CN113287018A - 抗肿瘤抗原的l2a5抗体或其功能性片段 - Google Patents

抗肿瘤抗原的l2a5抗体或其功能性片段 Download PDF

Info

Publication number
CN113287018A
CN113287018A CN201980022395.6A CN201980022395A CN113287018A CN 113287018 A CN113287018 A CN 113287018A CN 201980022395 A CN201980022395 A CN 201980022395A CN 113287018 A CN113287018 A CN 113287018A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
stn
probe
functional
antibodies
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201980022395.6A
Other languages
English (en)
Inventor
P·A·Q·维代拉
C·M·M·诺沃
L·R·R·洛雷罗
M·A·R·卡拉斯卡尔
J·A·R·C·费雷拉
M·A·S·帕尔马
L·L·桑托斯
L·C·O·力玛
柴文刚
M·巴赫曼
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fg Epe
Helmholtz Sendram Dresden Rosendoff Research Center EV
Portuguese Cancer Institute Porto Fg Epe
Universidade Nova de Lisboa
Original Assignee
Helmholtz Sendram Dresden Rosendoff Research Center EV
Portuguese Cancer Institute Porto Fg Epe
Universidade Nova de Lisboa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Helmholtz Sendram Dresden Rosendoff Research Center EV, Portuguese Cancer Institute Porto Fg Epe, Universidade Nova de Lisboa filed Critical Helmholtz Sendram Dresden Rosendoff Research Center EV
Publication of CN113287018A publication Critical patent/CN113287018A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3076—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3076—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
    • C07K16/3092—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties against tumour-associated mucins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57469—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving tumor associated glycolinkage, i.e. TAG
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/91—Cell lines ; Processes using cell lines

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)

Abstract

本发明提供了一种针对在癌症中识别的一组独特抗原的抗体或功能性抗体片段或它们的探针。本发明包含得自L2A5单克隆抗体的核苷酸序列。所述抗体或功能性抗体片段或它们的探针包括具有本文提供的氨基酸序列的可变重链域和可变轻链域。DNA/氨基酸序列的结合是独特的，并且以前从未描述过。本发明进一步提供了在检测、治疗和预防包括癌症在内的人类疾病有用的抗体或功能性抗体片段或结合物或重组蛋白。

