CN113272432A - Glb1重组报告基因、分离的构建体以及制备转基因报告小鼠的方法 - Google Patents
Glb1重组报告基因、分离的构建体以及制备转基因报告小鼠的方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种Glb1重组报告基因，其包括在Glb1基因的终止密码子位点从5’至3’端方向顺序地插入的2A序列以及报告基因，所述Glb1重组报告基因能够将Glb1转录水平与报告基因的转录水平显著性关联。一种制备转基因报告小鼠的方法，所述方法包括：将构建体引入小鼠胚胎干细胞或者小鼠生殖细胞，获得包括Glb1重组报告基因的小鼠胚胎干细胞或者小鼠生殖细胞；并且利用所述包括Glb1重组报告基因的小鼠胚胎干细胞或者小鼠生殖细胞生成杂合子转基因报告小鼠。其中，所述Glb1重组报告基因具有由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
Description
背景
技术领域
本申请涉及生物标志物的技术领域，更具体地说，涉及一种Glb1重组报告基因、一种分离的构建体、一种制备转基因报告小鼠的方法、一种抗衰老药物的筛选方法。
相关技术的描述
老化(aging)是在几乎所有组织和器官中的生理功能的进行性恶化，是包括心血管疾病(CVD)、阿尔茨海默氏病(AD)、老年痴呆症和慢性肺病在内的与年龄相关的疾病的最大危险因素。监测衰老过程和了解衰老机制不仅可以加强早期诊断，还可以为疾病的早期预防甚至治疗提供策略。
衰老(Senescence)被广泛接受为系统性退化的细胞基础。氧化应激、基因组不稳定性和癌基因激活也会诱导衰老，称为应激性衰老(SIS)。衰老细胞倾向于获得溶酶体质量和β-半乳糖苷酶蛋白，该β-半乳糖苷酶蛋白由Glb1基因编码，并且可以在pH 6.0检测到其活性，称为pH 6.0下的衰老相关的β-半乳糖苷酶活性(SAβ-gal)。低剂量的抗癌药物多柔比星(doxorubicin，DOX)诱导心肌细胞衰老，SAβ-gal升高。同样，DNA损伤试剂博来霉素(博来霉素)可以诱导以SAβ-gal为标志的肺上皮细胞的衰老。衰老细胞还可以通过DNA损伤灶γ-H2AX的积累，衰老相关分泌表型(SASP)的增加表达，以及上调的p16Ink4a、p19Arf和p21Wif1转录进行标记。
然而，大多数衰老标志物应用于体外培养的哺乳动物细胞，而用于系统性水平的体内衰老/老化的生物标志物仍然稀缺。
发明内容
鉴于上述问题，本申请的一个目的是提供一种Glb1重组报告基因、一种分离的构建体、一种制备报告小鼠的方法和一种抗衰老药物的筛选方法。
为实现上述目的，根据本申请的第一方面，提供一种Glb1重组报告基因，其包括：在Glb1基因的终止密码子位点从5’至3’端方向顺序地插入的2A序列以及报告基因；其中，所述Glb1基因与所述报告基因一起转录成单个mRNA，使得所述Glb1基因的转录水平与所述报告基因的转录水平显著相关。
根据本申请的第二方面，提供一种分离的构建体，其中，所述构建体用于靶向Glb1基因的终止密码子位点，所述构建体从5’至3’端方向依次包括：2A序列和报告基因。
根据本申请的第三方面，提供一种制备转基因报告小鼠的方法，所述方法包括：将根据第二方面所述的构建体引入小鼠胚胎干细胞或者小鼠生殖细胞，获得包括Glb1重组报告基因的所述小鼠胚胎干细胞或者所述小鼠生殖细胞；并且利用包括所述Glb1重组报告基因的所述小鼠胚胎干细胞或者所述小鼠生殖细胞生成杂合子的转基因报告小鼠。其中，所述Glb1重组报告基因具有由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
根据本申请的第四方面，提供一种抗衰老药物的筛选方法，所述方法包括：提供包括根据第一方面所述的Glb1重组报告基因的转基因报告小鼠或者根据第三方面所述的方法制备的转基因报告小鼠；将候选药物施用于所述转基因报告小鼠；通过体内成像技术对所述转基因报告小鼠体内的所述Glb1重组报告基因的蛋白水平进行监测；并且如果候选药物选择性地杀死了具有Glb1重组报告基因的高蛋白水平的细胞，则选择所述候选药物作为抗衰老药物，其中，所述Glb1重组报告基因的所述高蛋白水平采用85％置信区间定义。其中，所述转基因报告小鼠是9-13个月龄的杂合子的转基因报告小鼠。
本申请的优点总结如下：
根据本申请实施例的构建体靶向Glb1基因的终止密码子位点，并且该构建体包括2A序列和报告基因。该构建体能够将2A序列和报告基因精确插入Glb1基因预先设计的靶向位点，生成Glb1重组报告基因。经验证，根据本申请实施例的Glb1重组报告基因可稳定表达溶酶体β-半乳糖苷酶和报告蛋白，并且Glb1的转录水平与报告基因的转录水平显著相关。通过使用体内成像技术监测报告蛋白的荧光信号，可以在体内观察SAβ-gal的活性。
根据本申请的转基因报告小鼠的制备方法是能够产生转基因报告小鼠(Glb1+/C)。转基因报告小鼠将SAβ-gal活性与mCherry信号耦合，可利用体内成像技术在体内进行观察，避免SAβ-gal染色的主观影响，能够实时监测活体动物的系统性衰老，从而有助于研究衰老机制和开发抗衰老干预措施。
在根据本申请实施例的抗衰老药物的筛选方法中，采用9-13个月龄的Glb1+/C小鼠，其GAC荧光信号(表示重组Glbl基因，即具有核苷酸序列SEQ ID NO.1的Glb1-2A-mCherry)与实足年龄(chronological age)呈线性相关。因此，Glb1-2A-mCherry报告小鼠可用于筛选抗衰老药物。
此外，高GAC信号与心脏肥大以及预测的缩短寿命密切相关。在诸如由多柔比星和博来霉素诱导的心脏肥大和肺纤维化的病理性衰老中，GAC信号呈指数增加。
简要附图说明
下面结合附图对本申请进行说明，其中:
图1示出了构建Glb1靶向载体的策略及其鉴定结果。
图2示出了细胞和组织老化中增加的Glb1的mRNA和蛋白质水平。具体而言，图2的A-B部分说明了在复制衰老期间小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中Glb1、p16Ink4a和p21Wif1表达的mRNA水平升高(A)，以及SAβ-gal增加和形态扩大(B)。细胞传代数(P)被示出。比例尺，100μm。图2的C-D部分说明了从年轻(3个月大)和年老(24个月大)小鼠中分离的组织中Glb1、p16Ink4a和p21Wif1的mRNA(C)和蛋白质水平。图2的E部分说明了在年轻(3个月大)和年老(24个月大)小鼠的脑、肾脏和肝脏组织中检测到的SAβ-gal。比例尺，50μm。数据代表平均值±s.e.m.。*P<0.05，**P<0.005，***P<0.001，由学生t-检验计算。
图3说明了鼠组织中衰老标志物的组织化学分析。从年轻(3个月大)和年老(24个月大)小鼠中分离出的指定组织中GLB1、p16和p21的免疫组织化学染色。比例尺，100μm。
图4说明了GAC报告基因在细胞和组织水平的表征。具体来说，图4的A部分说明了Glb1+/C等位基因-Glb1-2A-mCherry报告基因的基因靶向策略示意图。P1、P2为用于靶向PCR验证的引物。图4的B-C部分说明了在指定的小鼠肺组织中Glb1和mCherry的相对mRNA水平(B)，以及显示相应蛋白质水平的代表性蛋白质印迹(C)。WT为Glb1+/+野生型小鼠；HE为Glb1+/C杂合小鼠；HO为Glb1C/C纯合小鼠。图4的D部分说明了Glb1+/C的MEF培养的第1至5代中Glb1和mCherry的mRNA水平之间的线性相关性。图4的E部分说明了在MEF晚期代数中显示的mCherry信号和mCherry蛋白水平升高且伴随有SAβ-gal染色增加的代表性图像。箭头表示大多数衰老细胞。图4的F部分为显示Glb1+/C小鼠脑切片中SAβ-gal染色和mCherry荧光信号的共定位的代表性图像。箭头表示具有共定位信号的代表性细胞。图4的G部分为显示Glb1+/C小鼠指定组织切片中Lamin B1染色和mCherry荧光信号的共定位的代表性图像。放大的区域显示了对Lamin B1和mCherry具有互斥信号的细胞。数据代表平均值±s.e.m.。**P<0.005，***P<0.001，由学生t-检验计算。比例尺，50μm。
图5说明了GAC等位基因的表征。具体而言，图5的A部分说明了使用图4A中所示的引物P1和P2在Glb1+/+、Glb1+/C和Glb1C/C小鼠中对野生型和GAC等位基因进行靶特异性PCR扩增。一条508bp的条带是从野生型等位基因中特异性扩增出来的，一条1324bp条带是GAC等位基因所特有的。图5的B部分示出了基因组测序数据，其显示了在Glb1基因的第16号外显子中正确且顺序地插入了2A编码序列和mCherry编码序列。图5的C部分说明了三种基因型的出生率分析。注意到Glb1+/+、Glb1+/C和Glb1C/C小鼠以预期的孟德尔比率出生。
图6A-6F说明了通过免疫荧光染色证实的mCherry信号特异性。具体而言，图6A-6B说明了代表性图像，显示了Glb1+/C小鼠心脏组织中mCherry荧光信号和抗mCherry(6A)或抗红色荧光蛋白(RFP)(6B)染色的共定位。图6C-F为显示来自Glb1+/C小鼠的脑、肺、肾和脾脏中mCherry荧光信号和抗RFP染色的共定位的代表性图像。比例尺，50μm。箭头表示具有红色和绿色荧光信号共定位的代表性细胞(上)和仅显示红色荧光信号的细胞(下)。
图7示出了mCherry在Glb1+/C组织中的免疫化学染色，其中，显示了在来自指定年龄的Glb1+/C和野生型小鼠的指定组织中的mCherry的免疫化学染色。比例尺，50μm。
图8图示了实时成像的GAC信号与寿命相关。具体来说，图8的A部分为显示在12个月(m)大的Glb1C/C、Glb1+/C和Glb1+/+小鼠中由IVIS LuminaⅡ系统检测到的实时GAC荧光信号的代表性图像。图8的B部分为显示从3个月大的Glb1+/+和Glb1+/C小鼠和19个月大的Glb1+/C小鼠中分离出的指定器官中的实时GAC荧光信号代表性图像。图8的C部分说明了一组指定年龄的Glb1+/C小鼠的代表性实时GAC荧光图像。Glb1+/+小鼠被包括作为背景对照。图8的D部分说明了一组27只9、11、13、15和17个月大的Glb1+/C小鼠的实时成像，并分析了GAC信号和实足年龄之间的线性回归。GAC信号与第9、11和13个月的实足年龄密切相关。X轴，小鼠的月份组；Y轴，涉及分析的月份组数；Z轴，线性回归的R2。图8的E部分为显示在中年小鼠(中年，9-13个月)中GAC荧光信号与实足年龄之间的线性相关性的图。应用85％置信区间来定义具有GAC高信号(GACH)的小鼠和具有低GAC信号(GACL)的小鼠。图8的F部分说明了具有高GAC信号和低GAC信号的中年小鼠之间的寿命比较。
图9说明了GAC信号与心脏老化和功能衰退相关。
图9的A部分说明了在具有高(H)和低(L)的GAC信号的Glb1+/C小鼠之间，以及中年(中年)和晚年(晚年)Glb1+/C小鼠之间，通过超声心动图确定的收缩期/舒张期左心室前壁(LVAWs/d)和收缩期/舒张期左心室后壁(LVPWs/d)的厚度的比较。H(顶部)和L(中间)组小鼠的代表性超声心动图图像显示在最右侧。图9的B部分说明了按GAC信号(H和L)或实足年龄(中年和晚年)分组的Glb1+/C小鼠的左心室舒张末期容积和收缩末期容积。图9的C部分说明了按GAC信号(H和L)和实足年龄(中年和晚年)分组的Glb1+/C小鼠的左心室射血分数和缩短分数。图9的D部分为示出了年轻和年老Glb1+/C小鼠的心脏切片中的mCherry荧光和抗mCherry染色的代表性图像。比例尺，50μm。
图10示出了与GAC信号不相关的参数。具体来说，图10的A-B部分说明了在显示高和低GAC信号的小鼠中，体重随时间的变化(A)和跑步活动(B)。图10的C-D部分说明了显示高和低GAC信号的小鼠在5天内的游泳速度和逃逸潜伏期。图10的E部分说明了高和低GAC信号小鼠以及中年和晚年小鼠在水迷宫试验中训练后24小时和72小时记录的穿过平台时间。
图11说明GAC信号在病理性衰老期间呈指数增强。具体而言，图11的A-B部分说明了DOX处理或未处理的Glb1+/C小鼠中的LVEDV和LVESV(A)以及LVEF(B)的情况。图11的C部分为显示Glb1+/C小鼠在DOX治疗之前(B/DOX)和DOX治疗之后(A/DOX)的GAC信号的代表性图像。9D，9天；#36、#37、#40：Glb1+/C小鼠；C：Glb1+/+小鼠；U：无关的老鼠。图11的D部分说明了C部分中GAC信号的量化。图11的E-F部分说明了来自DOX处理或未处理(CON)Glb1+/C小鼠的心脏的H&E(E)和Masson三色染色(F)。观察到心脏肥大和纤维化。比例尺，500μm(E)或100μm(F)。图11的G部分说明了DOX处理或未处理(CON)Glb1+/C小鼠的心脏切片中Glb1、mCherry和p21蛋白的免疫组织化学染色。比例尺，100μm。图11的H部分为显示Glb1+/C小鼠在博来霉素治疗前(B/Bleo)和博来霉素治疗后7天和14天(A/Bleo7D、A/Bleo14D)的全身GAC荧光的代表性图像。#35、#38、#39：Glb1+/C小鼠；C：Glb1+/+小鼠；#34，无关的老鼠。图11的I部分说明了H部分中GAC信号的量化。图11的J部分说明了Glb1+/C小鼠在用博来霉素治疗后14天的肺切片中的GAC信号和抗SMA染色。比例尺，50μm。图11的K部分说明了在用博来霉素治疗或未治疗(CON)后14天Glb1+/C小鼠肺切片的Masson三色染色。比例尺，100μm。
