CN113307818A - 具有荧光成像和光动力的荧光探针及其纳米制剂及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属药化和制药技术领域，涉及具有NIR II荧光成像和光动力治疗性能的荧光探针及其纳米制剂及制备方法。所述荧光分子以取代的三苯胺或四苯乙烯偶联乙烯二氧噻吩偶联苯并噻/硒/碲二唑为母核，具备NIR II荧光成像和活性氧产生性能。本发明将磷脂类分子、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰胆碱等合成磷脂与磷脂酰胆碱等天然磷脂或二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇及其衍生物或白蛋白或聚乙二醇类嵌段共聚物与所述荧光分子制得兼具良好NIR II荧光成像和光动力治疗效果的纳米制剂，该制剂在近红外光的照射下发出NIR II荧光，并产生ROS，能实现荧光影像指导的肿瘤光动力治疗。有助达到肿瘤诊疗一体化的目的。

Description

具有荧光成像和光动力的荧光探针及其纳米制剂及制备方法
技术领域
本发明属药物化学和药物制剂技术领域，涉及具有荧光成像和光动力的荧光探针及其纳米制剂，具体涉及具有NIR II荧光成像和光动力治疗性能的荧光探针及其纳米制剂及制备方法。
背景技术
现有技术公开了近红外光因其深组织穿透性和低组织背景干扰等优点而在生物医学领域中得到了广泛的应用。近年的研究表明，在较长的成像波长下，组织成分的光散射和自发荧光会减弱，同时，组织吸收在650-1450nm范围内会达到最小值；因此，在近红外II区窗口(NIR II，1000-1700nm)中的荧光成像与传统的可见光区(400-750nm)和近红外I区窗口(NIR I，750-950nm)荧光成像相比，因其波长更长具有更好的空间分辨率和特征对比度。
肿瘤的光动力治疗(Photodynamictherapy，PDT)是作为一种肿瘤疗法发展起来的，其中成功的应用是针对非恶性疾病。该疗法主要原理是使用特定波长的光激发光敏剂，传递能量给氧气产生活性氧(ROS)，造成肿瘤细胞死亡、微血管损伤以及诱导局部免疫等反应治疗肿瘤，该方法最显著特点是其无创性或微创性，因而相比于传统的癌症治疗方法，其副作用被显著降低。
随着纳米技术的发展，越来越多的在近红外区有强烈吸收的纳米材料被研究和报道，其中包括无机材料，如金纳米材料、碳纳米材料、钯纳米片和硫化铜纳米材料等；研究者认为，有机材料，如有机近红外染料、卟啉脂质体和高分子聚合物等，相较于无机材料，有机材料具有生物相容性高，易于代谢，毒副作用低等优点，更易于临床转化。
基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供具有荧光成像和光动力的荧光探针及其纳米制剂及制备方法，本申请的新型有机小分子可视化光动力治疗剂具有良好的临床应用前景，有望实现肿瘤的诊疗一体化。
发明内容
本发明的目的是基于现有技术的现状，提供具有荧光成像和光动力的荧光探针及其纳米制剂及制备方法，尤其是可用于NIR II荧光成像和光动力治疗的荧光探针及其制剂及制备方法。
本发明基于近红外光具有良好的组织渗透性，制备了具有NIR II成像功能、良好ROS生成性能和光照稳定性的新型有机小分子可视化光动力治疗剂。
本发明中，所述的荧光分子特征在于，以取代的三苯胺或四苯乙烯偶联乙烯二氧噻吩偶联苯并噻/硒/碲二唑为母核，兼具NIR II荧光成像和ROS产生性能；通过采用常见药物载体(包括磷脂分子、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇及其衍生物或白蛋白或聚乙二醇类嵌段共聚物等)，制备载该荧光分子的纳米制剂，制得能满足可视化治疗要求的兼具NIR II荧光成像和光动力性能的诊疗一体化的纳米制剂。
本发明中，兼具NIR II成像和ROS产生能力的荧光分子，其结构通式如通式I或通式II所示：
Figure BDA0002556331110000031
其中，
X是硫、硒或碲；
R1、R2、R3、R4至少一个是
Figure BDA0002556331110000032
其余的是氢；
R5、R6是氢、氟、氯、溴、碘、硝基或甲氧基等。
通式I的荧光分子按合成路线1制备：
以酰基取代的三苯胺为原料，经溴化、迈克尔加成反应、铃木反应得到目标产物：
Figure BDA0002556331110000033
其中，R1是氢或甲基；R2是氢、醛基或乙酰基；R3是氢、
Figure BDA0002556331110000041
R4、R5是氢、氟、氯、溴、碘、硝基或甲氧基；X是硫、硒或碲。
上述反应路线1反应式中采用试剂：
(a)N-溴代丁二酰亚胺(NBS)、二甲基甲酰胺(DMF)、氯仿，60℃；
(b)丙二腈、三乙胺、二氯甲烷，室温；(c)联硼酸频那醇酯、醋酸钾、双三苯基膦二氯化钯、无水二氧六环，85℃；(d)2MK2CO3、四三苯基膦钯、二氧六环，105℃。
Figure BDA0002556331110000042
X是硫、硒或碲；
R1、R2、R3、R4、R5、R6至少一个是
Figure BDA0002556331110000043
其余的是氢；
R7、R8是氢、氟、氯、溴、碘、硝基或甲氧基等。
通式II的荧光分子按合成路线1制备：
以酰基取代的四苯乙烯为原料，经迈克尔加成反应、铃木反应制得目标产物：
Figure BDA0002556331110000051
其中，R1是氢或甲基；R2、R3是氢、醛基或乙酰基；R4、R5是氢、氟、氯、溴、碘、硝基或甲氧基；X是硫、硒或碲；R6、R7是氢、
Figure BDA0002556331110000052
Figure BDA0002556331110000053
上述反应路线2反应式中采用试剂：
(a)丙二腈、三乙胺、二氯甲烷，室温；(b)联硼酸频那醇酯、醋酸钾、双三苯基膦二氯化钯、无水二氧六环，85℃；(c)2MK2CO3、四三苯基膦钯、二氧六环，105℃。
本发明采用上述任一种的NIR II荧光分子，制备脂质体制剂；
所述脂质体制剂中含有所述的荧光分子、磷脂分子、胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇或衍生物；
所述的荧光分子与磷脂分子的摩尔比为1:1-1:50；优选地，摩尔比为1:2-1:10；
所述的磷脂分子是二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、磷脂酰胆碱(PC)中的一种或几种的混合物；优选地，所述的磷脂分子是二硬脂酰磷脂酰胆碱；
所述的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇及其衍生物是二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000、二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇-氨基、二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇-马来酰亚胺、二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇-巯基中的一种或几种的混合物；优选的，所述的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇或衍生物分子是二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000。
