CN113265366B - 一种提高硅藻中金藻昆布多糖产量的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高硅藻中金藻昆布多糖产量的方法及其应用。该方法包括如下步骤：S1、种子液培养：将硅藻接种至种子培养基中，培养至对数生长期，得到硅藻种子液；S2、光发酵(兼养)培养：将步骤S1得到的硅藻种子液接种至装有发酵培养基的光发酵罐中，采用阶梯式调光的方式进行光发酵培养，培养过程中补加含有有机碳源的发酵培养基，使发酵培养基中碳氮比维持在15～120之间，并控制发酵体系的pH值为7.5～8.5。本发明中在阶梯式调光策略下采用补料分批培养，可以促进硅藻细胞的生长以及提高金藻昆布多糖的产量，该方法可以运用于硅藻规模化生产金藻昆布多糖的技术领域。

Description

一种提高硅藻中金藻昆布多糖产量的方法及其应用
技术领域
本发明属于工业生物技术领域，特别涉及一种提高硅藻中金藻昆布多糖产量的方法及其应用。
背景技术
金藻昆布多糖(Chrysolaminarin)是一类水溶性β-1,3-葡聚糖，主要由葡萄糖通过β-1,3糖苷键主链和少量的β-1,6糖苷键支链连接而成的葡聚糖，是低分子量(>40kDa)的葡聚糖，仅包含20～30个具有低分支度的线性残基。金藻昆布多糖具有抗氧化、抗肿瘤、降低血糖和血脂以及提升机体免疫能力等β-葡聚糖特有的生物活性，比酵母等来源的β-葡聚糖有更高的免疫活性，可作为免疫刺激剂和益生元，在功能性食品和动物饲料领域具有广泛的应用潜力。
金藻昆布多糖主要来源于硅藻、金藻和黄藻等海洋微藻，其作为微藻光合作用产物主要储存于藻细胞液泡内。在特定培养条件下，不同硅藻藻种中金藻昆布多糖含量可高达干重的12～33％。硅藻中金藻昆布多糖的合成和脂肪酸(fatty acid，FA)的合成之间存在竞争性，这两种途径之间都具有相同的碳前体3-磷酸甘油醛(G-3-P)。在应激条件下，碳代谢中的碳既可以转向脂质的合成生成三酰基甘油酯(TAG)，也可以转向碳水化合物的合成生成金藻昆布多糖。
目前规模化培养海洋硅藻一般在户外跑道池、透明管道光生物反应器中进行，获得的藻细胞密度低，培养时间长且易生物污染，稳定、可持续的规模生产难度极高。金藻昆布多糖的含量和产率以及积累调控技术极少有报道，这些共性关键问题阻碍了金藻昆布多糖的进一步商业化生产。海洋硅藻三角褐指藻(P.tricornutum)由于其兼养能力强，不易污染且能够积累大量的金藻昆布多糖，被认为是生产硅藻来源的金藻昆布多糖的最佳物种之一，但现有方法获得的金藻昆布多糖的产量和产率较低，难以达到商业化生产要求。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种提高硅藻中金藻昆布多糖产量的方法。
本发明的另一目的在于提供所述提高硅藻中金藻昆布多糖产量的方法的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种提高硅藻中金藻昆布多糖产量的方法，包括如下步骤：
S1、种子液培养：将硅藻接种至种子培养基中，培养至对数生长期，得到硅藻种子液；
S2、光发酵(兼养)培养：将步骤S1得到的硅藻种子液接种至装有发酵培养基的光发酵罐中，采用阶梯式调光的方式进行光发酵(兼养)培养，培养过程中补加含有有机碳源的发酵培养基，使发酵培养基中碳氮比维持在15～120之间，并控制发酵体系的pH值为7.5～8.5；其中，阶梯式调光的方式如下：初始光照强度为100±5μmol/m2/s，在240～336h(10～14天)内将光照强度逐步提高至260～350μmol/m2/s，直至培养结束。
步骤S1中所述的硅藻优选为三角褐指藻(P.tricornutum)。
