CN113278022A - 吡唑并嘧啶化合物和药物组合物及其应用 - Google Patents

吡唑并嘧啶化合物和药物组合物及其应用 Download PDF

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CN113278022A CN202110756784.0A CN202110756784A CN113278022A CN 113278022 A CN113278022 A CN 113278022A CN 202110756784 A CN202110756784 A CN 202110756784A CN 113278022 A CN113278022 A CN 113278022A
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Abstract

本发明涉及生物医药领域，公开了吡唑并嘧啶化合物和药物组合物及其应用，该化合物具有式(I)所示结构。本发明提供的具有式(I)所示结构的化合物对TRK激酶表现出优异的抑制活性，同时，在动物水平上表现出良好的抗肿瘤活性。

Description

吡唑并嘧啶化合物和药物组合物及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及吡唑并嘧啶化合物和药物组合物及其应用。
背景技术
NTRK/TRK(Tropomyosin receptor kinase)为祌经营养因子酪氨酸受体，隶属于受体酪氨酸激酶家族。TRK家族主要包括3个成员，NTRK1/TRKA，NTRK2/TRKB和NTRK3/TRKC。完整的TRK激酶包括胞外区、跨膜区和胞内区三个部分。TRK激酶的胞外区与相应的配体结合之后，能够引起激酶构型变化，形成二聚体。TRK激酶的胞内区发生自体磷酸化从而激活自身的激酶活性，进而进一步激活下游的信号转导通路(如MAPK，AKT，PKC等)，产生相应的生物学功能；其中NGF(神经生长因子)结合TRKA，BDNF(衍生的神经营养因子)结合TRKB，以及NT3(神经营养因子3)结合TRKC。
TRK激酶在神经的发育过程中发挥重要的生理功能，包括神经元轴突的生长与功能维持、记忆的发生发展以及保护神经元免受伤害等等。同时，大量的研究表明TRK信号转导通路的活化与肿瘤的发生发展密切相关，在神经细胞瘤、前列腺癌、乳腺癌等中都发现了活化的TRK信号蛋白。
近几年来多种TRK融合蛋白的发现，更显示了其促进肿瘤发生的生物学功能。
因此，近几年来，TRK融合蛋白己经成为一个有效的抗癌靶点和研究热点，例如WO2010048314、WO2012116217、WO2011146336、W02010033941、WO2018077246等均公开了具有不同结构类型的TRK激酶抑制剂。
此外，持续给药后出现的靶标突变是肿瘤产生耐药性的重要原因，近期临床上已经出现了TRK突变的病例，如TRKA G595R和G667C的突变(Russo M等.Cancer Discovery,2016,6(1)，36-44)、TRKC G623R的突变(Drilon A.等Annals of Oncology 2016,27(5),920-926)，而寻找新的TRK激酶抑制剂有望解决TRK突变引起的肿瘤耐药性问题。
发明内容
本发明的目的是提供新化合物以解决TRK突变引起的肿瘤耐药性问题。
为了实现上述目的，本发明的第一方面提供一种具有式(I)所示结构的吡唑并嘧啶化合物或其药学上可接受的盐，或其立体异构体、几何异构体、互变异构体、氮氧化物、水合物、溶剂化物、代谢产物，或其前药，
其中，在式(I)中，
Figure BDA0003147968380000023
R1选自C1-3的烷基、由1-3个卤素取代的C1-3的烷基；
R2选自H、C1-3的烷基；
R3选自C1-3的烷基；
R4为式(1)或式(2)所示的基团，
Figure BDA0003147968380000021
在式(1)和式(2)中，R41和R42各自独立地为H、C1-3的烷基、-(C1-3的烷基)-OH或
Figure BDA0003147968380000022
本发明的第二方面提供一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂，以及作为活性成分的前述第一方面中所述的具有式(I)所示结构的吡唑并嘧啶化合物或其药学上可接受的盐，或其立体异构体、几何异构体、互变异构体、氮氧化物、水合物、溶剂化物、代谢产物，或其前药。
本发明的第三方面提供前述具有式(I)所示结构的吡唑并嘧啶化合物或其药学上可接受的盐，或其立体异构体、几何异构体、互变异构体、氮氧化物、水合物、溶剂化物、代谢产物，或其前药在制备用于预防和/或治疗TRK酪氨酸激酶受体介异的疾病的药物中的应用。
本发明的第四方面提供第二方面所述的药物组合物在制备用于预防和/或治疗TRK酪氨酸激酶受体介异的疾病的药物中的应用。
本发明的第五方面提供前述第一方面所述的具有式(I)所示结构的吡唑并嘧啶化合物或其药学上可接受的盐，或其立体异构体、几何异构体、互变异构体、氮氧化物、水合物、溶剂化物、代谢产物，或其前药，或者前述第二方面所述的药物组合物在制备用于预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
本发明提供的具有式(I)所示结构的吡唑并嘧啶化合物或其药学上可接受的盐，或其立体异构体、几何异构体、互变异构体、氮氧化物、水合物、溶剂化物、代谢产物，或其前药对野生型和突变的TRK激酶表现出优异的抑制活性，同时，在动物水平上表现出良好的抗肿瘤活性。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
在没有相反说明的情况下，本发明所述C1-3的烷基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基。
在没有相反说明的情况下，本发明所述卤素包括氟、氯、溴、碘。
在没有相反说明的情况下，本发明所述由1-3个卤素取代的C1-3的烷基包括但不限于-CH2X、-CHX2、-CX3、-CH2CH2X、-CH2CHX2、-CH2CX3、-CH2CH2CH2X、-CH2CH2CHX2、-CH2CH2CX3，其中的各个X任意地为氟、氯、溴或碘。
在没有相反说明的情况下，本发明所述-(C1-3的烷基)-OH表示C1-3的烷基提供的结构直接与母核连接，且C1-3的烷基的自由末端上的一个H由-OH取代。
在没有相反说明的情况下，本发明“------”表示连接键，也即基团通过该连接键所在位置与母核结构连接。
在没有相反说明的情况下，在本发明列举的具体化合物中，未标示手性中心具体构型的化合物，即表示为外消旋体。
如前所述，本发明的第一方面提供了一种具有式(I)所示结构的吡唑并嘧啶化合物或其药学上可接受的盐，或其立体异构体、几何异构体、互变异构体、氮氧化物、水合物、溶剂化物、代谢产物，或其前药，
Figure BDA0003147968380000041
其中，在式(I)中，
R1选自C1-3的烷基、由1-3个卤素取代的C1-3的烷基；
R2选自H、C1-3的烷基；
R3选自C1-3的烷基；
R4为式(1)或式(2)所示的基团，
Figure BDA0003147968380000051
