CN113295756A - 一种检测黄曲霉毒素b1的无标记比率均相电化学传感方法 - Google Patents

一种检测黄曲霉毒素b1的无标记比率均相电化学传感方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于电化学传感技术领域，涉及一种用于检测黄曲霉毒素B1的无标记比率均相电化学传感方法。利用AFB1与适配体的特异性识别释放触发DNA(hDNA)，在溶液中引发两个发夹DNA(HP1和HP2)的杂交链式反应，形成长双链DNA。随着游离亚甲基蓝嵌入双链DNA螺旋中，MB在溶液中的扩散速率降低，MB氧化电流IMB降低。而二茂铁在反应过程中始终保持游离态，IFc保持不变。通过测量比率信号IMB/IFc可实现对AFB1的快速、准确检测。该传感方法对AFB1的检测线性范围为100pg/mL～100ng/mL，检出限为38.8pg/mL。通过与国标方法HPLC‑MS对比，结果证明该传感方法灵敏度高、选择性好、准确可靠。

Description

一种检测黄曲霉毒素B1的无标记比率均相电化学传感方法
技术领域
本发明属于电化学传感技术领域，涉及一种用于检测黄曲霉毒素B1的无标记比率均相电化学传感方法。
背景技术
作为最危险的生物污染物之一，黄曲霉毒素B1(AFB1)广泛存在于发霉的农产品中，对人类和动物健康造成严重影响。目前，针对AFB1检测的电化学适配体传感器都是基于非均相策略构建的，它们通常涉及适配体和其他传感材料在电极上的固定过程，往往存在以下缺点：(1)固定过程繁琐、且耗时；(2)步骤繁多的固定过程往往导致传感器的重现性相对较差；(3)适配体在电极上的固定通常会改变其几何形状并限制其构型自由度，导致其在传感界面较低的结合和识别效率。相比之下，均相电化学传感器的构建和识别都发生在溶液相中，避免了繁琐的电极组装和固定过程，能有效提高传感器的结合和识别效率。此外，均相电化学传感使电化学传感器的微型化、集成化和便携化成为可能，为真菌毒素的快速、现场分析提供了新的途径。
目前，大多数均相电化学传感器是基于亚甲基蓝(MB)标记适配体或DNA在溶液中的扩散速率低于游离MB而构建。然而，这些均相传感器需要在适配体或DNA上标记电活性探针，这种标记过程比较耗时、且昂贵。为了解决这个问题，研究者们开发出了无标记均相电化学传感策略，可以实现对分析物的简单、快速和低成本检测。此外，比率策略具有两个或两个以上相互独立的响应信号，利用这些信号的比值检测目标物，可以有效地消除外界因素引起的波动，提高检测的准确性和可靠性。因此，在非标记均相传感的基础上，引入比率策略，开发一种无标记比率均相电化学传感器对实现AFB1的简便、快速、低成本、精准检测具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种简便、快速、精准检测黄曲霉毒素B1的无标记比率均相电化学传感方法，该方法检测时间短，且成本低。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种用于检测黄曲霉毒素B1的无标记比率均相电化学传感方法，包括以下步骤：
(1)将一定浓度的触发DNA(记为hDNA)溶液和AFB1适配体(记为Apt)溶液混合，一定温度下孵育一定时间后，获得混合溶液A；
(2)向步骤(1)的混合溶液A中加入一定浓度的发夹DNA1(记为HP1)溶液、发夹DNA2(记为HP2)溶液、亚甲基蓝(记为MB)溶液、二茂铁(记为Fc)溶液以及不同浓度的黄曲霉毒素B1(记为AFB1)标准液，一定温度下孵育一定时间后，获得混合溶液B。对混合溶液B通过三电极体系进行电化学信号扫描，以获得的MB氧化电流(IMB)和Fc氧化电流(IFc)之比IMB/IFc与不同黄曲霉毒素B1浓度的对数值绘制标准曲线，得到最佳线性检测范围。
(3)为了检测待测黄曲霉毒素B1浓度，将步骤(2)中的AFB1标准液替换为待测AFB1溶液，经三电极体系进行电化学信号扫描后，将获得的IMB/IFc值代入标准线性曲线，实现对黄曲霉毒素B1的精准检测。
优选的，步骤(1)中，hDNA溶液的浓度为0.1～2.0μM，Apt溶液的浓度为0.1～2.0μM，hDNA溶液和Apt溶液的体积比为1:1，一定温度为20～37℃，一定时间为0.5～2小时。
优选的，步骤(2)中，HP1溶液的浓度为0.1～2.0μM，HP2溶液的浓度为0.1～2.0μM，MB溶液的浓度为0.5～10.0μM，Fc溶液的浓度为1.0～20.0μM，一定温度为20～37℃，一定时间为0.5～4小时。
优选的，步骤(2)中，HP1溶液、HP2溶液、MB溶液、Fc溶液和AFB1溶液的体积比为1：1：1：1：1。
优选的，步骤(1)和(2)中，hDNA溶液和HP1溶液的体积比为1:1。
优选的，步骤(2)中，所述AFB1在混合溶液B中的最终浓度为100pg/mL～100ng/mL。