具体实施方式
为了进一步说明本申请，下面对Glb1重组报告基因、分离的构建体、转基因报告小鼠的制备方法和抗衰老药物的筛选方法相关的实验进行了详述。需要说明的是，以下示例仅用于说明而非限制本申请。
定义
如本文所述，“Glb1基因”是编码一种被称之为β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)的酶的基因这种酶位于溶酶体中，溶酶体是细胞内的隔室，可分解和循环不同类型的分子。在本文中，Glb1基因可以包括Glb1基因的各种天然存在的变体形式和同源基因。
如本文所述，“构建体”是指一种已经通过人为干预，使其含有按照自然界中不存在的序列的DNA片段的单链或者双链DNA分子。构建体包括表达载体。
如本文所述，“同源臂”是指与基因组中选定的基因靶向位点同源的用于载体与靶位点重组的DNA序列。在确定了基因靶向位点后，可以根据靶向位点附近的序列来进行同源臂设计。
如本文所述，“报告基因”是指在转染后其产物可以被轻松测定，可以用作筛选成功转染细胞的标记，用于研究基因表达的调控，或用作标准化转染效率的对照。
如本文所述，mCherry是从珊瑚(Discosoma sp.)中提取的一段序列，其编码红色荧光蛋白，其颜色和单体分子的光稳定性高。
如本文所述，2A序列是指核糖体跳跃序列(ribosomal skipping sequence 2A)，其是来自口蹄疫病毒的一段核心序列，具备“自剪切”功能，用于进行上游和下游基因共表达。
Glb1重组报告基因
根据本申请的第一方面，提供一种Glb1重组报告基因，其包括：在Glb1基因的终止密码子位点从5’至3’端方向顺序地插入的2A序列以及报告基因。所述Glb1基因与所述报告基因一起转录成单个mRNA，使得所述Glb1基因的转录水平与所述报告基因的转录水平显著相关。
根据本申请实施例的Glb1基因报告基因被证明可稳定表达溶酶体β-半乳糖苷酶和报告蛋白，并且Glb1的转录水平与报告基因的转录水平显著相关。通过使用体内成像技术监测报告蛋白的荧光信号，可以在体内观察SAβ-gal的活性。
在一实施例中，所述报告基因可以是EGFP、Mrfp、mCherry、mYFP或lacZ。
在一实施例中，所述报告基因可以是mCherry。mCherry能够编码具有高度光稳定性的红色荧光蛋白。使用mCherry有利于精确定位SAβ-gal活性。
在一实施例中，Glb1重组报告基因具有由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
在一实施例中，所述Glb1重组报告基因用于在活体动物内通过体内成像技术监测所述Glb1重组报告基因的蛋白水平来监测系统性衰老和功能衰退，其中，所述Glb1重组报告基因的蛋白水平通过mCherry荧光信号实现可视化监测。在该实施例中，因为mCherry荧光信号与SAβ-gal的活性相耦合，所以SAβ-gal活性可以在体内可视化，这有助于研究系统性水平的体内衰老/老化。
在一实施例中，所述Glb1基因是小鼠Glb1基因，其转录本Ensemble号为Glb1-201(ENSMUST00000063042.10)，并且具有由SEQ ID NO.2.所示的核苷酸序列。
在一实施例中，所述2A序列具有由SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。所述mCherry具有由SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。
分离的构建体
根据本申请的第二个方面，提供了一种分离的构建体，所述构建体用于靶向Glb1基因的终止密码子位点，所述构建体从5’至3’端方向依次包括：2A序列和报告基因。所述分离的构建体是基于Glb1基因的靶位点而设计的，以用于获得上述Glb1重组报告基因。
根据本申请实施例的构建体用于靶向Glb1基因的终止密码子位点，并且该构建体包括2A序列和报告基因。该构建体能够将2A序列和报告基因精确插入Glb1基因的预先设计的靶向位点，从而生成Glb1重组报告基因。
在一实施例中，报告基因是mCherry。
在一实施例中，分离的构建体进一步包括：位于所述2A序列的5’端的5’端同源臂，以及位于mCherry序列的3’端的3’端同源臂。
在一实施例中，所述构建体包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
在一实施例中，所述Glb1基因为小鼠的Glb1基因，且具有由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
在一实施例中，所述2A序列具有由SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。所述mCherry具有由SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。所述5'同源臂具有由SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；并且所述3'同源臂具有由SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列。
转基因报告小鼠的制备
根据本申请的第三个方面，提供了一种制备转基因报告小鼠的方法。该方法包括：将根据第二方面所述的构建体引入小鼠胚胎干细胞或者小鼠生殖细胞，获得包括Glb1重组报告基因的所述小鼠胚胎干细胞或者所述小鼠生殖细胞；并且利用包括所述Glb1重组报告基因的所述小鼠胚胎干细胞或者所述小鼠生殖细胞生成杂合子的转基因报告小鼠。其中，所述Glb1重组报告基因具有由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
根据本申请的转基因报告小鼠的制备方法是能够产生转基因报告小鼠(Glb1+/C)。转基因报告小鼠将SAβ-gal活性与mCherry信号耦合，可利用体内成像技术在体内进行观察，避免SAβ-gal染色的主观影响，能够实时监测活体动物的系统性衰老，从而有助于研究衰老机制和开发抗衰老干预措施。
在一实施例中，所述杂合子转基因报告小鼠的年龄在9至13个月龄之间。实验发现，在一组9至13个月龄的Glb1+/C小鼠中，存在GAC荧光信号与实足年龄之间的线性相关性。此外，高GAC信号与心脏肥大以及预测的寿命缩短密切相关。在诸如由多柔比星和博来霉素诱导的心脏肥大和肺纤维化的病理性衰老中，GAC信号呈指数增加。因此，年龄在9-3个月之间的杂合子转基因报告小鼠是一种很好的报告小鼠，其可用于监测体内系统性衰老和功能衰退、在早期预测寿命，有助于了解衰老机制并帮助开发抗衰老干预措施。
在一实施例中，所述转基因报告小鼠用于：通过体内成像技术监测所述Glb1重组报告基因的蛋白水平来监测系统性衰老和功能衰退、研究衰老机制或者筛选抗衰老药物制剂。
抗衰老药物的筛选
根据本申请的第四方面，提供了一种抗衰老药物的筛选方法，所述方法包括：提供包括第一方面所述的Glb1重组报告基因的转基因报告小鼠或者根据第三方面所述的方法制备的转基因报告小鼠；将候选药物施用于所述转基因报告小鼠；通过体内成像技术对所述转基因报告小鼠体内的所述Glb1重组报告基因的蛋白水平进行监测；并且如果候选药物选择性地杀死了具有Glb1重组报告基因的高蛋白水平的细胞，则选择所述候选药物作为抗衰老药物，其中，所述Glb1重组报告基因的所述高蛋白水平采用85％置信区间定义。其中，所述转基因报告小鼠是9-13个月龄的杂合子的转基因报告小鼠。
在根据本申请实施例的抗衰老药物的筛选方法中，采用9-13个月龄的Glb1+/C小鼠，其GAC荧光信号(表示重组Glbl基因，Glb1-2A-mCherry)与实足年龄呈线性相关。此外，高GAC信号与心脏肥大以及预测的缩短寿命密切相关。在诸如由多柔比星和博来霉素诱导的心脏肥大和肺纤维化的病理性衰老中，GAC信号呈指数增加。因此，Glb1-2A-mCherry报告小鼠可用于筛选抗衰老药物。
在一实施例中，所述Glb1重组报告基因的蛋白水平通过mCherry荧光信号实现可视化监测。
在一实施例中，抗老化药物包括用于治疗CVD、AD、骨质疏松和肺纤维化的药物。
在一实施例中，通过标准途径，包括口服、吸入或肠胃外给药，将候选药物给药至转基因报告小鼠。在一实施例中，候选药物的给药量是根据转基因报告小鼠的重量确定的。
材料和方法
供体载体的构建
使用融合克隆方法构建靶向Glb1基因的终止密码子位点的供体载体。供体载体包括4.3kb的5'同源臂、0.8kb的2A-mCherry和4.4kb的3'同源臂。Glb1靶向载体的构建策略如图1的A部分所示。Glb1靶向载体具体包括以下部分：复制起始位点、氨苄青霉素抗性筛选基因、5'同源臂、2A序列、mCherry序列、聚腺苷酸拖尾信号、土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE，用于增强RNA转录的稳定性)以及3'同源臂。
限制性消化电泳图如图1的B部分所示。其中，E：EcoRV限制性内切酶消化结果，理论条带大小为10.8kb、4.5kb、0.1kb(0.1kb条带未显示，因为产物的量太小)；M：1kbDNA阶梯。
小鼠模型
Glb1-2A-mCherry敲入等位基因(Glb1+/C)是由上海南方模式生物科技发展有限公司(Shanghai Biomodel Organism Science&Technology Development Co.Ltd.)(上海，中国)使用CRISPR/Cas9系统产生的。敲入策略如图4的A部分所示。简而言之，将2A肽和mCherry的编码序列依次添加到Glb1开放阅读框(ORF)的3'端，从而生成一个编码Glb1-2A-mCherry融合肽的新开放阅读框。期望利用2A肽的“自切割”特性产生Glb1和mCherry肽。
所述敲入位点具体位于Glb1基因的16号外显子，Glb1基因的16号外显子的敲入位点的上下游分别表示如下：
GACCCCAGAGCTGTGTACAGTAGAGTTTGTTGACACTCCGGTCATTTCCTGACCTGACTTGACCATCG GTGGCCATTTTCCAAGCCAGTCTGGTCAAGACTCATGGCTGAACCTCTGAGACTGAGCCT(SEQ ID NO.8)
向导-RNA的靶序列设计如下：
gRNA1:TGGCCACCGATGGTCAAGTC AGG(SEQ ID NO.9)
gRNA2:ACCGATGGTCAAGTCAGGTC AGG(SEQ ID NO.10)
将Cas9mRNA、gRNA和供体载体显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，获得F0代小鼠。通过长片段PCR鉴定，共获得1只同源重组正确的F0代小鼠；F0代小鼠与C57BL/6J小鼠交配，获得5只阳性F1代小鼠。动物实验是根据在教学和研究中使用活体动物委员会批准的伦理和科学协议进行的。
体内荧光成像(mCherry检测)
Glb1+/C小鼠中的GAC信号使用IVISLuminaⅡ系统(CaliperLifeSciences，USA)成像。广角镜头用于同时捕捉>3只动物的图像。使用分档为4(中)、F/Stop为2、535nm激发滤光片和DsRed发射滤光片来拍摄图像。LivingImageSoftware(CaliperLifeSciences)用于比较在同一曝光时间拍摄的多张图像。
莫里斯水迷宫
Glb1+/C小鼠在圆形注水盆(直径为160cm和高度为50cm)中训练。每只小鼠每天进行四次试验，连续5天，试验间隔为15分钟。第一天被指定为训练第1天，最大试验时长为60秒。如果老鼠没有在规定的时间内到达平台，它们会被人工引导到平台上，并在那里停留15秒。获得任务5天后，分别在24小时和72小时后进行探针试验，以评估小鼠的短期和长期记忆巩固情况。移除平台，将小鼠置于与原始平台象限相对的池的象限中。在每次探针试验中，小鼠被允许游泳60秒。记录小鼠在原始平台象限内停留的时间和越过平台位置的次数。使用HVS水迷宫程序记录所有试验，用于后续分析逃逸潜伏期和游泳速度(WaterMaze3，Actimetrics)。
超声心动图评估
Glb1+/C小鼠通过吸入1.5-2％异氟醚气体进行麻醉，然后进行经胸超声心动图(Vevo2100ImagingSystem,VisualSonics)检查。记录心率、心输出量、LV射血分数、LV缩短分数、LV舒张末期容积和前壁厚度；LV收缩末期容积和后壁厚度。
多柔比星诱导的心脏衰老/肥大
在一周的时间跨度内每隔一天向三只16个月大的Glb1+/C小鼠以腹膜内注射方式注入多柔比星(DOX)(4mg/kg体重)，累积剂量为12mg/公斤。在第一次注射后4天和8天，通过Vevo2100成像系统获取超声心动图参数。在第9天使用IVISLuminaⅡ系统测量总体GAC实时信号。然后处死小鼠，收集心脏样本用于进一步分析。
博来霉素诱导的肺上皮衰老