本发明提供了上述含有所述荧光分子的脂质体制剂的制备方法，其包括步骤：
(1)将磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和所述荧光分子溶解于氯仿、二氯甲烷、四氢呋喃或它们的混合溶剂中；
(2)将(1)所述的混合溶液混合均匀后旋转蒸发除去有机溶剂形成脂质膜；
(3)向(2)中形成的脂质膜中加入一定量的缓冲溶液，充分震荡使脂质膜水化脱落；
(4)将步骤(3)得到的水溶液通过聚碳酸脂膜得到粒径均一的脂质体。
优选的，步骤(1)中的溶剂为氯仿。
优选的，步骤(2)的旋蒸温度在30-60℃之间。
优选地，步骤(3)中的缓冲溶剂pH在5-8之间，体积在1-10mL之间。
所述制剂中含有所述的荧光分子和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)及其衍生物。
所述的荧光分子与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇及其衍生物的质量比为1:1-1:50；优选地，质量比为1:2-1:10。
所述的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇及其衍生物是二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000、二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇-氨基、二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇-马来酰亚胺、二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇-巯基中的一种或几种的混合物。优选地，所述的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇及其衍生物是二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇2000。
本发明采用上述任一种的NIR II荧光分子，制备胶束；
本发明提供了上述含有所述荧光分子的胶束的制备方法，其包括步骤：
(1)将二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和所述荧光分子溶解于氯仿、二氯甲烷、四氢呋喃或它们的混合溶剂中；
(2)将(1)中所述混合溶液逐滴加入水中并稀释十倍；
(3)将(2)中所述混合溶液超声一定时间；
(4)将(3)中所述混合溶液于通风橱搅拌一定时间；
(5)将(4)中所述混合溶液通过0.2μm滤膜过滤，制备得到胶束。
优选地，步骤(1)中所述的溶剂为氯仿。
优选地，步骤(3)中所述的超声时间为2-10分钟。
优选地，步骤(4)中搅拌时间为8-12小时。
本发明采用以上所述的NIR II荧光分子，具体地，以上述化合物中的任一种制备白蛋白纳米制剂；
所述制剂中含有所述的荧光分子和白蛋白；
所述的荧光分子与白蛋白的质量比为1:1-1:50；优选地，质量比为1:2-1:10。
所述的白蛋白是人血清白蛋白、重组人血清白蛋白和牛血清白蛋白中的一种或几种的混合物。
上述含有所述荧光分子的白蛋白纳米制剂的制备方法，包括步骤；
(1)将白蛋白溶解于水中；
(2)将所述荧光分子溶解于甲醇、乙醇、丙二醇、氯仿、二氯甲烷、四氢呋喃或它们的混合溶剂中；
(3)将步骤(2)的有机溶液加入到步骤(1)的水溶液中并混合均匀；
(4)将步骤(3)得到的混合液室温搅拌1-8小时。
优选地，步骤(1)中所述的白蛋白水溶液浓度为0.1％-5％(w/v)，优选为0.5％-2％(w/v)。
优选地，步骤(2)中的有机溶剂与步骤(1)中的水的比例为1:40-1:60。
优选地，步骤(4)中搅拌时间为2-6小时。
本发明采用以上所述的NIR II荧光分子，具体地，以上述化合物中的任一种，制备聚乙二醇类嵌段共聚物包载的纳米制剂；
所述制剂中含有所述的荧光分子和聚乙二醇类嵌段共聚物。
所述的荧光分子与聚乙二醇类嵌段共聚物的质量比为1:1-1:50；优选地，质量比为1:2-1:10。
所述的聚乙二醇类嵌段共聚物是聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸嵌段共聚物、聚乙二醇-聚己内酯嵌段共聚物、聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物、聚乙二醇-聚碳酸酯嵌段共聚物的一种或者几种的混合物。所述的聚乙二醇类嵌段聚合物的分子量范围2000-60000之间，PEG的分子量在1000-5000之间。优选地，所述的聚乙二醇类嵌段共聚物是聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸嵌段共聚物(PEG-PLGA)，PLGA的分子量为50000，LA:GA＝50:50，PEG的分子量为2000。
上述含有所述荧光分子的PEG-PLGA纳米制剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)将所述荧光分子和PEG-PLGA以一定比例溶解于甲醇、乙醇、丙二醇、氯仿、二氯甲烷、四氢呋喃或它们的混合溶剂中；
(2)在超声、冰水浴条件下，将步骤(1)的有机溶液加入到纯水中混合均匀；
(3)将步骤(2)得到的混合液室温搅拌1-8小时用以挥干有机溶剂；
(4)将步骤(3)中所得纳米粒溶液冷冻干燥即得所需纳米粒子。
优选地，步骤(1)中所述的荧光分子与PEG-PLGA的质量比为1:5-1:10。
优选地，步骤(2)中的有机溶剂与纯水的比例为1:10-1:20。
优选地，步骤(3)中搅拌时间为2-6小时。
本发明所制备的纳米制剂与游离的荧光分子相比，其水溶性显著提高，符合兼具NIR II荧光成像和光动力治疗的要求。本发明经小鼠实验结果显示，所述的荧光探针的纳米制剂能够实现在肿瘤部位累积，在660nm激光照射下，能实现肿瘤原位灶和转移灶的清晰成像；进一步的NIR II荧光成像指导的肿瘤光动力治疗实验结果显示，所述纳米制剂在体内具有良好的光动力治疗能力，能有效杀死肿瘤细胞。
本发明提供了可用于NIR II荧光成像和光动力治疗的荧光探针及其制剂及制备方法。制备的具有NIR II成像功能、良好ROS生成性能和光照稳定性的有机小分子可视化光动力治疗剂具有良好的临床应用前景，有望实现肿瘤的诊疗一体化。
附图说明
图1，化合物BNET纳米粒的透射电镜图和粒径分布图。
图2，(a)在660nm激发下化合物BNET(10μM)和化合物BNET纳米粒(10μM)在不同溶液中的荧光光谱；(b)化合物BNET(10μM)和化合物BNET纳米粒(10μM)溶液可见光照片和溶液在660nm激光照射(激光功率密度为0.1W/cm2)下NIR II荧光成像。
图3，利用SOSG检测ROS的生成，其中显示，化合物BNET纳米粒的水溶液(10μM)和化合物BNET的5％THF溶液(10μM)，在660nm激光照射下(激光功率密度为0.1W/cm2)照射10分钟，检测溶液荧光强度的变化。
图4，荷CT26-Luc原位瘤模型小鼠给药(150mg/kg)后24小时处肿瘤部位的原位瘤(a)和转移瘤(b)的可见光照片和相应的NIR II荧光成像(660nm,激光功率密度为0.1W/cm2)，箭头指示原位瘤或转移瘤位置。
图5，荷CT26-Luc原位瘤模型小鼠光动力治疗效果，