在式(1)和式(2)中，R41和R42各自独立地为H、C1-3的烷基、-(C1-3的烷基)-OH或
Figure BDA0003147968380000052
根据一种优选的具体实施方式，在式(I)中，
R1选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、由1-3个F取代的C1-3的烷基；
R2选自H、甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基；
R3选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基；
R4为式(1)或式(2)所示的基团，
Figure BDA0003147968380000053
在式(1)和式(2)中，R41和R42各自独立地为H、甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、-(CH2)-OH、-(CH2CH2)-OH或
Figure BDA0003147968380000054
根据一种特别优选的具体实施方式，在式(I)中，
R1选自-CH2CF2H、-CH2CF3、-CH2CFH2、-CF2H、-CH3；
R2选自H、-CH3、
Figure BDA0003147968380000055
-CH2CH3；
R3选自-CH3、
Figure BDA0003147968380000056
R4为式(1)所示的基团，
Figure BDA0003147968380000061
在式(1)中，R41为H、-(CH2CH2)-OH、
Figure BDA0003147968380000062
根据另一种特别优选的具体实施方式，在式(I)中，
R1选自-CH2CF2H、-CH2CF3、-CH2CFH2、-CF2H、-CH3；
R2选自H、-CH3、
Figure BDA0003147968380000063
-CH2CH3；
R3选自-CH3、
Figure BDA0003147968380000064
R4为式(2)所示的基团，
Figure BDA0003147968380000065
在式(2)中，R42为H或-CH3。
根据一种最优选的具体实施方式，所述吡唑并嘧啶化合物为以下化合物中的至少一种：
Figure BDA0003147968380000066
Figure BDA0003147968380000071
Figure BDA0003147968380000081
本发明对制备具有式(I)所示结构的吡唑并嘧啶化合物的方法没有特别的限定，例如可以采用如下制备方法获得：
Figure BDA0003147968380000082
上述制备方法中涉及的是Suzuki偶联反应，对所述偶联反应的反应条件没有特别的限定，本领域技术人员可以根据有机合成领域内的公知常识以及本发明实施例部分提供的具体实例获得适宜的反应条件。
如前所述，本发明的第二方面提供了一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂，以及作为活性成分的前述第一方面中所述的具有式(I)所示结构的吡唑并嘧啶化合物或其药学上可接受的盐，或其立体异构体、几何异构体、互变异构体、氮氧化物、水合物、溶剂化物、代谢产物，或其前药。
如前所述，本发明的第三方面提供了前述具有式(I)所示结构的吡唑并嘧啶化合物或其药学上可接受的盐，或其立体异构体、几何异构体、互变异构体、氮氧化物、水合物、溶剂化物、代谢产物，或其前药在制备用于预防和/或治疗TRK酪氨酸激酶受体介异的疾病的药物中的应用。
如前所述，本发明的第四方面提供了第二方面所述的药物组合物在制备用于预防和/或治疗TRK酪氨酸激酶受体介异的疾病的药物中的应用。
如前所述，本发明的第五方面提供了前述第一方面所述的具有式(I)所示结构的吡唑并嘧啶化合物或其药学上可接受的盐，或其立体异构体、几何异构体、互变异构体、氮氧化物、水合物、溶剂化物、代谢产物，或其前药，或者前述第二方面所述的药物组合物在制备用于预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
优选情况下，所述肿瘤为乳腺癌、大肠癌、肺癌、甲状腺癌、皮肤癌、白血病、唾液腺肿瘤、神经内分泌肿瘤、淋巴瘤、脑肿瘤、成神经细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、间皮瘤、食管癌、肺肉瘤、成神经管细胞瘤、成胶质细胞瘤、结肠癌、肝癌、成视网膜细胞瘤、肾癌、膀胱癌、骨肉瘤、胃癌、子宫癌、外阴癌、小肠癌、前列腺癌、胆管癌、输尿管癌、肾上腺皮质癌或头颈部癌症的至少一种。
以下将通过实例对本发明进行详细描述。以下实例中，在没有特别说明的情况下，使用的各种原料均来自商购。
在没有特别说明的情况下，以下所述的室温表示25±3℃。
实施例1：(R)-N-(1-(2-(2-(2,2-二氟乙氧基)-5-氟苯基)乙基)-N-甲基-3-(1H-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-胺的制备
Figure BDA0003147968380000091
1)(R)-N-(1-(2-(2-(2,2-二氟乙氧基)-5-氟苯基)乙基)甲酰胺的制备
将(R)-1-(2-(2,2-二氟乙氧基)-5-氟苯基)乙烷-1-胺盐酸盐(19.5mmol)、三乙胺(48.8mmol)甲酸乙酯(50mL)加入至单口圆底烧瓶中，回流反应4h。TLC监测反应原料转化完全。减压脱除溶剂得淡黄色油状液体粗品，收率：94％。
2)(R)-1-(2-(2,2-二氟乙氧基)-5-氟苯基)-N-甲基-1-胺的制备
将(R)-N-(1-(2-(2-(2,2-二氟乙氧基)-5-氟苯基)乙基)甲酰胺(17.4mmol)、硼氢化钠(52.2mmol)和四氢呋喃(THF，50mL)加入至单口圆底烧瓶中室温搅拌，冰浴下滴加三氟化硼乙醚(17.4mmol)，滴加完毕后移走冰浴，油浴加热回流反应过夜。TLC监测反应原料转化完全。将反应冷却至室温，用乙酸乙酯(500mL)将反应体系稀释并转移至分液漏斗中，饱和食盐水(100mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩后得淡黄色油状液体，收率91％。
3)(R)-N-(1-(2-(2-(2,2-二氟乙氧基)-5-氟苯基)乙基)-N-甲基吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-胺的制备
在单口圆底烧瓶中加入5-氯吡唑并[1,5-a]嘧啶(19.5mmol)，(R)-1-(2-(2,2-二氟乙氧基)-5-氟苯基)-N-甲基-1-胺(15.1mmol)，无水正丁醇(30mL)和N，N-二异丙基乙胺(DIPEA，58.5mmol)。油浴加热回流反应过夜。TLC监测反应原料转化完全。将反应冷却至环境温度，减压浓缩后，残余物经柱层析纯化得淡黄色粘稠状液体，收率65％。
4)(R)-N-(1-(2-(2-(2,2-二氟乙氧基)-5-氟苯基)乙基)-3-碘-N-甲基吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-胺的制备