三只16个月大的Glb1+/C小鼠以3mg/kg的剂量接受在PBS(NipponKayaku)中的博来霉素的气管内滴注。治疗后第7天和14天，使用IVISLuminaⅡ系统测量总体GAC信号。在第14天处死小鼠，并收集肺样品用于进一步分析。
细胞培养
在妊娠第13.5天从胚胎中分离Glb1+/C和野生型MEF细胞。MEF细胞每3天传代一次，并保持在含有10％FBS(PANSERATECH，德国)、GlutaMAX(Gibco)、非必需氨基酸(NEAA)(Gibco)、青霉素和链霉素(Gibco)的DMEM中，置于37℃含5％CO2的加湿培养箱中培养。
蛋白质印迹
在RIPA缓冲液(20mMTris-HClpH7.5、150mMNaCl、1mMEDTA、1mMEGTA、1％NP40、1％TritonX-100、1％脱氧胆酸钠、0.1％SDS、1mMPMSF和蛋白酶抑制剂混合物)中裂解细胞和组织，使用PierceTMBCA试剂盒(23227，ThermoFisher)对蛋白质进行定量。蛋白质样品进行SDS-PAGE电泳并转移到PVDF膜上。用含5％脱脂牛奶的TBS-T缓冲液(TBS缓冲液，10mMTris-HClpH7.5，150mMNaCl，含0.1％Tween-20)封闭后，将膜与相关一抗在4℃下孵育过夜。随后加入偶联HRP的二抗并在室温下孵育1小时，然后使用ECL底物溶液(34578，ThermoFisher)进行检测。
免疫荧光染色
MEF细胞和冷冻组织切片在4％多聚甲醛(PFA)中固定5分钟，并用0.2％TritonX-100渗透5分钟。用3％BSA封闭1小时后，将样品与一抗在4℃下孵育过夜，随后与荧光偶联的二抗在室温下再孵育1小时。用DAPI染色细胞核后，将样品安放在抗褪色培养基中并用玻璃盖玻片覆盖。所有图像均使用DragonFly共聚焦成像系统(Andor)进行采集。
衰老相关的β-半乳糖苷酶的染色
根据制造商的方案，用衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒(9860，CellSignaling)制备冷冻组织切片和体外培养的MEF细胞用于SAβ-gal染色。将组织切片置于染色缓冲液中，置于干燥培养箱中，37℃培养20-24小时以显色，MEF细胞培养16小时。为了分析组织中mCherry荧光和β-半乳糖苷酶染色的共定位，将切片在1％PFA中固定10分钟，然后进行常规染色。
RNA提取和q-RT-PCR
在TRIzol试剂RNAisoPlus(Takara,Japan)中裂解细胞和组织，并根据制造商的说明提取总RNA。使用NanoDrop分析RNA的质量和浓度。来自每个样品的总共2μgRNA用于cDNA合成，并使用Hieff qPCR SYBR Green Master Mix(11201，Yeasen)在CFXConnect实时系统(Bio-Rad)上进行定量PCR(qPCR)。通过对gapdh值进行标准化来量化相对基因表达。
苏木精-伊红、免疫组织化学和Masson三色染色
如前所述进行苏木精-伊红(H&E)和免疫组织化学(IHC)染色。简而言之，对于H&E染色，将PFA固定的组织的石蜡包埋切片脱蜡和复水，然后按照苏木精染色、分化、发蓝处理、脱水、伊红染色、清除并添加盖玻片的顺序进行处理。对于IHC染色，使用3,3'-二氨基联苯胺(DAB)染色方法。使用封闭溶液(PV-6001，ZSGB-BIO，中国)封闭内源性过氧化物酶。用血清封闭后，进行一抗和生物素化二抗孵育步骤，并加入链霉亲和素-HRP，使用DAB底物(8059，Cell Signaling)使信号颜色显色。按照制造商的说明，使用来自Solarbio(G1340，Solarbio，中国)的试剂盒进行Masson三色染色。
统计分析
[1]用GraphPad Prism 7软件(GraphPad Software Inc.,USA)进行统计分析。采用Kaplan-Meier法和log-rank检验分析生存率，采用线性回归计算决定系数(R2)，应用85％置信区间来确定GACH组和GACL组，其他数据均使用未配对的学生t-检验进行分析。数据表示为三次独立实验的平均值±s.e.m.。P<0.05被认为表明具有统计学显著差异。
示例1：Glb1水平标记细胞衰老
尽管SAβ-gal已被广泛地用作衰老标记，但对其编码基因Glb1的研究却很少。我们研究了Glb1转录水平、β-半乳糖苷酶活性和其他衰老标记之间的相关性。如SAβ-gal、p16Ink4a和p21Wif1表达的增强以及细胞形态扩大(图2的A-B部分)表明，体外培养的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)在第7代(P7)经历连续复制衰老。与此一致的是，Glb1的mRNA水平也随着传代的增加而逐渐增加。因此，Glb1转录水平可用作替代的细胞衰老标志物。
我们接下来研究了从幼年(EA，2至8个月[m]，以3m为代表)、中年(中年，9-14m，以12m为代表)和晚年(晚年，15-27m，以24m为代表)小鼠中获得的各种组织中Glb1表达的水平。与幼年组相比，晚年组在包括脑、心、肝、肺、肾、脾的所有检查的组织中，Glb1的mRNA水平均明显上调(图2中C部分)，与来自晚年小鼠的各种组织中的p16和p21的上调呈现一致。与幼年小鼠相比，在晚年小鼠组织的蛋白质印迹和免疫组织化学(IHC)染色中观察到Glb1、p16和p21蛋白的类似上调(图2的D部分和图3)。在晚年组的脑、肝和肾组织切片中检测到SAβ-gal。尽管如此，Glb1表达水平可用作体外和体内细胞和组织衰老标志物。
示例2：Glb1-2A-mCherry报告小鼠的产生和表征
为了测试Glb1表达水平是否在时空上指示生理老化，我们使用CRISPR/Cas9系统在C57BL6/J小鼠中生成了GAC报告基因(图4A)。通过目标特异性PCR和测序(图5的A-B部分)证明了GAC等位基因的成功敲入，并且Glb1的mRNA和蛋白质的表达不受影响(图4的B-C部分)。杂合子和纯合子GAC小鼠均以预期的孟德尔比率出生并正常发育成成年(图5的C部分)，它们的总体寿命与野生型同窝小鼠相当(参见后续研究的数据)。
[2]在连续体外培养期间，Glb1+/C小鼠的MEF中的mCherry的mRNA水平与的Glb1的mRNA水平线性且显著相关(图4的D部分)。经历复制衰老的Glb1+/C小鼠的MEF在传代至P7时表现出高水平的mCherry荧光信号(以下称为GAC信号)(57.2±4.5％阳性细胞)，在传代至P5时表现高的SAβ-gal染色水平(29.7±1.4％阳性细胞)，以及在传代至P5时表现出高的mCherry蛋白水平(通过免疫荧光染色检测)(57.2±5.0％阳性细胞)(图4的E部分)。重要的是，在Glb1+/C小鼠的多个组织中，包括脑、心脏、肌肉、肝、肺、脾、肾和结肠，尤其是在SAβ-gal阳性但Lamin B1染色阴性的细胞中，检测到了GAC信号(图4的F部分和图4的G部分)。GAC荧光信号对mCherry蛋白的特异性在Glb1+/C小鼠的所有检查的组织中通过使用抗mCherry和/或抗红色荧光蛋白(RFP)的抗体免疫荧光和免疫组织化学染色得到证实(图6A-6F，图7).
示例3：中年小鼠中高GAC与缩短的寿命相关
我们很好奇是否可以对GAC信号进行实时成像以预测老化和/或寿命。因此，我们使用体内成像系统(IVIS)检测GAC信号。年龄匹配的野生型小鼠被包括作为背景对照。GAC信号在全身水平以及个体器官水平上，包括大脑、心脏、肝脏、肺、肾脏和脾脏，被成功获得(图8的A-B部分)。接下来，检查了一组27只不同年龄(9到17m)的Glb1+/C小鼠。为了便于分析，将小鼠分为五组：9m±2周(w)、11m±2w、13m±2w、15m±2w和17m±2w。图8的C部分显示了具有代表性的实时荧光图像。出乎意料的是，没有观察到GAC信号与实足年龄之间的明显相关性，晚年小鼠的整体GAC信号甚至下降了(图8的E部分)，这表明GAC信号与实足年龄之间的相互作用更为复杂。然后，我们筛选了可能显示GAC与实足年龄之间有意义的相关性的可能年龄阶段。相当惊人的是，在中年组(9m、11m和13m)中观察到GAC信号(以月为单位的特定年龄的平均值)与实足年龄之间的线性相关性(图8的D部分，R2＝0.9864，n＝20)。结果表明，中年Glb1+/C小鼠的GAC信号随着年龄的增长逐渐增加(图8的E部分)。这些发现表明，GAC信号可能是生命早期而非晚期的体内衰老指标。因此，我们将重点放在中年组上进行进一步研究。
时程老化是组织/器官、系统性退化和存活的有力指标。鉴于中年小鼠中GAC信号与实足年龄之间的密切相关性，当实足年龄尚未预测存活时，我们探讨了GAC信号是否可作为系统性衰老和寿命的早期指标。我们应用了85％的置信区间，并根据GAC信号(图8的E部分)将小鼠重新分组为高GAC组(GACH)和低GAC组(GACL)。最引人注目的是，在中年阶段检测到GACH的小鼠似乎比GACL的小鼠死得更早(图8的F部分，p＝0.0154)。相比之下，GACH和GACL中年小鼠之间的体重变化可以忽略不计(图10的A部分)。因此，GAC信号可以预测中年阶段的期望寿命。
示例4：GAC信号与心功能下降相关
除了结构退化之外，通过几乎所有器官系统的功能缺陷，例如心脏功能障碍和认知能力下降，来标志衰老。因此，我们对这些小鼠进行了一系列行为和功能测试。为了与时程老化比较，我们加入了额外的20m和24m(n＝13)的小鼠。我们发现Glb1+/C小鼠的跑步活动不受GAC或实足年龄的显著影响(图10的B部分)。当对小鼠进行水迷宫分析时，GACH和GACL的Glb1+/C小鼠之间的游泳速度和逃离潜伏期几乎没有差异(图10的C-D部分)。穿过平台的时间(24小时、72小时)反映了短期/长期记忆，仅显示中年阶段的GACH和GACL的Glb1+/C小鼠之间的细微差异(图10的E部分)。因此，GAC信号不太可能与学习能力和记忆相关。
我们接下来通过超声心动图检查了心功能。所观察到收缩期/舒张期左心室前壁(LVAWs/d)、收缩期/舒张期左心室后壁(LVPWs/d)的厚度，左心室舒张末期容积(EDV)、收缩末期容积(ESV)，射血分数(EF)或缩短分数(FS)在中年和晚年组之间无明显变化(图9的A-D部分)。这些发现表明时程老化对心脏结构和功能的节段性和多效性影响。有趣的是，中年阶段的Glb1+/C小鼠中，GACH组的LVAWs/d和LVPWs/d显著地比GACL组高，而GACH组的EDV和ESV显著比GACL组低(图9的A-B部分)。与GACL小鼠相比，GACH小鼠的LVEF和LVFS显著增加(图9的C部分)。荧光和免疫组织化学显微镜显示，mCherry荧光信号和蛋白质水平在老年Glb1+/C小鼠中升高(图9的D部分)。因此，当小鼠时程上还年轻时，GAC信号与心脏肥大和功能衰退相关。
示例5：病理性衰老呈指数增强GAC信号
我们接下来检查了GAC信号是否可以用于监测病理老化。为此，我们使用DOX来诱导心脏衰老/肥大。DOX治疗后第4天和第8天，Glb1+/C小鼠的EDV没有变化，但ESV降低，这表明适应性心脏肥大反应(图11的A部分)。这与经DOX处理的小鼠中LVEF升高相符(图11的B部分)。引人注目的是，在DOX治疗后8天，全身GAC信号呈指数增加(图11的C-D部分)。进一步的组织学分析证实了在DOX处理的Glb1+/C小鼠中，存在心脏肥大(图11的E部分)、心脏纤维化增加(图11的F部分)以及Glb1、mCherry和p21的表达增加(图11的G部分)。
此外，用博来霉素(一种诱导肺上皮衰老的DNA损伤试剂)处理过的小鼠显著性地降低了它们的体重。博来霉素治疗后的1至2周内，全身GAC信号显著增强了多达100倍，并在7天左右达到峰值(图11中的H-I部分)。这与组织学数据是一致的，其中，组织学数据显示经博来霉素治疗的Glb1+/C小鼠的肺切片中GAC荧光信号(图11的J部分)和纤维化(图11的K部分)增加。因此，GAC信号可用于可视化病理性衰老/老化，例如DOX诱导的心脏衰老和博来霉素诱导的肺上皮衰老。
虽然已经示出和描述了本申请的特定实施例，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，可以在不脱离本申请的更广泛方面的情况下进行改变和修改，因此，所附的权利要求书的目的是将涵盖落入本申请的真实精神和范围内的所有此类变化和修改。
序列表
<110> 深圳大学
<120> GLB1重组报告基因、分离的构建体以及制备转基因报告小鼠的方法
<130> PCT214993
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Glb1-2A-mCherry, GAC
<400> 1
gatgctggac tctatggggc atctgttgcc tctctgatac tagtgttcct cagctgacaa 60
cctctctctc tctctccctc tctctctctc tcttcctctc tctccctctc tctctctctc 120
tctctctctc tctctagggt caagtatgga tcaatggctt taacctcggc cgatactggc 180
ccacaatggg cccacaaaag accttgttcg tgccaaggaa catcctgacc acttcagccc 240