Description

抗肿瘤抗原的L2A5抗体或其功能性片段
技术领域
本发明提供了一种针对在癌症中识别的一组抗原的抗体或功能性抗体片段或它们的探针。
背景技术
唾液酸Tn(sialyl Tn，STn)是一种短的O-聚糖抗原，由与N-乙酰基半乳糖胺连接的唾液酸组成的二糖，即Neu5Acα-2,6GalNAc，它通过阿尔法构型中GalNAc残基依次O-连接至多肽链中的丝氨酸或苏氨酸残基。它的相关性与在正常健康组织中不存在但在几乎所有类型的癌中以不同的频率检测到的事实有关(Julien，Videira和&Delannoy，2012)。此外，STn是转移性、耐药性和高恶性癌细胞的靶标。它们的激发特征包括：
1)STn表达与人类癌细胞和癌起始细胞的瘤形成和转移能力的关系(Okasaki等，2012)。
2)STn与患者不良预后、总体存活率降低和对化学疗法缺乏反应的相关性(Choi等，2000)和3)逃避免疫保护(Carrascal等，2014)。
α-2,6唾液酸通常是终末癌症(terminating cancer)的生物标志物。短α2,6唾液酸化O-聚糖在几种类型的癌症中过表达。它们通常与癌症的进展和转移有关。此外，它们还可以通过被多种免疫受体(例如唾液酸结合蛋白(Siglecs))的识别而促成免疫逃避(Crocker，Paulson，&Varki，2007；Nicoll等2003)。
因此，本发明提供了特异性结合癌症生物标志物的抗体、功能性抗体片段或探针。除了特异性识别肿瘤细胞外，这些抗体还具有阻断宿主细胞受体识别这些配体的潜能，这些受体参与了肿瘤进展的基础机制，包括免疫耐受。
相关数量的抗体已经被批准用于治疗癌症患者(https://www.cancer.org/)。它们包括：
1.靶向癌症特异性(相关)抗原的单克隆抗体(Monoclonal antibodies，mAb)。重组人源化mAb抗HER2曲妥珠单抗(赫赛汀(Herceptin)TM)在各种科学出版物中都有描述，例如癌症研究(Cancer Res.)，1998，58：2825-2831。它靶向在将近30％的乳腺癌患者中表达的HER2受体。专利文件WO0105425描述了一种抗肿瘤组合物，其包含与抗HER2曲妥珠单抗偶联的烷基化蒽环霉素(alkylating anthracycline)。但是，这些治疗仅适用于少数患者(占乳腺癌患者的30％)。另外，曲妥珠单抗抗体靶向的HER2蛋白也在相关的正常细胞如心脏细胞中表达，这说明了相关的心脏毒性。本发明允许开发靶向超出HER2以外的更广泛受体列表的重组抗体，所述受体由不同类型的癌症表达，其被STn或一组由α-2,6唾液酸封端的聚糖修饰。这将有潜能为更广泛的癌症患者群体开发治疗方法。由于STn和被α-2,6唾液酸封端的聚糖二者在癌细胞都高度过表达，它也具有更高的特异性和降低毒性的潜力。
2.阻断阻止免疫系统工作的分子的MAb。它们被称为免疫检查点抑制剂(immunecheckpoint inhibitors)，并且包括阻断CTLA-4，PD-1和PD-L1的药物。PD-1抑制剂的实例是被批准用于治疗皮肤黑素瘤、非小细胞肺癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌和霍奇金淋巴瘤的派姆单抗(Pembrolizumab)(可瑞达(Keytruda))和纳武单抗(Nivolumab)(欧狄沃(Opdivo))。然而，免疫检查点不能提供立即的抗肿瘤反应，并且通常被用作辅助治疗。同样，免疫检查点抑制剂可以使免疫系统攻击体内的某些正常器官，从而导致某些人的严重副作用。
3.阻断癌细胞分裂所必需的细胞信号传导的MAb。这些药物包括靶向影响血管生长的血管内皮生长因子(VEGF)的贝伐单抗(Bevacizumab)(安维汀
Figure BDA0002701796190000021
)和靶向被称为表皮生长因子受体(EGFR)的细胞蛋白的抗体西妥昔单抗(Cetuximab)(爱必妥
Figure BDA0002701796190000022
)，EGFR对细胞生长很重要。但是，这些阻断细胞信号传导的抗体也会影响生理机制，并与毒性相关，例如高血压、出血、血栓和肾脏损害。
有一些专利文件(EP 2014302 A1；WO 2015053871 A4；US 7423126 B2；EP2993184 A1)要求保护编码与肿瘤相关的碳水化合物抗原的人抗体的核酸；然而，上述专利文献中的抗体均不识别STn抗原，STn抗原是本发明抗体的靶标。
专利申请EP2680004(A2)要求保护抗唾液酸化聚糖的抗体，该唾液酸化聚糖包括含有N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid，NeuAc)或N-羟乙酰神经氨酸(N-glycolylneuraminic acid，NeuGc)的STn抗原，而本发明涉及一种抗体，该抗体针对主要具有NeuAc的STn抗原和一组由α-2,6唾液酸封端的聚糖。
专利申请WO 1998046246 A1和WO 1995029927 A3要求保护产生与肿瘤相关的碳水化合物抗原的α-O-连接的糖结合物(glycoconjugates)或糖苷(glycosides)的方法，所述肿瘤相关的碳水化合物抗原包括2,6-唾液酸T抗原(2,6 sialyl T antigen)。尽管提到了用于开发治疗癌症的抗体的可能性，但这些专利申请均未提供检测2,6-唾液酸T抗原的抗体序列，也没有提供本专利主题的相关的含2,6-唾液酸的抗原的组。
若干专利申请已要求保护结合唾液酸残基的抗体，例如CA 2743032 A1，其特征在于识别唾液酸残基(包括NeuGc)的IgM抗体，或US 20160184450 A1和US 8148335 B2，它们要求保护与脱N-乙酰化唾液酸特异性结合的抗体，或EP 2302390 A1和US 20120142903 A1专利申请，它们包括识别NeuGc结构的抗体；而本发明要求保护一种抗体，该抗体不仅识别与GalNAc结合的NeuAc(STn抗原)，而且识别由α-2,6-连接的唾液酸封端的一组聚糖中的NeuAc的结构。
EP 2261255 A1专利申请记载了在鸡中识别单糖NeuAc的抗体的生产，以及US20110034676 A1专利申请要求保护抗Neu5Ac结构和Neu5Gc结构二者的多克隆抗体的生产和纯化。然而，本发明要求保护编码在小鼠中产生的mAb的核酸，所述mAb靶向寡糖STn抗原和被α-2,6-连接的唾液酸封端的一组聚糖。这是优点，因为本发明将允许区分肿瘤相关的聚糖，而不仅仅是单糖NeuAc，后者也在正常细胞中表达。
此外，US 2010/0034825 A1专利申请要求保护，使用长的Tn-或STn-MUC1串联重复糖肽进行免疫来产生抗MUC1糖蛋白的抗体。这项工作与本发明不同，因为靶标结构不同，即靶标MUC1糖蛋白而不是聚糖结构，STn也不是被α-2,6-连接的唾液酸封端的聚糖。
WO2016057916A1专利抗体识别STn抗原，而不是由α-2,6-连接唾液酸封端的聚糖。
根据以上所述，由于肿瘤抗原在正常细胞中同时表达，因此通常不是肿瘤特异性的。因此，由于脱靶效应，靶疗法通常显示出相关的毒性。肿瘤抗原不是泛肿瘤抗原(pan-tumour antigens)，并且局限于特定类型或等级的癌症。因此，靶疗法通常局限于特定的癌症子集。
因此，需要开发针对仅在癌细胞中识别的独特抗原组的抗体或功能性抗体片段或它们的探针。
独特的核酸序列允许产生抗体或功能性抗体片段或它们的探针以靶向唾液酸化聚糖非常重要，所述唾液酸化聚糖例如STn、2,6-唾液酸T、二唾液酸T和2,6-唾液酸-N-乙酰基乳糖胺，它们在不同类型和亚型的癌细胞中过表达。
本发明涉及编码mAb的核苷酸序列，所述mAb抗STn和由α-2,6-连接的唾液酸封端的一组聚糖。这些抗原是在癌症中过表达但在正常细胞中不表达的短链聚糖。这些抗原还是免疫受体的配体，并减弱免疫系统抗肿瘤细胞的活性，因此也可以被认为是免疫检查点的配体。
发明内容
单克隆抗体(Monoclonal antibody，mAbs)是指由单个B细胞克隆产生的抗体。MAb也可以由杂交瘤产生，杂交瘤是B细胞和骨髓瘤细胞之间的杂交体，或者是表达编码免疫球蛋白重链和轻链的重组DNA的细胞系，因此将产生单一且特异性的抗体。
抗体在细胞外环境(extracellular milieu)中表达，然后从那里纯化。
抗体的特异性是其与共享特定表位的一个抗原或一组抗原反应的能力。表位，也称为抗原决定簇，是抗原被抗体识别的部分。
抗体属于蛋白质的免疫球蛋白类别，它是两条相同的重链
Figure BDA0002701796190000041
和两条相同的轻链
Figure BDA0002701796190000042
装配。在每条重链或轻链的氨基末端，都有一段100-130个氨基酸的序列，它们编码可变区。在每个重链或轻链的羧基末端，都有编码恒定区的序列。
每个抗体结合两次相同的抗原，即是二价的。
抗原结合片段(antigen-binding fragment，Fab)是与抗原结合的抗体片段。每个Fab都包括来自抗体的每个重链和轻链的一个恒定域(constant domain)和一个可变域(variable domain)。可结晶的片段(Fc)区包括两条重链的羧基末端的2个或3个域。Fab确保与抗原结合时，Fc区确保每种抗体均产生效应免疫反应(effector immune response)。Fc区与多种细胞受体(例如Fc受体)和其他分子(例如补体蛋白)结合，介导不同的生理作用，包括调理作用(opsonization)以促进吞噬细胞的吞噬作用，自然杀伤细胞的细胞裂解作用以及肥大细胞、嗜碱粒细胞和嗜酸粒细胞的脱粒作用(degranulation)。
术语“可变域”或“可变区”是与抗原相互作用的抗体的轻链或重链的氨基末端部分。它在重链中具有约120至130个氨基酸的长度，以及在轻链中具有约100至110个氨基酸的长度。每个可变区的序列基本上是不同的，特别是在负责与特定抗原相互作用的互补决定区(CDR)中是不同的。位于CDR的侧翼的(flanked)是变化较小的框架区(frameworkregions，FR)。每条轻链和重链的CDR为三个。CDR L1、L2和L3在轻链内。CDR H1、H2和H3在重链内。
表述“功能性抗体片段或探针”是抗体的一部分，其包括抗体的重链和轻链的可变区，或者要么包括抗体的重链的可变区要么包括抗体的轻链的可变区。功能性抗体片段或探针保留了初始抗体的大部分或全部结合活性，所述片段或探针得自所述初始抗体。此类功能性抗体片段或探针可包括单链Fv(scFv)、双抗体、三抗体、四链抗体和微抗体。