将(R)-N-(1-(2-(2-(2,2-二氟乙氧基)-5-氟苯基)乙基)-N-甲基吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-胺(9.1mmol)、乙腈(60mL)和N-碘代丁二酰亚胺(NIS，13.7mmol)，室温下反应2h。TLC监测反应原料转化完全。用乙酸乙酯(300mL)稀释，并转移到分液漏斗中，NaOH溶液(1mol/L，100mL×2)洗涤，饱和食盐水(100mL×3)洗涤，用无水硫酸钠干燥，浓缩得红色油状粗品，粗品经混合溶剂(石油醚/乙酸乙酯：15/1，100mL)打浆后得淡黄色固体，收率84％。
5)(R)-N-(1-(2-(2-(2,2-二氟乙氧基)-5-氟苯基)乙基)-N-甲基-3-(1H-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-胺的制备
将(R)-N-(1-(2-(2-(2,2-二氟乙氧基)-5-氟苯基)乙基)-3-碘-N-甲基吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-胺(0.42mmol)，1-Boc-吡唑-4-硼酸频哪醇酯(0.63mmol)，无水碳酸钾(1.68mmol)，四(三苯基膦)钯(0.042mmol)加入到带支口反应管中，氩气抽充3次，加入无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF，10mL)和水(2mL)。氩气氛围下，加热至100℃反应4h。TLC监测反应原料转化完全。用乙酸乙酯(150mL)稀释，并转移到分液漏斗中，饱和食盐水(100mL×3)洗涤，用无水硫酸钠干燥，浓缩后经柱层析纯化得淡黄色固体，收率47％。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ12.71(s,1H),8.59(d,J＝7.8Hz,1H),8.14(s,1H),7.97(s,2H),7.26–7.03(m,3H),6.61(d,J＝7.8Hz,1H),6.27–5.89(m,2H),4.40–4.22(m,2H),2.99(s,3H),1.57(d,J＝7.2Hz,3H)。
实施例2：(R)-3-(1-环丙基-1H-吡唑-4-基)-N-(1-(2-(2-(2,2-二氟乙氧基)-5-氟苯基)乙基)-N-甲基吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-胺的制备
参照实施例1的制备方法，不同之处在于将实施例1的步骤5)中的1-Boc-吡唑-4-硼酸频哪醇酯替换为等摩尔量的1-环丙基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)-1H-吡唑。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.61(d,J＝8.0Hz,1H),8.12(s,1H),8.01(s,1H),7.86(s,1H),7.21(d,J＝9.6Hz,1H),7.17–7.10(m,2H),6.62(d,J＝8.0Hz,1H),6.28–5.95(m,2H),4.31(t,J＝14.0Hz,2H),3.76–3.68(m,1H),2.98(s,3H),1.59(d,J＝6.0Hz,3H),1.08–0.93(m,4H)。
实施例3：(R)-2-(4-(5-((1-(2-(2,2-二氟乙氧基)-5-氟苯基)乙基)(甲基)氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-1H-吡唑-1-基)乙烷-1-醇的制备
参照实施例1的制备方法，不同之处在于将实施例1的步骤5)中的1-Boc-吡唑-4-硼酸频哪醇酯替换为等摩尔量的2-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)-1H-吡唑-1-基)乙-1-醇。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.61(d,J＝7.8Hz,1H),8.14(s,1H),8.01(s,1H),7.89(s,1H),7.30–7.03(m,3H),6.62(d,J＝7.8Hz,1H),6.35–5.67(m,2H),4.93(t,J＝5.6Hz,1H),4.41–4.22(m,2H),4.16(t,J＝5.6Hz,2H),3.75(q,J＝5.6Hz,2H),2.97(s,3H),1.59(d,J＝7.2Hz,3H)。
实施例4：(R)-N-(1-(2-(2-(2,2-二氟乙氧基)-5-氟苯基)乙基)-N-甲基-3-(1-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-胺的制备
参照实施例1的制备方法，不同之处在于将实施例1的步骤5)中的1-Boc-吡唑-4-硼酸频哪醇酯替换为等摩尔量的1-(四氢-2H-吡喃-4-基)-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)-1H-吡唑。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.61(d,J＝7.8Hz,1H),8.13(s,1H),8.05(s,1H),7.92(s,1H),7.33–6.99(m,3H),6.62(d,J＝7.8Hz,1H),6.40–5.68(m,2H),4.49–4.17(m,3H),4.07–3.88(m,2H),3.58–3.43(m,2H),2.97(s,3H),2.10–1.82(m,4H),1.59(d,J＝7.2Hz,3H)。
实施例5：(R)-N-(1-(2-(2-(2,2-二氟乙氧基)-5-氟苯基)乙基)-N-甲基-3-(1H-吡唑-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-胺的制备
参照实施例1的制备方法，不同之处在于将实施例1的步骤5)中的1-Boc-吡唑-4-硼酸频哪醇酯替换为等摩尔量的1-Boc-吡唑-3-硼酸频哪醇酯。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.64(br,1H),8.71–8.62(m,1H),8.23(s,1H),7.46(s,1H),7.31–7.03(m,3H),6.81–6.50(m,2H),6.28–5.94(m,2H),4.30(t,J＝13.2Hz,2H),2.99(s,3H),1.59(d,J＝6.0Hz,3H)。
实施例6：(R)-N-(1-(2-(2-，2,2-二氟乙氧基)-5-氟苯基)乙基)-N-甲基-3-(1-甲基-1H-吡唑-3-基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-5-胺的制备