caaacaacat cacagtgttg gagctagagt ttgcaccctg cagcgagggg accccagagc 300
tgtgtacagt agagtttgtt gacactccgg tcatttccgg tagcggagct actaacttca 360
gcctgctgaa gcaggctggc gacgtggagg agaaccctgg tcctatggtg agcaagggcg 420
aggaggataa catggccatc atcaaggagt tcatgcgctt caaggtgcac atggagggct 480
ccgtgaacgg ccacgagttc gagatcgagg gcgagggcga gggccgcccc tacgagggca 540
cccagaccgc caagctgaag gtgaccaagg gtggccccct gcccttcgcc tgggacatcc 600
tgtcccctca gttcatgtac ggctccaagg cctacgtgaa gcaccccgcc gacatccccg 660
actacttgaa gctgtccttc cccgagggct tcaagtggga gcgcgtgatg aacttcgagg 720
acggcggcgt ggtgaccgtg acccaggact cctccctgca ggacggcgag ttcatctaca 780
aggtgaagct gcgcggcacc aacttcccct ccgacggccc cgtaatgcag aagaagacca 840
tgggctggga ggcctcctcc gagcggatgt accccgagga cggcgccctg aagggcgaga 900
tcaagcagag gctgaagctg aaggacggcg gccactacga cgctgaggtc aagaccacct 960
acaaggccaa gaagcccgtg cagctgcccg gcgcctacaa cgtcaacatc aagttggaca 1020
tcacctccca caacgaggac tacaccatcg tggaacagta cgaacgcgcc gagggccgcc 1080
actccaccgg cggcatggac gagctgtaca agtaactgtg agcactgaac gcctactcga 1140
gccctcagtc tcctgtcaag gacttgacca tcggtggcca ttttccaagc cagtctggtc 1200
aagactcatg gctgaacctc tgagactgag ccttggggag cacagctcta ctctggttac 1260
acggatcacc tttgttgtgc tagaatggaa gctacatttc tggaatgtgt gtaccctgct 1320
ggtg 1324
<210> 2
<211> 1944
<212> DNA
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 2
atgctccggg tccccctgtg tacgccgctc ccgctcctgg cactgctgca actgctgggc 60
gctgcgcacg gcatctataa tgtcacccag aggacattta agctcgacta cagccgggac 120
cgcttcctca aggatggaca gccattccga tacatctcgg gaagcattca ttacttccgg 180
ataccccgct tctactggga ggaccggctg ctgaagatga agatggctgg gctgaatgct 240
atccagatgt acgtgccctg gaacttccat gaaccccaac caggacaata tgagttttct 300
ggggaccgtg atgtggagca tttcatccag ctggctcatg agctgggact cctggtgatc 360
ctgaggcctg ggccctacat ctgtgcagag tgggacatgg ggggcttacc tgcttggcta 420
ctagagaaac aatctatcgt tctccggtct tctgacccag actaccttgt agctgtggat 480
aaatggctgg cagtccttct gcccaagatg aagcccctgc tctaccagaa cggaggaccg 540
atcataaccg tgcaggttga gaatgagtac gggtcctact ttgcctgcga ttacgactac 600
ctacgcttcc tggtgcaccg cttccgctac catctgggta atgacgtcat tctcttcacc 660
accgacggag caagtgaaaa aatgctgaag tgtgggaccc tgcaggacct gtacgccaca 720
gtggattttg gaacaggcaa caatatcaca caagctttcc tggtccagag gaagtttgaa 780
cctaaaggac ctttgatcaa ttctgagttc tatactggct ggctagacca ctggggtaaa 840
ccccattcca cggtgaaaac taaaacactg gctacctccc tctataacct gcttgcccgt 900
ggggccaacg tgaacttgta catgtttata ggtgggacca attttgccta ttggaatggt 960
gccaacacgc cctatgagcc acagcccacc agctatgact acgacgcccc actgagcgag 1020
gctggggacc tcactaagaa gtattttgct cttcgagaag tcattcagat gtttaaagaa 1080
gtcccagaag gccctatccc tccgtctaca cccaaatttg catatggaaa agttgctctg 1140
agaaagttca agacagtggc tgaagctctg ggtatcctgt gtcccaatgg gccagtgaaa 1200
agcctctatc ccctgacatt cactcaggta aaacagtatt ttgggtatgt gctgtaccga 1260
acaacgcttc ctcaagattg cagtaacccg aaacccattt tctcttcacc cttcaatggt 1320
gtccgtgatc gggcttacgt ctctgtggac ggggtccccc aaggaatcct tgatcgaaac 1380
ctcatgacag ctctgaacat acgggggaag gctggagcca cgctggacat cctggtggag 1440
aacatggggc gtgtgaacta tggcagattc atcaatgact tcaagggttt gatttccaac 1500
atgactatca actccactgt cctcaccaac tggacggtct tcccactgaa cactgaggcc 1560
atggtacgca accatctctg gggccgggag gccagtgatg agggtcacct tgacggacgg 1620
tcgacctcca attcttcgga cctcatactc cccacctttt acgtgggcaa cttctccatc 1680
ccctcgggca tcccagacct gccacaggac accttcatcc agtttcctgg gtggtccaag 1740
ggtcaagtat ggatcaatgg ctttaacctc ggccgatact ggcccacaat gggcccacaa 1800
aagaccttgt tcgtgccaag gaacatcctg accacttcag ccccaaacaa catcacagtg 1860
ttggagctag agtttgcacc ctgcagcgag gggaccccag agctgtgtac agtagagttt 1920
gttgacactc cggtcatttc ctga 1944
<210> 3
<211> 9538
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向小家鼠 GLB1d的16号外显子的构建载体，包括 5'臂 - 2A-mCherry-3'臂
<400> 3
gagtgggagc atttgaacct tgaggacaga cctccacgtt tcccgatttg agccctccga 60
gcacccatat ttcctttagt atagtctatt acctcgttgt ctttgtgttt tttaaacagg 120
gcctcactat gctgccctgg ctgtcccaga acttgttcag gagaccaggc tgatcttgaa 180
cttaaaaatc tacctgcctc tgcctcccgt atgctgggac taaagggatg tgctaccatg 240
atcaacctat attcacgttt aaggggcatc tgaatatctt aaaacagtat tgaggggtgg 300
atatggtggc gcaagctttt aatcccagcg cttggacggc agaggcaggg agagttctgc 360
tttctgggcc agcctggtct gttgagaccc tatctcaaac aaagtaaaag acagtattga 420
aagtttaact ctagggtctg gagagatggc tcagcagtta ggtgcactgg ttgctcttcc 480
agaggaccca ggttcaattc ccagcaacca cgtggcagct caccactata actctagttc 540
cagaagatct gatgccctca cacagacaga caggcaaaac accaatgtgc atgaagtaaa 600
aataaattta aaaaagaaat aaagcttcac tgtaaattct aggaagattg gctttgtccg 660
ggtaagttaa ggcagacaca cactcactga gaagtaggtc aggccctaac aggaacttcc 720
gctttgccgt cacctctgtg ttaatagcag aaggtagaag tgtgggctgg ggtcatgatg 780
gtcagagata gtcgacttct gccatggact gtagaagttg ggactgccat gggacacccc 840
caagcccctg cagtcacctc attagtatat ccttttggtt taccaagaat aatgtaccaa 900
gaataatttc agcatatatt tttctgtttg gtctttagtg gcagggtttc acactgtagc 960
ctagactagc caaatgtgct aagcaagagt cctttactaa gctatactct caactctttc 1020
agcataaatt ttacttattt ttaaaattat ttagttactt agttcagttt ttccaaggca 1080
gcgtttctct ttgtaacacg atagccaggg ctatgtagag aaaccctgtt tcaataaata 1140
aataataagc aggttagtaa aaataaaaat aaagaaagcc tttaaaactt ctagctggaa 1200
gcctagtgtg gtggtccaca cttattaccg tagcactaca gactcagagg ctggggagtc 1260
actacaaatt caaggtcagc atgtctatat agcaagttcc aagccagctg gggctactag 1320
caaaaccaaa gaagaactaa aaccttaccc taaggccaat gaggtacttt aaccccagca 1380
cttggggagg cagaggcagg taggttgatt gatctctgag gccagcctgg tctacagagc 1440
aagttccagg acagccaggg ctatacagaa accttgtctt ggtggaaata atacatacaa 1500
acaaaaacaa ttaaaaagtt ttttaaaatg ttgttgacag cactgttatt aagaacacaa 1560
agctagaaac acctgagtac ccattttcag tagtgaagga gtgagtagcc atccgcatat 1620
ttttctaggg aatgcagtgt cgtggcagca cgcacaggcc ccgctttaat ccctaacact 1680