步骤S1中所述的种子培养基为f/2培养基；优选为含有有机碳源和氮源的f/2培养基；更优选为含有0.025～0.20mol/L甘油和含氮量0.005～0.02mol/L的f/2培养基；最优选为含有0.10mol/L甘油和含氮量0.02mol/L的f/2培养基。
所述的f/2培养基含有如下组分：海盐2×104mg/L；NaNO3 75mg/L或含等摩尔氮素的有机氮源；NaH2PO4·2H2O 10.0mg/L；Na2SiO3·5H2O 30mg/L；Na2EDTA·2H2O 4.36mg/L；CuSO4·5H2O 9.8×10-3mg/L；Na2MoO4·2H2O 6.3×10-3mg/L；ZnSO4·7H2O 22.0×10-3mg/L；FeCl3·6H2O 3.15×10-3mg/L；CoCl2·6H2O 10.0×10-3mg/L；MnCl2·4H2O 180.0×10-3mg/L；pH为8.0。
所述的有机氮源为胰蛋白胨和尿素中的至少一种；优选为胰蛋白胨和尿素混合得到的有机氮源；进一步优选为胰蛋白胨和尿素按摩尔比1～2:1～2混合得到的有机氮源；再进一步优选为胰蛋白胨和尿素按摩尔比1:1混合得到的有机氮源。
步骤S1和S2中所述的培养的温度优选为20±1℃。
步骤S1中所述的培养时间为4～12天；优选为8～12天；更优选为10～12天。
步骤S1中所述的培养为在光照恒温摇床上进行的培养，其转速为100～160rpm(转速优选为160rpm)。
步骤S1中所述的培养的光照强度为10～30μmol/m2/s；优选为20μmol/m2/s。
步骤S2中所述的硅藻种子液的接种量为按其所在发酵体系的终浓度为1×106～2×107cells/mL添加计算；优选为按其在所述发酵体系的终浓度为5×106～1×107cells/mL添加计算；更优选为按其在所述发酵体系的终浓度为1×107cells/mL添加计算。
步骤S2中所述的发酵培养基优选为含有硅酸钠、有机碳源和氮源的f/2培养基。
所述的发酵培养基中硅酸钠的浓度为0～120mg/L；优选为0～22.5mg/L；进一步优选为0～15mg/L；再进一步优选为0mg/L(无硅发酵培养基，即培养基中不含硅元素)。
所述的有机碳源优选为甘油。
所述的发酵培养基中有机碳源的浓度为0.025～0.20mol/L；优选为0.10mol/L。
所述的氮源为硝酸钠、胰蛋白胨和尿素中的至少一种；优选为胰蛋白胨和尿素；进一步优选为胰蛋白胨和尿素按摩尔比1～2:1～2混合得到的有机氮源；再进一步优选为胰蛋白胨和尿素按摩尔比1:1混合得到的有机氮源。
所述的发酵培养基中氮源的浓度为0.005～0.02mol/L；优选为0.02mol/L。
所述的f/2培养基含有如下组分：海盐2×104mg/L；NaNO3 75mg/L或含等摩尔氮素的有机氮源(优选为等摩尔氮素的有机氮源)；NaH2PO4·2H2O 10.0mg/L；Na2SiO3·5H2O 0～120mg/L(优选为0～22.5mg/L；进一步优选为0～15mg/L；再进一步优选为0mg/L)；Na2EDTA·2H2O 4.36mg/L；CuSO4·5H2O 9.8×10-3mg/L；Na2MoO4·2H2O 6.3×10-3mg/L；ZnSO4·7H2O 22.0×10-3mg/L；FeCl3·6H2O 3.15×10-3mg/L；CoCl2·6H2O 10.0×10-3mg/L；MnCl2·4H2O 180.0×10-3mg/L；pH为8.0。
所述的有机氮源为胰蛋白胨和尿素中的至少一种；优选为胰蛋白胨和尿素混合得到的有机氮源；进一步优选为胰蛋白胨和尿素按摩尔比1～2:1～2混合得到的有机氮源；再进一步优选为胰蛋白胨和尿素按摩尔比1:1混合得到的有机氮源。
步骤S2中所述的发酵罐为光发酵罐(20L体积以内玻璃罐为外置LED光源，20L以上体积为内置LED光源；装填系数均为70～80％)；优选为1～50000L的光发酵罐；更优选为5～50L的光发酵罐。
