CN113265376B - 一种til细胞的活化方法 - Google Patents

一种til细胞的活化方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113265376B
CN113265376B CN202110434426.8A CN202110434426A CN113265376B CN 113265376 B CN113265376 B CN 113265376B CN 202110434426 A CN202110434426 A CN 202110434426A CN 113265376 B CN113265376 B CN 113265376B
Authority
CN
China
Prior art keywords
til
culture
cells
til cells
day
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110434426.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113265376A (zh
Inventor
湛振键
彭大为
刘世豪
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangdong Kangdun Hi tech Industry Group Co.,Ltd.
Hainan Zhongjian Investment Co.,Ltd.
Original Assignee
Guangdong Kangdun Innovation Industry Group Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangdong Kangdun Innovation Industry Group Co ltd filed Critical Guangdong Kangdun Innovation Industry Group Co ltd
Priority to CN202110434426.8A priority Critical patent/CN113265376B/zh
Publication of CN113265376A publication Critical patent/CN113265376A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113265376B publication Critical patent/CN113265376B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2304—Interleukin-4 (IL-4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明公开一种TIL细胞的活化方法，包括以下步骤：将TIL细胞用培养液悬浮培养，培养时首先加入绞股蓝皂苷和促活性小肽，至少一天后加入山莨菪碱和细胞因子；之后用含有细胞因子的培养液换液；所述促活性小肽的氨基酸序列为Ala‑Gly‑Glu‑Arg‑Asp‑Met。采用本发明方法，TIL细胞培养至第5d时，其杀伤活性明显增强，第7天时，达到活性峰值。

Description

一种TIL细胞的活化方法
技术领域
本发明属于生物医学领域，涉及细胞的活化方法，具体涉及一种TIL细胞的活化方法。
背景技术
TIL细胞(Tumor infiltrating lymphocyte)即肿瘤浸润淋巴细胞，是从肿瘤组织中分离出的浸润淋巴细胞，是继LAK之后的新型抗肿瘤效应细胞，其抗肿瘤效果是LAK至少50倍，已应用于临床治疗皮肤、肾、肺、肝、卵巢的原发或继发肿瘤。TIL细胞具有高效、特异、副作用小等优点，已经成为国内外恶性肿瘤生物治疗的热点之一。
新鲜分离的TIL抗肿瘤活性低下，而经过IL-2等细胞因子体外培养或体内激活，TIL的活性得到提高，然而遗憾的是TIL的活化培养时间较长，大量研究显示，TIL细胞的活性在培养第14～21d时才能达到峰值。例如《细胞因子诱导的杀伤细胞与肿瘤浸润淋巴细胞体外细胞毒活性比较》(蒋敬庭等)用含10％AB型血清、4.0×105U/L IL-2的RPMI1640培养液调整细胞浓度为2.0×106/mL，置温箱中培养。其对比了CIK细胞和TIL细胞对K562细胞的细胞毒活性，结果显示CIK细胞对K562细胞的细胞毒活性在14d时达峰值，而TIL细胞在21d时才达峰值。
因此，活化培养时间过长，使TIL细胞的临床应用受到限制。
发明内容
鉴于现有技术的不足，为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种TIL细胞的活化方法。
本发明方案包括以下内容：
一种TIL细胞的活化方法，包括以下步骤：将TIL细胞用培养液悬浮培养，培养时首先加入绞股蓝皂苷和促活性小肽，至少一天后加入山莨菪碱和细胞因子；之后用含有细胞因子的培养液换液；
所述促活性小肽的氨基酸序列为Ala-Gly-Glu-Arg-Asp-Met。该小肽由常规方法人工合成。
优选的，绞股蓝皂苷添加的终浓度为5～8mg/mL。
优选的，促活性小肽添加的终浓度为0.1～1.0mg/mL。
优选的，山莨菪碱添加的终浓度为1～5mg/mL。
优选的，所述细胞因子包括IL-2、IL-4。
优选的，所述培养液为含有血清的RPMI-1640培养液，所述血清包括新生牛血清、人AB型血清。
优选的，所述的TIL细胞的活化方法，包括以下步骤：
将TIL细胞用培养液培养，培养的第1天加入终浓度为5～8mg/mL绞股蓝皂苷和0.1～1.0mg/mL促活性小肽；第2天加入终浓度1～5mg/mL的山莨菪碱和60～80U/mL的IL-2，以后每隔1～2d采用含有终浓度400～1000U/mL IL-2的培养液换液。
本发明所取得的有益效果：
本发明首先发现绞股蓝皂苷、促活性小肽Ala-Gly-Glu-Arg-Asp-Met、山莨菪碱有利于新分离TIL细胞免疫抑制的解除，在此基础上经研究确定，促活性小肽在绞股蓝皂的作用下才能改善细胞的代谢功能，提前添加山莨菪碱不利于TIL细胞活性的释放。因此应首先添加促活性小肽和绞股蓝皂，再添加山莨菪碱和细胞因子。
采用本发明方法，TIL细胞培养至第5d时，其杀伤活性明显增强，第7天时，达到活性峰值。采用该方法培养5d即可得到增殖倍数175以上，杀伤率达到85％以上，培养5d后即可用于临床治疗，满足临床治疗的需求。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
实施例1：TIL细胞的分离
实验方法：
1)将肝癌组织剪碎至约1mm3小块，置于3600U DNA酶、60μg胶原酶和125U透明质酸酶的RPMI-1640培养液中，混匀并于37℃恒温搅拌1h。
2)将酶消化后的细胞悬液经200目滤网过滤，以除去未消化的肿瘤组织块。1500rpm离心5min收集单个细胞，用RPMI-1640培养液洗细胞，将细胞再悬浮。
3)梯度离心分离TIL细胞：于离心管内分层放入100％及75％的淋巴细胞分离液各15mL，再缓慢从管壁加入20mL细胞悬液，2000rpm离心20min，收集100％分离液界面上的TIL细胞，再用RPMI-1640培养液洗TIL细胞，以除去细胞分离液，得TIL细胞。
实施例2：新分离TIL细胞的活化培养方法
以下为研究过程中涉及的4种培养方式：
方法1：常规方法，将TIL细胞用培养液(10％新生牛血清、1000U/mL IL-2的RPMI-1640培养液)悬浮，细胞浓度3×105/mL，置5％CO2孵箱中37℃培养。每隔2d换液一次。第5、7、9、14天测定TIL细胞对HepG2的杀瘤效应。
方法2：将TIL细胞用培养液(10％新生牛血清、5mg/mL人参皂苷、1.0mg/mL促活性小肽Ala-Gly-Glu-Arg-Asp-Met、1mg/mL的山莨菪碱、1000U/mL的IL-2的RPMI-1640培养液)悬浮，细胞浓度3×105/mL，置5％CO2孵箱中37℃培养。每隔2d换液一次。第5、7、9、14天测定TIL细胞对HepG2的杀瘤效应。
方法3：将TIL细胞用培养液(10％新生牛血清、5mg/mL绞股蓝皂苷、1.0mg/mL促活性小肽Ala-Gly-Glu-Arg-Asp-Met、1mg/mL的山莨菪碱、1000U/mL的IL-2的RPMI-1640培养液)悬浮，细胞浓度3×105/mL，置5％CO2孵箱中37℃培养。每隔2d换液一次。第5、7、9、14天测定TIL细胞对HepG2的杀瘤效应。
方法4：将TIL细胞用培养液(10％新生牛血清的RPMI-1640培养液)悬浮，细胞浓度3×105/mL，置5％CO2孵箱中37℃培养。培养的第1天加入终浓度为1mg/mL的山莨菪碱和1.0mg/mL促活性小肽(Ala-Gly-Glu-Arg-Asp-Met)；第2天加入终浓度5mg/mL绞股蓝皂苷和1000U/mL的IL-2，以后每隔2d采用含有终浓度1 000U/mL IL-2的培养液换液。培养的第5、7、9、14天测定TIL细胞对HepG2的杀瘤效应。
方法5：将TIL细胞用培养液(10％新生牛血清的RPMI-1640培养液)悬浮，细胞浓度3×105/mL，置5％CO2孵箱中37℃培养。培养的第1天加入终浓度为5mg/mL绞股蓝皂苷和1.0mg/mL促活性小肽(Ala-Gly-Glu-Arg-Asp-Met)；第2天加入终浓度1mg/mL的山莨菪碱和1000U/mL的IL-2，以后每隔2d采用含有终浓度1 000U/mL IL-2的培养液换液。培养的第5、7、9、14天测定TIL细胞对HepG2的杀瘤效应。
方法6：将TIL细胞用培养液(10％新生牛血清的RPMI-1640培养液)悬浮，细胞浓度3×105/mL，置5％CO2孵箱中37℃培养。培养的第1天加入终浓度为5mg/mL绞股蓝皂苷和1.0mg/mL促活性小肽(Ala-Gly-Glu-Arg-Asp-Met)；第2天加入终浓度1mg/mL的山莨菪碱和60U/mL的IL-2，以后每隔2d采用含有终浓度1000U/mL IL-2的培养液换液。培养的第5、7、9、14天测定TIL细胞对HepG2的杀瘤效应。
杀伤活性测定：
采用MTT法测定细胞杀伤活性。以TIL细胞为效应细胞，HepG2细胞为靶细胞，实验前以含10％新生牛血清的RPMI-1640培养液调整TIL细胞浓度2×105个/mL，靶细胞浓度1×104个/mL，各取100μL效应细胞与靶细胞混合加入细胞板中，同时设靶细胞对照组和效应细胞对照组，靶细胞对照组为单纯靶细胞+培养液，效应细胞对照组为单纯效应细胞+培养液，每组样品设3个复孔；将细胞板置于培养箱内(相对湿度80％、37℃、5％CO2)培养20h，每孔加入20μL的MTT(5mg/mL)，继续培养4h后离心，弃上清，每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO)，振荡5～6min，待沉淀物完全溶解后测波长570nm吸光度A值，按以下公式计算杀伤率。所有数据均以
Figure BDA0003032522850000041
表示。
Figure BDA0003032522850000042
统计各方法培养所得TIL细胞的杀伤活性，结果见表1。
表1 杀伤活性
Figure BDA0003032522850000043
方法3、4、5结果显示，促活性小肽在绞股蓝皂的作用下，改善细胞的代谢功能，能够有效解除新分离TIL细胞的活性抑制。在此基础上第二天添加山莨菪碱和细胞因子，达到明显的提高TIL细胞活性的作用。方法4和方法5结果显示，提前添加山莨菪碱和细胞因子对促活性小肽的作用产生抑制。方法5和方法6结果显示，提前添加高剂量(1000U/mL)的IL-2，不利于TIL细胞活性的快速释放。以上结果显示TIL细胞的杀伤活性与培养液中的成分以及成分的添加时机有着重要关系。新分离的TIL细胞处于免疫抑制状态，采用本发明方法6，这种抑制被快速解除，培养至第5d时，其杀伤活性明显增强，第7天时，已经基本达到活性峰值。
实施例3：用量的优选
经正交试验筛选获知各成分的最佳用量。确定本发明方法的最优方案：
将细胞用培养液(10％新生牛血清的RPMI-1640培养液)悬浮，细胞浓度3×105/mL，置5％CO2孵箱中37℃培养。培养的第1天加入终浓度为5～8mg/mL绞股蓝皂苷和0.1～1.0mg/mL促活性小肽(Ala-Gly-Glu-Arg-Asp-Met)；第2天加入终浓度1～5mg/mL的山莨菪碱和60～80U/mL的IL-2，以后每隔1～2d采用含有终浓度400～1000U/mL IL-2的培养液换液。
采用该方法培养5d即可得到增殖倍数175以上，杀伤率达到85％以上，培养5d后即可用于临床治疗。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种TIL细胞的活化方法，其特征在于，包括以下步骤：
将TIL细胞用含10％新生牛血清的RPMI-1640培养液悬浮，细胞浓度3×105/mL，置5％CO2孵箱中37℃培养；培养的第1天加入终浓度为5～8mg/mL绞股蓝皂苷和0.1～1.0mg/mL促活性小肽；第2天加入终浓度1～5mg/mL的山莨菪碱和60～80U/mL的IL-2，以后每隔1～2d采用含有终浓度400～1000U/mL IL-2的培养液换液；
所述促活性小肽的氨基酸序列为Ala-Gly-Glu-Arg-Asp-Met。
CN202110434426.8A 2021-04-22 2021-04-22 一种til细胞的活化方法 Active CN113265376B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110434426.8A CN113265376B (zh) 2021-04-22 2021-04-22 一种til细胞的活化方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110434426.8A CN113265376B (zh) 2021-04-22 2021-04-22 一种til细胞的活化方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113265376A CN113265376A (zh) 2021-08-17
CN113265376B true CN113265376B (zh) 2022-08-16

Family

ID=77229136

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110434426.8A Active CN113265376B (zh) 2021-04-22 2021-04-22 一种til细胞的活化方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113265376B (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111700900A (zh) * 2020-05-15 2020-09-25 广东金骏康生物技术有限公司 一种天然免疫活化剂、til细胞促进剂及其应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111700900A (zh) * 2020-05-15 2020-09-25 广东金骏康生物技术有限公司 一种天然免疫活化剂、til细胞促进剂及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TIL细胞临床制备规范化研究;赖章超等;《中国肿瘤》;20110205(第02期);第89-91页 *
人肿瘤浸润淋巴细胞的克隆化;周生等;《中国应用生理学杂志》;19920905;第8卷(第03期);第209-213页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113265376A (zh) 2021-08-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100509614B1 (ko) 인간 항원 지시 세포의 활성화 방법, 활성화된 인간 항원 지시세포 및 그의 용도
KR101133185B1 (ko) 자연살해세포의 증식방법
CN110055218B (zh) 一种人工改造自然杀伤性细胞及其制备与应用
CN102600462B (zh) 人树突状细胞肿瘤疫苗及其制备方法和应用
Kim et al. Dendritic cell activation by polysaccharide isolated from Angelica dahurica
WO2015014291A1 (zh) 通过无血清培养扩增活化淋巴细胞的方法
WO2017084519A1 (zh) 化合物i和化合物ii及其制备方法和应用
CN113265376B (zh) 一种til细胞的活化方法
CN111849892B (zh) 一种胶质瘤来源肿瘤浸润淋巴细胞(til)的体外扩增方法及用途
CN105969731B (zh) 一种利用恶性胸腹水大量制备高杀伤活性til细胞的方法
CN109294988B (zh) 一种nk细胞诱导试剂盒
CN107708727A (zh) 一种用于治疗肝癌的肿瘤疫苗及其制备方法
TWI458485B (zh) 毒殺型樹突細胞群組用於製備藥物的用途及包含其之醫藥組合物
US20040161433A1 (en) Method for in vitro culture of lymphocytes and composition for use in immune therapy
CN113293130B (zh) 一种肿瘤特异性t细胞的培养方法
CN102600467B (zh) β-葡聚糖在制备人树突状细胞肿瘤疫苗中的应用
CN110872575A (zh) 一种iNKT细胞的体外扩增方法
CN105219723A (zh) 一种用于激活胃癌特异性免疫反应的试剂盒
CN106119192B (zh) 组合物及其在cik细胞培养中的应用
Greenberger et al. Acute myelogenous leukemia of the Wistar/Furth rat: establishment of a continuous tissue culture line producing lysozyme in vitro and in vivo
Lee et al. Optimizing tumor-associated antigen-stimulated autologous dendritic cell and cytokine-induced killer cell coculture to enhance cytotoxicity for cancer immunotherapy in manufacturing
CN111778210B (zh) 一种增强nk细胞对肿瘤细胞靶向杀伤力的培养方法
CN116970561B (zh) 一种工程化的γδT细胞及其制备方法
CN108441473A (zh) 一种体外富集cd8+* t细胞的方法
CN112370444B (zh) 一种pd-1/pd-l1抑制剂及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CP01 Change in the name or title of a patent holder

Address after: 2806, foreign trade group building, 239 Zhongxing Road, Chengdong community, Dongmen street, Luohu District, Shenzhen, Guangdong 518000

Patentee after: Guangdong Kangdun Hi tech Industry Group Co.,Ltd.

Address before: 2806, foreign trade group building, 239 Zhongxing Road, Chengdong community, Dongmen street, Luohu District, Shenzhen, Guangdong 518000

Patentee before: Guangdong kangdun Innovation Industry Group Co.,Ltd.

CP01 Change in the name or title of a patent holder
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20221212

Address after: Room 1001, 5th Floor, Incubation Building, Hainan Ecological Software Park, Old Town High-tech Industry Demonstration Zone, Chengmai County, Hainan Province, 571900

Patentee after: Hainan Zhongjian Investment Co.,Ltd.

Address before: 2806, foreign trade group building, 239 Zhongxing Road, Chengdong community, Dongmen street, Luohu District, Shenzhen, Guangdong 518000

Patentee before: Guangdong Kangdun Hi tech Industry Group Co.,Ltd.

TR01 Transfer of patent right