CN113278592A - 一种调节猪早期胚胎发育的营养物质的高通量筛选细胞模型及其构建与应用 - Google Patents

一种调节猪早期胚胎发育的营养物质的高通量筛选细胞模型及其构建与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种调节猪早期胚胎发育的营养物质的高通量筛选细胞模型，所述高通量筛选细胞模型的构建方法为：(1)pGF‑promoter载体构建：将猪PCNA基因启动子克隆至pGF‑mCMV‑EF1‑Neo慢病毒载体中，获得pGF‑promoter载体；(2)转染HEK‑293T细胞：将pGF‑promoter载体和pMD2.g、psPAX2共转染HEK‑293T细胞，孵育，收集慢病毒上清液；(3)感染pTr细胞：用慢病毒感染pTr细胞；(4)G418筛选稳转株：用G418筛选培养基培养pTr细胞，最终获得pTr‑PCNA promoter‑Luciferase稳转细胞株，其命名为pTr‑luc。本发明所建立的营养物质调节猪早期胚胎发育的细胞模型可用于调节猪早期胚胎发育的营养物质的高通量筛选，对于快速筛选促进猪早期胚胎发育的营养物质具有重要意义。

Description

一种调节猪早期胚胎发育的营养物质的高通量筛选细胞模型 及其构建与应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种调节猪早期胚胎发育的营养物质的高通量筛选细胞模型及其构建与应用。
背景技术
提高母猪繁殖性能是提高猪场生产效率和经济效益的关键。窝产活仔数是衡量母猪繁殖性能的主要指标，胚胎死亡率则是决定窝产活仔数的关键。猪的胚胎死亡率约为30％～50％，其中很大一部分发生在妊娠早期。早期胚胎损失的原因主要是胚胎附植失败，母猪妊娠早期特别是胚胎附植期的胚胎损失最高可占到整个妊娠期胚胎或胎儿死亡率的75％。因此，提高胚胎质量，保证早期胚胎发育，降低附植失败几率从而降低早期胚胎损失对于提高母猪繁殖性能和潜力具有重要意义。
越来越多的证据表明母体营养情况的改变会影响猪胚胎质量和早期胚胎发育。目前在这方面研究做多的是日粮营养水平和氨基酸。营养素如糖类、脂肪和氨基酸等可以调节能量供应，进行表观遗传修饰，调节线粒体功能和氧化平衡状态来影响卵母细胞的发育、成熟，提高早期胚胎发育水平。胚胎滋养层细胞(Porcine trophectoderm cells，pTr)最初是从妊娠第12天收集的猪囊胚中分离出来的，常用于猪滋养外胚层的功能研究。滋养层细胞增殖分化是早期胚胎发育中重要的一环，可以将其作为细胞模型进行营养物质促进早期胚胎发育的相关研究。增殖细胞核抗原(PCNA)，分子量是36KDa，是真核生物复制复合体的核心成分。因为PCNA与细胞的合成密切相关，在细胞增殖的启动上起着重要作用，所以通常认为PCNA基因的表达情况可以在很大程度上反应细胞的增殖状态。
本发明针对母猪早期胚胎发育此关键时期，构建高通量细胞模型以筛选出某些对于早期胚胎发育有积极作用的营养物质，进而为通过营养手段调节妊娠母猪营养状况，促进早期胚胎发育，提高胚胎质量，减少早期胚胎损失提供理论依据。
发明内容
本发明公开一种调节猪早期胚胎发育的营养物质的高通量筛选细胞模型，将嵌合后荧光素酶报告基因与PCNA基因启动子通过慢病毒转导至pTr细胞，经过筛选培养后得到可以稳定传代的pTr-luc细胞系，该细胞系可用于营养物质促进pTr细胞增殖的高通量筛选。
本发明公开一种调节猪早期胚胎发育的营养物质的高通量筛选细胞模型，所述高通量筛选细胞模型的构建方法为：
(1)pGF-promoter载体构建：将猪PCNA基因启动子克隆至pGF-mCMV-EF1-Neo慢病毒载体中，获得pGF-promoter载体；
(2)转染HEK-293T细胞：将pGF-promoter载体和pMD2.g、psPAX2共转染HEK-293T细胞，孵育，收集慢病毒上清液；
(3)感染pTr细胞：用慢病毒感染pTr细胞；
(4)G418筛选稳转株：用G418筛选培养基培养pTr细胞，最终获得pTr-PCNApromoter-Luciferase稳转细胞株，其命名为pTr-luc。
所述步骤(1)中，所述猪PCNA基因启动子的序列如SEQ ID NO.1所示。
所述步骤(2)中，pGF-promoter载体和pMD2.g、psPAX2的浓度比例为pGF-promoter：psPAX2：pMD2.g＝(2-5)：(2-3)：(1-2)。
所述pGF-promoter载体和pMD2.g、psPAX2的浓度比例为pGF-promoter：psPAX2：pMD2.g＝5：3：2。
