α-SMA大量分布于子宫内膜间质，呈强阳性染色，且差异具有统计学意义（P < 0.01）（见图2 A、C）。给予不同剂量的Dulaglutide治疗14天后，各给药组a-SMA的表达情况明显低于IUA组，结果与Masson染色一致，且差异具有统计学意义（见图2 A、C）。

⑸结论：

利用“机械损伤+感染”联合造模的方法成功诱导小鼠子宫内膜纤维化，这与IUA发病机制中的主要因素相似，即创伤和感染。与感染、机械损伤等其他单一方法诱导的IUA模型相比，“机械损伤+感染”联合的方法可以更好地构建动物模型。本发明通过H&E、Masson和α-SMA染色结果证实，与Normal组和Sham组的小鼠子宫相比，IUA模型组的腔体明显受损，子宫壁粗糙，薄厚不一，部分小鼠的子宫腔出现粘连甚至闭锁。另外，IUA组的子宫内膜间质纤维化程度增加，上皮细胞缺失，腺体受损萎缩，数量明显减少。上述病理表现均提示成功建立子宫内膜纤维化模型。IUA造模后，分别给予低剂量（150 μg/ Kg）、中剂量（300 μg/ Kg）、高剂量（600 μg/ Kg）的Dulaglutide干预14天 ，染色结果显示，各给药组随着药物剂量的增加，子宫腔形态得到了明显改善，子宫内膜的厚度增加，出现更多的腺体。因此，Dulaglutide显著改善了IUA模型小鼠宫腔的损伤情况，内膜厚度和腺体增加，显著抑制IUA纤维化程度和ECM沉积。

【杜拉鲁肽对小鼠宫腔粘连炎症反应的影响】

采用“机械损伤+感染”联合造模的方法建立IUA小鼠模型，结合前期的组织病理结果，应用实时荧光定量（real-time fluorescence quantitative PCR, RT-qPCR）、蛋白印迹法（western blot, WB）等方法探究Dulaglutide对IUA小鼠炎症反应的影响。

⑴主要实验试剂及仪器，参见表4~5。

表4 主要实验试剂

表5 主要仪器

⑵实验方法：

①组织总蛋白的提取：

无菌剪刀剪取少量子宫组织，加入300-400μL裂解液RIPA（含PMSF 1mM）匀浆（70Hz，90s），冰上静置30min后离心（4℃，12000rpm，15min）取上清，分装，-80℃保存。

②BCA试剂盒测定蛋白剂量和样品配制：

ⅰ蛋白剂量的测定：现配工作液，用酶标仪检测吸光值计算相应蛋白剂量。

ⅱ配制样品：等量配制蛋白样品（含loading）溶液，100℃金属浴，待加样。

③WB：

ⅰ配制SDS-PAGE胶：配制8%、10%、11%、12%的分离胶和对应浓缩胶。

ⅱ电泳：将SDS-PAGE胶置入电泳槽，加入三色预染蛋白Marker和待测蛋白样本，将仪器调至80 V-120V电泳，获得目的蛋白条带。

ⅲ转膜：将所需蛋白条带电转至PVDF膜。

ⅳ封闭：5%脱脂奶粉封闭1-2h，TBST缓冲液洗涤。

ⅴ一抗孵育：配制对应的一抗溶液，4℃孵育过夜，TBST洗涤。

ⅵ二抗孵育：配制对应二抗溶液，室温孵育1h，TBST洗涤。

ⅶ显影：用增强型化学（ECL）发光液显影。

其中：WB使用的抗体信息如表6所示。

表6

④组织总RNA的提取：

无菌剪刀剪取少量子宫组织（约10mg）置于离心管中，用无菌剪刀尽可能剪碎组织，加入500μL的TransZol Up，加入钢珠后置于匀浆机匀浆，静置5min。随后加入氯仿100μL，剧烈震荡后孵育10min。离心机（4℃，12000 rpm，15 min）离心，吸取水相200μL转移至新离心管，加入异丙醇250μL混匀孵育10 min。随后用离心机（10 min）离心后弃上清，加入DEPC水配制75%乙醇500μL，剧烈涡旋后离心（5 min），吸干上清，室温晾干。加入DEPC水溶解沉淀，-80℃保存。