术语“核苷酸序列”是指任何长度的核苷酸的序列，是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或它们的类似物。
可以转录所述核苷酸序列以产生mRNA，然后将其翻译成多肽和/或其片段。
源自本发明的潜在治疗是指在治疗、管理或改善与STn或一组α-2,6-唾液酸化聚糖表达相关的疾病中的用途。在本实施方案中，可能的治疗是指天然或修饰形式的源自本发明的抗体、功能性抗体片段或探针。
可能的治疗也可以与已知有用或已经或正在用于治疗、控制或改善疾病的药剂组合，包括在本发明中。
作为诊断剂的潜在用途是指当施用于受试者时将有助于诊断疾病的物质。这样的物质可以用于检测和/或定义源自疾病进展的过程的疾病的定位。它还包括可以帮助预测对某种疗法的反应或疾病预后的物质。在某些实施方案中，诊断剂的使用意味着本发明的抗体或功能性抗体片段或探针与报告分子(reporter molecule)，例如荧光、酶或第二抗体的结合(conjugation)。
唾液酸Tn，又名STn、唾液酸化Tn、唾液酸化的Tn、Neu5Ac-α2,6GalNAcα-O-Ser/Thr或通过“分化簇(cluster of differentiation)”命名法也称为CD175s，是最简单的唾液酸化的粘蛋白型O-聚糖(sialylated mucin-type O-glycan)。STn是一种截短的O-聚糖(truncated O-glycan)，其含有唾液酸(Neu5Ac)α-2,6连接(通过碳6)N-乙酰基-半乳糖胺(GalNAc)α-O-连接丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)(Neu5Ac-α2,6GalNAcα-O-Ser/Thr)。唾液酸化防止了各种核心结构的形成，否则这些核心结构将会出现在粘蛋白型O-聚糖中。
STn与癌症患者的不良结局(adverse outcome)和不良预后(poor prognosis)相关。STn抗原的生物合成已与唾液酸转移酶ST6GalNAc1的表达以及COSMC基因的突变或杂合性丧失相关连。
STn在超过80％的人类癌中表达，并且与癌症患者的不良预后有关连。
本发明提供了编码抗体重链或轻链或功能性抗体片段或它们的探针的核苷酸序列，其中由本发明的核苷酸序列编码的抗体重链或轻链或功能性抗体片段或它们的探针具有一个或多个表1和表2中列出的CDR。包括一个或多个CDR的抗体或功能性抗体片段或它们的探针能特异性结合STn或一组α-2,6-唾液酸化聚糖。特异性结合包括如实施例I中提供的特异性(specificity)、亲和力(affinity)和/或亲合力(avidity)。
在另一方面，由本发明的多核苷酸编码的抗体或其功能性片段可包括补体依赖性细胞毒性活性和/或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)活性。
产生本发明的抗体的方法可以包括在产生杂交瘤的两种细胞之间融合，将本发明的核苷酸序列引入宿主细胞，在一些条件以及足够的时间下培养所述宿主细胞以产生其编码的本发明的抗体或功能性片段重链和/或轻链，并且纯化抗体或功能性片段的重链和/或轻链。
与STn或一组α-2,6唾液酸化抗原结合的本发明的抗体或功能性抗体片段或它们的探针的重组表达可包括构建表达载体，所述表达载体包含编码本发明的抗体或功能性抗体片段或它们的探针的重链和/或轻链。
载体可以通过重组DNA技术生产。所述载体还可以包括其他编码核苷酸序列，产生嵌合序列。例如，可包括编码抗体分子恒定区域的核苷酸序列(WO 86/05807和WO 89/01036)，使得能够表达包含本发明抗体、功能性抗体片段或它们的探针的氨基酸序列的嵌合体蛋白，然后是整个重链，或者是轻链，或者是整个重链和轻链。
可以通过转染/转导技术将表达载体转移至宿主细胞，并且所得细胞产生本发明的抗体或其功能性片段。因此，本发明包括含有编码本发明的抗体或功能性抗体片段或它们的探针的核苷酸序列的宿主细胞。
可以选择宿主细胞以修饰源自插入的核苷酸序列的产物的特征。
在一个实施方案中，这些宿主细胞可以向编码的蛋白质添加糖基化或磷酸化位点或其他修饰。在另一个实施方案中，宿主细胞可以提供蛋白质的正确加工和细胞运输/分泌。
单链片段可变抗体(single-chain fragment variable antibody，scFv)是指仅包含VL和VH区的功能性抗体片段，所述VL和VH区通过接头(linker)连接，形成单价抗原结合位点。双抗体、三抗体和四抗体是包括scFv的二聚体、三聚体或四聚体的抗体，即分别包含两个、三个和四个多肽链，并分别形成两个、三个和四个抗原结合位点，所述抗原结合位点可以相同或不同。
所得的本发明的抗体、功能性抗体片段或它们的探针可以具有一个或多个结合位点。如果包含多于一个的结合位点，则这些位点可以彼此相同或不同。在两个不同的结合位点的情况下，抗体、功能性抗体片段或探针被称为“双特异性”抗体。
导致氨基酸置换的定点突变发生和PCR介导的突变发生(mutagenesis)可用于在CDR区中引入改善亲和力的突变，同时保留本发明抗体的特异性。
在一些实施方案中，本发明的抗体、功能性抗体片段或探针与一种或多种诊断剂或治疗剂或任何其他所需分子结合(conjugated)或融合(fused)。所得的结合的抗体、功能性抗体片段或探针在监测或诊断与STn或α-2,6唾液酸化聚糖的表达有关的疾病的发作、发展、进展和/或严重性中有用。
例如但不限于，抗体可以与治疗剂结合以诱导细胞杀伤或其他作用。治疗剂可以是化学治疗药物；紫杉醇(taxan)；抗代谢药、烷化剂、抗生素、抗有丝分裂剂、激素、核苷类似物、激酶抑制剂、放射性金属离子、毒素、细胞因子或抗血管生成剂。
使用经典的免疫组织学方法或免疫测定法，例如酶联免疫吸附测定法(enzymelinked immunosorbent assay，ELISA)和放射免疫测定法(radioimmunoassay，RIA)、流式细胞术、和免疫印迹法，本发明的抗体或功能性片段也能用于检测任何生物样品中STn或α-2,6唾液酸化聚糖的表达。
本发明的抗体、功能性抗体片段或它们的探针可以按有效浓度提供单独包括在药物组合物中或结合在药物组合物中或组合在药物组合物中，以产生副作用最小的治疗上有用的作用。
发明内容
本发明提供了特异性结合唾液酸Tn(STn)和被α2,6-连接的唾液酸封端的一组聚糖的抗体、功能性抗体片段或它们的探针。
抗体、功能性抗体片段或它们的探针结合至抗原结合位点。编码可变重链和轻链的核苷酸序列的例子分别是SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。
用含有唾液酸Tn(STn)的粘蛋白免疫小鼠后获得抗体。核苷酸序列得自L2A5单克隆抗体。一个核苷酸序列提供了可变的重(VH)链(SEQ ID No.1)，并包含H-CDR1(GGCTACTCCATCACCAGTGGTTATTAC，氨基酸SEQ ID No.12)、H-CDR2(ATAAACTACGACGGTAGCAAT，氨基酸SEQ ID No.14)、和H-CDR3(GCAAGAGGGGGGGACTAC，氨基酸SEQ ID No.16)。一个核苷酸序列提供了可变轻(VL)链(SEQ ID No.2)，其中包含互补决定区(CDR)：L-CDR1(TCAAGTGTAAGTTAC，氨基酸SEQ ID No.6)，L-CDR2(GACACATCC，氨基酸SEQID No.8)和L-CDR3(CAGCAGTGGAGTAGTGACCCACCCATGCTCACG，氨基酸SEQ ID No.10)。
轻链的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3与重链的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3的组合产生独特的序列，该序列编码的肽序列不仅识别二糖STn抗原，而且出乎意料的是，它还识别出一组在癌症中也过表达的以α-2,6唾液酸封端的聚糖。这些肽序列用于产生其他抗体、功能性抗体片段或探针。被所述抗体、功能性抗体片段或探针识别的整个聚糖组包括
唾液酸Tn：
NeuAcα-6GalNAcα/β1-
2,6-唾液酸T：
Figure BDA0002701796190000091
二唾液酸T：
Figure BDA0002701796190000092
2,6-唾液酸-N-乙酰基乳糖胺：
NeuAcα2-6Galβ1-4Glcβ1-
与目前的抗体和基于抗体的抗癌疗法相反，具有这种特异性的抗体由于它们高的肿瘤特异性以及对正常细胞的低反应性或缺乏反应性而特别令人关注。
本发明的分离的多核苷酸还可包括本文提供的核酸序列，其中该核酸序列编码抗体、功能性抗体片段或探针的可变重链和轻链域。核酸序列的实例分别是SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。
在另一方面，本发明提供了特异性结合STn和被α2,6-连接的唾液酸封端的一组聚糖的抗体、功能性抗体片段或它们的探针，用于检测受试者的肿瘤的方法。
在一些实施方案中，本发明提供了药物组合物，所述药物组合物包含本发明的抗体、功能性抗体片段或探针以及药学上可接受的载体。
在另一个实施方案中，本发明提供了药物组合物，所述药物组合物包含阻断细胞-细胞或受体-配体相互作用的抗体、功能性抗体片段或探针。
在一些实施方案中，本发明提供了通过施用治疗有效量的本发明药物组合物来治疗或预防有需要的受试者的疾病的方法。
无意于在此限制本公开，本公开呈现了所示实施例的附图，以便于更易理解。
附图说明
图1显示了使用间接ELISA的L2A5抗体与动物粘蛋白的滴定(Titration)和结合。使用先前用唾液酸酶(sialidase)处理或未处理过的多种包被浓度的牛颌下腺粘蛋白(bovine submaxillary mucins，BSM)进行抗体滴定。磷酸盐缓冲液用作阴性对照，抗-STn抗体B72.3与BSM的结合为阳性对照。用结合至辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase)的山羊抗小鼠IgG检测L2A5 mAb的结合。