所述pGF-promoter载体和pMD2.g、psPAX2共转染HEK-293T细胞采用的转染试剂为purefection。
所述步骤(4)中G418筛选培养基的筛选浓度为550μg/mL-700μg/mL；优选为650μg/mL。
所述步骤(4)中G418筛选培养基培养pTr细胞的培养时间为3周-6周；优选为4周。
上述高通量筛选细胞模型可筛选出能够激活pTr细胞PCNA基因启动子的营养物质物质。
所述营养物质为白藜芦醇、芹菜素、维生素A棕榈酸酯、维生素B6、7-羟基黄酮、丹蒽醌和高良姜素。
本发明将荧光素酶报告基因和PCNA基因启动子通过慢病毒转导至猪胚胎滋养层细胞，经G418筛选后得到可以稳定传代的pTr-PCNA promoter-Luciferase稳定转染细胞株。通过225种营养物质的高通量筛选，初步鉴定出7种能够激活pTr细胞PCNA基因启动子的物质。本发明所建立的营养物质调节猪早期胚胎发育的细胞模型可用于高通量筛选，对于快速筛选促进猪早期胚胎发育的营养物质具有重要意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1.不同长度的PCNA基因启动子片段，从左到右的片段分别为216bp，321bp，527bp，1,009bp，1,978bp，其中1,978bp下面有一条1,100bp左右的杂带。
图2.pGL-4.17载体结构。
图3.线性化的pGL-4.17载体，从左到右的pGL-4.17载体分别含有不同的同源臂，可以分别与216bp、321bp、527bp、1,009bp、1,978bp的启动子进行In-fusion克隆连接。
图4.pGF-mCMV-EF1-Neo载体结构。
图5.线性化的pGF载体，从左到右的分别为未酶切的pGF、EcoRI单酶切的pGF、SpeI单酶切的pGF以及双酶切的pGF。双酶切的pGF载体可以与1,009bp长度的启动子进行In-fusion克隆连接。
图6.菌落PCR扩增条带电泳结果。
图7.含有不同长度的启动子重组载体转染pTr细胞后的荧光素酶活性检测，与pGL-basic相比，1,009bp长度的启动子转录活性最高，是pGL-basic的17.85倍。
图8.稳定表达PCNA启动子和荧光素酶的pTr细胞。
图9.225种营养物质的初步筛选的Z-Score，225种化合物的高通量筛选结果显示有9种Z值>2.0的营养物质。
图10.不同浓度的几种营养物质对pTr-luc细胞增殖活力的影响，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，相对于空白对照组。
图11.不同浓度的几种营养物质处理pTr-luc细胞后的相对荧光强度。
图12.不同处理时间对于pTr-luc细胞荧光素酶活性的影响。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。所述方法如无特别说明均为常规方法，所述原料如无特别说明均能从公开商业途径获得。
主要实验材料和试剂配制
本发明使用的猪胚胎滋养层细胞系(Porcine trophectoderm cells，pTr)，人胚胎肾细胞293T(Human Embryonic Kidney Cells 293T，HEK-293T)获赠于中国农业大学动物科技学院曾祥芳老师课题组。
pGF-mCMV-EF1-Neo质粒购自美国System Biosciences公司，货号为TR010PA-N。
pGL-4.17购自广州优宝生物科技有限公司，货号VT1731。
psPAX2购自addgene，https://www.addgene.org/，质粒编号12260。
pMD2.g购自addgene，https://www.addgene.org/，质粒编号12259。
pTr细胞完全培养基：将5mL FBS、0.5mL青链霉素混合液、0.5mL胰岛素铁硒传递蛋白加入到50mL离心管中，补充DMEM/F12培养基至50mL，充分混匀，得到含有10％FBS、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和1％胰岛素铁硒传递蛋白的pTr细胞培养液，4℃保存。
HEK-293T细胞完全培养基：将5mL FBS、0.5mL青链霉素混合液加入到50mL离心管中，补充DMEM高糖培养基至50mL，充分混匀，得到含有10％FBS、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的HEK-293T细胞培养液，4℃保存。