参照实施例1的制备方法，不同之处在于将实施例1的步骤5)中的1-Boc-吡唑-4-硼酸频哪醇酯替换为等摩尔量的1-甲基-吡唑-3-硼酸频哪醇酯。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.65(d,J＝8.0Hz,1H),8.14(s,1H),7.63(s,1H),7.21(s,1H),7.17–7.06(m,2H),6.73(d,J＝2.0Hz,1H),6.64(d,J＝8.0Hz,1H),6.28–5.96(m,2H),4.35–4.24(m,2H),3.85(s,3H),2.98(s,3H),1.58(d,J＝6.0Hz,3H)。
实施例7：N-(环丙基(2-(2,2-二氟乙氧基)-5-氟苯基)甲基)-N-甲基-3-(1-甲基-1H-吡唑-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-胺的制备
Figure BDA0003147968380000131
1)2-(2,2-二氟乙氧基)-5-氟苄腈的制备
将5-氟-2-羟基苯腈(21.9mmol)、碳酸钾(65.7mmol)和乙腈(50mL)加入至单口圆底烧瓶中，室温搅拌30min后加入1,1-二氟-2-碘乙烷(32.8mmol)，升温至回流继续反应4h。TLC监测反应原料转化完全。将反应冷却至室温，用乙酸乙酯(300mL)将反应体系稀释并转移至分液漏斗中，饱和食盐水(100mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩后得淡黄色固体，收率96％。
2)和3)：环丙基(2-(2,2-二氟乙氧基)-5-氟苯基)甲胺的制备
2)：将2-(2,2-二氟乙氧基)-5-氟苄腈(19.9mmol)和环丙基溴化镁的四氢呋喃溶液(1mol/L，25mL)加入至单口圆底烧瓶中，室温搅拌反应过夜。得到的亚胺中间体直接进行下一步还原反应。3)：往上述反应体系中分批加入硼氢化钠(49.7mmol)后，滴加甲醇(20mL)，继续室温搅拌反应过夜。TLC监测反应原料转化完全。用乙酸乙酯(300mL)将反应体系稀释并转移至分液漏斗中，饱和食盐水(100mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩后得淡黄色油状液体，收率78％。
4)-7)：采用实施例1中步骤1)-4)的方法，得到N-(环丙基(2-(2,2-二氟乙氧基)-5-氟苯基)甲基)-3-碘-N-甲基吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-胺，四步合并收率37％。
8)：采用实施例1中步骤5)的制备方法，不同之处在于将实施例1的步骤5)中的1-Boc-吡唑-4-硼酸频哪醇酯替换为等摩尔量的1-甲基-吡唑-3-硼酸频哪醇酯。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.41(d,J＝7.8Hz,1H),8.02(s,1H),7.55(s,1H),7.24–7.16(m,1H),7.15–7.05(m,1H),7.07–6.98(m,1H),6.63(s,1H),6.59–6.31(m,2H),4.94(t,J＝7.2Hz,1H),4.53–4.31(m,2H),2.93(s,3H),0.88–0.78(m,1H),0.62–0.50(m,2H),0.51–0.42(m,1H),0.41–0.33(m,1H)。
实施例8：2-(4-(5-((环丙基(2-(2,2-二氟乙氧基)-5-氟苯基)甲基)(甲基)氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-1H-吡唑-1-基)乙-1-醇的制备
参照实施例7的制备方法，不同之处在于将实施例7的步骤8)中的1-甲基-吡唑-3-硼酸频哪醇酯替换为等摩尔量的2-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)-1H-吡唑-1-基)乙-1-醇。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.42(d,J＝7.8Hz,1H),8.00(s,1H),7.83(s,1H),7.81(s,1H),7.25–7.17(m,1H),7.14–7.06(m,1H),7.06–6.97(m,1H),6.60–6.32(m,2H),4.95(t,J＝7.2Hz,1H),4.91(t,J＝5.6Hz,1H),4.53–4.32(m,2H),4.12(t,J＝5.6Hz,2H),3.73(q,J＝5.6Hz,2H),2.94(s,3H),0.89–0.79(m,1H),0.61–0.50(m,2H),0.50–0.41(m,1H),0.41–0.32(m,1H)。
实施例9：2-(4-(5-(环丙基(5-氟-2-(2,2,2-三氟乙氧基)苄基)氨基)氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-1H-吡唑-1-基)乙烷-1-醇的制备
Figure BDA0003147968380000151
1)5-氟-2-(2,2,2-三氟乙氧基)苯甲醛的制备
将5-氟-2-羟基苯甲醛(21.4mmol)、碳酸铯(64.3mmol)和DMF(50mL)加入至单口圆底烧瓶中，室温搅拌30min后加入1,1,1-三氟-2-碘乙烷(32.1mmol)，升温至回流继续反应过夜。TLC监测反应原料基本转化完全。将反应冷却至环境温度，用乙酸乙酯(300mL)将反应体系稀释并转移至分液漏斗中，饱和食盐水(100mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩后得淡黄色固体，收率68％。
2)和3)：N-(5-氟-2-(2,2,2-三氟乙氧基)苄基)环丙胺的制备
2)将5-氟-2-(2,2,2-三氟乙氧基)苯甲醛(13.5mmol)、甲醇(50mL)、环丙胺(67.5mmol)和醋酸(5mL)依次加入至单口圆底烧瓶中，室温搅拌过夜反应。TLC监测反应原料转化完全。得到的亚胺中间体无需分离，直接进行下一步还原反应。3)室温下，往上述反应体系中分批加入氰基硼氢化钠(40.5mmol)，继续反应5h。TLC监测反应亚胺转化完全。将反应体系缓慢倒入水中，NaOH调pH值至中性，乙酸乙酯萃取(100mL×3)，合并有机相，饱和食盐水(50mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得到淡黄色油状粗品，收率89％。
4)至6)：2-(4-(5-(环丙基(5-氟-2-(2,2,2-三氟乙氧基)苄基)氨基)氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-1H-吡唑-1-基)乙烷-1-醇的制备
参照实施例1中步骤3)至5)的制备方法。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.72(d,J＝7.8Hz,1H),8.15(s,1H),7.73(s,1H),7.67(s,1H),7.27–7.16(m,1H),7.14–7.03(m,1H),6.95–6.78(m,2H),4.96–4.79(m,5H),4.05(t,J＝5.6Hz,2H),3.68(q,J＝5.6Hz,2H),2.98–2.87(m,1H),1.02–0.91(m,2H),0.89–0.72(m,2H).