图2显示了L2A5与肿瘤细胞的细胞表面的结合。通过流式细胞术并使用具有ST6GalNAc1基因转导或未转导(野生型)并因此过表达STn抗原的癌细胞系来评估L2A5抗体的结合。该图显示了STn阳性和WT乳腺癌细胞系MDA-MB-231中相对细胞计数L2A5抗体代表性直方图。使用了3F1抗体(抗STn抗体)或第二抗小鼠Ig-FITC抗体(灰色轮廓)。为了评估与唾液酸化抗原的结合特异性，经唾液酸酶处理使表达STn的细胞系脱唾液酸化。实线和虚线分别代表唾液酸酶未处理的细胞和处理的细胞的直方图。X轴代表与STn表达有关的荧光。
图3显示了L2A5抗体对膜结合蛋白和重组人粘蛋白1(MUC1)的反应性。蛋白质印迹分析(Western blot analysis)抗STn抗体3F1和L2A5与表达STn的MDA-MB-231细胞系的膜提取物以及用STn加人Ig Fc区大量修饰的MUC1嵌合蛋白的结合。MDA-MB-231STn+膜提取物(A)和嵌合蛋白MUC1 STn-IgG(B)用3F1和L2A5抗体染色。除了未处理的膜提取物和嵌合蛋白(NT)的印迹，使用唾液酸酶(T)对膜提取物样品进行脱唾液酸化，或使用未糖基化的MUC1STn-IgG蛋白(Ung)。
图4显示了通过免疫组织化学方法在石蜡包埋的膀胱癌中测量的L2A5抗体的反应性a)L2A5(左)染色表现出高的延伸性和强的强度，而仅与STn结合的B72.3(中)和TKH2(右)mAb显示出较低的敏感性，以弱的强度转导并减少了特异性染色的延伸。b)与可用抗体相比，L2A5的敏感性。L2A5(左)识别减少量的抗原(箭头)，与在同一区域具有不同的反应性的B72.3(中)和TKH2(右)不同。C)唾液酸酶处理癌组织中抗体反应性的作用。用唾液酸酶处理并与L2A5孵育后，L2A5赋予的染色完全消失。左：没有唾液酸酶；右：带有唾液酸酶。
图5显示通过免疫组织化学法在石蜡包埋的结直肠癌中测量的L2A5抗体的反应性。该图显示了与抗STn抗原的抗体相比，L2A5的反应性。与B72.3(中)和TKH2(右)反应性相比，L2A5(左)在延伸和强度方面表现出增加的反应性。
图6通过在石蜡包埋的膀胱癌中的免疫组织化学法显示了L2A5抗体的反应性。该图显示了与B72.3和TKH2抗STn抗体相比时，L2A5抗体的高度特异性的免疫组织化学证据。a)–L2A5在转移性膀胱癌样品中的肿瘤特异性。L2A5主要存在于肿瘤细胞(箭头)中，在于淋巴细胞群、血管和结缔组织中不存在染色。b)–正常结直肠组织中L2A5(左)和B72.3(右)抗体的反应性。L2A5与肠上皮细胞(enterocyte)反应性微弱(箭头，左)，而B72.3与杯状细胞(goblet cell)反应(右)。
图7显示了与L2A5抗体结合的聚糖抗原序列。通过聚糖微阵列分析确定聚糖的特异性。
图8显示了体内(in vivo)靶模块(target module，TM)的抗肿瘤能力，所述靶模块由包含由本发明的目的L2A5的核酸编码的氨基酸的部分(moiety)组成。源自L2A5的TM是抗体片段，并且具有与L2A5相同的反应性，即抗STn TM。通过优尼卡(UniCAR)T细胞杀死STn阳性细胞是靶向特异性的，并且严格取决于TM的存在。
图9显示了体内(in vivo)靶模块(TM)的抗肿瘤能力，所述靶模块由包含由本发明的目的L2A5的核酸编码的氨基酸的部分(moiety)组成。源自L2A5的TM是抗体片段，并且具有与L2A5相同的反应性，即抗STn TM。将抗STn TM和UniCAR T细胞的过继转移(adoptivetransfer)(Koristka等人2014)到表达STn+肿瘤的动物模型中，显示了对STn阳性肿瘤的有效且依赖于TM的根除。图8显示了使用装备有对STn抗原特异的TM的UniCAR T细胞杀死肿瘤细胞。使用单因素方差分析(one-way ANOVA)和邦弗朗尼多重比较检验(Bonferronimultiple-comparison test)进行统计分析(**p<0.01)。
具体实施方式
本发明提供了特异性结合STn和被α2,6-连接的唾液酸封端的一组聚糖的抗体、功能性抗体片段或它们的探针。
所述抗体、功能性抗体片段或它们的探针结合至抗原结合位点。编码可变重链和轻链的核苷酸序列的例子分别是SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。
本发明的分离的多核苷酸还可包括本文提供的核酸序列，其中该核酸序列编码抗体、功能性抗体片段或探针的可变重链和轻链域(variable heavy and light chaindomain)。
本发明还提供了组合物以产生特异性结合STn和被α2,6-连接的唾液酸封端的一组聚糖的抗体、功能性抗体片段或它们的探针。
该组合物包括编码抗体、功能性抗体片段或探针的抗原结合位点的核苷酸序列。该组合物包括编码可变的重链和轻链的核苷酸序列。
本发明的分离的多核苷酸还可包括本文提供的核酸序列，其中该核酸序列编码抗体、功能性抗体片段或探针的可变重链和轻链域。
在另一方面，本发明提供了特异性结合STn和被α2,6-连接的唾液酸封端的一组聚糖的抗体、功能性抗体片段或它们的探针，用于检测受试者的肿瘤的方法。
在一些实施方案中，本发明提供了药物组合物，所述药物组合物包含编码本发明的抗体、功能性抗体片段或探针的核苷酸序列以及药学上可接受的载体。
在另一个实施方案中，本发明提供了药物组合物，所述药物组合物包含包含编码阻断细胞-细胞或受体-配体相互作用的抗体、功能性抗体片段或探针的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了通过施用治疗有效量的本发明药物组合物来治疗或预防有需要的受试者的疾病的方法。
该方法包括以下步骤：
a)用特异性结合STn和由α2,6-连接的唾液酸封端的一组聚糖的抗体染色从可能患有肿瘤的受试者获得的生物样品，其中上述染色在适合于抗体或功能性抗体片段或它们的探针与STn、2,6-唾液酸T、二唾液酸T或2,6-唾液酸乳糖胺特异性结合的条件下进行；
b)并且其中抗体结合的存在或不存在表明存在或不存在表达细胞表面STn、2,6-唾液酸T、二唾液酸T或2,6-唾液酸乳糖胺的肿瘤细胞。
如本文所用，生物样品包含分离的细胞、或组织或肿瘤来源的蛋白质。
与匹配的健康细胞相比，唾液酸化聚糖在几种类型的癌细胞中过表达，而匹配的健康细胞中其表达可以忽略不计。在胰腺癌、结直肠癌和卵巢癌中发现最高的STn频率，其中几乎100％的癌细胞表达STn(Julien等人，2012)。膀胱癌的频率为75％(Ferreira等人，205)。肺腺癌(Lung adenocarcinoma)的表达接近80％，子宫颈癌(cervical cancer)、胆管癌(cholangiocarcinoma)、食道癌(oesophagus)、结肠癌和乳腺癌的频率在50％至70％之间。另外，STn过表达发生在癌变早期，细胞分化的丧失通常参与较高的组织学分级分类，正调节STn的表达(Julien等人)。
唾液酸化聚糖可被抗体、功能性抗体片段或探针以高亲和力和特异性靶向。本发明还提供了组合物以产生结合STn和被α-2,6唾液酸封端的一组聚糖的抗体、功能性抗体片段或探针。
这些组合物是通过使用绵羊血清粘蛋白(ovine serum mucins)免疫6周龄的雌性巴比赛(Balb/c)小鼠而获得的，使用的是例如实施例I中所述的方法。
通过例如实施例II或实施例III或实施例VI中所记载的方法，选择对STn阳性细胞系、STn阳性粘蛋白或细胞裂解物具有反应性的小鼠血清。收集显示对STn具有反应性的血清的那些免疫小鼠的脾细胞，并与骨髓瘤细胞(Sp2/0)融合以获得表达抗体的永生杂交瘤细胞(immortalized hybridoma cell)。
杂交瘤技术的方法，例如实施例IV中所记载的方法，在本领域中已得到很好的描述。
通过诸如实施例II或实施例III或实施例VI中所记载的方法筛选存在抗STn的抗体的杂交瘤上清液。扩展所选的杂交瘤用于抗体产生和表征。
从获得的几种抗STn mAb中，选择mAb L2A5作为主要候选对象，并用于进一步分析。
通过使用实施例II中所记载的和图1中所表现的方法确定了对高含量STn的粘蛋白的反应性和L2A5 mAb的抗体滴定度。此外，通过唾液酸酶处理进行脱唾液酸化以评估L2A5抗体对唾液酸化结构的识别。如图1所示，L2A5 mAb的反应性随mAb浓度以对数方式增加。观察到对BSM的高免疫反应性，达到终点滴定度(endpoint titre)6 000。此外，用唾液酸酶的处理清楚地证明了该抗体对BSM的反应性降低，显示了对唾液酸化结构的特异性和依赖性结合。值得注意的是，以与实施例II中记载的那些相似的方法，但是其中带有STn的粘蛋白被脱唾液酸化的(去唾液酸的(asialo))粘蛋白替代时，L2A5抗体没有显示出反应性。
唾液酸化聚糖在癌细胞中过度表达并且可被抗体、功能性抗体片段或探针以高亲和力和特异性靶向。
本发明提供了组合物以产生结合STn和被α-2,6唾液酸封端的一组聚糖的抗体、功能性抗体片段或它们的探针。
糖基化对于治疗性mAb的质量和开发至关重要。糖基化模式随所选的表达系统或培养条件而变化，对其药代动力学和药效学有重大影响。因此，糖基化的控制对于确保分子的安全性和有效性至关重要。对于治疗性癌细胞靶向，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)、补体依赖性细胞毒性(complement-dependent cytotoxicity，CDC)、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(antibodydependent cell-mediated phagocytosis，ADCP)和直接细胞凋亡(cell apoptosis)对于疗效至关重要。
鼠骨髓瘤细胞系SP2/0中产生的MAb可添加在正常人IgG上无法自然发现的糖，从而影响免疫原性。
在本发明的实施方案中，为了提高治疗性抗体的功效，通过操纵甘露糖、唾液酸、岩藻糖和半乳糖残基，在糖基化位点Asn88和Asn297上改变IgG分子的聚糖组成(LimingLiu的评论，2015)。
在一个实施方案中，非人类抗体可以被人源化，这是指嵌合免疫球蛋白的构建，所述嵌合免疫球蛋白含有包含在人免疫球蛋白(受体抗体)中的得自原始非人类抗体(例如小鼠抗体)的感兴趣氨基酸序列。在人源化抗体中，人类抗体的CDR氨基酸残基被具有所需的特异性、亲和力和能力的非人物种(例如小鼠抗体)的来自CDR的残基所代替。通常，人源化抗体将包含至少一个，并且通常是两个可变域，其中所有或几乎所有CDR区都对应于非人类抗体的CDR区，而FR区的全部或部分是人类免疫球蛋白的区。