⑤逆转录：

使用NanoDrop 2000检测RMA剂量，依据所得剂量计算各样品所需测量体积及其他指标。

依据说明书使用cDNA逆转录试剂盒（参见表7）、qPCR试剂盒（参见表8）进行逆转录。

其中qPCR引物信息如表9所示。

表7 cDNA逆转录试剂盒

表8 qPCR试剂盒

表9 qPCR引物信息

⑥统计学分析：

所有RT-qPCR数据结果均设置复孔取平均值，每个反应管均获得相应的循环数（Ct）值，以GAPDH作为内参，用2^-ΔΔCt方法计算小鼠子宫组织中对应的信使核糖核酸（messenger RNA, mRNA）水平。WB内参为GAPDH，所有结果均使用Image J 1.52p软件进行灰度分析和比较。所有计量资料统计方法见第一章（1.2.2.6 统计学分析）。

⑶结论：

①Dulaglutide对小鼠子宫内膜损伤后炎症因子的影响：

本发明评估了小鼠子宫内膜损伤后Dulaglutide对IUA组织形态学的影响，发现IUA子宫腔充血水肿，子宫内膜丧失再生能力，间质纤维化程度增加，腺体明显减少，受损的子宫内膜中聚集了大量的炎性细胞，可以诱发急性慢性炎症。

通过比较“机械损伤+感染”诱导的IUA子宫内膜中与炎症相关调节基因的mRNA表达情况，发现IUA组中炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA相对表达量较Normal组和Sham组明显上调，差异具有统计学意义（见图3 A-C）。给药组分别给予低、中、高剂量Dulaglutide治疗IUA小鼠14天后，可以显著降低IUA中IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA水平，差异具有统计学意义（见图3 A-C）。随后，进一步检测了IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白表达含量，WB结果与qPCR一致（见图3D），促炎因子在IUA组高表达，给予Dulaglutide显著降低，且差异具有统计学意义（见图3 E-G）。这些数据表明，中剂量和高剂量的Dulaglutide对IUA具有保护作用，可以减少子宫内膜损伤后促炎因子的释放。

②Dulaglutide对M1巨噬细胞极化的影响：

通过检测IUA子宫内膜中与M1巨噬细胞的极化相关调节基因的mRNA表达情况，发现IUA组中趋化因子CCL2和巨噬细胞标记物F4/80的mRNA相对表达量较Normal组和Sham组明显上调，差异具有统计学意义（见图4 A-B）。给予低、中、高剂量Dulaglutide治疗后，各给药组中CCL2和F4/80的mRNA水平显著降低，且差异具有统计学意义（见图4 A-B）。这些结果表明，Dulaglutide在子宫内膜损伤后抑制了M1巨噬细胞的极化。随后，验证了巨噬细胞标记物F4/80的蛋白表达含量，结论与qPCR结果一致，差异具有统计学意义（见图4 C-D）。

综上所述，Dulaglutide通过抑制M1巨噬细胞极化和炎性因子的释放而发挥抗炎活性，从而减轻了IUA子宫内膜的损伤，对IUA小鼠具有保护作用。

【杜拉鲁肽对小鼠宫腔粘连纤维化的影响】

通过“机械损伤+感染”建立IUA小鼠模型，结合前期的组织病理结果，应用RT-qPCR、WB等方法探究Dulaglutide对IUA小鼠子宫内膜纤维化的影响。

⑴主要实验试剂与仪器及实验方法同【杜拉鲁肽对小鼠宫腔粘连炎症反应的影响】。

⑵结论：

①Dulaglutide对子宫内膜纤维化程度和ECM的影响：

通过检测与纤维化和ECM成分相关的基因表达，结果显示，IUA组别中α-SMA、胶原蛋白Collagen 1a、纤连蛋白（fibronectin, FN）、基质金属蛋白酶抑制剂（matrixmetallo-proteinase inhibitor, TIMP）-1、MMP9、结缔组织生长因子（connective tissuegrowth factor, CTGF）的mRNA相对表达含量明显上升（见图5 A-F）。给予低、中、高剂量Dulaglutide治疗14天后，α-SMA、Collagen 1a、FN、TIMP-1、MMP9、CTGF的mRNA的水平降低，提示Dulaglutide改善了子宫内膜纤维化和ECM的成分，且与药物剂量相关，差异具有统计学意义（见图5A-F）。另外，通过检测α-SMA、Collagen 1a和TIMP-1的蛋白表达含量，结果与qPCR、Masson、IHC染色结果一致（见图5G-J）。数据表明，Dulaglutide可能改善子宫内膜纤维化并减少ECM的沉积。