gaagaaaagg cgggagcagg gaacaatgta ttagtcaggc atgctggcac atgcctgtag 1740
ccccagcgta caagagtcca aagtagaggg attatgaatt tgaggttatc ctggactaac 1800
atataaaaaa aagaaaaaag tccccaaagc taattggtat atccgtacca ttgaatgtca 1860
tatgtttaaa acaataatgc atatatacac ttatttgtgc atgtatgtgt gtgagtgtat 1920
gtggtatgtg catgtacatg tgtgctatgc tcctgtgtac aggggaggag gtcagagaaa 1980
tcaaagtgtc ctgccctggc tctccacctt acccccttga gacagactct ctttctgaac 2040
ctggagctgg gctggagacc agtaagctcc cgtggtcctc tgtctcagtc tcccacaaca 2100
ctggcattgc aggcatggga aagacggcac ctagctcatt tatgtggttg ctggggactt 2160
gaacgtgtgt cctcatgctt gcccggcatg gctcttaccc actgggccat cttcccagcc 2220
tatttatgta cactggcaca taggtaaaaa ttagtcaaaa ctaattcagg gcaactgaaa 2280
tcaggagctg gtcttaagac cgtgaaaaca ggattctggc agagatgggg ctgataaagc 2340
ccaggtgaaa ctattatggt ttatgccttt caggacggag agagataaca gatcccgagt 2400
aaaaacaaga gttaaagtag ttctgagaac ctcgaaactg ccaccctttt ctaaatgact 2460
tagtccaaca gacaggcagt tctgagtcgc tgacctcctt ctgtgagcac tgaacgccta 2520
gagcttttgt ttcagtggta agtggtgccc acactgaacc aggagtacag cccatctgca 2580
ccccactcct tgcaccaggc actaggctga ccaccaaaat gtgctgtgcc cccctagcac 2640
ataattcata atcatctcct accatagcct cccaagggct aaaattacag cacccacccc 2700
attcaccctt gcttccatct tgggctgctt tggggaccgt tctcaaacta catggactct 2760
gtgttgccat cgaccctggg agggggaaaa ttaaatggag acctgcctga gttcagacag 2820
ctagcagcag gcaagaataa gatgggaaac caggaaagaa atccaggtgg actggaataa 2880
agccaaggga agttttatta tccctgcagt ctcggcactt cagaggcaga ggcaggagga 2940
ttatctggac tagatagttc aggctagtct gctgtacaga aagactgtgc aaatattaat 3000
tgtttatttt aaaatgagca ggaggggccg ggcatggtgg ccagcattcg ggaggcagag 3060
gcagatggat ttctgagttc gaggccagcc tggtctacag agtgagttcc aggacagcca 3120
gagctacaca gagaaaccct gtctcgaaaa accaaaaaaa acaaaaaaac aaaaaaaatg 3180
agcaggaggg accaccacga ggaccactct ctttccttcc ttctctcctt tcttgtcccc 3240
tctgcccttg ccctctagaa cttccctcct cttccagatc ttctgtttac ctctggcatg 3300
tgtgacccca caccaccccc agcaccccca gcagactatt ccatctgttc tgtagcccct 3360
cgaaccctga gtgcgtcttt tccagaagca gtgtccctgc tcacaggagt catccccaca 3420
gcttgcaaga ctgaaaatct tgtcttccaa gccattctcc ccacatccct cggaggaaag 3480
ctacaagaac cacacaccca acaataatgt agacactctc ctgtgtaggc ctctgctccc 3540
atccccgtct cgtcccaccg ctgtggctta cgcccactat attgcccagg ctgccttcag 3600
actcagactg atcctcctac cgtagcctct cgcatgctga ggttgtagca cctgcggcac 3660
acgccctcac attcttcccg gggttgtttg ggaaacagtt cttagactat gttcaggctt 3720
tatgcacgtc aggcgacatg gctgagctct gcctctgtgg ggcagagagc aaggaagact 3780
ctcctgctga agggtgtggg cagccatagc agagagggtt ggggtacaga caggcagttc 3840
ctgggagcca gggtggatct cagaatgtgc tgaggtgtgg cccaagactg gtctgtagct 3900
tctgaatctg aggctccaaa attcgtttct tctgcagcag gaattggtat ttggaagaag 3960
ctctaccacc taacatggga tactgggatg ctggactcta tggggcatct gttgcctctc 4020
tgatactagt gttcctcagc tgacaacctc tctctctctc tccctctctc tctctctctt 4080
cctctctctc cctctctctc tctctctctc tctctctctc tagggtcaag tatggatcaa 4140
tggctttaac ctcggccgat actggcccac aatgggccca caaaagacct tgttcgtgcc 4200
aaggaacatc ctgaccactt cagccccaaa caacatcaca gtgttggagc tagagtttgc 4260
accctgcagc gaggggaccc cagagctgtg tacagtagag tttgttgaca ctccggtcat 4320
ttccggtagc ggagctacta acttcagcct gctgaagcag gctggcgacg tggaggagaa 4380
ccctggtcct atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat 4440
gcgcttcaag gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga 4500
gggcgagggc cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg 4560
ccccctgccc ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta 4620
cgtgaagcac cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa 4680
gtgggagcgc gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc 4740
cctgcaggac ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga 4800
cggccccgta atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc 4860
cgaggacggc gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca 4920
ctacgacgct gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc 4980
ctacaacgtc aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga 5040
acagtacgaa cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaagta 5100
actgtgagca ctgaacgcct actcgagccc tcagtctcct gtcaaggact tgaccatcgg 5160
tggccatttt ccaagccagt ctggtcaaga ctcatggctg aacctctgag actgagcctt 5220
ggggagcaca gctctactct ggttacacgg atcacctttg ttgtgctaga atggaagcta 5280
catttctgga atgtgtgtac cctgctggtg actttgcagc cccgccttgc ctgacctccc 5340
accctagtgg ccaccgggaa ggctgaaggg agtggacacc acaggaagac acaggttgga 5400
gcaaaacttg aataatgtcc tttatcctga tttgaaataa tcacgtcatc tttctgctga 5460
ataaaattgg tttgcaagtt gtgggggtcc tgtcattaat atatcaggca ggtattaaac 5520
tccagggtct gacttaaatc tcaactagac ctgagtgggc tgcctgaagc tacttcacca 5580
gcttgaggta caaagtgggt agaagagaga gctggtttgg gtgagaagag ggctttgttt 5640
ttgatcctgc tttgactatt tctgaatctc tgtgatatct gcttggtgag agatctccag 5700
ttataaacca tctaaaagat taatagttgc tcaaagtagg tagtatggtc tctctataca 5760
attgaataga attctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctcct 5820
ctctctctct gtgtgtgtgt gtgtgttcat gttcatgtat gtatgaagtt gcatgtatat 5880
gcatgtatgt atgcaggtca gaggcccatc ttgggtgtca tttctcagga atgtcttagt 5940
atctaggcac atacaggatg tataaaatgt aattctgctt atgtttgaga ccctgtctcc 6000
aaaaaaaaaa agtgttaacg tggggctggt ctgtagctaa gttgataaaa cacgtttgtt 6060
tgtcatgcaa gaagcactgg gttctctccc tagcagtgca caaaaccagg catgatagta 6120
catgttgtgg ttataaaaag ataaagaggt ctaagaacat gttctatggg ggtgtggtga 6180
ggtgtgtgtg tgggtgcctc ggcaggccca tgccaagaca tcccttccct ctaaaggact 6240
agccccccca cacacacaca cacacaccac gacagtatag tatagaatag agtttattta 6300
gggcatgggg aggggagcta agatggtagt agagacagag agagggagag agtagagaag 6360
tagaggctgg ccaggacaaa gtgaagagag ggggaaaggg gatggggaga gggggaacaa 6420
gggagcaaga ggcaagagag taagagagag aggagggggc aagcagccta cctgggtttt 6480