实施例10：N-(1-(5-氟-2-(2,2,2-三氟乙氧基)苯基)乙基)-N-甲基-3-(1H-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-胺的制备
Figure BDA0003147968380000161
1)1-(5-氟-2-(2,2,2-三氟乙氧基)苯基)乙-1-酮的制备
参照实施例9中的步骤1)的制备方法。不同之处将实施例9中的5-氟-2-羟基苯甲醛替换为等摩尔量的5-氟-2-羟基苯乙酮。
2)至5)：N-(1-(5-氟-2-(2,2,2-三氟乙氧基)苯基)乙基)-3-碘-N-甲基吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-胺的制备
参照实施例9中的步骤2)至5)的制备方法。不同之处将实施例9中的环丙胺替换为等摩尔量的甲氨。
6)：N-(1-(5-氟-2-(2,2,2-三氟乙氧基)苯基)乙基)-N-甲基-3-(1H-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-胺的制备
参照实施例9中的步骤6)的制备方法。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ12.67(s,2H),8.58(d,J＝7.8Hz,1H),8.12(s,1H),7.93(s,2H),7.26–7.00(m,3H),6.58(d,J＝7.8Hz,1H),6.17–5.89(m,1H),4.72(q,J＝9.0Hz,2H),2.96(s,3H),1.56(d,J＝7.2Hz,3H)。
实施例11：2-(4-(5-((1-(5-氟-2-(2,2,2-三氟乙氧基)苯基)乙基)(甲基)氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-1H-吡唑-1-基)乙烷-1-醇的制备
参照实施例10的制备方法。不同之处将1-Boc-吡唑-4-硼酸频哪醇酯替换为等摩尔量的2-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)-1H-吡唑-1-基)乙-1-醇。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.58(d,J＝7.8Hz,1H),8.10(s,1H),7.96(s,1H),7.85(s,1H),7.26–7.20(m,1H),7.19–7.09(m,2H),6.57(d,J＝7.8Hz,1H),6.17–5.89(m,1H),4.89(t,J＝5.2Hz,1H),4.70(q,J＝9.0Hz,2H),4.13(t,J＝5.6Hz,2H),3.73(q,J＝5.6Hz,2H),2.92(s,3H),1.57(d,J＝7.2Hz,3H)。
实施例12：N-(1-(5-氟-2-(2,2,2-三氟乙氧基)苯基)乙基)-N-甲基-3-(1-甲基-1H-吡唑-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-胺的制备
参照实施例10的制备方法。不同之处将1-Boc-吡唑-4-硼酸频哪醇酯替换为等摩尔量的1-甲基-吡唑-3-硼酸频哪醇酯。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.62(d,J＝7.8Hz,1H),8.11(s,1H),7.59(s,1H),7.25–7.18(m,1H),7.18–7.07(m,2H),6.69(s,1H),6.60(d,J＝7.8Hz,1H),6.17–5.89(m,1H),4.77–4.60(m,2H),3.82(s,3H),2.94(s,3H),1.56(d,J＝7.2Hz,3H)。
实施例13：N-(1-(2-(2,2,2-三氟乙氧基)-5-氟苯基)丙基)-N-甲基-3-(1H-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-胺的制备
Figure BDA0003147968380000181
1)至8)参照实施例7的制备方法。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ12.65(s,2H),8.60(d,J＝7.8Hz,1H),8.12(s,1H),7.94(s,2H),7.27–7.02(m,3H),6.59(d,J＝7.8Hz,1H),6.17–5.89(m,1H),4.72(q,J＝9.0Hz,2H),2.96(s,3H),2.04–1.90(m,2H)1.57(d,J＝7.2Hz,3H)。
实施例14：2-(4-(5-((1-(5-氟-2-(2,2,2-三氟乙氧基)苯基)丙基)(甲基)氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-1H-吡唑-1-基)乙烷-1-醇的制备
参照实施例13的制备方法。不同之处将1-Boc-吡唑-4-硼酸频哪醇酯替换为等摩尔量的2-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)-1H-吡唑-1-基)乙-1-醇。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.60(d,J＝7.8Hz,1H),8.13(s,1H),8.02(s,1H),7.90(s,1H),7.39–7.27(m,1H),7.24–7.11(m,2H),6.66(d,J＝7.8Hz,1H),6.17–5.89(m,1H),4.92(t,J＝5.6Hz,1H),4.71(q,J＝9.0Hz,2H),4.15(t,J＝5.6Hz,2H),3.75(q,J＝5.6Hz,2H),2.92(s,3H),2.17–1.96(m,2H),0.97(t,J＝7.2Hz,3H)。
实施例15：2-(4-(5-((1-(2-(2,2-二氟乙氧基)-5-氟苯基)丙基)(甲基)氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-1H-吡唑-1-基)乙烷-1-醇的制备参照实施例14的制备方法。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.57(d,J＝7.8Hz,1H),8.11(s,1H),8.01(s,1H),7.88(s,1H),7.41–7.22(m,1H),7.21–7.00(m,2H),6.72(d,J＝7.8Hz,1H),6.29–5.49(m,2H),4.88(t,J＝5.6Hz,1H),4.37–4.17(m,2H),4.13(t,J＝5.6Hz,2H),3.73(q,J＝5.6Hz,2H),2.91(s,3H),2.06–1.87(m,2H),0.93(t,J＝7.2Hz,3H)。
实施例16：N-(环丙基(5-氟-2-(2,2,2-三氟乙氧基)苯基)甲基)-N-甲基-3-(1H-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-胺的制备
参照实施例7的制备方法。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ12.67(s,1H),8.55(d,J＝7.8Hz,1H),8.11(s,1H),7.93(s,2H),7.53–7.40(m,1H),7.21–7.02(m,2H),6.55(d,J＝7.8Hz,1H),5.49–4.91(m,1H),4.66(q,J＝9.0Hz,2H),3.04(s,3H),1.69–1.56(m,1H),0.74–0.55(m,3H),0.46–0.35(m,1H)。
实施例17：2-(4-(5-((环丙基(5-氟-2-(2,2,2-三氟乙氧基)苯基)甲基)(甲基)氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-1H-吡唑-1-基)乙烷-1-醇的制备
参照实施例7的制备方法。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.54(d,J＝7.8Hz,1H),8.09(s,1H),7.97(s,1H),7.84(s,1H),7.59–7.44(m,1H),7.25–6.99(m,2H),6.55(d,J＝7.8Hz,1H),5.43–5.01(m,1H),4.90(t,J＝5.6Hz 1H),4.63(q,J＝9.0Hz,2H),4.13(t,J＝5.6Hz,2H),3.73(q,J＝5.6Hz,2H),2.99(s,3H),1.74–1.54(m,1H),0.78–0.51(m,3H),0.48–0.31(m,1H)。