在一个实施方案中，修饰免疫细胞例如T细胞以表达抗体(全部或部分)或结合抗体的受体，即嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)。CAR是将针对所需抗原(例如，肿瘤抗原)的抗体特异性与激活T细胞受体的细胞内结构域结合以产生嵌合受体的分子，所述嵌合受体表现出特异性抗肿瘤细胞免疫活性。在一个实施方案中，这些修饰的T细胞的抗原识别域与肿瘤相关抗原结合。在一个实施方案中，其涉及经修饰以表达CAR的T细胞的过继细胞(adoptive cell transfer)转移。
可以使用本领域中已知的多种技术来生产CAR，包括但不限于使用RNA引导的核酸内切酶，尤其是Cas9/CRISPR系统，来特异性改造T细胞以表达CAR(WO 2014191128 A1)。在另一个实施方案中，使用由对某些人细胞表面蛋白具有特异性的结合部分(bindingmoiety)和标记(tag)组成的靶模块，其中所述标记得自任何人核蛋白，优选地得自人核La蛋白(WO2016030414 A1)。
同样，本发明的抗体或功能性片段可以与纳米粒子连接，插入脂质体膜中，以用作特异性载体，以原位递送诱导凋亡的有毒化合物以及对热疗(hyperthermia therapy)有用的金属离子。
本发明的用于生产抗体、功能性抗体片段或它们的探针的组合物是通过使用绵羊血清粘蛋白免疫6周龄的雌性Balb/c小鼠而获得的，使用的是实施例I中所述的方法。通过诸如实施例II或实施例III或实施例VI中所述的方法，选择对STn阳性细胞系、STn阳性粘蛋白或细胞裂解物显示反应性的小鼠血清。为了获得表达抗-STn抗体的永生杂交瘤细胞，收集显示对STn具有反应性的血清的那些免疫小鼠的脾细胞，并与骨髓瘤细胞融合。杂交瘤技术的方法，例如实施例IV中所记载的方法，在本领域中已得到很好的描述。
通过诸如实施例II或实施例III或实施例VI中所记载的方法筛选出存在抗STn的抗体的杂交瘤上清液中。扩展所选的杂交瘤用于抗体产生和表征。
从获得的几种抗STn mAb中，选择mAb L2A5作为主要候选对象，并用于进一步分析。
通过使用实施例II中所记载的和图1中所表现的方法确定了对高含量STn的粘蛋白的反应性和L2A5 mAb的抗体滴定度。此外，通过唾液酸酶处理进行脱唾液酸化以评估L2A5抗体对唾液酸化结构的识别。如图1所示，L2A5 mAb的反应性随mAb浓度以对数方式增加。
观察到对BSM的高免疫反应性，达到终点滴定度6 000。此外，用唾液酸酶的处理清楚地证明了该抗体对BSM的反应性降低，显示了对唾液酸化结构的特异性和依赖性结合。值得注意的是，以与实施例II中记载的那些相似的方法，但是其中带有STn的粘蛋白被脱唾液酸化的(去唾液酸的(asialo))粘蛋白替代时，L2A5抗体没有显示出反应性。
通过使用实施例III中所记载的方法，证实了L2A5 mAb与活的MDA-MB-231癌细胞的结合。作为模型，由于基因ST6GalNAc1的过表达，使用了表达STn抗原的MDA-MB-231癌细胞。如图2所示，L2A5 mAb对80％至88％的STn+细胞显示高反应活性。用唾液酸酶处理癌细胞系后，反应性显著降低。还如图2所示，L2A5与未表达STn抗原的野生型MDA-MB-231癌细胞没有呈现出结合。总之，这些结果证实了L2A5 mAb对存在于癌细胞表面的STn抗原的特异性和选择性。同样如图2所示，其他抗STn抗体，也会与STn反应，与癌细胞系MDA-MB-231相关，其显示出略微不同的结合特征(binding profiles)。
为了证实L2A5 mAb对带有STn的膜蛋白(STn bearing membrane proteins)的结合特异性，进行了如实施例VI中所记载的测定。如图3所示，L2A5 mAb与源自过表达ST6GalNAc1的MDA-MB-231细胞系的蛋白反应，并且因此与STn反应。该图显示出对分子量大于245kDa以及约160、85、50和40kDa的蛋白质的反应性。膜蛋白脱唾液酸化后，观察到反应性降低或消除，证实了L2A5 mAb与唾液酸化蛋白的结合。来自野生型癌细胞的膜蛋白不表达STn抗原，不能与L2A5 mAb产生阳性反应。同样如图3所示，L2A5表现出与MUC1 STn-IgG的牢固结合(约180kDa)，但没有与无糖基化的MUC1 STn-IgG的结合。总之，结果表明L2A5 mAb识别表达STn的癌细胞的膜提取物中以及STn载体蛋白(例如MUC1)上的STn抗原。
用L2A5和两种抗STn mAb对有15例膀胱肿瘤(八个膀胱切除术和七个转移)和15例结直肠肿瘤(腺癌和腺瘤)的一系列30个病例进行染色。如图4所示，就转移病例而言，所有分析的mAb的所有膀胱肿瘤均为阳性。对于L2A5、B72.3和TKH2 mAb，其中三个为阳性，三个为阴性。一个病例显示与L2A5减少的染色，而其他mAb则没有染色。注意针对L2A5的抗原检测灵敏度略高。如图4所示，虽然TKH2和B72.3显示相似的反应性，但L2A5在膀胱癌病例中显示出更高的反应性。用唾液酸酶对癌组织进行酶处理后，这种特异性和敏感性被消除。
如图5所示，所有结直肠癌病例对于抗STn mAb和L2A5均为阳性，但在延伸和强度方面表现出不同的模式。与B72.3(中)或TKH2(右)染色模式相比，L2A5(左)结合在大多数病理组织(约70％)中显示相似的强度和延伸。
如图6a)所示，在转移性膀胱癌样品中，L2A5主要与肿瘤细胞反应，而不与淋巴细胞群、血管或结缔组织反应。在图6b)中，正常结直肠癌组织中，L2A5(左)在肠上皮细胞中呈现非特异性染色，而B72.3(右)与杯状细胞反应。
在膀胱肿瘤模型中，L2A5染色是排他性肿瘤。L2A5在尿路上皮肿瘤细胞中呈现特定的染色，包括STn密度低的浸润和转移位点的其他斑点。
在结直肠样本中，L2A5与癌症组织反应，但也与非病理组织反应。染色基本上位于肠上皮细胞中，而杯状细胞中存在用B72.3或TKH2获得的非特异性染色。在结直肠样本中，没有特定的染色位置，尽管L2A5能够检测到L2A5在增生异常组织中存在弱染色。
为了更细致地检查碳水化合物的结合特异性，使用聚糖微阵列分析抗体，所述聚糖微阵列包括印刷在合适的固体表面上的结构多样的聚糖探针。结果证实了选择性识别STn的特异性，但也观察到了与以下物质的结合：
唾液酸Tn：
NeuAcα-6GalNAcα1/β1
2,6-唾液酸T：
Figure BDA0002701796190000181
二-唾液酸T：
Figure BDA0002701796190000182
2,6-唾液酸乳糖胺：
NeuAcα2-6Galβ1-4Glcβ1
并且实际上不与微阵列中存在的其他抗原序列结合。结合的序列总结在图7中。
为了确定L2A5 mAb轻链和重链的可变区CDR(SEQ ID Nos.6、8、10、12、14、16)和FR(SEQ ID Nos.5、7、9、11、13、15)的氨基酸序列，使用了实施例IX中所记载的方法。
实施例
提供以下实施例仅用于说明本公开的各个方面，并且不应解释为以任何方式限制本公开。它们涉及抗体的表征、选择和生产。
实施例I
抗体生产-免疫
提供了产生抗体的示例性方法，但是可以使用任何其他标准方法。
根据杂交瘤技术进行单克隆抗体(mAb)生产。对6周龄的雌性Balb/c小鼠(英国哈兰(Harlan,UK))用完全的弗氏佐剂(西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich))以1：1(V/V)乳化的10μg绵羊颌下腺黏蛋白(ovine submaxillary mucin，OSM)进行腹膜免疫，然后以21天的间隔另外注射2次用不完全的弗氏佐剂(Sigma Aldrich)乳化的OSM。从小鼠颊部(cheek)收集血液样品，并通过ELISA筛选收集的血清的STn结合特异性。如果血清显示出所需的和特异性免疫反应，则在杀死和收获脾脏之前三天向相应的小鼠进行最后一次加强注射。
实施例II
ELISA法
小鼠血清滴定和杂交瘤上清液的筛选通过针对牛下颌腺粘蛋白(bovinesubmaxillary mucin，BSM)(一种表达STn的蛋白)的ELISA进行测定。在96孔板的孔中包被50μl溶于磷酸盐缓冲盐水(PBS)的BSM(3μg/ml)，并在4℃孵育过夜。为了评估筛选的杂交瘤上清液与唾液酸化结构的特异性结合，将来自产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)(罗氏(Roche))的50μl唾液酸酶以25mU/ml在唾液酸酶缓冲液(10mM Na2HPO4，pH＝6.0)中稀释后添加到孔的子集中，并在37℃下孵育90分钟。唾液酸酶处理后，将板用含有0.05％吐温(Tween)20的PBS(PBS-T)洗涤3次，然后用5％脱脂奶粉封闭60分钟。PBS-T洗涤后，将稀释的小鼠血清或杂交瘤上清液添加至孔中，并孵育90分钟。将板用PBS-T洗涤四次，然后与辣根过氧化物酶(HRP)结合的山羊抗小鼠Ig(1：1000)(碧迪医疗器械(BD Pharmingen))孵育60分钟。在另外三个洗涤步骤后，将50μl四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine)(赛默飞世尔科技(Thermofisher Scientific))底物添加到每个孔中，将板在黑暗中孵育，并通过添加50μl 1M HCl终止反应。在酶标仪(microplate reader)上于450nm处测量光密度。选择产生最高滴定度的感兴趣抗体的小鼠进行融合。为了筛选杂交瘤细胞的抗体产生，实施了相同的程序。
实施例III
流式细胞术的制备和分析
通过使用稳定表达STn和不表达STn的亲代细胞的人膀胱和乳腺细胞系，通过流式细胞术确定抗体或杂交瘤上清液的结合。每个条件下收集约3×105个细胞并重悬于PBS缓冲液中。为了评估筛选的杂交瘤上清液和抗体对唾液酸化结构的特异性结合，将样品以100mU/ml的唾液酸酶处理，在37℃下处理90分钟。唾液酸酶处理后，将细胞洗涤并将其与抗STn mAb B72.3、3F1、TKH2和杂交瘤上清液在4℃下孵育30分钟。进行随后的洗涤步骤，并在黑暗中用FITC结合的抗小鼠Ig(达科(Dako)；稀释度1:10)检测一抗15分钟。洗涤后，使用流式细胞仪获取每个样品的数据。
实施例IV
抗体生产-杂交瘤技术