其中显示，NIR II影像指导的光动力治疗组、传统光动力治疗组(即非影像指导的光动力治疗组)和磷酸缓冲盐溶液组小鼠的生存曲线(n＝5)。****P<0.0001。
图6，在660nm激发下化合物SNET(10μM)在5％THF溶液中的荧光光谱。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步说明，但不仅限于此。
实施例1：化合物6aa(BNET)的合成方法
Figure BDA0002556331110000111
(1)4-((4-溴苯基)(苯基)氨基)苯甲醛(2a)的合成
在室温下将NBS(3.88g，21.80mmol)滴加到4-(二苯基氨基)苯甲醛(5.00g，18.29mmol)到氯仿/DMF(40mL，v/v，1:1)中的混合溶液中。将混合物在氮气保护下于60℃搅拌12小时，然后用水淬灭，水相用二氯甲烷萃取。用水和饱和盐水洗涤有机相，用无水硫酸钠干燥过夜。除去二氯甲烷后，将残余物通过硅胶色谱法纯化，用乙酸乙酯/石油醚(1:30)洗脱，得到所需的产物化合物2a(5.92g，产率92％)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.81(s,1H),7.75(t,J＝8.0Hz,2H),7.58(d,J＝8.3Hz,3H),7.43(t,J＝7.6Hz,1H),7.24(d,J＝8.7Hz,1H),7.19(d,J＝7.2Hz,1H),7.11(d,J＝8.2Hz,3H),7.00(d,J＝8.0Hz,1H),6.94(d,J＝7.5Hz,1H).MALDI-MS(ESI)Calcd for:C19H15BrNO+([M+H]+):352.0332,Found:351.9444。
(2)2-(4-((4-溴苯基)(苯基)氨基)亚苄基)丙二腈(3a)的合成
将化合物2a(3.00g，8.52mmol)溶于20mL干燥的二氯甲烷溶液中，加入5滴三乙胺和0.65mL丙二腈。将上述反应液在室温下搅拌2小时后减压除去溶剂，残余物以乙酸乙酯/石油醚(1:10)为流动相的硅胶色谱柱进行纯化，得到橙色固体化合物3a(3.24g，产率95％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.74(d,J＝10.7Hz,2H),7.57-7.51(m,1H),7.48(dd,J＝8.8,3.3Hz,2H),7.39(t,J＝7.7Hz,2H),7.26(d,J＝6.7Hz,1H),7.17(d,J＝8.5Hz,2H),7.05(t,J＝9.2Hz,2H),6.96(d,J＝8.9Hz,2H).MALDI-MS(ESI)Calcd for:C22H15BrN3 +([M+H]+):400.0444,Found:400.9986。
(3)2-(4-(苯基(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼硼烷-2-基)苯基)氨基)亚苄基)丙二腈(4a)的合成
向装有化合物3a(1.50g，3.75mmol)无水1，4-二氧六环溶液的50mL双颈烧瓶中依次加入联硼酸频那醇酯(2.19g，8.62mmol)，乙酸钾(1.29g，13.13mmol)和Pd(PPh3)Cl2(0.27g，0.38mmol)。将上述反应液在氮气保护下置于85℃的油浴中搅拌反应。10小时后，将反应液冷却至室温，用水洗涤，二氯甲烷萃取，有机相无水硫酸钠干燥过夜。将溶剂在减压下浓缩，并将所得残余物通过硅胶色谱法用乙酸乙酯/石油醚(1:20)作流动相纯化，得橙色粉末的化合物4a(0.81g，产率48％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.80(d,J＝8.2Hz,2H),7.74(d,J＝8.5Hz,2H),7.53(s,1H),7.37(t,J＝7.5Hz,2H),7.25(d,J＝8.3Hz,1H),7.15(m,4H),7.00(d,J＝8.7Hz,2H),1.35(s,12H).MALDI-MS(ESI)Calcd for:C28H27BN3O2 +([M+H]+):448.2196,Found:448.1755。
(4)2,2'-((((((((((((5,6-二硝基苯并[c][1,2,5]噻唑-4,7-二取代]]双(2,3-二氢噻吩[3,4-b][1,4]二恶英-7,5-二基)双(4,1-亚苯基))双(苯基氮杂二基)双(4,1-亚苯基))双(亚甲叉基))二甲基腈(BNET)的合成
化合物4a(0.40g，0.60mmol)，4,7-双(7-溴-2,3-二氢噻吩并[3,4-b][1,4]二恶-5-基)-5,6-二硝基苯并[c][1,2,5]噻二唑1(化合物5a，0.67g，1.50mmol)和Pd[PPh3]4(0.066g，0.057mmol)放入50mL双颈烧瓶中。在氮气下用注射器加入脱气的1，4-二氧六环，将所得溶液通过真空脱气。在氮气下加入2MK2CO3溶液。将该混合物进一步真空脱气，然后在105℃下搅拌8小时。减压除去溶剂后，将所得残余物用二氯甲烷萃取。有机相用水和饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥。通过硅胶色谱法用乙酸乙酯/石油醚(1:1)作为流动相纯化产物，得到黑色固体化合物BNET(0.28g，产率41％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.86-7.59(m,9H),7.55(d,J＝9.4Hz,1H),7.38(m,5H),7.25(m,5H),7.07(m,8H),4.35(m,4H),4.29-4.19(m,4H).13CNMR(151MHz,CDCl3)δ189.82,170.42,157.14,152.28,151.95,145.30,145.06,144.29,143.86,142.45,142.31,137.02,136.79,132.32,130.68,129.43,129.22,129.11,127.75,127.23,127.10,126.16,125.81,125.60,125.00,124.75,122.64,119.65,118.66,102.05,63.93,13.57.MALDI-MS(ESI)Calcd for:C62H37N10O8S3 +([M+H]+):1146.1982,Found:1146.7115。
实施例2：含有化合物BNET的白蛋白纳米制剂的制备与评价
将牛血清白蛋白溶解在水中并混合均匀，使蛋白浓度为0.5％(w/v)。取2mL0.5％白蛋白水溶液于10mL试剂瓶中。准确称量2.0mg化合物BNET并溶解于0.4mL有机溶剂中。药物用量与蛋白用量之比为1:5。将溶有化合物BNET的有机溶剂加入白蛋白水溶液中，室温搅拌4小时，制得含有化合物BNET的白蛋白纳米制剂。所制备的纳米制剂的相关参数如表1所示，以及形态如图1所示。
表1
Figure BDA0002556331110000141
化合物BNET经660nm激发，其发射波长在900-1400nm，为NIR II荧光。化合物BNET在良性极性溶剂70％四氢呋喃(THF)中表现为荧光淬灭，在不良溶剂20％THF中发出荧光。将化合物BNET制备成白蛋白纳米制剂，其在水中的荧光强度介于BNET在20％THF与化合物BNET在70％THF之间，表明将化合物BNET制备成白蛋白纳米制剂后可以调节化合物BNET的荧光强度(如图2所示)。