优选的，步骤(2)中，所述三电极体系的工作电极为裸玻碳电极或导电玻璃，对电极为铂丝电极，参比电极为Ag/AgCl电极；所采用测量方法为差分脉冲伏安法(DPV)或交流伏安法(ACV)，扫描电位为-0.5V～0.5V。
本发明能够实现的原理为：
当混合溶液B中不存在AFB1时，hDNA与Apt的杂交使HP1和HP2在溶液中保持发夹结构。此时，只有少量的MB嵌入到HP1和HP2中，大部分MB在溶液中是游离的，因此产生较大的IMB。当AFB1存在时，其与Apt的特异性识别导致hDNA的释放，并触发两个发夹DNA(HP1和HP2)的杂交链式反应，在溶液中形成长双链DNA序列。随着游离MB嵌入到双链DNA螺旋中，由于MB/双链DNA复合物具有较低的MB扩散速率，此时可以得到较低的IMB。而Fc在整个反应过程中始终保持游离态，IFc保持不变。因此，以IMB为目标响应信号，IFc为内参比信号，通过测量比率信号IMB/IFc可实现对AFB1的快速、精准检测。
本发明的有益效果为：
(1)本发明以MB和Fc为无标记探针来同时产生响应信号(IMB)和参考信号(IFc)，并使用它们的比值(IMB/IFc)检测黄曲霉毒素B1，提高了检测精准度。
(2)本发明所提出的传感方法不需要昂贵的标记和繁琐的固定过程。
(3)本发明所提出的传感方法实现了黄曲霉毒素B1的灵敏、精准检测，具有简便、快速、成本低等特点。
附图说明
图1为该比率均相电化学传感方法的检测原理示意图。
图2(A)为本发明实施例1中该传感方法对不同浓度AFB1的电化学信号，其中AFB1的浓度依次为100pg/mL、300pg/mL、1ng/mL、3ng/mL、10ng/mL、30ng/mL、100ng/mL；图2(B)为本发明实施例1中该传感方法对不同浓度AFB1检测的标准线性曲线。
具体实施方式
下面结合说明书附图和实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
一种用于检测黄曲霉毒素B1的无标记比率均相电化学传感方法，具体包括以下步骤：
(1)将0.2μM hDNA溶液和0.3μM AFB1适配体溶液按体积比1:1混合，在37℃下孵育1小时后，获得混合溶液A；
(2)向步骤(1)的混合溶液A中加入1体积1.0μM HP1溶液、1体积1.0μM HP2溶液、1体积5.0μM MB溶液、1体积15.0μM Fc溶液以及1体积不同浓度的AFB1标准液(AFB1在混合溶液B中的浓度分别为100pg/mL、300pg/mL、1ng/mL、3ng/mL、10ng/mL、30ng/mL、100ng/mL)，在37℃下孵育2小时后，获得混合溶液B。对混合溶液B通过三电极体系(其中，裸玻碳电极为工作电极、铂丝电极为对电极、Ag/AgCl(饱和KCl)电极为参比电极)在电位-0.5V～0.5V下进行ACV扫描，以获得的IMB和IFc之比IMB/IFc与不同AFB1浓度的对数值绘制标准曲线，得到最佳线性检测范围。
从图2的(A)中，可以看出，随着AFB1浓度的增大，IMB逐渐降低，而IFc几乎保持不变。
从图2的(B)中，可以看出，比率信号IMB/IFc与AFB1浓度对数之间的标准线性曲线为IMB/IFc＝-0.259-0.141Log CAFB1[g/mL](R2＝0.998)，线性范围为100pg/mL-100ng/mL，检出限为38.8pg/mL。
将该检测方法应用于检测加标玉米和小麦样品中不同浓度的黄曲霉毒素B1，其检测过程如下：将1体积0.2μM hDNA溶液和1体积0.3μM AFB1适配体溶液混合，在37℃下孵育1小时后，获得混合溶液A；向混合溶液A中加入1体积1.0μM HP1溶液、1体积1.0μM HP2溶液、1体积5.0μM MB溶液、1体积15.0μM Fc溶液以及1体积待测样品溶液，在37℃下孵育2小时后，获得混合溶液B。对混合溶液B通过三电极体系(其中，裸玻碳电极为工作电极、铂丝电极为对电极、Ag/AgCl(饱和KCl)电极为参比电极)在电位-0.5V～0.5V下进行ACV扫描，将获得的比率信号IMB/IFc，代入标准线性曲线IMB/IFc＝-0.259-0.141Log CAFB1[g/mL]，计算得到玉米和小麦中黄曲霉毒素B1的浓度信息。
为了验证所提出检测方法的准确度，我们使用AFB1的国标检测方法即高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS，GB 5009.22-2016)对同样的玉米和小麦样品进行了检测。两种方法的检测结果如表1所示；
表1：本发明所提出检测方法以及HPLC-MS分别检测玉米和小麦中AFB1的结果
Figure BDA0003093015710000041
表1的结果表明所提出检测方法可以实现黄曲霉毒素B1的灵敏、精准检测。
说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，均应涵盖在本发明的权利要求范围内。