pTr细胞冻存液：在离心管中依次加入2mL FBS、7mL DMEM/F12培养基、1mL DMSO，充分混匀后置于4℃备用。
HEK-293T细胞冻存液：在离心管中依次加入2mL FBS、7mL DMEM/F12培养基、1mLDMSO，充分混匀后置于4℃备用。
1％的琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖置于100mL 1xTAE电泳缓冲液中，微波炉加热至完全溶解，加入10μL ExRed核酸染料，轻轻摇匀后倒入插入梳子的电泳板中，待冷却凝固后使用。
转染试剂purefection，购自美国System Biosciences公司，货号为LV750A-1。
不同浓度的G418筛选培养基：在50mL pTr细胞完全培养基中分别加入10μL、20μL、30μL、40μL和50μL的0.1g/mL G418溶液，使G418筛选浓度分别达到200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL、800μg/mL和1000μg/mL，置于4℃保存。
丙酸钠-pTr培养基：称取0.0384g丙酸钠溶于10mL pTr细胞完全培养基中，充分震荡混匀，得到含40mM丙酸钠的pTr细胞完全培养基，用0.22μm滤膜过滤后，再稀释10倍，得到含有4mM丙酸钠的pTr培养基。
实施例1、营养物质调节猪早期胚胎发育的高通量筛选细胞模型的构建
1、启动子筛选
(1)猪PCNA基因启动子区序列扩增
在NCBI数据库中查询猪PCNA基因的相关序列信息，确定其基因ID为692192。下载猪PCNA基因启动子序列，包括起始密码子ATG前2,000bp左右的序列，用Primer Premier6.0软件分别设计5种PCNA基因启动子区的引物，其引物序列如下表1。以pTr细胞基因组DNA为模板，扩增不同长度的PCNA基因启动子区序列，长度分别为216bp，321bp，527bp，1,009bp，1,978bp。所扩增的片段经琼脂糖凝胶电泳检测分析，如图1所示，与2,000Marker对比五种不同长度的启动子DNA条带均在正确的位置上。其中1,978bp的条带下有一条1,100bp左右的杂带，可以通过后续的切胶回收去除。
表1.启动子引物序列
Figure BDA0003074354750000071
依据同源臂原则，设计能够通过In-fusion克隆连接到pGL4.17载体(图2)序列中的5种PCNA基因启动子序列的引物，其引物序列如下表2。
表2.启动子引物序列(载体线性化)
Figure BDA0003074354750000072
(2)pGL系列质粒的线性化
用设计的pGL线性化的引物扩增pGL-4.17质粒，扩增片段进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示。扩增产物即为含有同源臂的线性化的pGL4.17质粒，可以分别与216bp、321bp、527bp、1,009bp、1,978bp等五个启动子片段进行In-fusion克隆连接。
(3)pGF系列质粒的线性化
用QuickCut SpeI酶和QuickCut EcoRI酶对pGF-mCMV-EF1-Neo载体(图4)进行双酶切，酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图5所示。扩增产物即为线性化的pGF-mCMV-EF1-Neo质粒，可以与1,009bp长度的启动子进行In-fusion克隆连接。
将pGF-1009连接产物转化后挑取单克隆，用相应的PCR引物进行扩增，扩增产物进行1％琼脂糖电泳，结果如图6所示。有单一的长度为1,009bp的片段，初步证明pGF-1009载体构建成功。
将质粒送去测序，测序结果用snapgene软件进行分析，结果表明，pGL-216、pGL-321、pGL-527、pGL-1009、pGL-1978和pGF-1009载体全部构建成功。
(4)最适启动子筛选
将不同长度的启动子片段重组质粒分别瞬时转染至猪胚胎滋养层细胞，培养2天后，用4mM丙酸钠-pTr培养基处理1天，加入荧光素底物，检测荧光强度，结果如图7所示。用pGL-216、pGL-321、pGL-527、pGL-1009和pGL-1978分别转染pTr细胞后，测得荧光素酶(Luciferase)活性是分别是pGL-basic的7.68倍、6.46倍、11.27倍、17.85倍和15.33倍，推测在1,009bp长度的启动子转录活性较高，存在正向调控元件的结合位点。pGL-216的Luciferase高于pGL-321，pGL-1009的Luciferase高于pGL-1978，所以推测216bp～321bp、1,009bp～1,978bp之间可能存在负向的转录调控元件的结合位点。综上所述，选择1,009bp长度的启动子进行后续的稳转株构建。