将经免疫的小鼠的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤(ATCC，美国)细胞以3：1的比例混合，并在聚乙二醇/二甲亚砜存在下使用标准方案融合。然后将细胞平铺到(plated)到96孔平底微孔板(橙科技(Orange Scientific))中，并保持在补充有HAT(1×10-4M次黄嘌呤、4×10- 7M氨基蝶呤、1.6×10-5M胸苷，Sigma-Aldrich)、10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、0.2mg/ml庆大霉素(Sigma-Aldrich)、1mM丙酮酸钠(Gibco)、1％(v/v)MEM非必需氨基酸(Gibco)的RPMI培养基中，并在37℃下孵育7-12天。通过间接ELISA扩增和筛选产生对BSM有活性的抗体的杂交瘤细胞，用有限稀释法至少克隆3次，获得稳定的单克隆细胞系。在37℃不添加HAT的选择培养基中培养选择的杂交瘤。选择一种对唾液酸化结构特别是STn特异的杂交瘤L2A5，并通过有限稀释四次来克隆。
实施例V
STn表达的免疫组织化学分析
根据当地伦理委员会，获得了一系列30个病例，包括15例结直肠肿瘤(腺癌和腺瘤)和15例膀胱肿瘤(八个膀胱切除术和七个转移灶)。另外，包括5例肿瘤邻近的正常结直肠组织。使用生物素/链霉亲和素系统通过免疫组化学法(immunohistochemistry，IHC)对福尔马林固定、石蜡包埋(Formalin-fixed,paraffin embedded，FFPE)的组织进行STn筛选。简而言之，将FFPE组织切片用二甲苯脱石蜡，再用一系列分级的酒精洗涤液再水化，在最大功率额定值下将溶液预热5分钟后，在微波中使用pH 6.0的柠檬酸缓冲液(Vector，美国伯林盖姆(Burlingame))进行热诱导的抗原修复15分钟。将切片与0.3％过氧化氢(MerckKGaA，德国达姆施塔特(Darmstadt,Germany))孵育25分钟，然后用UV
Figure BDA0002701796190000211
(赛默飞科技(Thermo Scientific)，美国费利蒙)封闭，并在4℃的湿室中与抗STn mAb B72.3、TKH2(Kjeldsen等，1988)和L2A5孵育过夜。用PBS-吐温洗涤后，将第二抗体添加到组织切片中，然后再用链霉亲和素孵育。通过与3,3'-二氨基联苯胺(ImmPACTTMDAB)(Vector，美国伯林盖姆)孵育4分钟来观察STn。最后，将核用苏木精复染1分钟。使用抗STn mAb B72.3、TKH2和L2A5杂交瘤培养上清液以1：5稀释后评估STn表达；在PBS中的5％BSA中分别为1：5和1：3。阳性和阴性对照切片进行平行测试。阴性对照切片不含一抗。STn+肿瘤组织用作阳性对照。当通过肿瘤细胞中棕色显色产物的显微存在观察到抗STn TKH2抗体的免疫反应性时，将肿瘤分类为阳性。STn表达和L2A5染色由两名独立的观察员进行了双盲评估，并由经验丰富的病理学家进行了验证。每当有分歧时，都要审查载玻片，并达成共识。为了评估抗体特异性，在与过氧化氢一起孵育后进行唾液酸酶处理，其中从STn抗原中除去唾液酸，从而损害抗体的识别性。因此，这种酶处理后的阳性染色(在37℃下4h；0.2U/mL)被认为是非特异性的。
实施例VI
蛋白质印迹(WB)
根据制造商的说明，使用膜蛋白提取试剂盒从细胞系中分离膜蛋白。按照制造商的建议，使用蛋白质分析试剂盒估算获得的蛋白质量。将膜蛋白提取物(50μg)或含有STn(1μg)–BSM和MUC1 STn-IgG–的纯化蛋白变性，并上样至8％梯度丙烯酰胺凝胶中，在还原条件下进行SDS-PAGE电泳，并根据标准程序电泳转移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidenedifluoride，PVDF)膜上(阿默沙姆海邦(Amersham Hybond)P 0.2μm PVDF，通用电气医疗生命科学(GE Healthcare Life Sciences))。将膜用10％脱脂奶粉在TBS吐温0.1％(TBS-T)中的封闭1h，然后与在TBS-T中稀释的抗STn B72.3、3F1或L2A5一抗的上清液于4℃孵育过夜。用TBS-T洗涤后，使用在TBS-T中以1：2500稀释1h的HRP结合的山羊抗小鼠Ig，显示标记的蛋白。洗涤后，通过Lumi-Light蛋白质印迹底物(Roche)揭示标记的蛋白质，然后将其暴露于X射线胶片。
实施例VII
mRNA的分离和cDNA合成
将1×106和5×106之间的杂交瘤细胞用于RNA分离。将细胞以300×g离心5分钟，弃去上清液。细胞团块用PBS洗涤，并根据生产商的说明使用GenEluteTM哺乳动物总RNA微量制备试剂盒(Sigma-Aldrich)分离总RNA。如高容量cDNA转录试剂盒(应用生物系统公司(Applied Biosystems))所描述的那样，使用纳米微滴(Nanodrop)对提取的总RNA进行定量，最多可使用2μg进行逆转录。cDNA合成是使用以下热循环条件进行的：25℃10分钟，然后37℃120分钟和85℃5秒。最后将反应保持并冷却至4℃。
实施例VIII
抗体测序–scFv片段
使用引物对VH正向(TTTTTGGATCCSARGTNMAGCTGSAGSAGTCWGG)/VH反向(ATTGGGACTAGTTTCTGCGACAGCTGGATT)和VL正向(TTTTTGAATTCTGAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA)/VL反向(TTTTTGGGCCCGGATACAGTTGGTGCAGCATC)从cDNA扩增L2A5MAb的可变重(VH)和轻链(VL)域。所有PCR均使用Advantage HF 2PCR试剂盒(Clontech)进行。使用以下热循环条件：在94℃下初始熔融3分钟，然后在95℃下45秒，在70℃下1分钟和在68℃下2分钟。然后将反应在68℃下保持5分钟并冷却至4℃。根据制造商的规程，将纯化的PCR产物进一步克隆到pGEM-Teasy(Promega)克隆载体中。根据制造商的方案，使用QIAGEN质粒加midi试剂盒(QIAGEN)分离质粒。测序是由Seqlab(德国哥廷根)使用pGEM-Teasy载体的T7启动子引物进行的。
可以以一致的质量生产这些组合物，以用于临床和诊断应用。
实施例IX
抗体域
利用序列分析工具IgBLAST搜索IMGT-V域划分系统(国际ImMunoGeneTics数据库；http://imgt.cines.fr)，确定了编码L2A5 mAb FR和CDR域的氨基酸序列的可变重链(VH)和轻链(VL)核苷酸序列。
实施例X
将核酸克隆到靶模块中
如(Cartellieri等人，2016)所述进行抗STn靶标模块(TM)，但是用LA25核酸序列代替CDR区。使用标准铬释放测定法测量T细胞介导的肿瘤杀伤。将MDA-MB-231和MCR STn+细胞系与移植有载体对照(仅编码EGFP标记蛋白的载体主链)、UniCAR Stop结构(缺乏细胞内信号传导域)或α-E5B9信号传导结构(UniCAR 28/ζ)的T细胞一起孵育(Mitwasi 2017)。将两种细胞系分别与各自的基因工程T细胞在存在或不存在80nM抗STn TM(a-STn TM)的情况下以效应子与靶标(E：T)比率为5：1进行培养24小时。
实施例XI
体内抗肿瘤活性
转导MDA-MB-231STn细胞表达萤火虫荧光素酶(firefly luciferase,Luc)，生成MDA-MB-231STn-Luc细胞。如(Cartellieri等人，2016)所述进行抗STn靶标模块(targetmodule，TM)，但是用LA25核酸序列代替CDR区。每只小鼠，将1.5×106肿瘤细胞与1×106UniCAR 28/ζT细胞和10μg抗STn TM混合。单独的MDA-MB-231STn-Luc细胞(1.5×106)或与不含TM的1×106UniCAR 28/ζT细胞混合的MDA-MB-231STn-Luc细胞被用作未处理的对照。将各自的混合物皮下注射到雌性NMRI-Foxn1nu/Foxn1nu小鼠中，得到三组动物，每组五只小鼠。从第0天开始，然后在第1、3、6和8天，腹腔注射200μL D-荧光素钾盐(D-luciferinpotassium salt)(15mg/mL)后10分钟进行麻醉小鼠的发光成像。
本发明将在抗体市场和癌症研究/开发领域中提供新产品。
本发明提供了产生一种针对在癌症中识别的一组抗原的抗体或功能性抗体片段或它们的探针的组合物。
表1显示了分别识别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的克隆L2A5的可变重(VH)链和可变轻(VL)链的核苷酸序列的实例以及分别识别为SEQ ID Nos.3和4可变重(VH)链和可变轻(VL)链的编码的氨基酸序列的实例。
表1克隆L2A5的可变轻(VL)链和可变重(VH)链的核苷酸序列和编码的氨基酸序列的实例。
SEQ ID No. 链(mu)
1 可变重(VH)链的核苷酸序列
2 可变轻(VL)链的核苷酸序列
3 VH链的氨基酸序列
4 VL链的氨基酸序列
表2显示了克隆L2A5的六个构架(FR)和六个互补决定区(CDR)(H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3，L-CDR1、L-CDR2、LCDR3)的编码氨基酸序列并且得到鉴定为SEQ ID NO：5到SEQ IDNO：16的核苷酸序列。
表2：克隆L2A5的三个构架(FR)和三个互补决定区(CDR)(H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3，L-CDR1、L-CDR2、LCDR3)的编码氨基酸序列。
SEQ ID No. 区域
5 L-FR1氨基酸序列
6 L-CDR1氨基酸序列
7 L-FR2氨基酸序列
8 L-CDR2氨基酸序列
9 L-FR3氨基酸序列
10 L-CDR3氨基酸序列
11 H-FR1氨基酸序列
12 H-CDR1氨基酸序列
13 H-FR2氨基酸序列
14 H-CDR2氨基酸序列
15 H-FR3氨基酸序列
16 H-CD3氨基酸序列
Figure IDA0002701796230000011
Figure IDA0002701796230000021
Figure IDA0002701796230000031
Figure IDA0002701796230000041
Figure IDA0002701796230000051
Figure IDA0002701796230000061