单线态氧荧光探针SOSG对单线态氧具有高度选择性，因此用SOSG来评估化合物BNET的ROS产生量。实验组包括(1)SOSG+激光照射；(2)载化合物BNET的制剂+SOSG+激光照射；(3)载化合物BNET的制剂+SOSG。其中，SOSG终浓度为5μM的溶液，化合物BNET终浓度为10μM。溶液体积为200μL。光照条件为0.1W/cm2，660nm，10分钟。用荧光酶标仪(Bio-Tek)在λex＝485±20nm，λem＝528±20nm下检测SOSG的荧光强度。与背景样品或对照样品相比，通过SOSG荧光增强评估样品产生的ROS。结果显示化合物BNET白蛋白纳米制剂能够产生大量的ROS(如图3所示)。
采用CT26-Luc细胞株建立原位结肠癌模型，静脉注射化合物BNET纳米粒(150mg/kg)24小时后，切开盲肠部位的皮肤及腹膜，暴露肠段，对原位灶和转移灶分别进行NIR II荧光成像，可以对肿瘤的原位灶以及大小约为1mm的转移灶清晰成像(如图4所示)。在NIRII荧光成像下，采用光纤对肿瘤部位实施光动力治疗。治疗后60天内荷瘤小鼠肿瘤未复发(如图5所示)，而未经NIR II荧光成像下的光动力治疗，小鼠在60天内全部复发死亡。
实施例3：化合物6ab(SNET)的合成方法
Figure BDA0002556331110000161
化合物4a(0.15g，0.21mmol)，4,7-双(7-溴-2,3-二氢噻吩并[3,4-b][1,4]二恶-5-基)苯并[1,2-c:4,5-c']双([1,2,5]硒二唑)(化合物5b，0.24g，0.53mmol)和Pd[PPh3]4(0.023g，0.021mmol)放入25mL双口烧瓶中。在氮气下用注射器加入脱气的1，4-二氧六环，将所得溶液通过真空脱气。在氮气下加入2MK2CO3溶液(0.45mL)。将该混合物进一步真空脱气，然后回流搅拌8小时，减压除去溶剂后，将所得残余物用二氯甲烷萃取。有机相经水和饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥。通过硅胶色谱法用乙酸乙酯/石油醚(1:1)作为流动相纯化产物，得到墨绿色固体化合物SNET(0.088g，产率35％)。1HNMR(600MHz,CDCl3)δ7.78(m,5H),7.74(d,J＝8.7Hz,2H),7.70(dd,J＝8.4,3.2Hz,1H),7.56(s,1H),7.42(m,5H),7.19(m,10H),7.12(d,J＝8.7Hz,2H),7.05(d,J＝9.0Hz,2H),4.41–4.35(m,4H),4.30–4.25(m,4H).13CNMR(151MHz,CDCl3)δ189.87,157.24,156.49,152.43,152.33,145.28,144.33,142.39,137.06,136.83,132.35,130.71,129.44,129.22,129.02,127.19,127.06,126.16,125.82,125.69,125.60,125.01,124.75,122.68,119.61,118.64,114.49,113.37,102.95,102.67,63.95,63.82.MALDI-MS(ESI)Calcd for:C62H37N10O8S2Se+([M+H]+):1194.1429,Found:1194.1569。
实施例4：含有化合物SNET的白蛋白纳米制剂的制备与评价
将牛血清白蛋白溶解在水中并混合均匀，使蛋白浓度为0.5％(w/v)。取2mL0.5％白蛋白水溶液于10mL试剂瓶中。准确称量2.0mg化合物SNET并溶解于0.4mL有机溶剂中。药物用量与蛋白用量之比为1:5。将溶有化合物SNET的有机溶剂加入白蛋白水溶液中，室温搅拌4小时，即可得到含有化合物SNET的白蛋白纳米制剂。所制备得到的纳米制剂的相关参数，如表2所示。
表2
Figure BDA0002556331110000171
化合物SNET经660nm激发，其发射波长在900-1400nm，为NIR II荧光(如图6所示)，将化合物SNET制备成白蛋白纳米制剂，发射NIR II荧光。
评估化合物SNET的ROS的产生量，实验组包括(1)SOSG+激光照射；(2)载化合物BNET的制剂+SOSG+激光照射；(3)载化合物BNET的制剂+SOSG。其中，SOSG终浓度为5μM的溶液，化合物BNET终浓度为10μM，溶液体积为200μL。光照条件为0.1W/cm2，660nm，10分钟。用荧光酶标仪(Bio-Tek)在λex＝485±20nm，λem＝528±20nm下检测SOSG的荧光强度。与背景样品或对照样品相比，通过SOSG荧光增强评估了样品的ROS。结果显示化合物SNET白蛋白纳米制剂能够产生大量的ROS。
采用CT26-Luc细胞株建立原位结肠癌模型，静脉注射化合物SNET纳米粒(100mg/kg)24小时后，切开盲肠部位的皮肤及腹膜，暴露肠段，对原位灶和转移灶分别进行NIR II荧光成像，可以对肿瘤的原位灶以及大小约为1.2mm的转移灶清晰成像。在NIR II荧光成像下，采用光纤对肿瘤部位实施光动力治疗。治疗后60天内荷瘤小鼠肿瘤未复发。而未经NIRII荧光成像下的光动力治疗，小鼠在60天内全部复发死亡。
实施例5：化合物6bc的合成方法
Figure BDA0002556331110000181
(1)1-(4-((4-溴苯基)(苯基)氨基)苯基)乙-1-酮(2b)的合成
在室温下将NBS(3.90g，22.03mmol)滴加到1-(4-(二苯氨基)苯基)乙-1-酮(5.00g，17.42mmol)到氯仿/DMF(40mL，v/v，1:1)中的混合溶液中。将混合物在氮气保护下于60℃搅拌12小时，然后用水淬灭，水相用二氯甲烷萃取。用水和饱和盐水洗涤有机相，用无水硫酸钠干燥过夜。除去二氯甲烷后，将残余物通过硅胶色谱法纯化，用乙酸乙酯/石油醚(1:30)洗脱，得到所需的产物化合物2b(5.92g，产率92％)。MALDI-MS(ESI)Calcd for:C20H17BrNO+([M+H]+):366.0488，Found:366.0432。
(2)2-(1-(4-((4-溴苯基)(苯基)氨基)苯基)亚乙基)丙二腈(3b)的合成
将化合物2b(4.00g，10.96mmol)溶于30mL干燥的二氯甲烷溶液中，加入5滴三乙胺和0.8mL丙二腈。将上述反应液在室温下搅拌2小时后减压除去溶剂，残余物以乙酸乙酯/石油醚(1:10)为流动相的硅胶色谱柱进行纯化，得到橙色固体化合物3b(4.13g，产率91％)。MALDI-MS(ESI)Calcd for:C23H17BrN3 +([M+H]+):414.0600，Found:414.0821。
(3)2-(1-(4-(苯基(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)苯基)氨基)苯基)亚乙基)丙二腈(4b)的合成
向装有化合物3b(1.80g，4.36mmol)无水1，4-二氧六环溶液的50mL双颈烧瓶中依次加入联硼酸频那醇酯(2.22g，8.72mmol)，乙酸钾(1.40g，14.25mmol)和Pd(PPh3)Cl2(0.31g，0.44mmol)。将上述反应液在氮气保护下置于85℃的油浴中搅拌反应。10小时后，将反应液冷却至室温，用水洗涤，二氯甲烷萃取，有机相无水硫酸钠干燥过夜。将溶剂在减压下浓缩，并将所得残余物通过硅胶色谱法用乙酸乙酯/石油醚(1:20)作流动相纯化，得橙色粉末的化合物4b(1.56g，产率78％)。MALDI-MS(ESI)Calcd for:C29H29BN3O2 +([M+H]+):462.2353，Found:462.3245。