实施例18：N-(环丙基(5-氟-2-(2,2,2-三氟乙氧基)苯基)甲基)-N-甲基-3-(1-甲基-1H-吡唑-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-胺的制备
参照实施例7的制备。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.58(d,J＝7.8Hz,1H),8.11(s,1H),7.61(s,1H),7.55–7.43(m,1H),7.22–6.99(m,2H),6.67(s,1H),6.57(d,J＝7.8Hz,1H),4.62(q,J＝9.0Hz,2H),3.83(s,3H),3.01(s,3H),1.70–1.58(m,1H),0.75–0.53(m,3H),0.45–0.30(m,1H)。
实施例19：2-(4-(5-((1-(5-氟-2-(2-氟乙氧基)苯基)乙基)(甲基)氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-1H-吡唑-1-基)乙-1-醇的制备
参照实施例10的制备方法。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.57(d,J＝7.8Hz,1H),8.11(s,1H),7.98(s,1H),7.87(s,1H),7.29–6.91(m,3H),6.62(s,1H),6.18–5.74(m,1H),4.98–4.82(m,1H),4.65–4.33(m,2H),4.30–3.97(m,4H),3.73(q,J＝5.6Hz,2H),2.93(s,3H),1.56(d,J＝7.2Hz,3H)。
实施例20：N-(1-(5-氟-2-(2-氟乙氧基)苯基)乙基)-N-甲基-3-(1-甲基-1H-吡唑-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-胺的制备
参照实施例10的制备方法。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.61(d,J＝7.8Hz,1H),8.12(s,1H),7.61(d,J＝2.4Hz,1H),7.25–7.14(m,1H),7.14–7.05(m,1H),7.05–6.97(m,1H),6.76–6.70(m,1H),6.64(s,1H),6.18–5.74(m,1H),4.65–4.38(m,2H),4.25–4.09(m,2H),3.82(s,3H),2.95(s,3H),1.56(d,J＝7.2Hz,3H)。
实施例21：N-(1-(5-氟-2-甲氧基苯基)乙基)-N-甲基-3-(1H-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-胺的制备
参照实施例10的制备方法。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ12.70(s,1H),8.60(d,J＝7.8Hz,1H),8.13(s,1H),7.95(s,2H),7.19–6.91(m,3H),6.63(d,J＝7.8Hz,1H),6.07–5.79(m,1H),3.76(s,3H),3.02(s,3H),1.54(d,J＝7.2Hz,3H)。
实施例22：2-(4-(5-((1-(5-氟-2-甲氧基苯基)乙基)(甲基)氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-1H-吡唑-1-基乙烷-1-醇的制备
参照实施例10的制备方法。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.60(d,J＝7.8Hz,1H),8.11(s,1H),7.98(s,1H),7.85(s,1H),7.20–7.05(m,2H),7.05–6.95(m,1H),6.64(d,J＝7.8Hz,1H),6.09–5.72(m,1H),4.89(t,J＝5.6Hz,1H),4.13(t,J＝5.6Hz,2H),3.82–3.64(m,5H),2.98(s,3H),1.55(d,J＝7.2Hz,3H)。
实施例23：N-(1-(5-氟-2-甲氧基苯基)乙基)-N-甲基-3-(1-甲基-1H-吡唑-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-胺的制备
参照实施例10的制备方法。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.63(d,J＝7.8Hz,1H),8.12(s,1H),7.64(s,1H),7.20–7.04(m,2H),7.03–6.95(m,1H),6.70(s,1H),6.66(d,J＝7.8Hz,1H),6.06–5.83(m,1H),3.83(s,3H),3.73(s,3H),3.00(s,3H),1.54(d,J＝7.2Hz,3H)。
实施例24：N-(1-(2-(二氟甲氧基)-5-氟苯基)乙基)-N-甲基-3-(1H-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-胺的制备
Figure BDA0003147968380000211
1)1-(2-(二氟甲氧基)-5-氟苯基)乙-1-酮的制备
将乙腈(20mL)和水(20mL)加入至单口烧瓶并置于-20℃的低温搅拌器中，加入氢氧化钾(389.6mmol)继续搅拌使其溶解。5-氟-2羟基苯乙酮(19.5mmol)溶解在乙腈(10mL)中滴加至反应体系中继续搅拌20min。溴氟甲基膦酸二乙酯(39.0mmol)滴加至反应体系中，滴完后自然升温至环境温度继续反应2h。TLC监测反应原料准话完全。将反应体系加入至100mL冰水中，用乙酸乙酯萃取(50mL×3)，无水硫酸钠干燥。减压浓缩后经柱层析纯化得淡黄色固体，收率86％。
2)至6)：N-(1-(2-(二氟甲氧基)-5-氟苯基)乙基)-N-甲基-3-(1H-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-胺的制备
参照实施例10的步骤2-6)的制备方法。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ12.68(s,1H),8.63(d,J＝7.8Hz,1H),8.15(s,1H),7.97(s,2H),7.43–7.32(m,1H),7.28–7.22(m,2H),7.08(t,J＝74.0Hz,1H),6.61(d,J＝7.8Hz,1H),6.20–5.93(m,1H),2.90(s,3H),1.57(d,J＝7.2Hz,3H)。
实施例25：2-(4-(5-((1-(2-(二氟甲氧基)-5-氟苯基)乙基)(甲基)氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-1H-吡唑-1-基)乙烷-1-醇的制备
参照实施例24的制备方法。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.68(d,J＝7.8Hz,1H),8.18(d,1H),8.05(s,1H),7.92(s,1H),7.48–7.39(m,1H),7.34–7.28(m,2H),7.15(t,J＝74.0Hz,1H),6.67(d,J＝7.8Hz,1H),6.25–5.96(m,1H),4.95(t,J＝5.6Hz,1H),4.19(t,J＝5.6Hz,2H),3.79(q,J＝5.6Hz,2H),2.96(s,3H),1.63(d,J＝7.2Hz,3H)。
实施例26：N-(1-(2-(二氟甲氧基)-5-氟苯基)乙基)-N-甲基-3-(1-甲基-1H-吡唑-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-胺的制备
参照实施例24的制备方法。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.72(d,J＝7.8Hz,1H),8.19(s,1H),7.71–7.59(m,1H),7.46–7.37(m,1H),7.34–6.99(m,3H),6.82–6.74(m,1H),6.69(d,J＝7.8Hz,1H),6.29–5.98(m,1H),3.89(s,3H),2.99(s,3H),1.62(d,J＝7.2Hz,3H)。