1009bp长度的启动子的序列为如SEQ ID NO.1所示：
ctgtagccaccagcctactactccagagccacagcaactcagaatctcagccgcatctgcaacctataccacagctcacagcaacgccggatccttaacccgctgagcaaggccagggttcgaacccgcaacctcatggttcctagtcggattcgttaaccactgcgccacgacgggaactcctgaattttgtttttaaaagtacatttgtacaaaaaaaaaagcttagaaagttgtatgcagtaaacgatagtttggtgtgtgtgtggtgggggaggcgatggcagtggggagccacgataactgttttcttttaatcataactgtacatctctttattgttcacttttaggaacgcttctataattgctactctataatagcagggggaaaaaagtgcatatttaaagtagctatactctttaggcgcatggtggctcttcctcctagaaggctggatttccgtttcaccttcactttcaaggctgtaaatgtcccatccctcaagcgggaaattgatgaggcaccacaaagccacctcaacgacccccccccaagcctaggcctgaccttcacacttgccccgacttgtctaacgtccgggcgccggaacacgacaaaaaggcggggagccccgcaggatgcctatcagcaggccctcgttaggcgcaagattcctgccccgcccctacgcccacactctccaatggatgttcggggtgggacgggcttcatgtggagcagggacacgattggctccgcagcctctccgcccaggcagtgggcggggcagcgtggtgacgtagccatgaagggcgtgggggcgtagcgcgcgctcgcagacgcggctgtattaaaccgctgcaggcgcggccggctggcagtgtgcgtcctccggttcaggctctgttgtggtgttttcctgctctctctcaacttctgaagcctaagccggctactccttccttctttcttccacctgtagccgcgtcgttgtgattccaccacc。
2、慢病毒包装与感染
(1)pGF-1009载体构建
利用In-fusion酶将筛选出的转录起始活性最强的启动子Promoter-1009克隆至线性化的pGF-mCMV-EF1-Neo慢病毒载体中构建pGF-1009慢病毒载体。利用菌落PCR进行初步鉴定质粒中是否含有目的基因，随后送往北京睿博兴科公司进行测序，结果返回后，与NCBI数据库中公布的启动子序列进行BLAST对比。
(2)转染HEK-293T细胞
准备HEK-239T细胞，提前一天铺板(4～5)×106个细胞至10cm培养皿。用500ul的Opti-MEM减血清培养基稀释质粒，转染共20μg质粒，其中pGF-1009：psPAX2：pMD2.g＝5：3：2。再加入40μL purefection转染试剂，涡旋5～10s混匀，孵育15min。
将混合液加入到细胞中，培养基中可以有血清和双抗。转染6h后，更换为DMEM-Hepes培养基，48h和72h后，分别收取病毒上清液。得到的上清液2,000g，10min离心后，用0.22μm的滤膜过滤，用慢病毒浓缩试剂按比例浓缩病毒上清，4℃过夜。4,000g，20min 4℃离心上清液，灰白色沉淀即为病毒，用pTr细胞完全培养基重悬，分装后于-80℃保存。
(3)感染pTr细胞
慢病毒感染培养基：分别收取转染HEK-293T细胞48h、72h后的培养基，1,000rpm离心5min后，将上清液用0.22μm滤膜过滤，置于-80℃保存。