(4)2,2'-(((((((((((5,6-二甲氧基苯基[c][1,2,5]硒唑-4,7-二取代)双)双(2,3-二氢噻吩[3,4-b][1，4]二恶英-7,5-二基)双(4,1-亚苯基))双(苯基氮杂二基))双(4,1-亚苯基))双(乙烷-1-基-1-亚烷基))二甲基腈(6bc)的合成；
化合物4b(0.75g，1.62mmol)，4,7-双(7-溴-2,3-二氢噻吩并[3,4-b][1,4]二恶-5-基)-5,6-二甲氧基苯并[c][1,2,5]硒二唑(化合物5c，0.50g，0.74mmol)和Pd[PPh3]4(0.081g，0.07mmol)放入50mL双颈烧瓶中。在氮气下用注射器加入脱气的1，4-二氧六环，将所得溶液通过真空脱气。在氮气下加入2MK2CO3溶液。将该混合物进一步真空脱气，然后在105℃下搅拌8小时。减压除去溶剂后，将所得残余物用二氯甲烷萃取。有机相用水和饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥。通过硅胶色谱法用乙酸乙酯/石油醚(1:1)作为流动相纯化产物，得到黑色固体化合物6bc(0.49g，产率56％)。MALDI-MS(ESI)Calcd for:C66H47N8O6S2Se+([M+H]+):1192.2253，Found:1192.2316。
实施例6：含有化合物6bc的脂质体制剂的制备与评价
将二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和所述荧光分子溶解于氯仿试剂中，摩尔比为56：1.8：0.2：42。将所述的混合溶液混合均匀后置入10mL茄形瓶中，在水浴中旋转蒸发30分钟用以除去有机溶剂从而形成脂质膜，水浴温度为40℃。向中形成的脂质膜中加入5mL的PBS缓冲溶液，超声使脂质膜水化脱落。将得到的水溶液通过聚碳酸脂膜得到粒径均一的脂质体。所制备得到的纳米制剂的相关参数，如表3所示。
表3
Figure BDA0002556331110000211
化合物6bc经660nm激发，其发射波长在900-1400nm，为NIR II荧光。将化合物6bc制备成脂质体，发射NIR II荧光。
评估化合物6bc的ROS的产生量，实验组包括(1)SOSG+激光照射；(2)载化合物BNET的制剂+SOSG+激光照射；(3)载化合物BNET的制剂+SOSG。其中，SOSG终浓度为5μM的溶液，化合物BNET终浓度为10μM，溶液体积为200μL。光照条件为0.1W/cm2，660nm，10分钟。用荧光酶标仪(Bio-Tek)在λex＝485±20nm，λem＝528±20nm下检测SOSG的荧光强度。与背景样品或对照样品相比，通过SOSG荧光增强评估了样品的ROS。结果显示化合物6bc脂质体制剂能够产生大量的ROS。
采用CT26-Luc细胞株建立原位结肠癌模型，静脉注射化合物6bc脂质体纳米粒(100mg/kg)24小时后，切开盲肠部位的皮肤及腹膜，暴露肠段，对原位灶和转移灶分别进行NIR II荧光成像，可以对肿瘤的原位灶以及大小约为1.0mm的转移灶清晰成像。在NIR II荧光成像下，采用光纤对肿瘤部位实施光动力治疗。治疗后60天内荷瘤小鼠肿瘤未复发。而未经NIR II荧光成像下的光动力治疗，小鼠在60天内全部复发死亡。
实施例7：化合物6cd的合成方法
Figure BDA0002556331110000221
(1)1,1'-((((4-溴苯基)氮杂二基)双(4,1-亚苯基))双(乙-1-酮)(2c)的合成
在室温下将NBS(3.25g，18.24mmol)滴加到1,1'-((苯基氮杂二基)双(4,1-亚苯基))双(乙烷-1-酮)(5.00g，15.20mmol)到氯仿/DMF(40mL，v/v，1:1)中的混合溶液中。将混合物在氮气保护下于60℃搅拌12小时，然后用水淬灭，水相用二氯甲烷萃取。用水和饱和盐水洗涤有机相，用无水硫酸钠干燥过夜。除去二氯甲烷后，将残余物通过硅胶色谱法纯化，用乙酸乙酯/石油醚(1:30)洗脱，得到所需的产物化合物2c(5.83g，产率94％)。MALDI-MS(ESI)Calcd for:C22H19BrNO2 +([M+H]+):408.0594，Found:408.0489。
(2)2,2'-(((((4-溴苯基)氮杂二基)双(4,1-亚苯基))双(乙烷-1-基-1-亚烷基))二甲基腈(3c)的合成
将化合物2c(5.00g，12.22mmol)溶于30mL干燥的二氯甲烷溶液中，加入5滴三乙胺和1.0mL丙二腈。将上述反应液在室温下搅拌2小时后减压除去溶剂，残余物以乙酸乙酯/石油醚(1:10)为流动相的硅胶色谱柱进行纯化，得到橙色固体化合物3c(5.47g，产率89％)。MALDI-MS(ESI)Calcd for:C28H19BrN5 +([M+H]+):504.0818，Found:504.1237。
(3)2,2'-(((((4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)苯基)氮杂二基)双(4,1-亚苯基))双(乙烷-1-基-1-亚丙基))二烯腈(4c)的合成
向装有化合物3c(2.0g，3.97mmol)无水1，4-二氧六环溶液的50mL双颈烧瓶中依次加入联硼酸频那醇酯(1.81g，7.14mmol)，乙酸钾(1.36g，13.90mmol)和Pd(PPh3)Cl2(0.28g，0.40mmol)。将上述反应液在氮气保护下置于85℃的油浴中搅拌反应。10小时后，将反应液冷却至室温，用水洗涤，二氯甲烷萃取，有机相无水硫酸钠干燥过夜。将溶剂在减压下浓缩，并将所得残余物通过硅胶色谱法用乙酸乙酯/石油醚(1:20)作流动相纯化，得橙色粉末的化合物4c(1.86g，产率85％)。MALDI-MS(ESI)Calcd for:C34H31BN5O2 +([M+H]+):552.2571，Found:552.2143。
(4)2,2'，2″，2″′-((((((((((((5,6-氟苯基[c][1,2,5]碲唑-4,7-二取代]双)(2,3-二氢噻吩[3,4-b][1,4]二恶英-7,5-二基)双(4,1-亚苯基))双(氮杂三基))四(苯-4,1-二基))四(乙-1-yl-1-亚基))四丙二腈的(6cd)合成
化合物4c(0.86g，1.56mmol)，4,7-双(7-溴-2,3-二氢噻吩并[3,4-b][1,4]二氧-5-基)-5,6-二氟苯并[c][1,2,5]碲二唑(化合物5d，0.50g，0.71mmol)和Pd[PPh3]4(0.081g，0.07mmol)放入50mL双颈烧瓶中。在氮气下用注射器加入脱气的1，4-二氧六环，将所得溶液通过真空脱气。在氮气下加入2MK2CO3溶液。将该混合物进一步真空脱气，然后在105℃下搅拌8小时。减压除去溶剂后，将所得残余物用二氯甲烷萃取。有机相用水和饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥。通过硅胶色谱法用乙酸乙酯/石油醚(1:1)作为流动相纯化产物，得到黑色固体化合物6cd(0.41g，产率41％)。MALDI-MS(ESI)Calcd for:C74H45F2N12O4S2Te+([M+H]+):1398.2183，Found:1398.4213。
实施例8：含有化合物6cd的胶束的制备与评价
将3mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和1mg所述荧光分子溶解于氯仿溶剂中,然后逐滴加入水中并稀释十倍最终体积为10mL。将所述混合溶液超声2分钟后至于50mL茄形瓶中，于通风橱搅拌8小时，最后将混合溶液通过0.2μm滤膜过滤，制备得到胶束。所制备得到的纳米制剂的相关参数，如表4所示。