gctaggtaac tgtgggatgg agtttagaca gaatgctaac agtacacaca cgtgtaatag 6540
cattcaagaa gtgagaggag agcactgaag tccaagttta tcctcagcta cacagcgggg 6600
tccgtacctt gtgttatatg taaccctgtc tcaaaaaaat aataatatga ttgcatctga 6660
gtggtaaaca tttgggtact tggctacatt tcctaaccta tactttaaat ttggaggaag 6720
ggaacaagtg tgcgcacaca ctagaagttt ccagccccac ccccaccccc gtctcccact 6780
cccacgggag cactgggatt acacttgtgc acactattgt tttaagcttt tacatggcta 6840
ccagaggtcc aagctcaagt cctcatgctt gcttgggaag tgccgtcaac caccgagcca 6900
cctccacatc tggcttttgt ttcagttttt atgtatatga gtactgtatt tgcatgtctg 6960
cctgtatgat gaaagagggc atcagatccc aatatggttg tgagccacca tgtggggtct 7020
ggggattgaa ctctggacct ctggaagagc agctggtgct cttaacccct gagccaacct 7080
ccagccctgt tttgtttttt tgaaacagtt ccagagctgc ctttgagctc atcatgtagc 7140
caaggatagc ctttaatttc tgatccttct tacaaacatg caccgcacgc ctttaatccc 7200
agcactcggg aggcagaggc aggcagattt ctgagttcga ggccagcctg gtctacaaag 7260
tgagttccag gacagccagg gctatacaga ggaagcctgt ctcgaaaaac aaaacaaaaa 7320
caaaaaaaaa aaaaaaaaag cttttccatt cttagactct gatgggaagg gagcccaggg 7380
cttcatgcat gttggacatt tgactgacag agctacatcc ccatccccag gcctttactc 7440
cattgtctaa tgtcactttc tgtttgtcag tctgtccata tttgtttctc ggtaattcta 7500
gtttacttga aatgaaatcg cttagccctc agtctcctgt caagtgactg ggacagcaga 7560
tgatctccca tgctctttat ttctttcttc ttatgaaaaa ataaaaggtc attttctgaa 7620
atcatttctt agtcactgtg agggatctaa gctgtggtac aataccacat gtgggctata 7680
ggaacgtaaa gtgactgtcc agagagtggg aggggacacg ctggctctag gcaactgtgt 7740
tccagcccct gagtgtcaga gcttcctctc agcttccctt gcccctctgg ctgactggaa 7800
acttgcactg aggtttctac actttgattt ttcaagacag ggtttctctg tgtagccctg 7860
gctgttctgg cactcactct gtagaccagg ctggcctcag attcacagag accgcttgcc 7920
tctgcctcct gagcaccagg atcaaaggcg tgtgccacca ctgcctacca catggctcag 7980
ttgatgaagt gtttgcctgg caagagtgag gccctgggtt ccaccccccc tcactgaaga 8040
aacaaggtat ggccaagcac atgggtaatc ctagcactct aaagtggagg ctggaagctc 8100
acgatcagag caagttccag gtcagaatac aagtaacagt actgctaata gttcggactt 8160
tgtgatggaa actcaagtta gtctctccct cgccctctct ctctcatcat tgttggcaag 8220
aaagtgactt gctcatacgc cttggtttcc tcaagtgtgg ctcccacttg ggctttctca 8280
gttgcgtcaa gcctagaagt atcctggcta gcacctgcca cggagcatgc tctagtttcg 8340
tttctgctct tgtgtgagca ccctggccaa aaaaaacagc ttcggggaga aaggacttgt 8400
tttaactcac aatttcgcca ggcaatgatg gcacatgcct ttaaccccag aacttgggag 8460
gcagaagcag gtggatttct gagttcgagg ccagcctggt ctacagaatg agttccagga 8520
cagccagggc tgtacagaga aaccctgtct cgaaacaaaa caaaacaaac aaacaaacaa 8580
acaaacaaaa aaaaaccctc acgattttac tggtgaacgt ggcaggagcc ggaagctagt 8640
cagcggtatt cgatggtcac aagcagataa gtgataaggg cacaagagct cgcttgcttg 8700
ctgacttatg cttagctcaa gcttgactct ctgtgctgtt tgaggccccc tgcccaggga 8760
atggtgccac ccacagtggg ctgtgtctcc ccatatcaac tacttaagac agtccaccat 8820
agacacacca aggctaacag cgtagactcc tcctcactaa gacatccctc caatggttct 8880
actctgggtc tagttgacaa agctaaacac cacacacata ttcattgaca ctttcgatca 8940
agtccccacc ctcgcagaga agccaaaggg gtggggaaag tgatgccacc caagatggtt 9000
ctctgtagcc ctctgtgttc agttcagcca ctcggtgcta ctctgccact gtgctagact 9060
caggctacta agcaaataaa cttgtctgtg atgagccgtg ctacacacta aggactagag 9120
gctgagggaa tggcagcatc caaagggatc ctctagccat gacctgggag ccaccgtgga 9180
cactcagcct gtagaaaagg ctacaggccc ccaatggcgt aagcctaaga ggatggactg 9240
gccccaaccc tcacctggag aacgcaggag agctggccct ggtggcatgg gccctggaga 9300
gctggtgagc tgacccaatc agtccagatc caggtctttg agttggccca acccaacatc 9360
tacccatcta tgtatgagct gctggagaga aggaaggggc cagtcctgca gatggaaaac 9420
tgtggggtct ccatgacaca ggacagcagc aggatagcca agaggtgtcc cagtgaggag 9480
ccacgattga tggtgcagca gaagtcagag gcctcaaacc agctcgatga ctccttgc 9538
<210> 4
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2A序列
<400> 4
ggtagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gcgacgtgga ggagaaccct 60
ggtcct 66
<210> 5
<211> 711
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mCherry序列
<400> 5
atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60
gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120
cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180
ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240
cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300
gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360
ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420
atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480
gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540
gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600
aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660
cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaagta a 711
<210> 6
<211> 4324
<212> DNA
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 6
gagtgggagc atttgaacct tgaggacaga cctccacgtt tcccgatttg agccctccga 60
gcacccatat ttcctttagt atagtctatt acctcgttgt ctttgtgttt tttaaacagg 120
gcctcactat gctgccctgg ctgtcccaga acttgttcag gagaccaggc tgatcttgaa 180
cttaaaaatc tacctgcctc tgcctcccgt atgctgggac taaagggatg tgctaccatg 240
atcaacctat attcacgttt aaggggcatc tgaatatctt aaaacagtat tgaggggtgg 300
atatggtggc gcaagctttt aatcccagcg cttggacggc agaggcaggg agagttctgc 360
tttctgggcc agcctggtct gttgagaccc tatctcaaac aaagtaaaag acagtattga 420
aagtttaact ctagggtctg gagagatggc tcagcagtta ggtgcactgg ttgctcttcc 480
agaggaccca ggttcaattc ccagcaacca cgtggcagct caccactata actctagttc 540
cagaagatct gatgccctca cacagacaga caggcaaaac accaatgtgc atgaagtaaa 600
aataaattta aaaaagaaat aaagcttcac tgtaaattct aggaagattg gctttgtccg 660
ggtaagttaa ggcagacaca cactcactga gaagtaggtc aggccctaac aggaacttcc 720
gctttgccgt cacctctgtg ttaatagcag aaggtagaag tgtgggctgg ggtcatgatg 780
gtcagagata gtcgacttct gccatggact gtagaagttg ggactgccat gggacacccc 840
caagcccctg cagtcacctc attagtatat ccttttggtt taccaagaat aatgtaccaa 900