步骤S2中所述的阶梯式调光的方式优选为通过如下步骤实现：初始光照强度为100±5μmol/m2/s(发酵罐中心的光照强度)，在264h(11天)内以每24h提高20μmol/m2/s提高至260～300μmol/m2/s(优选260±5μmol/m2/s)，再以260～300μmol/m2/s(优选260±5μmol/m2/s)的光照强度培养至结束；进一步优选为通过如下步骤实现：初始光照强度为100±5μmol/m2/s，在0～144h时间段内调光4～6次，将光照强度提高至160～200μmol/m2/s；在144～216h时间段内维持光照强度不变；在216～288h时间段内调光2～3次，将光照强度提高至260～300μmol/m2/s直至培养结束；再进一步优选为通过如下步骤实现：初始光照强度为100±5μmol/m2/s，前96h内每48h提高20μmol/m2/s光照强度，直到140μmol/m2/s；在96～144h内，每24h提高20μmol/m2/s光照强度，直到180μmol/m2/s；144～216h内保持光照强度为180μmol/m2/s不变；216h提高20μmol/m2/s光照强度，216～240h保持光照强度为200μmol/m2/s不变，240h之后每24h提高30μmol/m2/s光照强度，直到260±5μmol/m2/s，培养至结束。
步骤S1和S2中所述的培养所用的光源为LED自然白光，其光谱组成为红：绿：蓝(R:G:B)＝18.9:76.1:5.1。
所述的LED自然白光由LED自然白灯条提供。
步骤S2中所述的发酵培养条件为：搅拌转速100～200rpm，通气量0.5～1.5vvm(优选为1.0～1.5vvm；更优选为1.0vvm)，培养至发酵体系中硅藻生长至稳定期终止培养。
步骤S2中所述的发酵培养的总时间为10～14天；优选为10～12天。
步骤S2中所述的培养过程中补加含有有机碳源的发酵培养基的补料时间为第6～8天；优选为第8天(即采用补料分批培养：补料前培养的时间为6～8天(优选为8天)，补料后再继续培养4～6天(优选为4天))。
步骤S2中所述的含有有机碳源的发酵培养基优选为含有甘油的发酵培养基；进一步优选为含有20～30g/L甘油的发酵培养基；再进一步优选为含有25～30g/L甘油的发酵培养基。
步骤S2中所述的发酵培养基中的碳氮比优选为15～30；更优选为30。
步骤S2中所述的发酵体系的pH值优选为8.0。
步骤S2中所述的发酵体系的pH值为采用酸碱调节剂进行调节；优选为采用盐酸溶液和氢氧化钠溶液进行调节；更优选为采用2～4mol/L的盐酸溶液和2～4mol/L的氢氧化钠溶液进行调节。
步骤S2中所述的发酵培养中还可以根据泡沫情况滴加消泡剂进行调节。
所述的提高硅藻中金藻昆布多糖产量的方法在培养硅藻和/或生产金藻昆布多糖中的应用。
所述的硅藻优选为三角褐指藻(P.tricornutum)。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明提供了一种提高硅藻中金藻昆布多糖产量的方法，将培养至对数生长期的硅藻种子液，接种至无硅、含混合氮源的发酵培养基，在硅藻细胞密度与光照强度相关联的阶梯式调光策略下进行补料分批培养，获得富含金藻昆布多糖的藻体生物质。采用本发明的方法可以促进细胞生长以及提高金藻昆布多糖的产量，可以运用于硅藻规模化生产金藻昆布多糖的技术领域。
(2)由于硅藻中金藻昆布多糖合成和脂肪酸合成之间存在竞争性，本发明通过改变摇瓶培养体系中的碳氮比和硅酸钠浓度来促进细胞生长及金藻昆布多糖产量的提高，在以硝酸钠为氮源(CGly/NNaNO3为30)时金藻昆布多糖产量最高，比混合氮源(胰蛋白胨和尿素、CGly/NT/U＝15)显著提高了63.16％，金藻昆布多糖产率达到48.33mg/L/d。而在混合氮源(T/U)条件下，无硅培养的胁迫条件可以促进金藻昆布多糖的积累，其产率可达45.33mg/L/d。