表4
Figure BDA0002556331110000241
化合物6cd经660nm激发，其发射波长在900-1400nm，为NIR II荧光。将化合物6cd制备成胶束，发射NIR II荧光。
评估化合物6cd的ROS的产生量，实验组包括(1)SOSG+激光照射；(2)载化合物BNET的制剂+SOSG+激光照射；(3)载化合物BNET的制剂+SOSG。其中，SOSG终浓度为5μM的溶液，化合物BNET终浓度为10μM，溶液体积为200μL。光照条件为0.1W/cm2，660nm，10分钟。用荧光酶标仪(Bio-Tek)在λex＝485±20nm，λem＝528±20nm下检测SOSG的荧光强度。与背景样品或对照样品相比，通过SOSG荧光增强评估了样品的ROS。结果显示化合物6cd胶束制剂能够产生大量的ROS。
采用CT26-Luc细胞株建立原位结肠癌模型，静脉注射化合物6cd胶束(100mg/kg)24小时后，切开盲肠部位的皮肤及腹膜，暴露肠段，对原位灶和转移灶分别进行NIR II荧光成像，可以对肿瘤的原位灶以及大小约为1.5mm的转移灶清晰成像。在NIR II荧光成像下，采用光纤对肿瘤部位实施光动力治疗。治疗后60天内荷瘤小鼠肿瘤未复发。而未经NIR II荧光成像下的光动力治疗，小鼠在60天内全部复发死亡。
实施例9：化合物10ae的合成
Figure BDA0002556331110000251
(1)(E)-2-(1-(4-(2-(4-溴苯基)-1，2-二苯基乙烯基)苯基)亚乙基)丙二腈(8a)的合成
将化合物7a(3.00g，6.64mmol)溶于25mL干燥的二氯甲烷溶液中，加入5滴三乙胺和1.0mL丙二腈。将上述反应液在室温下搅拌2小时后减压除去溶剂，残余物以乙酸乙酯/石油醚(1:30)为流动相的硅胶色谱柱进行纯化，得到橙色固体化合物8a(2.73g，产率82％)。MALDI-MS(ESI)Calcd for:C31H22BrN2 +([M+H]+):501.0961，Found:501.0945。
(2)(E)-2-(1-(4-(1,2-二苯基-2-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)苯基)乙烯基)苯基)亚乙基)丙二腈(9a)的合成
向化合物8a(2.5g，4.99mmol)的无水1，4-二氧六环溶液中依次加入联硼酸频那醇酯(2.52g，9.98mmol)，乙酸钾(1.71g，17.47mmol)和Pd(PPh3)Cl2(0.69g，0.99mmol)。将上述反应液在氮气保护下置于85℃的油浴中搅拌反应。10小时后，将反应液冷却至室温，用水洗涤，二氯甲烷萃取，有机相无水硫酸钠干燥过夜。将溶剂在减压下浓缩，并将所得残余物通过硅胶色谱法用乙酸乙酯/石油醚(1:30)作流动相纯化，得橙色粉末的化合物9a(1.94g，产率71％)。MALDI-MS(ESI)Calcd for:C37H34BN2O2 +([M+H]+):549.2714，Found:549.2237。
(3)2,2'-((((((1E，1'E)-(((5,6-二碘苯基[c][1,2,5]噻唑-4,7-二取代)双)(2,3-二氢噻吩[3,4-b][1,4]二恶英-7,5-二基)双(4,1-亚苯基))双(1,2-二苯基乙烯-2,1-二基))双(4,1-亚苯基))双(乙烯-1-基-1-亚乙基))二恶腈(10ad)的合成
化合物9a(0.83g，1.51mmol)，4,7-双(7-溴-2,3-二氢噻吩并[3,4-b][1,4]二恶-5-基)-5,6-二碘苯并[c][1,2,5]噻二唑(化合物5e，0.50g，0.61mmol)和Pd[PPh3]4(0.069g，0.06mmol)放入50mL双颈烧瓶中。在氮气下用注射器加入脱气的1，4-二氧六环，将所得溶液通过真空脱气。在氮气下加入2MK2CO3溶液。将该混合物进一步真空脱气，然后在105℃下搅拌8小时。减压除去溶剂后，将所得残余物用二氯甲烷萃取。有机相用水和饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥。通过硅胶色谱法用乙酸乙酯/石油醚(1:1)作为流动相纯化产物，得到黑色固体化合物10ae(0.37g，产率40％)。MALDI-MS(ESI)Calcd for:C80H51I2N6O4S3 +([M+H]+):1510.1249，Found:1510.1386。
实施例10：含有化合物10ae的脂质体制剂的制备与评价
将二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和所述荧光分子溶解于氯仿试剂中，摩尔比为56：1.8：0.2：42。将所述的混合溶液混合均匀后置入10mL茄形瓶中，在水浴中旋转蒸发30分钟用以除去有机溶剂从而形成脂质膜，水浴温度在40℃。向中形成的脂质膜中加入5mL的PBS缓冲溶液，超声使脂质膜水化脱落。将得到的水溶液通过聚碳酸脂膜得到粒径均一的脂质体。所制备得到的纳米制剂的相关参数，如表5所示。
表5
Figure BDA0002556331110000271
化合物10ae经660nm激发，其发射波长在900-1400nm，为NIR II荧光。将化合物10ae制备成脂质体，发射NIR II荧光。
评估化合物10ae的ROS的产生量，实验组包括(1)SOSG+激光照射；(2)载化合物BNET的制剂+SOSG+激光照射；(3)载化合物BNET的制剂+SOSG。其中，SOSG终浓度为5μM的溶液，化合物BNET终浓度为10μM，溶液体积为200μL。光照条件为0.1W/cm2，660nm，10分钟。用荧光酶标仪(Bio-Tek)在λex＝485±20nm，λem＝528±20nm下检测SOSG的荧光强度。与背景样品或对照样品相比，通过SOSG荧光增强评估了样品的ROS。结果显示化合物10ae脂质体制剂能够产生大量的ROS。
采用CT26-Luc细胞株建立原位结肠癌模型，静脉注射化合物10ae脂质体纳米粒(100mg/kg)24小时后，切开盲肠部位的皮肤及腹膜，暴露肠段，对原位灶和转移灶分别进行NIR II荧光成像，可以对肿瘤的原位灶以及大小约为1.2mm的转移灶清晰成像。在NIR II荧光成像下，采用光纤对肿瘤部位实施光动力治疗。治疗后60天内荷瘤小鼠肿瘤未复发。而未经NIR II荧光成像下的光动力治疗，小鼠在60天内全部复发死亡。
实施例11：化合物10bf的合成
Figure BDA0002556331110000281
Figure BDA0002556331110000291
(1)(E)-2-(4-(2-(4-溴苯基)-2-(4-(1,1-二氰基丙-1-烯-2-基)苯基)-1-苯基乙烯基)亚苄基)丙二腈(8b)的合成
将化合物7b(3.00g，6.64mmol)溶于25mL干燥的二氯甲烷溶液中，加入5滴三乙胺和1.0mL丙二腈。将上述反应液在室温下搅拌2小时后减压除去溶剂，残余物以乙酸乙酯/石油醚(1:30)为流动相的硅胶色谱柱进行纯化，得到橙色固体化合物8b(2.73g，产率82％)。MALDI-MS(ESI)Calcd for:C31H22BrN2 +([M+H]+):501.0961，Found:501.1287。
(2)(Z)-2-(4-(2-(4-(1,1-二氰基丙-1-烯-2-基)苯基)-1-苯基-2-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)苯基)乙烯基)亚苄基)丙二腈(9b)的合成