gaataatttc agcatatatt tttctgtttg gtctttagtg gcagggtttc acactgtagc 960
ctagactagc caaatgtgct aagcaagagt cctttactaa gctatactct caactctttc 1020
agcataaatt ttacttattt ttaaaattat ttagttactt agttcagttt ttccaaggca 1080
gcgtttctct ttgtaacacg atagccaggg ctatgtagag aaaccctgtt tcaataaata 1140
aataataagc aggttagtaa aaataaaaat aaagaaagcc tttaaaactt ctagctggaa 1200
gcctagtgtg gtggtccaca cttattaccg tagcactaca gactcagagg ctggggagtc 1260
actacaaatt caaggtcagc atgtctatat agcaagttcc aagccagctg gggctactag 1320
caaaaccaaa gaagaactaa aaccttaccc taaggccaat gaggtacttt aaccccagca 1380
cttggggagg cagaggcagg taggttgatt gatctctgag gccagcctgg tctacagagc 1440
aagttccagg acagccaggg ctatacagaa accttgtctt ggtggaaata atacatacaa 1500
acaaaaacaa ttaaaaagtt ttttaaaatg ttgttgacag cactgttatt aagaacacaa 1560
agctagaaac acctgagtac ccattttcag tagtgaagga gtgagtagcc atccgcatat 1620
ttttctaggg aatgcagtgt cgtggcagca cgcacaggcc ccgctttaat ccctaacact 1680
gaagaaaagg cgggagcagg gaacaatgta ttagtcaggc atgctggcac atgcctgtag 1740
ccccagcgta caagagtcca aagtagaggg attatgaatt tgaggttatc ctggactaac 1800
atataaaaaa aagaaaaaag tccccaaagc taattggtat atccgtacca ttgaatgtca 1860
tatgtttaaa acaataatgc atatatacac ttatttgtgc atgtatgtgt gtgagtgtat 1920
gtggtatgtg catgtacatg tgtgctatgc tcctgtgtac aggggaggag gtcagagaaa 1980
tcaaagtgtc ctgccctggc tctccacctt acccccttga gacagactct ctttctgaac 2040
ctggagctgg gctggagacc agtaagctcc cgtggtcctc tgtctcagtc tcccacaaca 2100
ctggcattgc aggcatggga aagacggcac ctagctcatt tatgtggttg ctggggactt 2160
gaacgtgtgt cctcatgctt gcccggcatg gctcttaccc actgggccat cttcccagcc 2220
tatttatgta cactggcaca taggtaaaaa ttagtcaaaa ctaattcagg gcaactgaaa 2280
tcaggagctg gtcttaagac cgtgaaaaca ggattctggc agagatgggg ctgataaagc 2340
ccaggtgaaa ctattatggt ttatgccttt caggacggag agagataaca gatcccgagt 2400
aaaaacaaga gttaaagtag ttctgagaac ctcgaaactg ccaccctttt ctaaatgact 2460
tagtccaaca gacaggcagt tctgagtcgc tgacctcctt ctgtgagcac tgaacgccta 2520
gagcttttgt ttcagtggta agtggtgccc acactgaacc aggagtacag cccatctgca 2580
ccccactcct tgcaccaggc actaggctga ccaccaaaat gtgctgtgcc cccctagcac 2640
ataattcata atcatctcct accatagcct cccaagggct aaaattacag cacccacccc 2700
attcaccctt gcttccatct tgggctgctt tggggaccgt tctcaaacta catggactct 2760
gtgttgccat cgaccctggg agggggaaaa ttaaatggag acctgcctga gttcagacag 2820
ctagcagcag gcaagaataa gatgggaaac caggaaagaa atccaggtgg actggaataa 2880
agccaaggga agttttatta tccctgcagt ctcggcactt cagaggcaga ggcaggagga 2940
ttatctggac tagatagttc aggctagtct gctgtacaga aagactgtgc aaatattaat 3000
tgtttatttt aaaatgagca ggaggggccg ggcatggtgg ccagcattcg ggaggcagag 3060
gcagatggat ttctgagttc gaggccagcc tggtctacag agtgagttcc aggacagcca 3120
gagctacaca gagaaaccct gtctcgaaaa accaaaaaaa acaaaaaaac aaaaaaaatg 3180
agcaggaggg accaccacga ggaccactct ctttccttcc ttctctcctt tcttgtcccc 3240
tctgcccttg ccctctagaa cttccctcct cttccagatc ttctgtttac ctctggcatg 3300
tgtgacccca caccaccccc agcaccccca gcagactatt ccatctgttc tgtagcccct 3360
cgaaccctga gtgcgtcttt tccagaagca gtgtccctgc tcacaggagt catccccaca 3420
gcttgcaaga ctgaaaatct tgtcttccaa gccattctcc ccacatccct cggaggaaag 3480
ctacaagaac cacacaccca acaataatgt agacactctc ctgtgtaggc ctctgctccc 3540
atccccgtct cgtcccaccg ctgtggctta cgcccactat attgcccagg ctgccttcag 3600
actcagactg atcctcctac cgtagcctct cgcatgctga ggttgtagca cctgcggcac 3660
acgccctcac attcttcccg gggttgtttg ggaaacagtt cttagactat gttcaggctt 3720
tatgcacgtc aggcgacatg gctgagctct gcctctgtgg ggcagagagc aaggaagact 3780
ctcctgctga agggtgtggg cagccatagc agagagggtt ggggtacaga caggcagttc 3840
ctgggagcca gggtggatct cagaatgtgc tgaggtgtgg cccaagactg gtctgtagct 3900
tctgaatctg aggctccaaa attcgtttct tctgcagcag gaattggtat ttggaagaag 3960
ctctaccacc taacatggga tactgggatg ctggactcta tggggcatct gttgcctctc 4020
tgatactagt gttcctcagc tgacaacctc tctctctctc tccctctctc tctctctctt 4080
cctctctctc cctctctctc tctctctctc tctctctctc tagggtcaag tatggatcaa 4140
tggctttaac ctcggccgat actggcccac aatgggccca caaaagacct tgttcgtgcc 4200
aaggaacatc ctgaccactt cagccccaaa caacatcaca gtgttggagc tagagtttgc 4260
accctgcagc gaggggaccc cagagctgtg tacagtagag tttgttgaca ctccggtcat 4320
ttcc 4324
<210> 7
<211> 4392
<212> DNA
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 7
gacttgacca tcggtggcca ttttccaagc cagtctggtc aagactcatg gctgaacctc 60
tgagactgag ccttggggag cacagctcta ctctggttac acggatcacc tttgttgtgc 120
tagaatggaa gctacatttc tggaatgtgt gtaccctgct ggtgactttg cagccccgcc 180
ttgcctgacc tcccacccta gtggccaccg ggaaggctga agggagtgga caccacagga 240
agacacaggt tggagcaaaa cttgaataat gtcctttatc ctgatttgaa ataatcacgt 300
catctttctg ctgaataaaa ttggtttgca agttgtgggg gtcctgtcat taatatatca 360
ggcaggtatt aaactccagg gtctgactta aatctcaact agacctgagt gggctgcctg 420
aagctacttc accagcttga ggtacaaagt gggtagaaga gagagctggt ttgggtgaga 480
agagggcttt gtttttgatc ctgctttgac tatttctgaa tctctgtgat atctgcttgg 540
tgagagatct ccagttataa accatctaaa agattaatag ttgctcaaag taggtagtat 600
ggtctctcta tacaattgaa tagaattctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc 660
tctctctctc tcctctctct ctctgtgtgt gtgtgtgtgt tcatgttcat gtatgtatga 720
agttgcatgt atatgcatgt atgtatgcag gtcagaggcc catcttgggt gtcatttctc 780
aggaatgtct tagtatctag gcacatacag gatgtataaa atgtaattct gcttatgttt 840
gagaccctgt ctccaaaaaa aaaaagtgtt aacgtggggc tggtctgtag ctaagttgat 900
aaaacacgtt tgtttgtcat gcaagaagca ctgggttctc tccctagcag tgcacaaaac 960
caggcatgat agtacatgtt gtggttataa aaagataaag aggtctaaga acatgttcta 1020
tgggggtgtg gtgaggtgtg tgtgtgggtg cctcggcagg cccatgccaa gacatccctt 1080
ccctctaaag gactagcccc cccacacaca cacacacaca ccacgacagt atagtataga 1140
atagagttta tttagggcat ggggagggga gctaagatgg tagtagagac agagagaggg 1200
agagagtaga gaagtagagg ctggccagga caaagtgaag agagggggaa aggggatggg 1260
gagaggggga acaagggagc aagaggcaag agagtaagag agagaggagg gggcaagcag 1320
cctacctggg ttttgctagg taactgtggg atggagttta gacagaatgc taacagtaca 1380
cacacgtgta atagcattca agaagtgaga ggagagcact gaagtccaag tttatcctca 1440
gctacacagc ggggtccgta ccttgtgtta tatgtaaccc tgtctcaaaa aaataataat 1500
atgattgcat ctgagtggta aacatttggg tacttggcta catttcctaa cctatacttt 1560
aaatttggag gaagggaaca agtgtgcgca cacactagaa gtttccagcc ccacccccac 1620
ccccgtctcc cactcccacg ggagcactgg gattacactt gtgcacacta ttgttttaag 1680
cttttacatg gctaccagag gtccaagctc aagtcctcat gcttgcttgg gaagtgccgt 1740
caaccaccga gccacctcca catctggctt ttgtttcagt ttttatgtat atgagtactg 1800
tatttgcatg tctgcctgta tgatgaaaga gggcatcaga tcccaatatg gttgtgagcc 1860
accatgtggg gtctggggat tgaactctgg acctctggaa gagcagctgg tgctcttaac 1920
ccctgagcca acctccagcc ctgttttgtt tttttgaaac agttccagag ctgcctttga 1980
gctcatcatg tagccaagga tagcctttaa tttctgatcc ttcttacaaa catgcaccgc 2040
acgcctttaa tcccagcact cgggaggcag aggcaggcag atttctgagt tcgaggccag 2100
cctggtctac aaagtgagtt ccaggacagc cagggctata cagaggaagc ctgtctcgaa 2160
aaacaaaaca aaaacaaaaa aaaaaaaaaa aaagcttttc cattcttaga ctctgatggg 2220
aagggagccc agggcttcat gcatgttgga catttgactg acagagctac atccccatcc 2280
ccaggccttt actccattgt ctaatgtcac tttctgtttg tcagtctgtc catatttgtt 2340
tctcggtaat tctagtttac ttgaaatgaa atcgcttagc cctcagtctc ctgtcaagtg 2400
actgggacag cagatgatct cccatgctct ttatttcttt cttcttatga aaaaataaaa 2460
ggtcattttc tgaaatcatt tcttagtcac tgtgagggat ctaagctgtg gtacaatacc 2520
acatgtgggc tataggaacg taaagtgact gtccagagag tgggagggga cacgctggct 2580
ctaggcaact gtgttccagc ccctgagtgt cagagcttcc tctcagcttc ccttgcccct 2640
ctggctgact ggaaacttgc actgaggttt ctacactttg atttttcaag acagggtttc 2700
tctgtgtagc cctggctgtt ctggcactca ctctgtagac caggctggcc tcagattcac 2760
agagaccgct tgcctctgcc tcctgagcac caggatcaaa ggcgtgtgcc accactgcct 2820
accacatggc tcagttgatg aagtgtttgc ctggcaagag tgaggccctg ggttccaccc 2880
cccctcactg aagaaacaag gtatggccaa gcacatgggt aatcctagca ctctaaagtg 2940
gaggctggaa gctcacgatc agagcaagtt ccaggtcaga atacaagtaa cagtactgct 3000
aatagttcgg actttgtgat ggaaactcaa gttagtctct ccctcgccct ctctctctca 3060
tcattgttgg caagaaagtg acttgctcat acgccttggt ttcctcaagt gtggctccca 3120
cttgggcttt ctcagttgcg tcaagcctag aagtatcctg gctagcacct gccacggagc 3180
atgctctagt ttcgtttctg ctcttgtgtg agcaccctgg ccaaaaaaaa cagcttcggg 3240
gagaaaggac ttgttttaac tcacaatttc gccaggcaat gatggcacat gcctttaacc 3300
ccagaacttg ggaggcagaa gcaggtggat ttctgagttc gaggccagcc tggtctacag 3360
aatgagttcc aggacagcca gggctgtaca gagaaaccct gtctcgaaac aaaacaaaac 3420
aaacaaacaa acaaacaaac aaaaaaaaac cctcacgatt ttactggtga acgtggcagg 3480
agccggaagc tagtcagcgg tattcgatgg tcacaagcag ataagtgata agggcacaag 3540
agctcgcttg cttgctgact tatgcttagc tcaagcttga ctctctgtgc tgtttgaggc 3600
cccctgccca gggaatggtg ccacccacag tgggctgtgt ctccccatat caactactta 3660
agacagtcca ccatagacac accaaggcta acagcgtaga ctcctcctca ctaagacatc 3720
cctccaatgg ttctactctg ggtctagttg acaaagctaa acaccacaca catattcatt 3780
gacactttcg atcaagtccc caccctcgca gagaagccaa aggggtgggg aaagtgatgc 3840
cacccaagat ggttctctgt agccctctgt gttcagttca gccactcggt gctactctgc 3900
cactgtgcta gactcaggct actaagcaaa taaacttgtc tgtgatgagc cgtgctacac 3960
actaaggact agaggctgag ggaatggcag catccaaagg gatcctctag ccatgacctg 4020
ggagccaccg tggacactca gcctgtagaa aaggctacag gcccccaatg gcgtaagcct 4080
aagaggatgg actggcccca accctcacct ggagaacgca ggagagctgg ccctggtggc 4140
atgggccctg gagagctggt gagctgaccc aatcagtcca gatccaggtc tttgagttgg 4200
cccaacccaa catctaccca tctatgtatg agctgctgga gagaaggaag gggccagtcc 4260
tgcagatgga aaactgtggg gtctccatga cacaggacag cagcaggata gccaagaggt 4320
gtcccagtga ggagccacga ttgatggtgc agcagaagtc agaggcctca aaccagctcg 4380
atgactcctt gc 4392
<210> 8
<211> 128
<212> DNA
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 8
gaccccagag ctgtgtacag tagagtttgt tgacactccg gtcatttcct gacctgactt 60
gaccatcggt ggccattttc caagccagtc tggtcaagac tcatggctga acctctgaga 120
ctgagcct 128
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于小鼠 Glb1 基因第16号外显子的敲入位点
的5' 向导RNA1
<400> 9
tggccaccga tggtcaagtc agg 23
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于小鼠 Glb1 基因第16号外显子的敲入位点
的3' 向导RNA1
<400> 10
accgatggtc aagtcaggtc agg 23
Claims (16)
1.一种Glb1重组报告基因，包括：在Glb1基因的终止密码子位点从5’至3’端方向顺序地插入的2A序列以及报告基因；其中，所述Glb1基因与所述报告基因一起转录成单个mRNA，使得所述Glb1基因的转录水平与所述报告基因的转录水平显著相关。
2.如权利要求1所述的Glb1重组报告基因，其中，所述报告基因为mCherry。
3.如权利要求2所述的Glb1重组报告基因，其中，所述Glb1重组报告基因具有由SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列。
4.如权利要求3所述的Glb1重组报告基因，其中，所述Glb1重组报告基因用于在活体动物内通过体内成像技术监测所述Glb1重组报告基因的蛋白水平来监测系统性衰老和功能衰退，其中，所述Glb1重组报告基因的蛋白水平通过mCherry荧光信号实现可视化监测。
5.如权利要求1所述的Glb1重组报告基因，其中，所述Glb1基因为小鼠Glb1基因，且具有由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
6.一种分离的构建体，其中，所述构建体用于靶向Glb1基因的终止密码子位点，所述构建体从5’至3’端方向依次包括：2A序列和报告基因。
7.如权利要求6所述的构建体，其中，所述报告基因为mCherry。
8.如权利要求7所述的构建体，进一步包括：位于所述2A序列的5’端的5’端同源臂，以及位于mCherry序列的3’端的3’端同源臂。
9.如权利要求6所述的构建体，其中，所述构建体包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
10.如权利要求6所述的构建体，其中，所述Glb1基因为小鼠的Glb1基因，且具有由SEQID NO.2所示的核苷酸序列。
11.一种制备转基因报告小鼠的方法，所述方法包括：
将权利要求6-7中任一项所述的构建体引入小鼠胚胎干细胞或者小鼠生殖细胞，获得包括Glb1重组报告基因的所述小鼠胚胎干细胞或者所述小鼠生殖细胞；并且
利用包括所述Glb1重组报告基因的所述小鼠胚胎干细胞或者所述小鼠生殖细胞生成杂合子的转基因报告小鼠；
其中，所述Glb1重组报告基因具有由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
12.如权利要求11所述的方法，其中，所述转基因报告小鼠的月龄为9-13个月。
13.如权利要求12所述的方法，其中，所述转基因报告小鼠用于：通过体内成像技术监测所述Glb1重组报告基因的蛋白水平来监测系统性衰老和功能衰退、研究衰老机制或者筛选抗衰老药物制剂。
14.一种抗衰老药物的筛选方法，所述方法包括：
提供包括权利要求1所述的Glb1重组报告基因的转基因报告小鼠或者根据权利要求11所述的方法制备的转基因报告小鼠；
将候选药物施用于所述转基因报告小鼠；
通过体内成像技术对所述转基因报告小鼠体内的所述Glb1重组报告基因的蛋白水平进行监测；并且
如果候选药物选择性地杀死了具有Glb1重组报告基因的高蛋白水平的细胞，则选择所述候选药物作为抗衰老药物，其中，所述Glb1重组报告基因的所述高蛋白水平采用85％置信区间定义；
其中，所述转基因报告小鼠是9-13个月龄的杂合子的转基因报告小鼠。
15.如权利要求14所述的方法，其中，所述Glb1重组报告基因的蛋白水平通过mCherry荧光信号实现可视化监测。
16.如权利要求15所述的方法，其中，所述抗衰老药物包括用于治疗心血管疾病、阿尔茨海默氏病、骨质疏松和肺纤维化的药物。
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