②Dulaglutide对EMT的影响：

通过检测Dulaglutide对EMT相关基因的mRNA表达，结果显示，相较Normal组和Sham组的子宫内膜，IUA组的EMT间质标记物波形蛋白（vimentin）的mRNA相对表达含量增加。给予中、高剂量的Dulaglutide治疗14天后，vimentin的mRNA相对表达含量相对减少，且与药物剂量相关联（见图6 A）。

通过探究EMT上皮标记物E-钙粘蛋白（E-cadherin）和vimentin的蛋白表达，与正常的子宫内膜比较，IUA组的E-cadherin低表达、vimentin高表达。中、高剂量Dulaglutide治疗后，显著增加了E-cadherin的表达，并抑制了vimentin（见图6 B-D）。这些结果表明，Dulaglutide在IUA小鼠体内逆转了EMT。

③Dulaglutide对子宫内膜TGF-β1和Samd表达的影响：

本发明中小鼠的TGF-β1的mRNA水平，子宫内膜损伤和治疗后TGF-β1的mRNA相对含量水平发生了显著变化。IUA组与Normal组、Sham组相比，TGF-β1的mRNA相对含量增加，且差异具有统计学意义（见图7 A）。但是Dulaglutide治疗后，TGF-β1的mRNA相对含量减少。因此，可以认为Dulaglutide可能通过调节TGF-β1改善IUA子宫内膜纤维化。

通过研究TGF-β1和Smad的蛋白表达水平，结果显示，与正常的子宫内膜相比，IUA的子宫内膜损伤后TGF-β1和Smad 2的磷酸化（p-Smad 2）水平显著增加，且差异具有统计学意义（见图7 B-D）。Dulaglutide干预子宫内膜损伤后，显著下调了低剂量D1组、中剂量D2组、高剂量D3组的TGF-β1和p-Smad 2的蛋白表达，且与剂量相关，差异具有统计学意义（见图7 B-D）。因此，Dulaglutide可能通过激活TGF-β1/Smad 2信号通路，抑制了子宫内膜组织TGF-β1、p-Smad 2，提示Dulaglutide通过在IUA小鼠体内靶向TGF-β1/ Smad 2信号传导来抑制基质沉积和纤维化。这可能是Dulaglutide改善子宫内膜纤维化的相关机制。

④Dulaglutide对子宫内膜ER（雌激素受体）和PR（孕激素受体）表达的影响：

通过检测Dulaglutide作用的IUA小鼠子宫内膜ER和PR的情况，结果显示IUA组子宫内膜组织中的ER-α、PR的mRNA相对表达含量上调，而给予不同剂量的Dulaglutide治疗后，ER-α、PR的mRNA相对表达含量下调（见图8 A-B）。因此，可以认为Dulaglutide可能通过抑制IUA的炎症反应和子宫内膜纤维化，进一步改善了子宫内膜的功能。

综上所述，Dulaglutide可能通过激活TGF-β1/Smad 2-CTGF信号通路信号通路，抑制小鼠子宫内膜纤维化，组织ECM的沉积和EMT。Dulaglutide还可能通过抑制IUA的炎症反应和子宫内膜纤维化，进一步改善了子宫内膜的功能。

Claims (5)

1.杜拉鲁肽在治疗和预防宫腔粘连药物中的应用。

2.如权利要求1所述的杜拉鲁肽在治疗和预防宫腔粘连药物中的应用，其特征在于：该杜拉鲁肽配制成12 ~15ml杜拉鲁肽药液。

3.如权利要求2所述的杜拉鲁肽在治疗和预防宫腔粘连药物中的应用，其特征在于：所述杜拉鲁肽药液的制备是指使用无菌1x PBS溶液依据相应浓度溶解杜拉鲁肽进行配制。

4.如权利要求3所述的杜拉鲁肽在治疗和预防宫腔粘连药物中的应用，其特征在于：所述杜拉鲁肽用量为150μg/Kg~600μg/Kg。

5.如权利要求2或3所述的杜拉鲁肽在治疗和预防宫腔粘连药物中的应用，其特征在于：所述杜拉鲁肽药液的给药周期为1次/周，连续给药14天。

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