向化合物8b(2.5g，4.99mmol)的无水1，4-二氧六环溶液中依次加入联硼酸频那醇酯(2.52g，9.98mmol)，乙酸钾(1.71g，17.47mmol)和Pd(PPh3)Cl2(0.69g，0.99mmol)。将上述反应液在氮气保护下置于85℃的油浴中搅拌反应。10小时后，将反应液冷却至室温，用水洗涤，二氯甲烷萃取，有机相无水硫酸钠干燥过夜。将溶剂在减压下浓缩，并将所得残余物通过硅胶色谱法用乙酸乙酯/石油醚(1:30)作流动相纯化，得橙色粉末的化合物9b(1.94g，产率71％)。MALDI-MS(ESI)Calcd for:C37H34BN2O2 +([M+H]+):549.2714，Found:549.2346。
(3)2-(4-((Z)-2-(4-(7-(5,6-二氯-7-(7-(4-((E)-1-(4-(1,1-双氰丙酸-1-烯-2-基)苯基)-2-(4-(2,2-二氰基乙烯基)苯基)-2-苯基乙烯基)苯基)-2,3-二氢噻吩并[3,4-b][1,4]二恶英-5-基)苯并[c][1,2,5]硒二氮杂-4-基)-2,3-二氢噻吩并[3,4-b][1,4]二恶-5-基)苯基)-1-(4-(1,1-二氰基丙-1-烯-2-基)苯基)-2-苯基乙烯基)亚苄基)丙二腈(10be)的合成
化合物9b(1.13g，1.81mmol)，4,7-双(7-溴-2,3-二氢噻吩并[3,4-b][1,4]二氧-5-基)-5,6-二氯苯并[c][1,2,5]硒二唑(化合物5f，0.50g，0.72mmol)和Pd[PPh3]4(0.081g，0.07mmol)放入50mL双颈烧瓶中。在氮气下用注射器加入脱气的1，4-二氧六环，将所得溶液通过真空脱气。在氮气下加入2MK2CO3溶液。将该混合物进一步真空脱气，然后在105℃下搅拌8小时。减压除去溶剂后，将所得残余物用二氯甲烷萃取。有机相用水和饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥。通过硅胶色谱法用乙酸乙酯/石油醚(1:1)作为流动相纯化产物，得到黑色固体化合物10bf(0.26g，产率24％)。MALDI-MS(ESI)Calcd for:C88H51Cl2N10O4S2Se+([M+H]+):1529.2087，Found:1529.1875。
实施例12：含有化合物10bf的胶束的制备与评价
将3mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和1mg所述荧光分子溶解于氯仿溶剂中，然后逐滴加入水中并稀释十倍最终体积为10mL。将所述混合溶液超声2分钟后至于50mL茄形瓶中，于通风橱搅拌8小时，最后将混合溶液通过0.2μm滤膜过滤，制备得到胶束。所制备得到的纳米制剂的相关参数，如表6所示。
表6
Figure BDA0002556331110000311
化合物10bf经660nm激发，其发射波长在900-1400nm，为NIR II荧光。将化合物10bf制备成胶束，发射NIR II荧光。
评估化合物10bf的ROS的产生量，实验组包括(1)SOSG+激光照射；(2)载化合物BNET的制剂+SOSG+激光照射；(3)载化合物BNET的制剂+SOSG。其中，SOSG终浓度为5μM的溶液，化合物BNET终浓度为10μM，溶液体积为200μL。光照条件为0.1W/cm2，660nm，10分钟。用荧光酶标仪(Bio-Tek)在λex＝485±20nm，λem＝528±20nm下检测SOSG的荧光强度。与背景样品或对照样品相比，通过SOSG荧光增强评估了样品的ROS。结果显示化合物10bf胶束制剂能够产生大量的ROS。
采用CT26-Luc细胞株建立原位结肠癌模型，静脉注射化合物10bf胶束(100mg/kg)24小时后，切开盲肠部位的皮肤及腹膜，暴露肠段，对原位灶和转移灶分别进行NIR II荧光成像，可以对肿瘤的原位灶以及大小约为1.5mm的转移灶清晰成像。在NIR II荧光成像下，采用光纤对肿瘤部位实施光动力治疗。治疗后60天内荷瘤小鼠肿瘤未复发。而未经NIR II荧光成像下的光动力治疗，小鼠在60天内全部复发死亡。
实施例13：化合物10cg的合成
Figure BDA0002556331110000321
(1)(E)-2-(4-(2-(4-溴苯基)-1，2-二苯基乙烯基)亚苄基)丙二腈(8c)的合成
将化合物7c(4.00g，9.11mmol)溶于25mL干燥的二氯甲烷溶液中，加入5滴三乙胺和1.0mL丙二腈。将上述反应液在室温下搅拌2小时后减压除去溶剂，残余物以乙酸乙酯/石油醚(1:30)为流动相的硅胶色谱柱进行纯化，得到橙色固体化合物8c(4.04g，产率91％)。MALDI-MS(ESI)Calcd for:C30H20BrN2 +([M+H]+):487.0804，Found:487.1098。
(2)(E)-2-(4-(1,2-二苯基-2-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)苯基)乙烯基)亚苄基)丙二腈(9c)的合成
向化合物8c(2.31g，4.74mmol)的无水1，4-二氧六环溶液中依次加入联硼酸频那醇酯(2.40g，9.49mmol)，乙酸钾(1.63g，16.59mmol)和Pd(PPh3)Cl2(0.67g，0.95mmol)。将上述反应液在氮气保护下置于85℃的油浴中搅拌反应。10小时后，将反应液冷却至室温，用水洗涤，二氯甲烷萃取，有机相无水硫酸钠干燥过夜。将溶剂在减压下浓缩，并将所得残余物通过硅胶色谱法用乙酸乙酯/石油醚(1:30)作流动相纯化，得橙色粉末的化合物9c(1.67g，产率66％)。MALDI-MS(ESI)Calcd for:C36H32BN2O2 +([M+H]+):535.2558，Found:535.2785。
(3)2,2'-((((((1E，1'E)-((苯并[c][1,2,5]碲二唑-4,7-二甲双(2,3-二氢噻吩[3,4-b][1,4]二恶英-7,5-二苯基))双(4,1-亚苯基))双(1,2-二苯基乙烯-2,1-二基))双(4,1-亚苯基))双(甲炔基)二丙二腈(10cg)的合成
化合物9c(0.92g，1.72mmol)，4,7-双(7-溴-2,3-二氢噻吩并[3,4-b][1,4]二恶-5-基)苯并[c][1,2,5]碲二唑(化合物5f，0.50g，0.75mmol)和Pd[PPh3]4(0.081g，0.07mmol)放入50mL双颈烧瓶中。在氮气下用注射器加入脱气的1，4-二氧六环，将所得溶液通过真空脱气。在氮气下加入2MK2CO3溶液。将该混合物进一步真空脱气，然后在105℃下搅拌8小时。减压除去溶剂后，将所得残余物用二氯甲烷萃取。有机相用水和饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥。通过硅胶色谱法用乙酸乙酯/石油醚(1:2)作为流动相纯化产物，得到黑色固体化合物10cg(0.36g，产率36％)。MALDI-MS(ESI)Calcd for:C78H49N6O4S2Te+([M+H]+):1328.2346，Found:1328.1984。
实施例14：含有化合物10cg的PEG-PLGA纳米粒子的制备与评价将所述荧光分子和PEG-PLGA(PLGA的分子量为50000，LA:GA＝50:50，PEG的分子量为2000。)以1:5的比例溶解于二氯甲烷中，在超声、冰水浴条件下，将上述有机溶液1mL逐滴加入到6mL纯水中并混合均匀，将得到的混合液室温搅拌6小时以挥干有机溶剂，最后将所得纳米粒溶液低温冻干即得所需纳米粒子。所制备得到的纳米制剂的相关参数，如表7所示。