Claims (6)

1.一种检测黄曲霉毒素B1的无标记比率均相电化学传感方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将一定浓度的hDNA溶液和AFB1适配体溶液混合，一定温度下孵育一定时间后，获得混合溶液A；
(2)向步骤(1)的混合溶液A中加入一定浓度的HP1溶液、HP2溶液、亚甲基蓝MB溶液、二茂铁Fc溶液以及不同浓度的AFB1标准液，一定温度下孵育一定时间后，获得混合溶液B；
对混合溶液B通过三电极体系进行电化学信号扫描，以获得的MB氧化电流IMB和Fc氧化电流IFc之比IMB/IFc与不同黄曲霉毒素B1浓度的对数值绘制标准曲线，得到最佳线性检测范围；
(3)将步骤(2)中的AFB1标准液替换为待测AFB1溶液，经三电极体系进行电化学信号扫描后，将获得的IMB/IFc值代入标准线性曲线，实现对黄曲霉毒素B1的精准检测。
2.根据权利要求1所述的一种检测黄曲霉毒素B1的无标记比率均相电化学传感方法，其特征在于，步骤(1)中，hDNA溶液的浓度为0.1～2.0μM，AFB1适配体溶液的浓度为0.1～2.0μM，hDNA溶液和AFB1适配体溶液的体积比为1:1，一定温度为20～37℃，一定时间为0.5～2小时。
3.根据权利要求1所述的一种检测黄曲霉毒素B1的无标记比率均相电化学传感方法，其特征在于，步骤(2)中，HP1溶液的浓度为0.1～2.0μM，HP2溶液的浓度为0.1～2.0μM，MB溶液的浓度为0.5～10.0μM，Fc溶液的浓度为1.0～20.0μM，HP1溶液、HP2溶液、MB溶液、Fc溶液和AFB1溶液的体积比为1：1：1：1：1；一定温度为20～37℃，一定时间为0.5～4小时。
4.根据权利要求1所述的一种检测黄曲霉毒素B1的无标记比率均相电化学传感方法，其特征在于，步骤(1)和(2)中，hDNA溶液和HP1溶液的体积比为1:1。
5.根据权利要求1所述的一种检测黄曲霉毒素B1的无标记比率均相电化学传感方法，其特征在于，步骤(2)中，所述AFB1在混合溶液B中的浓度为100pg/mL～100ng/mL。
6.根据权利要求1所述的一种检测黄曲霉毒素B1的无标记比率均相电化学传感方法，其特征在于，步骤(2)中，所述三电极体系的工作电极为裸玻碳电极或导电玻璃，对电极为铂丝电极，参比电极为Ag/AgCl电极；所采用测量方法为差分脉冲伏安法(DPV)或交流伏安法(ACV)，扫描电位为-0.5V～0.5V。
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