CN113278594B - 香茅酸作为疫苗生产增效剂的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种香茅酸作为病毒或病毒疫苗生产增效剂的应用。本发明意外发现，在培养SVA的培养基中加入香茅酸，能够使SVA的复制水平显著增加，表明香茅酸具有促进SVA复制的作用，可用于SVA病毒表达或疫苗生产的增效剂，用于SVA病毒或病毒疫苗的高效生产。

Description

香茅酸作为疫苗生产增效剂的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种香茅酸作为病毒或病毒疫苗生产增效剂的应用。
背景技术
塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)是小RNA病毒科(Picornaviridae)新增的塞内卡病毒属的唯一成员，临床症状与口蹄疫难以区分，主要表现为口鼻部、蹄部等产生水泡和溃疡。由于SVA是新发传染病，目前尚无商业化的疫苗，且其致病和免疫机制仍不完全清楚。
前期研究表明RIG-I是SVA激活天然免疫的关键分子，但是SVA的2C和3Cpro蛋白能够降低RIG-I的蛋白表达，对RIG-I起到相反的拮抗功能；SVA的2C和3Cpro也能够激活Caspase-3，诱导细胞凋亡；SVA的3Cpro利用自身的酶活性切割MAVS、TRIF和TANK等关键天然免疫分子，抑制宿主的天然免疫应答；SVA的3Cpro蛋白还抑制IRF3/7的蛋白表达和去除RIG-I、TBK1和TRAF3分子的泛素化，拮抗宿主的抗病毒功能；因此，由于上述免疫关键分子及SVA蛋白的存在，抑制了SVA的复制，无法实现大规模的复制。此外，SVA感染还可激活细胞的自噬。上述研究主要集中于SVA与天然免疫通路中关键分子的互作调控，而关于化学物质促进SVA复制的研究还未见报道。
香茅酸(S(-)-citronellic acid)，别名为3,7-二甲基-6-辛酸，是无色液体，具有青草气味，可作为配制香精的辅料用于食用和日化香精中，还可作为合成的中间体，生成多个下游产品。香茅酸具有抗菌性和驱虫性，对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌等都具有抑制作用。本发明意外发现，在培养SVA的培养基中加入香茅酸，能够使SVA的复制水平显著增加，表明香茅酸具有促进SVA复制的作用，可用于SVA病毒表达或疫苗生产的增效剂，用于SVA 病毒或疫苗的高效生产。
发明内容
本发明提供了一种香茅酸作为病毒生产增效剂的应用。具体包括以下内容：
第一方面，本发明提供了一种香茅酸或其药学上可接受的盐作为病毒生产增效剂的应用，所述香茅酸的结构式如下式(Ⅰ)所示：
Figure RE-GDA0003145897490000011
优选地，所述病毒为小RNA病毒科病毒。
优选地，所述病毒为塞内卡病毒。
优选地，所述的香茅酸加入药学上可接受的载体和/或辅料，制成粉针剂、胶囊剂、片剂、混悬剂的任一种剂型。
第二方面，本发明提供了一种香茅酸或其药学上可接受的盐作为病毒疫苗生产增效剂的应用，所述香茅酸的结构式如下式(Ⅰ)所示：
Figure RE-GDA0003145897490000021
优选地，所述病毒为小RNA病毒科病毒。
优选地，所述病毒为塞内卡病毒。
优选地，所述的香茅酸加入药学上可接受的载体和/或辅料，制成粉针剂、胶囊剂、片剂、混悬剂的任一种剂型。
第三方面，本发明提供了一种小RNA病毒科病毒的生产方法，其特征在于，所述方法为：用小RNA病毒科病毒感染宿主细胞后培养，所述培养体系中含有香茅酸；所述香茅酸的结构式如下式(Ⅰ)所示：
Figure RE-GDA0003145897490000022
优选地，所述小RNA病毒科病毒为塞内卡病毒。
优选地，所述培养体系中香茅酸含量为5-50mg/L。
本发明的有益效果是：本发明意外发现，在培养SVA的培养基中加入香茅酸，能够使 SVA的复制水平显著增加，表明香茅酸具有促进SVA复制的作用，可用于SVA病毒表达或疫苗生产的增效剂，用于SVA病毒或疫苗的高效生产。
附图说明
图1香茅酸在IB细胞中促进SVA复制的结果图；
图2香茅酸在PK-15细胞中促进SVA复制的结果图；
图3不同浓度的香茅酸在PK-15细胞中促进SVA复制的结果图；
图4不同浓度的香茅酸在IB细胞中促进SVA复制的结果图。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买获得。
香茅酸购自sigma公司。
塞内卡病毒菌株SVA/FJ-201由本团队分离，并保存于中国农业科学院兰州兽医研究所口蹄疫与新发病流行病学团队与国家口蹄疫参考实验室。
实施例1香茅酸促进SVA复制的效果评价实验
1.含香茅酸培养基的制备
在DMEM培养基中，分别加入不同剂量的香茅酸，使其浓度分别为0mg/L、10mg/L和20mg/L。
2.香茅酸孵育细胞的样品制备
用配制好的含有香茅酸的培养基孵育IB细胞，然后接种SVA/FJ-201(1MOI)，接种后 8h收取上清。
3.SVA病毒滴度测定
测定上一步骤获得的上清的TCID50，进行病毒滴度分析。
TCID50的测定步骤如下：提前16h将IB细胞接种96孔板，在细胞形成单层细胞后，用PBS洗3遍IB细胞，接种步骤2收取的上清(10-1-10-10)作为感染空孔，另设两列阴性对照孔。在感染孔中加入100μl病毒滤液或倍比稀释病毒稀释液，37℃吸附1h，每20min轻轻摇晃一次，保证病毒吸附均匀。吸附1h后，吸去上清，用PBS轻轻洗板1次。加入病毒维持液，待48h后，每12h观察一次细胞病变情况，72h后记录病变孔数，计算TCID50，平行测定三次，取平均值为最终病毒滴度。