感染pTr细胞慢病毒感染前18～24h，将pTr细胞以2×105/孔铺到6孔板中，使细胞在第二天慢病毒感染时的汇合度达到40％～60％。第二天，细胞换液，加入1mL收集的48h病毒液，同时加入溴化己二甲铵(polybrene)使其终浓度为5μg/mL，4h后加入1mL新鲜的pTr细胞完全培养基。8-12h后观察细胞状态，若细胞无明显病变，继续培养，24h后更换新鲜的慢病毒感染培养基。继续培养24h后用2mL新鲜的pTr细胞完全培养基替换含有病毒的培养基，随后准备开始G418筛选。
3、G418筛选稳转株
首先通过预实验确定G418最适筛选浓度为650μg/mL，用该浓度的G418筛选培养基培养pTr细胞一个月，期间每2～3天以1：3传代。最终获得的pTr-PCNA promoter-Luciferase稳转株结果如图8所示。A图为常规显微镜下pTr细胞图；B图为荧光显微镜下pTr细胞图。可以看出，几乎100％的pTr细胞都表达GFP绿色荧光蛋白，说明包含PCNA启动子和荧光素酶的pGF-1009载体已稳定在pTr细胞中表达。至此，我们获得了稳定表达PCNA启动子和荧光素酶基因的pTr细胞，经过筛选培养后得到可以稳定传代的pTr-luc细胞系，该细胞系可用于营养物质促进pTr细胞增殖的高通量筛选。
实施例2、营养物质调节猪胚胎滋养层细胞增殖的高通量筛选及验证
(1)营养物质调节猪胚胎滋养层细胞增殖的高通量筛选
通过快速检测荧光素酶的强度来筛选某种物质对于pTr细胞PCNA基因的刺激效果。参考Steady-Glo Luciferase Assay System试剂盒说明书进行荧光素酶活性检测。
试验前一天，按每孔1×104个细胞将pTr-luc细胞接种至黑色不透光96孔板。处理：待细胞融合度达到80％后，用含有不同脂肪酸或其他化合物的225种营养物质培养基处理细胞24h。裂解：24h后，移除培养基，加入100μL荧光素混合液，静置10min。上机：将黑色不透光96孔板放入Biotek多功能酶标仪中，选用Luciferase检测模块，设置灵敏度为150，间隔时间5s，开始检测。
检测结果用相对荧光强度(relative Luciferase activity)表示。Z值模型可以用于高通量筛选中阳性物质的鉴定。
Figure BDA0003074354750000111
其中x为每种化合物处理细胞的相对荧光强度，μ为所有化合物处理细胞的相对荧光强度的平均值，σ为该试验的标准差。将Z-scores2.0作为阈值，高通量筛选初步结果如图9所示。
共发现9种Z-scores>2.0或接近2.0的营养物质，其中Z-scores>2.0的7种化合物如表3所示，主要包括植物提取物和维生素。随后，针对Z-socres>2.0的物质进行CCK细胞活力检测和二次筛选。
表3.Z值>2.0的化合物及其主要功能
Figure BDA0003074354750000112
Figure BDA0003074354750000121
(2)CCK8细胞增殖活力检测
试验结果如图10所示，总的来说10μM是大部分营养物质的最适处理浓度。10μM的白藜芦醇和维生素B6分别处理pTr-luc细胞24h后，显著增加了pTr-luc细胞的细胞活力(P<0.01)。50μM的高良姜素、7-羟基黄酮和Danthron对于pTr-luc细胞活力具有极显著的抑制作用(P<0.001)。2μM和10μM的维生素A棕榈酸酯均对pTr-luc细胞增殖活力有促进作用，其中10μM的维生素A棕榈酸酯的促进效果更好；2μM和10μM的芹菜素对于pTr-luc细胞增殖活力有促进的趋势，但无显著影响，而在50μM的浓度下，芹菜素对pTr-luc细胞增殖活力有抑制的效果，同样没有显著影响(P＝0.069)。
(3)浓度依赖性试验
对初次筛选出的9种营养物质进行二次筛选。试验设置2μM、10μ和50μM三个营养素处理浓度。二次筛选的结果如图11所示，与空白对照相比，绝大部分处理组的相对荧光强度都是2倍以上，说明初次高通量筛选的结果可信度较高，不同浓度营养素处理后，大部分可以促进PCNA启动子的表达，从而激活PCNA基因的转录起始，起到促细胞增殖的作用。
(4)时间依赖性试验
图12展示的是10μM白藜芦醇、10μM高良姜素和10μM芹菜素不同处理时间对于pTr-luc荧光素酶活性的影响，总的来说，处理时间对于荧光素酶活性的影响较大。对于10μM白藜芦醇，荧光素酶活性随着处理时间增加而增加，其中48h处理后，pTr-luc细胞的荧光素酶活性最高，与12h处理组相比有极显著差异(P<0.0001)，与24h处理组相比也有显著差异(P<0.05)，表明白藜芦醇对于pTr-luc细胞PCNA启动子的促进作用呈时间依赖性。对于10μM高良姜素，24h处理组的效果最好，与12h处理组相比有显著差异(P<0.05)；48h处理组的荧光素酶活性略低于24h组，表明高良姜素对于pTr-luc细胞PCNA启动子的促进作用最佳处理时间为24h。对于10μM芹菜素，结果与白藜芦醇相似，结果呈现时间依赖性，其中48h处理组与12h、24h处理组均有显著差异(P<0.05)。
综上，通过对225种营养物质的HTS检测，我们鉴定出7种具有增强PCNA基因表达能力的物质。在本发明筛选出的7种化合物中，分别是白藜芦醇、芹菜素、维生素A棕榈酸酯、维生素B6、7-羟基黄酮、丹蒽醌和高良姜素。其中，芹菜素可以通过促进PCNA基因、CDK4基因和CCND1基因的表达，促进pTr细胞增殖，这为筛选促进猪早期胚胎发育的营养物质提供了基础。只有维生素A棕榈酸酯(维生素A的衍生物)之前被报道具有促进早期胚胎发育的作用，其余6种化合物均无相关报道。它们大多是植物提取物，具有抗氧化的作用。
白藜芦醇可以调节小鼠的AMPK通路，改善妊娠糖尿病导致的产仔数和初生重降低，证明了白藜芦醇对动物繁殖性能的调控作用。在母猪饲粮中添加白藜芦醇后，初乳的乳糖水平和常乳中脂肪水平显著提高，而胎盘和乳中抗氧化酶活性也显著提高，间接改善了子代的抗氧化能力，同时还发现白藜芦醇可以调节母猪胎盘中SIRT1的蛋白表达。本试验中，发现10μM的白藜芦醇激活了pTr细胞PCNA基因启动子，从而促进了pTr细胞的增殖，同时增加了CAT基因的表达，但效果不显著。10μM的白藜芦醇对于PCNA mRNA和CDK4等增殖相关基因的表达无影响，这可能是由于处理时间较短，为24h，在时间依赖性试验中可以发现，白藜芦醇促进PCNA基因启动子表达的最佳作用时间为48h。总体而言，目前白藜芦醇在母猪中的应用研究较少，对于早期胚胎发育的具体作用机制尚不清楚。
维生素A棕榈酸酯是视黄醇与棕榈酸结合的酯。维生素A是维持动物体正常生长、发育所必须的一种营养素，维生素A与早期胚胎发育密切相关，近年来报道的维生素A缺乏模型试验中，胚胎发育的结果往往是死亡。特别是在早期胚胎发育过程中，母体需要足够的视黄醇来支持正常的胚胎发育。本发明发现2μM的维生素A棕榈酸酯可以激活PCNA基因启动子，从而促进pTr细胞的增殖，而在mRNA表达验证试验时，发现2μM维生素A棕榈酸酯对于PCNA等增殖相关基因和CAT抗氧化基因的表达并无促进作用，推测这可能是由于处理时间短和并不是最佳浓度导致的，CCK-8细胞增殖试验中，10μM的维生素A棕榈酸酯可以显著促进pTr细胞的增殖。
芹菜素作为一种黄酮类植物提取物，在抗氧化、抗癌等方面具有一定的效果。P13K-Akt-mTOR通路调控细胞增殖、分化、凋亡和自噬等。通常认为，芹菜素会抑制P13K-Akt-mTOR通路从而抑制细胞增殖和自噬。除了抑制癌细胞增殖，芹菜素似乎在某些情况下也可以促进正常细胞的增殖。最近有报道表明芹菜素可以激活P13K-Akt-mTOR通路，从而促进细胞增殖。这也于本发明的结果相符合，10μM的芹菜素可以激活pTr的PCNA基因启动子从而促进细胞增殖，mRNA表达验证试验显示，10μM芹菜素极显著地促进了PCNA基因、CDK4基因和CCND1基因的表达，调节细胞周期，促进pTr细胞增殖。综上所述，芹菜素对于胚胎滋养层细胞的增殖存在促进效果，具体机制有待继续研究。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一种调节猪早期胚胎发育的营养物质的高通量筛选细胞模型及其构建与应用
<130> GI20210109
<141> 2021-05-19
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1009
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctgtagccac cagcctacta ctccagagcc acagcaactc agaatctcag ccgcatctgc 60
aacctatacc acagctcaca gcaacgccgg atccttaacc cgctgagcaa ggccagggtt 120
cgaacccgca acctcatggt tcctagtcgg attcgttaac cactgcgcca cgacgggaac 180
tcctgaattt tgtttttaaa agtacatttg tacaaaaaaa aaagcttaga aagttgtatg 240
cagtaaacga tagtttggtg tgtgtgtggt gggggaggcg atggcagtgg ggagccacga 300
taactgtttt cttttaatca taactgtaca tctctttatt gttcactttt aggaacgctt 360
ctataattgc tactctataa tagcaggggg aaaaaagtgc atatttaaag tagctatact 420
ctttaggcgc atggtggctc ttcctcctag aaggctggat ttccgtttca ccttcacttt 480
caaggctgta aatgtcccat ccctcaagcg ggaaattgat gaggcaccac aaagccacct 540
caacgacccc cccccaagcc taggcctgac cttcacactt gccccgactt gtctaacgtc 600
cgggcgccgg aacacgacaa aaaggcgggg agccccgcag gatgcctatc agcaggccct 660
cgttaggcgc aagattcctg ccccgcccct acgcccacac tctccaatgg atgttcgggg 720
tgggacgggc ttcatgtgga gcagggacac gattggctcc gcagcctctc cgcccaggca 780
gtgggcgggg cagcgtggtg acgtagccat gaagggcgtg ggggcgtagc gcgcgctcgc 840
agacgcggct gtattaaacc gctgcaggcg cggccggctg gcagtgtgcg tcctccggtt 900
caggctctgt tgtggtgttt tcctgctctc tctcaacttc tgaagcctaa gccggctact 960
ccttccttct ttcttccacc tgtagccgcg tcgttgtgat tccaccacc 1009

Claims (10)

1.一种调节猪早期胚胎发育的营养物质的高通量筛选细胞模型，其特征在于，所述高通量筛选细胞模型的构建方法为：
(1)pGF-promoter载体构建：将猪PCNA基因启动子克隆至pGF-mCMV-EF1-Neo慢病毒载体中，获得pGF-promoter载体；
(2)转染HEK-293T细胞：将pGF-promoter载体和pMD2.g、psPAX2共转染HEK-293T细胞，孵育，收集慢病毒上清液；
(3)感染pTr细胞：用慢病毒感染pTr细胞；
(4)G418筛选稳转株：用G418筛选培养基培养pTr细胞，最终获得pTr-PCNA promoter-Luciferase稳转细胞株，其命名为pTr-luc。
2.根据权利要求1所述的高通量筛选细胞模型，其特征在于，所述猪PCNA基因启动子的序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1或2所述的高通量筛选细胞模型，其特征在于，所述步骤(2)中pGF-promoter载体和pMD2.g、psPAX2的浓度比例为pGF-promoter：psPAX2：pMD2.g＝(2-5)：(2-3)：(1-2)。
4.根据权利要求3所述的高通量筛选细胞模型，其特征在于，所述pGF-promoter载体和pMD2.g、psPAX2的浓度比例为pGF-promoter：psPAX2：pMD2.g＝5：3：2。
5.根据权利要求1-4任一项所述的高通量筛选细胞模型，其特征在于，所述pGF-promoter载体和pMD2.g、psPAX2共转染HEK-293T细胞采用的转染试剂为purefection。
6.根据权利要求1-5任一项所述的高通量筛选细胞模型，其特征在于，所述步骤(4)中G418筛选培养基的筛选浓度为550μg/mL-700μg/mL。
7.根据权利要求6所述的高通量筛选细胞模型，其特征在于，所述步骤(4)中G418筛选培养基的筛选浓度为650μg/mL。
8.根据权利要求1-7任一项所述的高通量筛选细胞模型，其特征在于，所述步骤(4)中G418筛选培养基培养pTr细胞的培养时间为3周-6周；优选为4周。
9.根据权利要求1-8任一项所述的高通量筛选细胞模型，其特征在于，所述高通量筛选细胞模型可筛选出能够激活pTr细胞PCNA基因启动子的营养物质物质。
10.根据权利要求1-9任一项所述的高通量筛选细胞模型，其特征在于，所述营养物质为白藜芦醇、芹菜素、维生素A棕榈酸酯、维生素B6、7-羟基黄酮、丹蒽醌和高良姜素。
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