表7
Figure BDA0002556331110000341
化合物10cg经660nm激发，其发射波长在900-1400nm，为NIR II荧光。将化合物10cg制备成PEG-PLGA纳米粒子，发射NIR II荧光。
为了评估化合物10cg的ROS产生量，实验组包括(1)SOSG+激光照射；(2)载化合物BNET的制剂+SOSG+激光照射；(3)载化合物BNET的制剂+SOSG。其中，SOSG终浓度为5μM的溶液，化合物BNET终浓度为10μM，溶液体积为200μL。光照条件为0.1W/cm2，660nm，10分钟。用荧光酶标仪(Bio-Tek)在λex＝485±20nm，λem＝528±20nm下检测SOSG的荧光强度。与背景样品或对照样品相比，通过SOSG荧光增强评估了样品的ROS。结果显示化合物10cg的PEG-PLGA纳米制剂能够产生大量的ROS。
采用CT26-Luc细胞株建立原位结肠癌模型，静脉注射化合物10cg纳米粒(150mg/kg)24小时后，切开盲肠部位的皮肤及腹膜，暴露肠段，对原位灶和转移灶分别进行NIR II荧光成像，可以对肿瘤的原位灶以及大小约为1.2mm的转移灶清晰成像。在NIR II荧光成像下，采用光纤对肿瘤部位实施光动力治疗。治疗后60天内荷瘤小鼠肿瘤未复发。而未经NIRII荧光成像下的光动力治疗，小鼠在60天内全部复发死亡。

Claims (11)

1.一种荧光分子，其特征在于，其结构如通式I或通式II所示：
Figure FDA0002556331100000011
其中X是硫、硒或碲；
R1、R2、R3、R4至少一个是
Figure FDA0002556331100000012
其余的是氢；
R5、R6是氢、氟、氯、溴、碘、硝基或甲氧基；
或，
Figure FDA0002556331100000013
其中，
X是硫、硒或碲；
R1、R2、R3、R4、R5、R6至少一个是
Figure FDA0002556331100000014
其余的是氢；
R7、R8是氢、氟、氯、溴、碘、硝基或甲氧基。
2.按权利要求1所述的荧光分子的制备方法，其特征在于通式I的荧光分子合成路线如下：
以酰基取代的三苯胺为原料，经过溴化、迈克尔加成反应、铃木反应得到目标产物：
Figure FDA0002556331100000021
其中，R1是氢或甲基；R2是氢、醛基或乙酰基；R3是氢、
Figure FDA0002556331100000022
R4、R5是氢、氟、氯、溴、碘、硝基或甲氧基；X是硫、硒或碲；
上述反应中采用试剂：
(a)N-溴代丁二酰亚胺(NBS)、二甲基甲酰胺(DMF)、氯仿，60℃；(b)丙二腈、三乙胺、二氯甲烷，室温；(c)联硼酸频那醇酯、醋酸钾、双三苯基膦二氯化钯、无水二氧六环，85℃；(d)2M K2CO3、四三苯基膦钯、二氧六环，105℃。
3.按权利要求1所述的荧光分子的制备方法，其特征在于，通式II的荧光分子合成路线如下：
以酰基取代的四苯乙烯为原料，经过迈克尔加成反应、铃木反应得到目标产物，
Figure FDA0002556331100000031
其中，
R1是氢或甲基；R2、R3是氢、醛基或乙酰基；R4、R5是氢、氟、氯、溴、碘、硝基或甲氧基等；X是硫、硒或碲；R6、R7是氢、
Figure FDA0002556331100000032
Figure FDA0002556331100000033
所述反应中采用试剂：
(a)丙二腈、三乙胺、二氯甲烷，室温；(b)联硼酸频那醇酯、醋酸钾、双三苯基膦二氯化钯、无水二氧六环，85℃；(c)2M K2CO3、四三苯基膦钯、二氧六环，105℃。
4.一种脂质体，其特征在于，其组成包括权利要求1所述荧光分子、和磷脂类分子和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)或衍生物，其中，磷脂类分子选自二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、磷脂酰胆碱(PC)中的一种或几种的混合物；二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇及其衍生物选自二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000、二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇-氨基、二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇-马来酰亚胺、二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇-巯基中的一种或几种的混合物。
5.按权利要求4所述的脂质体，其特征在于，所述的荧光分子、磷脂类分子的摩尔比为1:1-1:50，脂质体的粒径为50-1000nm。
6.一种胶束，其特征在于，其组成包括权利要求1所述的荧光分子和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)及其衍生物，其中，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇及其衍生物选自二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000、二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇-氨基、二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇-马来酰亚胺、二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇-巯基中的一种或几种的混合物。
7.按权利要求6所述的胶束，其特征在于，所述的荧光分子与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇及其衍生物的质量比为1:1-1:50，胶束的粒径为50-1000nm。
8.一种白蛋白纳米制剂，其特征在于，其组成包括权利要求1所述的荧光分子和白蛋白，其中，白蛋白选自人血清白蛋白、重组人血清白蛋白或牛血清白蛋白中的一种或几种的混合物。
9.按权利要求8所述的白蛋白纳米制剂，其特征在于，所述的荧光分子与白蛋白的质量比为1:1-1:50，白蛋白纳米制剂的粒径为50-1000nm。
10.一种聚乙二醇类嵌段共聚物包载的纳米粒子，其特征在于，其组成包括权利要求1所述的荧光分子和聚乙二醇类嵌段共聚物，其中，聚乙二醇类嵌段共聚物选自聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸嵌段共聚物(PEG-PLGA)、聚乙二醇-聚己内酯嵌段共聚物(PEG-PCL)、聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物(PEG-PLA)、聚乙二醇-聚碳酸酯嵌段共聚物的一种或者几种。
11.按权利要求10所述的聚乙二醇类嵌段共聚物包载的纳米粒子，其特征在于，所述得荧光分子与聚乙二醇类嵌段共聚物的质量比为1:1-1:50，纳米粒子的粒径为50-1000nm。
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