(3)本发明在光发酵罐体系的兼养培养模式下，采用补料(混合氮源)分批培养模式能显著性地提高三角褐指藻金藻昆布多糖的含量和产率，分别高达19.19％DW和143.77mg/L/d，相比混合氮源条件下的非补料培养模式分别提高了43.53％和186.28％。
(4)本发明在光发酵罐体系的混合氮源补料分批培养模式下，进一步采用阶梯式调光策略，显著性地提高了金藻昆布多糖的含量和产率，分别高达27.02％DW和218.25mg/L/d，相比两阶段调光策略分别提高了26.44％和43.95％。
附图说明
图1为实施例1的摇瓶体系中不同培养基碳氮比下兼养培养三角褐指藻时生物量浓度的变化图。
图2为实施例1的摇瓶体系中不同培养基碳氮比下兼养培养三角褐指藻时金藻昆布多糖产率、含量和产量的变化图。
图3为实施例2的摇瓶体系中不同硅酸钠浓度下兼养培养三角褐指藻时生物量浓度的变化图。
图4为实施例2的摇瓶体系中不同硅酸钠浓度下兼养培养三角褐指藻时金藻昆布多糖含量和产量的变化图。
图5为实施例3的5L光发酵罐体系中在非补料培养模式下采用不同氮源兼养培养三角褐指藻的生物量增长曲线图。
图6为实施例3的5L光发酵罐体系中在非补料培养模式下采用不同氮源兼养培养三角褐指藻的生物量产率、金藻昆布多糖含量和产率的变化图。
图7为实施例4的5L光发酵罐体系中在补料分批培养模式下采用不同氮源兼养培养三角褐指藻的生物量增长曲线图。
图8为实施例4的5L光发酵罐体系中在补料分批培养模式下采用不同氮源兼养培养三角褐指藻的生物量产率、金藻昆布多糖含量和产率的变化图。
图9为实施例5的5L光发酵罐体系中不同调光策略下兼养培养三角褐指藻的光照强度变化图。
图10为实施例5的5L光发酵罐体系中不同调光策略下兼养培养三角褐指藻的生物量增长曲线图。
图11为实施例5的5L光发酵罐体系中不同调光策略下兼养培养三角褐指藻的生物量产率、金藻昆布多糖含量和产率的变化图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂、仪器及设备未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
本发明实施例中采取的检测方法可参照如下说明：
(一)三角褐指藻细胞密度的测定
采用流式细胞仪进行细胞密度测定。吸取2mL三角褐指藻细胞培养液离心，去除上清液，用超纯水洗涤、重悬至上机浓度(约1～5×106cells/mL)，经300目尼龙筛绢过滤后上机进行细胞密度绝对计数(3次重复)。
(二)三角褐指藻生物量浓度的测定
采用烘干差重法测定生物量浓度。测量已烘至恒重的离心管重量，记为空管重量W1。吸取2mL三角褐指藻的藻液于该离心管中，8000r/min下离心3min，弃上清，蒸馏水洗涤离心两次后将藻泥置于烘箱中80℃烘干至恒重，测定并记录总重量W2。每个样品设置3个平行，取平均值并计算标准差，按如下公式计算生物量浓度：
Figure BDA0003092976740000061
式中：W1为空管重，单位为g；W2为烘干后离心管和微藻生物质的总重量，单位为g；V为样品体积，单位为L。
(三)三角褐指藻胞内金藻昆布多糖含量的测定
采用苯胺蓝荧光检测法测定三角褐指藻胞内金藻昆布多糖的含量，具体步骤如下：