实施例27：N-(2,5-二氟苄基)-N-甲基-3-(1-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-胺的制备
Figure BDA0003147968380000231
参照实施例9中步骤2)至6)的制备方法。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.68(d,J＝7.6Hz,1H),8.16(s,1H),7.99(s,1H),7.83(s,1H),7.38–7.03(m,3H),6.68(d,J＝8.0Hz,1H),4.97(s,2H),4.43–4.33(m,1H),3.99(d,J＝11.2Hz,2H),3.56–3.44(m,2H),3.30(s,3H),2.04–1.82(m,4H)。
实施例28：N-(1-(2,5-二氟苯基)乙基)-N-甲基-3-(1-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-胺的制备
参照实施例27的制备方法。不同之处在于将起始原料的2,5-二氟苯甲醛替换为等摩尔量的2,5-二氟苯乙酮。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.43(d,J＝7.8Hz,1H),7.92(s,1H),7.81(s,1H),7.66(s,1H),7.15–6.93(m,3H),6.45(d,J＝7.8Hz,1H),6.00–5.86(m,1H),4.22–4.13(m,1H),3.83–3.72(m,2H),3.27(t,J＝11.4Hz,2H),2.79(s,3H),1.83–1.67(m,4H),,1.39(d,J＝7.2Hz,3H)。
实施例29：2-(4-(5-((1-(2,5-二氟苯基)乙基)(甲基)氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-1H-吡唑-1-基)乙烷-1-醇的制备
参照实施例27的制备方法。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.63(d,J＝8.4Hz,1H),8.12(s,1H),7.97(s,1H),7.83(s,1H),7.39–7.15(m,3H),6.70–6.62(m,1H),6.23–6.07(m,1H),4.94–4.85(m,1H),4.22–4.09(m,2H),3.85–3.69(m,2H),3.08–2.93(m,3H),1.58(d,J＝7.2Hz,3H)。
实施例30：N-(1-(2,5-二氟苯基)乙基)-N-甲基-3-(1-甲基-1H-吡唑-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-胺的制备
参照实施例27的制备方法。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.71(d,J＝7.6Hz,1H),8.17(s,1H),7.66(d,J＝2.0Hz,1H),7.42–7.16(m,3H),6.97–6.56(m,2H),6.25–6.13(m,1H),3.86(s,3H),2.98(s,3H),1.61(d,J＝7.2Hz,3H)。
实施例31：N-(1-(2,5-二氟苯基)丙基)-N-甲基-3-(1-甲基-1H-吡唑-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-胺的制备
参照实施例13的制备方法，将其中步骤2中的原料5-氟-2-(2,2,2-三氟乙氧基)苯腈替换为等摩尔量的2,5-二氟苯腈。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.68(d,J＝7.8Hz,1H),8.15(s,1H),7.65(s,1H),7.47–7.15(m,3H),6.79–6.68(m,2H),6.13–5.89(m,1H),3.84(s,3H),2.94(s,3H),2.18–1.96(m,2H),0.93(t,J＝7.2Hz,3H)。
实施例32：2-(4-(5-((1-(2,5-二氟苯基)丙基)(甲基)氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-1H-吡唑-1-基)乙烷-1-醇的制备
参照实施例13的制备方法。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.64(d,J＝7.8Hz,1H),8.14(s,1H),8.02(s,1H),7.88(s,1H),7.46–7.16(m,3H),6.78–6.64(m,1H),6.10–5.89(m,1H),4.89(t,J＝5.4Hz,1H),4.14(t,J＝5.4Hz,2H),3.80–3.70(m,2H),2.96(s,3H),2.17–1.97(m,2H),0.95(t,J＝7.2Hz,3H)。
实施例33：2-(4-(5-((环丙基(2,5-二氟苯基)甲基)(甲基)氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)-1H-吡唑-1-基)-1-醇的制备
参照实施例13的制备方法。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.62(d,J＝7.8Hz,1H),8.12(s,1H),7.98(s,1H),7.82(s,1H),7.53–7.48(m,1H),7.28–7.14(m,2H),6.70–6.62(m,1H),5.36–5.17(m,1H),4.90(t,J＝5.4Hz,1H),4.14(t,J＝5.4Hz,2H),3.74(q,J＝5.4Hz,2H),3.14(s,3H),1.71–1.62(m,1H),0.76–0.61(m,2H),0.57–0.50(m,2H)。
测试例1
材料与方法：TRKA、TRKA-G595R、TRKA-G667C、TRKA-F589L、TRKB、TRKC、TRKC-G623R和TRKC-G696A等激酶，来源于Carna Biosciences 08-186，08-187，08-197；HTRF KinEASETK kit(Cisbio公司62TK0PEC)；384孔板(Greiner公司)；ATP(Life technologiesPV3227)，MgCl2(sigma)公司；PHERAstar FS多功能酶标仪(BMG公司)；低速离心机(StaiteXiangyi公司)；恒温箱(Binder公司)。选取的阳性对照化合物为已上市的TRK抑制剂拉罗替尼(Larotrectinib、Vitrakvi、loxo-101)。
化合物溶解及保存：根据溶解性，用二甲基亚砜(DMSO)将受试化合物配置成10mmol/L的母液，分装后-20℃保存；
化合物工作液的配制：测试前将分装的化合物从冰箱取出，用纯DMSO稀释到100×所需浓度；然后用去离子水将化合物稀释至4×所需浓度；
1.33×酶缓冲液(Enzymatic buffer)的配制：将5×酶缓冲液(来源于HTRF试剂盒)用去离子水稀释到1.33×，并且加入1.33×终浓度的相应成分：1.33mmol/L二硫苏糖醇(DTT)、1.33mmol/L MnCl2、6.65mmol/L MgCl2和39.9nmol/L SEB；
激酶工作液的配制：用1.33×酶缓冲液将TRKA、TRKB和TRKC稀释到2×所需浓度分别为0.404ng/μL、0.304ng/μL和0.236ng/μL；
底物工作液的配制：用1.33×酶缓冲液将TK Substrate–biotin(来源于HTRF试剂盒)和ATP(10mM)稀释为4×所需终浓度的混合液；TRKA、TRKB和TRKC的ATP终浓度分别为：3.727μmol/L、2.56μmol/L和2.526μmol/L。TK Substrate–biotin(来自HTRF KinEASE TKkit)终浓度均为：0.2μmol/L。
检测工作液的配制：用HTRF测试缓冲液将16.67μmol/L的抗生蛋白链菌-XL665(Streptavidin-XL665)稀释到4×所需终浓度，然后与等体积的抗体-铕隐酸盐(Antibody-Cryptate)混合(均来源于HTRF试剂盒)。
酶反应步骤：向低体积384微孔板的每个孔中加入4μL的激酶工作液，同时加入4μL的1.33×酶缓冲液作为阴性对照(Negative)；向孔加入2μl的化合物工作液，同时加入2μL的8％DMSO水溶液作为零化合物浓度对照(即阳性对照，Positive)；于25℃，孵育5min；向孔中加入2μL底物工作液启动酶反应，于37℃，振荡反应30min。