实验结果如图1所示，在IB细胞培养过程中，加入香茅酸后，SVA的TCID50显著增高，说明香茅酸显著增加了SVA的病毒TCID50，促进了SVA病毒的复制。
实施例2香茅酸促进SVA复制的效果评价实验
1.含香茅酸培养基的制备
在DMEM培养基中，分别加入不同剂量的香茅酸，使其浓度分别为0mg/L、10mg/L和20mg/L。
2.香茅酸孵育细胞的样品制备
用配制好的含有香茅酸的培养基孵育PK-15细胞，然后接种SVA/FJ-201(1MOI)，接种后12h收取上清。
3.SVA病毒滴度测定
感染SVA后收集细胞上清，通过TCID50测定，进行病毒滴度分析。病毒效价的测定：提前16h将IB细胞接种96孔板，在细胞形成单层细胞后，用PBS洗3遍IB细胞，接种步骤2收取的上清(10-1-10-10)，另设两列阴性对照孔。在感染孔中加入100μl病毒滤液或倍比稀释病毒稀释液，37℃吸附1h，每20min轻轻摇晃一次，保证病毒吸附均匀。吸附1h后，吸去上清，用PBS轻轻洗板1次。加入病毒维持液，待48h后，每12h观察一次细胞病变情况，72h后记录病变孔数，计算TCID50，平行测定三次，取平均值为最终病毒滴度。
实验结果如图2所示，在PK-15细胞培养过程中，加入香茅酸后，，SVA的TCID50显著增高，说明香茅酸显著增加了SVA的病毒TCID50，促进了SVA病毒的复制。
实施例3不同浓度的香茅酸在PK-15或IB细胞中促进SVA的复制
1.含香茅酸培养基的制备
在DMEM培养基中，分别加入不同剂量的香茅酸，使其浓度分别为0mg/L、2.5mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L和50mg/L。
2.香茅酸孵育细胞的样品制备
用配制好的含有上述不同浓度香茅酸的培养基孵育PK-15细胞，然后接种SVA(1MOI)，接种后12h收取上清；
同时用配制好的含有上述不同浓度香茅酸的培养基孵育IB细胞，然后接种SVA(1MOI)，接种后8h收取上清。
3.SVA病毒滴度测定
感染SVA后收集细胞上清，通过TCID50测定，进行病毒滴度分析。病毒效价的测定：提前16h将IB细胞和PK-15细胞分别接种96孔板，在细胞形成单层细胞后，用PBS洗3遍 IB细胞和PK-15细胞，分别接种步骤2收取的上清(10-1-10-10)，另设两列阴性对照孔。分别在感染孔中加入100μl病毒滤液或倍比稀释病毒稀释液，37℃吸附1h，每20min轻轻摇晃一次，保证病毒吸附均匀。吸附1h后，吸去上清，用PBS轻轻洗板1次。加入病毒维持液，待48h后，每12h观察一次细胞病变情况，72h后记录病变孔数，计算TCID50，平行测定三次，取平均值为最终病毒滴度。
实验结果如图3和图4所示，在PK-15和IB细胞培养过程中，加入不同浓度的香茅酸，对SVA复制的影响效果一致。当加入2.5mg/L的香茅酸时，SVA的TCID50无显著变化；当加入5mg/L的香茅酸时，SVA的TCID50显著增加。此后，随着香茅酸含量的增加，SVA的 TCID50显著增高，成剂量依赖关系。上述结果表明，香茅酸显著增加了SVA的病毒TCID50，促进了SVA病毒的复制。
综上，尽管本发明实施例以宿主细胞PK-15和IB细胞为例，研究证明了香茅酸能够在宿主细胞PK-15和IB细胞中促进SVA病毒的复制，进而促进了SVA病毒的表达生产；但是本发明并不局限于上述宿主细胞PK-15和IB细胞，其他能够用于生产SVA病毒的宿主细胞均适用。即，在任何生产SVA病毒的宿主细胞中加入香茅酸，均能促进SVA病毒的复制，进而促进SVA病毒的表达生产。
需要说明的是，小RNA病毒科主要包括以下四个属：肠道病毒属、鼻病毒属、心病毒属、口疮病毒属，而SVA属于口疮病毒属。由于小RNA病毒科四个属之间的病毒结构蛋白具有高度保守性。本发明虽然以小RNA病毒科病毒的SVA为例，证明了香茅酸可以促进SVA病毒的复制，但不局限于SVA。在本发明所述的香茅酸能够促进SVA病毒的复制的基础上，同样也能促进小RNA病毒科其他病毒的复制。

Claims (5)

1.香茅酸或其药学上可接受的盐作为塞内卡病毒生产增效剂的应用，其特征在于，所述香茅酸的结构式如下式(Ⅰ)所示：
Figure FDA0003388441720000011
2.香茅酸或其药学上可接受的盐作为塞内卡病毒疫苗生产增效剂的应用，其特征在于，所述香茅酸的结构式如下式(Ⅰ)所示：
Figure FDA0003388441720000012
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的香茅酸或其药学上可接受的盐加入药学上可接受的载体和/或辅料，制成粉针剂、胶囊剂、片剂、混悬剂的任一种剂型。
4.一种塞内卡病毒的生产方法，其特征在于，所述方法为：用塞内卡病毒感染宿主细胞后培养，所述培养体系中含有香茅酸；所述香茅酸的结构式如下式(Ⅰ)所示：
Figure FDA0003388441720000013
5.如权利要求4所述的生产方法，其特征在于，所述培养体系中香茅酸含量为5-50mg/L。
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