Claims (8)

1.一种抗体、功能性抗体片段或它们的探针，其特征在于，所述抗体、功能性抗体片段或它们的探针得自L2A5单克隆抗体，并特异性结合STn和由α2,6-连接的唾液酸封端的一组聚糖，编码可变轻链域和重链域，所述可变轻链域和重链域各自包含互补决定区，其中：
a)所述轻链L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3分别为SEQ ID No.6、SEQ ID No.8和SEQ IDNo.10；
b)所述重链H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3分别是SEQ ID No.12、SEQ ID No.14和SEQ IDNo.16。
2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述由α2,6-连接的唾液酸封端的一组聚糖包括STn、2,6-唾液酸T或二唾液酸T或2,6-唾液酸乳糖胺。
3.根据前述权利要求所述的抗体，其特征在于，所述抗体、功能性抗体片段或它们的探针是嵌合的或人源化的。
4.根据前述权利要求所述的抗体，其特征在于所述抗体、功能性抗体片段或它们的探针在糖基化位点发生聚糖变化。
5.一种使用权利要求1-4中所限定的抗体、功能性抗体片段或它们的探针检测受试者中肿瘤的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
a)用核苷酸序列染色从可能患有肿瘤的受试者获得的生物样品，所述核苷酸序列编码特异性结合STn和由α2,6-连接的唾液酸封端的一组聚糖的抗体，其中上述染色是在适合于抗体或功能性抗体片段或它们的探针的特异性结合的条件下进行的，所述抗体或功能性抗体片段或它们的探针由编码STn、2,6-唾液酸T、二唾液酸T或2,6-唾液酸乳糖胺的核苷酸序列编码；
b)并且其中编码所述抗体的核苷酸序列的结合的存在或不存在表明癌细胞的存在或不存在，所述癌细胞表达细胞表面STn、2,6-唾液酸T、二唾液酸T或2,6-唾液酸乳糖胺。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述生物样品包含分离的细胞，或组织，或得自肿瘤的蛋白质。
7.权利要求1至4中所限定的抗体、功能性抗体片段或它们的探针的用途，其特征在于用于治疗肿瘤。
8.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1至4中所限定的抗体、功能性抗体片段或它们的探针，其特征在于，所述组合物还包含药学上可接受的载体。
CN201980022395.6A 2018-01-26 2019-01-17 抗肿瘤抗原的l2a5抗体或其功能性片段 Pending CN113287018A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PT110526A PT110526B (pt) 2018-01-26 2018-01-26 Anticorpo, fragmento funcional ou sonda do mesmo contra antigénios tumorais
PT110526 2018-01-26
PCT/PT2019/000001 WO2019147152A1 (en) 2018-01-26 2019-01-17 L2a5 antibody or functional fragment thereof against tumour antigens