HTRF试剂检测步骤：向孔加入8μL的检测工作液终止反应；25℃反应1h；
HTRF信号的读取：采用PHERAstar FS读数检测信号，仪器相应设置如下：
Optic module
Figure BDA0003147968380000261
积分延迟(Integration delay，lag time)50μs
积分时间(Integration time)400μs
闪光次数(Number of flashes)200
对于每孔读出的原始数据，比值＝665 nm/620 nm；
抑制率的计算：
Figure BDA0003147968380000271
IC50值的计算：以化合物浓度的对数为横坐标，抑制率为纵坐标，在GraphPadPrism 5中，拟合非线性曲线：log(inhibitor)vs.response--Variableslope，求出酶活抑制率为50％时的待测化合物浓度即IC50。
本发明提供结构如式(I)所示化合物对TRKA-G595R、TRKA-G667C、TRKA-F589L、TRKC-G623R和TRKC-G696A等激酶的半数抑制浓度(IC50)见表1：
表1：化合物对TRKA-G595R、TRKA-G667C、TRKA-F589L、TRKC-G623R和TRKC-G696A等激酶的抑制活性
Figure BDA0003147968380000272
如表1所示，本发明提供的化合物TRKA-G595R、TRKA-G667C、TRKA-F589L、TRKC-G623R和TRKC-G696A等突变后的激酶均表现出优异的抑制活性，且活性明显优于已上市的TRK抑制剂拉罗替尼。
测试例2：本发明的化合物在裸小鼠皮下移植瘤模型上的抗肿瘤活性
本发明化合物的药效通过移植肿瘤的标准鼠类模型来进行评估的。Ba/F3-ETV6-TRKC G623R细胞株培养、收集后，于后腹侧皮下接种于5-6周龄的雌性裸小鼠体内(BALB/cJGpt-Foxn1nu/Gpt，江苏集萃药康生物科技有限公司)。当肿瘤体积达到100-150mm3时，动物随机地分为溶剂对照组(70％PEG-400的水溶液)和化合物组(每组6只动物)。后续采用实施例的化合物对动物进行灌胃给药(相应剂量，溶解在70％PEG-400的水溶液中)，从肿瘤细胞接种后的0到12天中的任何地方开始，并且在试验中每天进行一次或两次。
实验指标为考察实施例化合物对肿瘤生长的影响，具体指标为T/C％或抑瘤率TGI(％)。
每周二次用游标卡尺测量肿瘤直径，肿瘤体积(V)计算公式为：
V＝1/2×a×b2其中a、b分别表示长、宽。
T/C(％)＝(T-T0)/(C-C0)×100其中T、C为实验结束时的肿瘤体积；T0、C0为实验开始时的肿瘤体积。
抑瘤率(TGI)(％)＝100-T/C(％)。
当肿瘤出现消退时，抑瘤率(TGI)(％)＝100-(T-T0)/T0×100
如果肿瘤比起始体积缩小，即T<T0或C<C0时，即定义为肿瘤部分消退(PR)；如果肿瘤完全消失，即定义为肿瘤完全消退(CR)。
二组肿瘤体积之间比较采用双尾Student’s t检验，P<0.05定义为有统计学显著性差异。
以下BID表示一天两次给药。
Figure BDA0003147968380000281
Figure BDA0003147968380000291
本发明的化合物在Ba/F3-ETV6-TRKC G623R细胞株裸小鼠皮下移植瘤模型上表现出优异的抗肿瘤活性。其中，化合物1明显抑制Ba/F3-ETV6-TRKC G623R细胞株裸小鼠皮下移植瘤的生长，抑瘤率为80％以上；化合物9对Ba/F3-ETV6-TRKC G623R细胞株裸小鼠皮下移植瘤的抑瘤率也很高。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种具有式(I)所示结构的吡唑并嘧啶化合物或其药学上可接受的盐，或其立体异构体、几何异构体、互变异构体、氮氧化物、水合物、溶剂化物、代谢产物，或其前药，
Figure FDA0003147968370000011
其中，在式(I)中，
R1选自C1-3的烷基、由1-3个卤素取代的C1-3的烷基；
R2选自H、C1-3的烷基；
R3选自C1-3的烷基；
R4为式(1)或式(2)所示的基团，
Figure FDA0003147968370000012
在式(1)和式(2)中，R41和R42各自独立地为H、C1-3的烷基、-(C1-3的烷基)-OH或
Figure FDA0003147968370000013
2.根据权利要求1所述的化合物，其中，在式(I)中，
R1选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、由1-3个F取代的C1-3的烷基；
R2选自H、甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基；
R3选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基；
R4为式(1)或式(2)所示的基团，
Figure FDA0003147968370000021
在式(1)和式(2)中，R41和R42各自独立地为H、甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、-(CH2)-OH、-(CH2CH2)-OH或
Figure FDA0003147968370000022
3.根据权利要求2所述的化合物，其中，在式(I)中，
R1选自-CH2CF2H、-CH2CF3、-CH2CFH2、-CF2H、-CH3；
R2选自H、-CH3、
Figure FDA0003147968370000023
-CH2CH3；
R3选自-CH3、
Figure FDA0003147968370000024
R4为式(1)所示的基团，
Figure FDA0003147968370000025
在式(1)中，R41为H、-(CH2CH2)-OH、
Figure FDA0003147968370000026
4.根据权利要求2所述的化合物，其中，在式(I)中，
R1选自-CH2CF2H、-CH2CF3、-CH2CFH2、-CF2H、-CH3；
R2选自H、-CH3、
Figure FDA0003147968370000027
-CH2CH3；
R3选自-CH3、
Figure FDA0003147968370000028
R4为式(2)所示的基团，
Figure FDA0003147968370000031
在式(2)中，R42为H或-CH3。
5.根据权利要求1或2所述的化合物，其中，所述吡唑并嘧啶化合物为以下化合物中的至少一种：
Figure FDA0003147968370000032
Figure FDA0003147968370000041
6.一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂，以及作为活性成分的权利要求1-5中任意一项所述的具有式(I)所示结构的吡唑并嘧啶化合物或其药学上可接受的盐，或其立体异构体、几何异构体、互变异构体、氮氧化物、水合物、溶剂化物、代谢产物，或其前药。
7.权利要求1-5中任意一项所述的具有式(I)所示结构的吡唑并嘧啶化合物或其药学上可接受的盐，或其立体异构体、几何异构体、互变异构体、氮氧化物、水合物、溶剂化物、代谢产物，或其前药在制备用于预防和/或治疗TRK酪氨酸激酶受体介异的疾病的药物中的应用。
8.权利要求6所述的药物组合物在制备用于预防和/或治疗TRK酪氨酸激酶受体介异的疾病的药物中的应用。
9.权利要求1-5中任意一项所述的具有式(I)所示结构的吡唑并嘧啶化合物或其药学上可接受的盐，或其立体异构体、几何异构体、互变异构体、氮氧化物、水合物、溶剂化物、代谢产物，或其前药，或者权利要求6所述的药物组合物在制备用于预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其中，所述肿瘤为乳腺癌、大肠癌、肺癌、甲状腺癌、皮肤癌、白血病、唾液腺肿瘤、神经内分泌肿瘤、淋巴瘤、脑肿瘤、成神经细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、间皮瘤、食管癌、肺肉瘤、成神经管细胞瘤、成胶质细胞瘤、结肠癌、肝癌、成视网膜细胞瘤、肾癌、膀胱癌、骨肉瘤、胃癌、子宫癌、外阴癌、小肠癌、前列腺癌、胆管癌、输尿管癌、肾上腺皮质癌或头颈部癌症的至少一种。
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