(1)将新鲜藻液于4℃8000r/min离心5min收集藻细胞，冷冻干燥获得冻干藻粉。称取冻干藻粉15mg，用12mL TE缓冲液(先配制5mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)溶液，再用10mmol/L Tris-HCl调节pH至8.0)溶解，50℃温水浴30min，再用细胞破碎仪70Hz破碎细胞10min，于8000r/min离心5min除去细胞碎片，得到上清液S。收集上述浸提的上清S，加入100％三氯乙酸(TCA)溶液，使其终浓度为10％(w/v)，50℃水浴60min，以10000r/min离心20min，得到上清液F。将上清F与5倍无水乙醇混合，置于-20℃冰箱过夜，次日取出，再以10000r/min离心20min，收集沉淀，得到TCA处理的粗多糖样品T，将湿沉淀T稀释定容至10mL作为待测液。
(2)标准曲线绘制：称取酵母β-1,3-葡聚糖(CAS：9012-72-0，购自北京百灵威科技有限公司)20.00mg，用1mol/L氢氧化钠溶解并定容至100mL，为200μg/mL的葡聚糖储备液，用前稀释为质量浓度为1、2、5、10、15、20、30、40、60μg/mL的系列工作液。测定工作液的荧光强度(激发波长为398nm、发射波长为502nm)，再以葡聚糖工作液的浓度-荧光强度进行线性回归，绘制标准曲线。
(3)样品含量测定：取微藻多糖的待测液1.00mL于10mL离心管中，加入0.10mL的6mol/L NaOH，于80℃水浴保温30min。取出，迅速将离心管插入冰浴中10min。加入2.10mL苯胺蓝工作液(33体积0.1％苯胺蓝水溶液+18体积1mol/L盐酸+49体积pH 9.5的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液混合)，50℃水浴中保温30min，将反应液pH调至9.6。取出，室温下放置30min，去除未反应的试剂。取200μL反应液于酶标仪96孔板中，激发波长为398nm、发射波长为502nm，测定反应液荧光强度。将测定的荧光强度值代入β-1,3-葡聚糖的质量浓度-荧光强度之间的线性回归方程中，即可计算得出样品中金藻昆布多糖的含量。
实施例1在摇瓶体系中不同培养基碳氮比对三角褐指藻生物量和金藻昆布多糖产量的影响
1.1 藻种活化及种子液制备
将三角褐指藻(P.tricornutum)转接至改良(双倍磷源)的f/2人工海水培养基(表1)的斜面上进行培养，培养温度20℃，pH值8.0，光照强度20μmol/m2/s，并观察三角褐指藻的生长情况。从斜面上挑取三角褐指藻藻苔于改良的f/2液体培养基中，装液量为100mL，盐度为20‰，pH值8.0，置于光照强度为20μmol/m2/s的恒温光照摇床中进行培养，摇床转速为160rpm，培养10～12天用作种子液。其中改良的f/2人工海水培养基如表1所示。
表1改良的f/2人工海水培养基配方
组分 含量(mg/L) 组分 含量(mg/L) 组分 含量(mg/L)
海盐 2×10<sup>4</sup> NaNO3 75 NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O 10
Na<sub>2</sub>SiO<sub>3</sub>·5H<sub>2</sub>O 30 Na<sub>2</sub>EDTA·2H<sub>2</sub>O 4.36 CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O 9.8×10<sup>-3</sup>
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O 6.3×10<sup>-3</sup> ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 22.0×10<sup>-3</sup> FeCl<sub>3</sub>·6H<sub>2</sub>O 3.15×10<sup>-3</sup>
CoCl<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O 10.0×10<sup>-3</sup> MnCl<sub>2</sub>·4H<sub>2</sub>O 180.0×10<sup>-3</sup>
注：EDTA为乙二胺四乙酸。
1.2 摇瓶体系中不同培养基碳氮比下三角褐指藻的兼养培养
1.2.1 兼养培养：通过往甘油(Glycerol，简称Gly)浓度为0.10mol/L的改良的f/2培养基(表1)中依次加入0.02、0.01、0.005、0.0025mol/L(终浓度)的硝酸钠，使得培养基中碳氮比(CGly/NNaNO3；培养基中碳的总含量与氮的总含量的比值)为15、30、60、120；以含0.02mol/L总氮(0.01mol/L尿素+0.01mol/L胰蛋白胨；简称T/U)的培养基作为对照组，甘油浓度为0.10mol/L，其培养基中CGly/NT/U比为15。控制初始细胞密度为1.0×107cells/mL。每个梯度三个平行，将摇瓶放置在温度为20±1℃、光照强度为20±1μmol/m2/s、转速为160r/min的恒温光照摇床中培养12天，光源为全光谱LED灯。
1.2.2 分析测试：培养过程中每2天取样一次，取样体积为2mL，测定样品的细胞密度，同时将剩余藻液离心取藻泥，并用蒸馏水洗涤两次后将藻泥置于60℃烘箱中烘干以监测三角褐指藻细胞生物量浓度的变化。所有实验结束后收集剩余藻液，洗涤收集藻泥，并将藻泥真空冷冻干燥以获得藻粉，藻粉置于-20℃冰箱中储存作后续分析检测金藻昆布多糖含量，计算产量和产率。
采用Origin 9.0和SPSS软件对数据进行处理和统计学分析采用单因素方差分析法和成对数据t-检验进行显著性检验分析，不同字母表示组间显著性差异(P<0.05)。
1.3 产能分析结果
不同培养基碳氮比对三角褐指藻生物量和金藻昆布多糖产量的影响如图1和图2所示。结果表明，在培养基碳氮比(CGly/NNaNO3或CGly/NT/U)为15～120时，三角褐指藻生物量浓度在2.66～4.03g/L之间，其中碳氮比为15和30时生物量浓度之间无显著性差异，但显著高于碳氮比为60和120的实验组；培养基碳氮比为15～120时，金藻昆布多糖的含量在10.16～17.22％DW(干重)之间，当CGly/NNaNO3为30时金藻昆布多糖的产量和产率最高分别为646.38mg/L和48.33mg/L/d，分别比对照组(CGly/NT/U＝15)提高了63.16％和73.97％。
实施例2在摇瓶体系中不同硅酸钠浓度对三角褐指藻生物量和金藻昆布多糖产量的影响
2.1 藻种活化及种子液制备
三角褐指藻(P.tricornutum)按1.1所述方法传代培养，培养10～12天用作种子液。
2.2 摇瓶体系中不同硅酸钠浓度下三角褐指藻的兼养培养
实验前期对三角褐指藻连续培养结果表明，在混养条件下以尿素和胰蛋白胨为混合氮源连续培养(三代)三角褐指藻，藻细胞生长状况良好，获得的生物量浓度高，而以硝酸钠为氮源连续混养培养三角褐指藻，其藻细胞生长状况不佳，有部分藻细胞死亡。因此后续实验以尿素和胰蛋白胨为混合氮源进行摇瓶体系的单因素优化。在以0.10mol/L甘油为碳源、0.02mol/L总氮(0.01mol/L尿素+0.01mol/L胰蛋白胨)为氮源的无硅f/2培养基(即Na2SiO3·5H2O浓度为0mg/L的改良的f/2培养基(表1))中，依次加入0、7.5、15、22.5、30、60、90、120mg/L(终浓度)的硅酸钠，命名为0Si、1/4Si、1/2Si、3/4Si、1Si、2Si、3Si、4Si。控制初始细胞密度为1.0×107cells/mL，其余培养条件同1.2.1。
检测及分析方法同1.2.2。
2.3 产能分析结果：