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113287018A true CN113287018A (zh) 2021-08-20

Family

ID=65244573

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980022395.6A Pending CN113287018A (zh) 2018-01-26 2019-01-17 抗肿瘤抗原的l2a5抗体或其功能性片段

Country Status (15)

Country Link
US (1) US11353460B2 (zh)
EP (1) EP3743726B1 (zh)
JP (1) JP7324777B2 (zh)
KR (1) KR20210005546A (zh)
CN (1) CN113287018A (zh)
AU (1) AU2019211035A1 (zh)
BR (1) BR112020014931A2 (zh)
CA (1) CA3089300A1 (zh)
EA (1) EA202091760A1 (zh)
IL (1) IL276208A (zh)
MX (1) MX2020007828A (zh)
PT (1) PT110526B (zh)
SG (1) SG11202006897VA (zh)
WO (1) WO2019147152A1 (zh)
ZA (1) ZA202005023B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2619976A (en) * 2022-06-24 2023-12-27 Cellmabs S A Humanised antibodies or functional fragments thereof against tumour antigens

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1989008711A1 (en) * 1988-03-11 1989-09-21 The Biomembrane Institute Monoclonal antibodies and vaccine development directed to human cancer-associated antigens by immunization with animal and human mucin and with synthetic carbohydrate-carrier conjugates
WO2016057916A1 (en) * 2014-10-10 2016-04-14 Siamab Therapeutics, Inc. Glycan-interacting compounds and methods of use
WO2017040529A1 (en) * 2015-08-31 2017-03-09 Bluebird Bio, Inc. Anti-sialyl tn chimeric antigen receptors

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2532858B2 (ja) 1985-04-01 1996-09-11 セルテツク リミテツド 形質転換したミエロ―マ細胞系
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
CA2189356A1 (en) 1994-05-02 1995-11-09 Ting Chi Wong Process for preparation of glycosides of tumor-associated carbohydrate antigens
JP4308918B2 (ja) 1997-04-16 2009-08-05 スローン−ケッタリング インスティトゥート フォア キャンサー リサーチ （２，６）−ＳＴエピトープクラスターを有するα−Ｏ−結合複合糖質、その製造方法および使用
JP3809277B2 (ja) 1998-03-05 2006-08-16 生化学工業株式会社 Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ｏ−硫酸基転移酵素のポリペプチド及びそれをコードするｄｎａ
GB9917012D0 (en) 1999-07-20 1999-09-22 Pharmacia & Upjohn Spa Combined preparations comprising antitumor agents
EP1651955A4 (en) 2003-07-15 2007-11-21 Univ California METHODS FOR DETECTING AND ANALYZING N-GLYCOLYLNEURAMINIC ACID (NEU5GC) IN BIOLOGICAL MATERIALS
US8148335B2 (en) 2004-06-23 2012-04-03 Children's Hospital & Research Center Oakland De-N-acetyl sialic acid antigens, antibodies thereto, and methods of use in cancer therapy
JP2010505775A (ja) 2006-10-04 2010-02-25 クーベンハヴンス・ユニヴェルシテット Ｍｕｃ１に対する癌特異的な免疫反応の産生及び癌特異的ｍｕｃ１抗体
JP5156887B2 (ja) * 2007-02-14 2013-03-06 独立行政法人科学技術振興機構 ２−６シアリル６−スルホ糖鎖に対する抗体
EP2014302A1 (en) 2007-07-12 2009-01-14 Institut Curie An antibody specific for the Tn antigen for the treatment of cancer
FI20070853A0 (fi) 2007-11-09 2007-11-09 Glykos Finland Oy Glykaania sitovat monoklonaaliset vasta-aineet
EP2287202A1 (en) 2009-08-07 2011-02-23 Dublin City University Anti-sialic acid antibody molecules
US20110177614A1 (en) 2010-01-15 2011-07-21 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for detecting cancer
JP6172687B2 (ja) 2013-05-02 2017-08-02 国立研究開発法人産業技術総合研究所 シアリル化糖鎖を認識するモノクローナル抗体
WO2014191128A1 (en) 2013-05-29 2014-12-04 Cellectis Methods for engineering t cells for immunotherapy by using rna-guided cas nuclease system
KR20160054501A (ko) 2013-08-26 2016-05-16 맵백스 테라퓨틱스, 인코포레이티드 시알릴-루이스 ａ에 대한 사람 항체 코드화 핵산
EP2990416B1 (en) 2014-08-29 2018-06-20 GEMoaB Monoclonals GmbH Universal chimeric antigen receptor expressing immune cells for targeting of diverse multiple antigens and method of manufacturing the same and use of the same for treatment of cancer, infections and autoimmune disorders
WO2018217116A1 (en) * 2017-05-25 2018-11-29 Instituto De Patologia E Imunologia Da Universidade Do Porto (Ipatimup) Detection and isolation of cancer cells from body fluids based on a glycosylation pattern and methods of use thereof

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1989008711A1 (en) * 1988-03-11 1989-09-21 The Biomembrane Institute Monoclonal antibodies and vaccine development directed to human cancer-associated antigens by immunization with animal and human mucin and with synthetic carbohydrate-carrier conjugates
WO2016057916A1 (en) * 2014-10-10 2016-04-14 Siamab Therapeutics, Inc. Glycan-interacting compounds and methods of use
WO2017040529A1 (en) * 2015-08-31 2017-03-09 Bluebird Bio, Inc. Anti-sialyl tn chimeric antigen receptors

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
L.R. LOUREIRO 等: "Development of a novel target module redirecting UniCAR T cells to Sialyl Tn-expressing tumor cells", BLOOD CANCER JOURNAL, vol. 8, no. 9, pages 1 - 6, XP055567228, DOI: 10.1038/s41408-018-0113-4 *
LILIANA LOUREIRO 等: "Challenges in antibody development against Tn and Sialyl-Tn antigens", BIOMOLECULES, vol. 5, no. 3, pages 1783 - 1809, XP055365128, DOI: 10.3390/biom5031783 *
LILIANA R.L.等: "Novel monoclonal antibody L2A5 specifically targeting sialyl-Tn and short glycans terminated by alpha-2-6 sialic acids", SCIENTIFIC REPORTS, vol. 8, no. 1, pages 1 - 16, XP055567232, DOI: 10.1038/s41598-018-30421-w *

Also Published As

Publication number Publication date
EP3743726A1 (en) 2020-12-02
EA202091760A1 (ru) 2020-11-23
KR20210005546A (ko) 2021-01-14
EP3743726B1 (en) 2024-06-12
WO2019147152A1 (en) 2019-08-01
US20210033616A1 (en) 2021-02-04
JP7324777B2 (ja) 2023-08-10
JP2021516254A (ja) 2021-07-01
BR112020014931A2 (pt) 2020-12-08
SG11202006897VA (en) 2020-08-28
AU2019211035A1 (en) 2020-08-06
ZA202005023B (en) 2022-01-26
CA3089300A1 (en) 2019-08-01
PT110526B (pt) 2021-02-04
US11353460B2 (en) 2022-06-07
MX2020007828A (es) 2020-11-24
IL276208A (en) 2020-09-30
PT110526A (pt) 2019-07-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2050466B1 (en) Diagnosis and treatment of cancer using anti-desmoglein-3 antibodies
JP6025904B2 (ja) Ｅｇｆファミリーリガンドのアンタゴニストを成分とする医薬組成物
JP5918540B2 (ja) 抗ｄｌｌ３抗体
DK2740489T3 (en) Pharmaceutical composition for the treatment and / or prevention of pancreatic cancer
KR101638490B1 (ko) 암의 치료 및 예방용 의약 조성물
AU2008321840B2 (en) Diagnosis and treatment of cancer using anti-GPR49 antibody
US20180155438A1 (en) Diagnosis and treatment of cancer using anti-itm2a antibody
KR20120139720A (ko) 암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약품
US20200157231A1 (en) Diagnosis and treatment of cancer using anti-lgr7 antibody
WO2011105573A1 (ja) 抗icam3抗体およびその用途
JP5746018B2 (ja) 抗ｔｍｐｒｓｓ１１ｅ抗体を用いた癌の診断と治療
JP7324777B2 (ja) 腫瘍抗原に対するｌ２ａ５抗体またはその機能的断片
EP2303924B1 (en) Lm-antibodies, functional fragments, lm-1 target antigen, and methods for making and using same

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination