CN113278047A - 选用新鲜鹿茸提取复合活性多肽的加工方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种选用新鲜鹿茸提取复合活性多肽的加工方法，其包括对鹿茸进行初步清洁去血水去皮毛以及切片等前处理，对切片进行震动灌洗分离细胞悬液和基质残渣，然后分别对细胞悬液和基质残渣进行提取，然后通过酶解形成小分子肽结构更易于吸收，其中，对细胞悬液进行精提，对基质残渣进行多次粗提的方式，提高鹿茸多肽的含量及纯度，同时保留了多种协同增益成分。

Description

选用新鲜鹿茸提取复合活性多肽的加工方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其是一种选用新鲜鹿茸提取复合活性多肽的加工方法。
背景技术
关节病变，是现代人群的常见病，尤其是随着工作状态的转变，上班族们处于长期久坐、工作压力大、长时间熬夜的工作状态，越来越多的人时常会出现关节异响的状况。长久的伏案久坐，容易造成关节间产生的润滑液少，加大关节摩擦的损耗，久而久之，会加重对软骨的磨损，而软骨磨损过度则可能引发退行性关节炎，加重身体的负担。
关节软骨是一种特殊的结缔组织，它覆盖在关节的负重关节面上，关节软骨有维持功能的基质和软骨细胞构成。基质中主要有水、胶原和蛋白多糖。胶原纤维具有很强的张力，而蛋白多糖，是一类大分子蛋白多糖聚合物，大分子的糖蛋白通过吸收与挤出水分来调节所承受的压力，关节腔液起到润滑作用，减少关节软骨表面在运动时的摩擦。
多数人认为关节软骨缺乏独立的再生修复能力，而修复主要靠邻近疏松结缔组织的化生，形成纤维样软骨。但有研究表明，成年人软骨细胞仍保留小的增生能力，关节软骨的基质也能再形成。覆在除关节面以外的骨外表明上的骨外膜包括两层，其外层由致密的结缔组织构成，而其内层则含有幼稚的骨原细胞，该骨原细胞既可以分化为软骨细胞形成软骨，也可以分化为骨细胞形成骨，而这两种分化能力则取决于环境影响。（中华外科杂志1989年第27卷第10期594页，关节软骨缺损修复的研究进展）。鹿茸为鹿科动物梅花鹿或马鹿的雄鹿密生茸毛的未骨化的幼角,药物分析表明,鲜鹿茸提取物中含有多种具有重要生理活性的物质,如鲜鹿茸胰岛素样生长因子（IGF-1）、鲜鹿茸生长激素（HGH）、鲜鹿茸促生长释放因子（GHRF-6）、鲜鹿茸表皮生长因子(EGF) 、鲜鹿茸神经生长因子（NGF）、鲜鹿茸成纤维生长因子(FGF)等，这类生物活性因子，对人体的伤口愈合、延缓细胞凋亡等具有重要作用。有研究（修忠标，孙磊等．鹿茸多肽对实验性膝骨性关节炎软骨细胞凋亡及相关细胞因子的影响[J]．中国骨伤．2012．25(5)：418-423.）表明：鹿茸多肽（鹿茸多肽是从梅花鹿茸中提取的一种多肽类生物活性因子，为鹿茸的主要活性成分）可抑制膝骨性关节炎过程中软骨细胞凋亡，降低关节液中白细胞介素——lβ和肿瘤坏死因子——α的水平，一定程度上延缓关节软骨的退变。
然而，现有鹿茸多肽的提取方法存在以下不足：
(1)传统的，采用加热、强酸或酶蛋白水解新鲜鹿茸所得到的鹿茸多肽，该方法虽然可以获得含量较高、得率较高的鹿茸多肽，但其制备条件使得所得鹿茸多肽在很大程度上失去了天然生物活性，大大降低了生物应用效果；(2)常规的，采用酸醇法提取分离所得鹿茸多肽，其分子构象、天然特性等较传统方法较多保留、生物学活性也有所提高，但酸醇法所得鹿茸多肽较为粗糙、纯度不高、且含有较多不溶性杂质和皮质类固醇激素及性激素，这些直接应用存在过敏风险和其他副作用等；(3)采用柱层析法或高效液相进一步纯化，虽能得到分子量分布均一性较好、纯度较高、生物活性较好的鹿茸多肽，但其剔除了其它成分、包括具有协同增效的功效成分，使其在实际应用中效果大打折扣；此外，鹿茸多肽在液体中不易保存、且易于降解氧化、生物活性也大大降低。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种选用新鲜鹿茸提取复合活性多肽的加工方法，该方法提取的鹿茸多肽具有纯度高，同时还保留了协同增效的其他成分。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种选用新鲜鹿茸提取物制备复合活性多肽食品的加工方法，其特征在于，包括以下步骤：①将所获得的新鲜鹿茸清洗、其血水、去皮毛处理后切成薄片，②将鹿茸薄片按片状间隔排列于清洗管中，将清洗管的灌液口打开，清洗管另一端的排气孔连接抽气泵，清洗管中被抽真空后，与灌液口连接的清洗液灌入清洗管中充满鹿茸薄片，关闭灌液口后对清洗管来回震动10-15min，然后，抽取清洗液，将鹿茸薄片灌注清洗3次，然后将收集的清洗液合并获得含有细胞成分的细胞悬液，收集清洗管中的鹿茸残片形成基质残渣，③将细胞悬液离心处理，去除上清液，沉淀物用生理盐水离心洗涤2-3次，去除上清液，收集沉淀物后加入纯净水，通过超声处理静置20h，然后进行层析提纯，收集洗脱液，④将基质残渣过滤得到第一滤液和第一滤渣；将第一滤渣加入氢氧化钠溶液，在超声震荡条件下浸泡2-5h，过滤得到第二滤液和第二滤渣；第二滤渣继续加水蒸煮2h后过滤得到第三滤渣和第三滤液；用盐酸或硫酸溶液在超声震荡条件下浸泡第三滤渣2-5h，过滤得到第四滤液和第四滤渣；将第四滤渣用纯净水煎煮，过滤得到第五滤液；⑤将步骤③中收集的洗脱液合并第一、第二、第三、第四、第五滤液，然后加入消化酶酶解得到酶解液，将酶解液真空冻干，形成复合活性多肽提取物。
上述结构中，新鲜鹿茸通过切薄片后，经灌洗震动分离细胞和基质后，对分离出的细胞悬液进行离心超声破碎，使得蛋白成分得到释放，通过层析提纯获得纯度较高的提取物，同时，基质部分进行过滤分离滤液和滤渣，在超声震荡条件下，使得基质中或细胞间物质被溶解提取出来，基质部分有效成分的提取采用粗提的方式获取，其目的在于保留更多的有效增益成分，通过两种方式分别提取，既可以获得高纯的鹿茸多肽，又能减少其增益成分的流失。
进一步的，所述步骤①中将所获得的新鲜鹿茸经纯净水清洗外表面，刮去表面绒毛,对新鲜鹿茸断面处用乙醇清洗消毒，用切片机切成厚度为1-3cm块状，用20℃～25℃的乙醇浸润36-48h,用清水洗净,沥干,切成0.35-0.75cm的薄片。
上述结构中，首先对新鲜鹿茸做初步的清洗消毒，切成块状后，用乙醇浸润，可以起到胀大和软化鹿茸的作用，使其更易于切成薄片，切成薄片后，可以更有利于基质于细胞成分的分离。
进一步的，所述步骤②中，排列于清洗管中的鹿茸薄片之间的间隔空隙不小于3cm。
上述结构中，使得鹿茸薄片与薄片之间留有一段空隙充满清洗液，在来回震动的过程中使得薄片会受到左右两边一定的冲击，从而使得细胞成分更完全的脱离。
进一步的，所述清洗液采用质量浓度为0.2%的SDS溶液或质量浓度为0.2%的TritonX-100溶液。
进一步的，所述步骤③中，将细胞悬液以3000-3500r/min速度离心处理15min后去除上清液，沉淀物中加入质量浓度为25％-35％的生理盐水以3000-3500r/min速度离心洗涤2-3次，去除上清液，收集沉淀物后加入纯净水，通过超声处理静置20h，收集提取液。
上述结构中，获得的细胞悬液通过超声破碎，使其内部蛋白释放出来，通过酶解使其转化成小分子肽。
进一步的，所述步骤④中，氢氧化钠的质量浓度为0.2%，所述盐酸或硫酸溶液的质量浓度为0.2%。
进一步的，所述步骤⑤中消化酶包括胰蛋白酶，胰蛋白酶的酶解pH条件为8-10。
进一步的，所述步骤⑤中消化酶包括胃蛋白酶，胃蛋白酶的酶解pH条件为2-3。
采用上述方案，本发明在对鹿茸进行清洁去血水去皮毛以及切片等前处理后，对切片进行震动灌洗分离细胞悬液和细胞外基质结构，然后分别对细胞悬液和基质残渣进行提取，通过酶解形成小分子肽结构更易于吸收，其中，对细胞悬液进行精提，对基质残渣进行多次粗提的方式，提高鹿茸多肽的含量及纯度，同时保留了多种协同增益成分。此外，为了促进软骨的生长，给其提供一个营养充分的生长环境，还可以添加促进钙质吸收的成分如络蛋白磷酸肽、维生素D3等、以及促进润滑液生成的软骨素、氨糖等成分，当然在制成药剂、口服液、片剂时可以加适量的防腐剂。
下面结合实施例对本发明作进一步描述。
具体实施方式
本发明不局限于下列具体实施方式，本领域一般技术人员根据本发明公开的内容，可以采用其他多种具体实施方式实施本发明的，或者凡是采用本发明的设计结构和思路，做简单变化或更改的，都落入本发明的保护范围。
实施例一
选取100g新鲜鹿茸作为原料，①将所获得的新鲜鹿茸经纯净水清洗外表面，刮去表面绒毛,对新鲜鹿茸断面处用体积分数为75%的乙醇清洗消毒，用切片机切成厚度为1.4cm块状，用25℃、体积分数为85%的乙醇浸润48h,用清水洗净,沥干,切成0.35的薄片；②将鹿茸薄片按片状间隔排列于清洗管中，将清洗管的灌液口打开，清洗管另一端的排气孔连接抽气泵，清洗管中被抽真空后，与灌液口连接的清洗液灌入清洗管中充满鹿茸薄片，清洗液采用200ml质量浓度为0.2%的SDS溶液或质量浓度为0.2%的TritonX-100溶液，关闭灌液口后对清洗管来回震动10-15min，震动频率20KHz，其中，薄片与薄片之间的间隔空隙为3cm，使得薄片与薄片之间留有一段空隙充满清洗液，在来回震动的过程中使得薄片会受到左右两边一定的冲击，从而使得细胞成分更完全的脱离；结束后，抽取清洗液，将鹿茸薄片按上述步骤②重复灌注清洗3次，然后将收集的3次清洗液合并获得含有细胞成分的细胞悬液，收集清洗管中的鹿茸残片形成基质残渣，然后分别处理细胞悬液和基质残渣；③将细胞悬液以3500r/min速度离心处理15min后去除上清液，沉淀物中加入质量浓度为35％的生理盐水以3500r/min速度离心洗涤2-3次，去除上清液，收集沉淀物后加入100ml纯净水，通过100W超声处理15min，静置20h，然后进行层析提纯，以pH4.5 HAc-NaAc 缓冲液充分平衡，以3ml/min 流速将样品加入柱内，并以12ml/min 的流速分别用PH4.5 HAc-NaAc 缓冲液、PH5.0 HAc-NaAc 缓冲液洗脱，收集活性峰洗脱液，④将基质残渣过滤得到第一滤液和第一滤渣；将第一滤渣加入200ml质量浓度为0.2%的氢氧化钠溶液，在频率为20KHz的超声震荡条件下浸泡2h，过滤得到第二滤液和第二滤渣；第二滤渣继续加100ml纯净水水蒸煮2h后过滤得到第三滤渣和第三滤液；用100ml质量浓度为0.2%的盐酸溶液在超声震荡条件下浸泡第三滤渣2h，过滤得到第四滤液和第四滤渣；将第四滤渣用100ml纯净水煎煮，过滤得到第五滤液；⑤将步骤③中收集的洗脱液合并第一、第二、第三、第四、第五滤液，然后加入0.5g胰蛋白酶，调节溶液pH为8，35℃酶解5h后得到酶解液，将酶解液真空冻干，形成冻干片。
实施例二
选取100g新鲜鹿茸作为原料，①将所获得的新鲜鹿茸经纯净水清洗外表面，刮去表面绒毛,对新鲜鹿茸断面处用体积分数为75%的乙醇清洗消毒，用切片机切成厚度为1.5cm块状，用20℃的体积分数为85%的乙醇浸润48h,用清水洗净,沥干,切成0.75cm的薄片；②将鹿茸薄片按片状间隔排列于清洗管中，将清洗管的灌液口打开，清洗管另一端的排气孔连接抽气泵，清洗管中被抽真空后，与灌液口连接的清洗液灌入清洗管中充满鹿茸薄片，清洗液采用200ml质量浓度为0.2%的SDS溶液，关闭灌液口后对清洗管来回震动10-15min，震动频率20Hz，其中，薄片与薄片之间的间隔空隙为3cm，使得薄片与薄片之间留有一段空隙充满清洗液，在来回震动的过程中使得薄片会受到左右两边一定的冲击，从而使得细胞成分更完全的脱离；结束后，抽取清洗液，将鹿茸薄片按上述步骤②重复灌注清洗3次，然后将收集的3次清洗液合并获得含有细胞成分的细胞悬液，收集清洗管中的鹿茸残片形成基质残渣，然后分别处理细胞悬液和基质残渣；③将细胞悬液以3500r/min速度离心处理15min后去除上清液，沉淀物中加入质量浓度为35％的生理盐水以3500r/min速度离心洗涤2-3次，去除上清液，收集沉淀物后加入100ml纯净水，通过100W超声处理15min，静置20h，然后进行层析提纯，以pH4.5 HAc-NaAc 缓冲液充分平衡，以3ml/min 流速将样品加入柱内，并以12ml/min 的流速分别用PH4.5 HAc-NaAc 缓冲液、PH5.0 HAc-NaAc 缓冲液洗脱，收集活性峰洗脱液；④将基质残渣过滤得到第一滤液和第一滤渣；将第一滤渣加入200ml质量浓度为0.2%的氢氧化钠溶液，在频率20KHz超声震荡条件下浸泡5h，过滤得到第二滤液和第二滤渣；第二滤渣继续加100ml纯净水水蒸煮2h后过滤得到第三滤渣和第三滤液；用100ml质量浓度为0.2%的盐酸溶液在同频率的震荡条件下浸泡第三滤渣5h，过滤得到第四滤液和第四滤渣；将第四滤渣用100ml纯净水煎煮，过滤得到第五滤液；⑤将步骤③中收集的洗脱液合并第一、第二、第三、第四、第五滤液，然后加入0.5g胃蛋白酶，调节pH为3，35℃下酶解5h后得到酶解液，将酶解液真空冻干，形成冻干片。
实施例三
选取100g新鲜鹿茸作为原料，①将所获得的新鲜鹿茸经纯净水清洗外表面，刮去表面绒毛,对新鲜鹿茸断面处用体积分数为75%的乙醇清洗消毒，用切片机切成厚度为1cm块状，用25℃、体积分数为85%的乙醇浸润48h,用清水洗净,沥干,切成0.5的薄片；②将鹿茸薄片按片状间隔排列于清洗管中，将清洗管的灌液口打开，清洗管另一端的排气孔连接抽气泵，清洗管中被抽真空后，与灌液口连接的清洗液灌入清洗管中充满鹿茸薄片，清洗液采用200ml质量浓度为0.2%的TritonX-100溶液，关闭灌液口后对清洗管来回震动10-15min，震动频率20KHz，其中，薄片与薄片之间的间隔空隙为3cm，使得薄片与薄片之间留有一段空隙充满清洗液，在来回震动的过程中使得薄片会受到左右两边一定的冲击，从而使得细胞成分更完全的脱离；结束后，抽取清洗液，将鹿茸薄片按上述步骤②重复灌注清洗3次，然后将收集的3次清洗液合并获得含有细胞成分的细胞悬液，收集清洗管中的鹿茸残片形成基质残渣，然后分别处理细胞悬液和基质残渣；③将细胞悬液以3500r/min速度离心处理15min后去除上清液，沉淀物中加入质量浓度为35％的生理盐水以3500r/min速度离心洗涤2-3次，去除上清液，收集沉淀物后加入100ml纯净水，通过100W超声处理15min，静置20h，然后进行层析提纯，以pH4.5 HAc-NaAc 缓冲液充分平衡，以3ml/min 流速将样品加入柱内，并以12ml/min 的流速分别用PH4.5 HAc-NaAc 缓冲液、PH5.0 HAc-NaAc 缓冲液洗脱，收集活性峰洗脱液；④将基质残渣过滤得到第一滤液和第一滤渣；将第一滤渣加入200ml质量浓度为0.2%的氢氧化钠溶液，在频率为20KHz的超声震荡条件下浸泡2h，过滤得到第二滤液和第二滤渣；第二滤渣继续加100ml纯净水水蒸煮2h后过滤得到第三滤渣和第三滤液；用100ml质量浓度为0.2%的盐酸溶液在超声震荡条件下浸泡第三滤渣2h，过滤得到第四滤液和第四滤渣；将第四滤渣用100ml纯净水煎煮，过滤得到第五滤液；⑤将步骤③中收集的洗脱液合并第一、第二、第三、第四、第五滤液，然后加入0.5g胰蛋白酶，调节溶液pH为8，35℃酶解5h后得到酶解液，将酶解液真空冻干，形成冻干片。
取上述实施例三中300ml酶解液进行检测，得到如下表1所示成分：
表1-酶解液中成分及含量
名称 单位 实测值 检出限
亮氨酸 g/100ml 0.13 0.0014
缬氨酸 g/100ml 0.094 0.00013
谷氨酸 g/100ml 0.28 0.00028
苏氨酸 g/100ml 0.058 0.00019
脯氨酸 g/100ml 0.24 0.0035
组氨酸 g/100ml 0.046 0.00079
蛋氨酸 g/100ml 0.0041 0.0030
甘氨酸 g/100ml 0.42 0.00034
精氨酸 g/100ml 0.14 0.0026
丙氨酸 g/100ml 0.22 0.0039
丝氨酸 g/100ml 0.074 0.00024
天门冬氨酸 g/100ml 0.17 0.00014
苯丙氨酸 g/100ml 0.08 0.0033
异亮氨酸 g/100ml 0.056 0.00050
酪氨酸 g/100ml 0.0056 0.0038
赖氨酸 g/100ml 0.12 0.00018
盐酸氨基葡萄糖 g/100ml 10.4 -
肽含量 g/100ml 2.31 -
镁 mg/L 36.9 5
本发明将新鲜鹿茸切薄片，将其中的细胞结构和外基质结构分离后分别进行提取，可以有效保留组织中所含的其他增益成分，且可以得到纯度高的鹿茸多肽；由上表1检测可知，本发明提取的复合活性多肽中，不仅其含量高，同时还保留了多种协同增益的有效成分。

Claims (8)

1.一种选用新鲜鹿茸提取复合活性多肽的加工方法，其特征在于，包括以下步骤：①将所获得的新鲜鹿茸清洗、其血水、去皮毛处理后切成薄片，②将鹿茸薄片按片状间隔排列于清洗管中，将清洗管的灌液口打开，清洗管另一端的排气孔连接抽气泵，清洗管中被抽真空后，与灌液口连接的清洗液灌入清洗管中充满鹿茸薄片，关闭灌液口后对清洗管来回震动10-15min，然后，抽取清洗液，将鹿茸薄片灌注清洗3次，然后将收集的清洗液合并获得含有细胞成分的细胞悬液，收集清洗管中的鹿茸残片形成基质残渣，③将细胞悬液离心处理，去除上清液，沉淀物用生理盐水离心洗涤2-3次，去除上清液，收集沉淀物后加入纯净水，通过超声处理静置20h，然后进行层析提纯，收集洗脱液，④将基质残渣过滤得到第一滤液和第一滤渣；将第一滤渣加入氢氧化钠溶液，在超声震荡条件下浸泡2-5h，过滤得到第二滤液和第二滤渣；第二滤渣继续加水蒸煮2h后过滤得到第三滤渣和第三滤液；用盐酸或硫酸溶液在超声震荡条件下浸泡第三滤渣2-5h，过滤得到第四滤液和第四滤渣；将第四滤渣用纯净水煎煮，过滤得到第五滤液；⑤将步骤③中收集的洗脱液合并第一、第二、第三、第四、第五滤液，然后加入消化酶酶解得到酶解液，将酶解液真空冻干，形成复合活性多肽提取物。
2.根据权利要求1中的选用新鲜鹿茸提取复合活性多肽的加工方法，其特征在于：所述步骤①中将所获得的新鲜鹿茸经纯净水清洗外表面，刮去表面绒毛,对新鲜鹿茸断面处用乙醇清洗消毒，用切片机切成厚度为1-3cm块状，用20℃～25℃的乙醇浸润36-48h,用清水洗净,沥干,切成0.35-0.75cm的薄片。
3.根据权利要求1或2所述的选用新鲜鹿茸提取复合活性多肽的加工方法，其特征在于：所述步骤②中，排列于清洗管中的鹿茸薄片之间的间隔空隙不小于3cm。
4.根据权利要求3所述的选用新鲜鹿茸提取复合活性多肽的加工方法，其特征在于：所述清洗液采用质量浓度为0.2%的SDS溶液或质量浓度为0.2%的TritonX-100溶液。
5.根据权利要求1所述的选用新鲜鹿茸提取复合活性多肽的加工方法，其特征在于：所述步骤③中，将细胞悬液以3000-3500r/min速度离心处理15min后去除上清液，沉淀物中加入质量浓度为25％-35％的生理盐水以3000-3500r/min速度离心洗涤2-3次，去除上清液，收集沉淀物后加入纯净水，通过超声处理静置20h，收集提取液。
6.根据权利要求1所述的选用新鲜鹿茸提取复合活性多肽的加工方法，其特征在于：所述步骤④中，氢氧化钠的质量浓度为0.2%，所述盐酸或硫酸溶液的质量浓度为0.2%。
7.根据权利要求1所述的选用新鲜鹿茸提取复合活性多肽的加工方法，其特征在于：所述步骤⑤中消化酶包括胰蛋白酶，胰蛋白酶的酶解pH条件为8-10。
8.根据权利要求1所述的选用新鲜鹿茸提取复合活性多肽的加工方法，其特征在于：所述步骤⑤中消化酶包括胃蛋白酶，胃蛋白酶的酶解pH条件为2-3。
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