不同硅酸钠浓度对三角褐指藻生物量和金藻昆布多糖产量的影响如图3和图4所示。结果表明，随着硅酸钠浓度的增加，三角褐指藻生物量浓度呈现先升高后下降的趋势，而金藻昆布多糖含量(8.63～16.35％DW)呈现逐渐降低的趋势。在1/2Si(硅酸钠浓度为15mg/L)条件下，生物量浓度最高可达4.02g/L，显著高于其他硝酸钠浓度组别；而在无Si条件(硅酸钠浓度为0mg/L)下，金藻昆布多糖产量和产率均最高分别为595.67mg/L和45.33mg/L/d，分别比对照组(1Si，硅酸钠浓度为30mg/L)提高了49.53％和54.60％。
实施例3在5L光发酵罐体系中非补料培养模式下不同氮源兼养培养三角褐指藻(P.tricornutum)
3.1 藻种活化及种子液制备
三角褐指藻(P.tricornutum)按1.1所述方法传代培养，培养10～12天用作种子液。
3.2 5L发酵罐体系中非补料培养模式下不同氮源对三角褐指藻的兼养培养
配制3.5L的f/2无硅培养基(同实施例2)于5L发酵罐中(配制两个发酵罐)，初始甘油浓度为0.10mol/L，在两个罐中分别设置初始氮源种类及浓度为：0.02mol/L的混合氮源(0.01mol/L尿素+0.01mol/L胰蛋白胨)、0.01mol/L的硝酸钠(实施例1中摇瓶中优化结果)。将发酵罐于121℃高压灭菌15min，待冷却后，将浓缩的种子液分别接种于两个发酵罐中，连续培养10天。三角褐指藻初始密度为1.0×107cells/mL，光发酵过程中控制pH值为8.0，温度为20℃，通气量维持在1.0～1.5vvm左右，光源采用LED自然白灯条串联放置在灯板上，每个发酵罐采用4块灯板并环绕放置在发酵罐四周。酸碱瓶中分别为盐酸、氢氧化钠和消泡剂，其浓度分别为3mol/L、3mol/L和3％(w/v，消泡剂/培养基)左右，发酵过程中为维持藻细胞生长所需pH值的恒定，需要用盐酸和氢氧化钠进行自动调节，同时为了减少泡沫对藻细胞生长的遮蔽效应，需根据泡沫情况自动滴加消泡剂进行调节。培养过程中，光照强度随培养时间根据细胞生长状况从100μmol/m2/s增加到160μmol/m2/s进行调光(初始光照强度为100μmol/m2/s培养至120h，120h调节光电控制箱电流，使得光照强度增加到160μmol/m2/s，培养至结束)，转速也从100rpm增加到120rpm(初始转速为100rpm培养至144h，144h通过发酵罐控制系统调节搅拌浆转速至120rpm，以120rpm培养至结束)培养时间为240h。
分析测试：培养过程中每12h取样15mL藻液用于测试生长指标、每24h取样50mL藻液用于测试胞内生物质含量，取部分藻液用于细胞密度的测试，另一部分藻液经离心、洗涤后获得藻泥，藻泥用于获得藻细胞的生物量干重以及冷冻干燥后测定藻粉中碳水化合物和金藻昆布多糖的含量。
3.3 产能分析结果
在非补料培养模式下，不同种类氮源及浓度对三角褐指藻的生物量、金藻昆布多糖含量及产率等的影响见图5和图6。如图5所示，在培养前120h内，三角褐指藻在混合氮源以及硝酸钠为氮源的条件下生长状况一致，至120h时两者之间生物量浓度无显著性差异。至培养结束(240h)，以尿素和胰蛋白为混合氮源(T/U)的实验组中生物量和生物量产率均达到最大值，分别为3.90g/L和315.00mg/L/d，显著高于以硝酸钠为氮源的实验组(P<0.05)。如图6所示，以胰蛋白胨和尿素为混合氮源(0.02mol/L)，初始碳氮比(CGly/NT/U)为15，培养结束时三角褐指藻金藻昆布多糖的含量、产量及产率最高分别为13.37％DW、521.43mg/L和50.22mg/L/d，极显著高于硝酸钠组(P<0.01)，较硝酸钠组(0.01mol/L硝酸钠，初始CGly/NNaNO3为30)分别提高了30.69％、40.93％和44.60％。
这里发酵罐体系培养与摇体系培养(实施例1)的结果不完全一致，可能原因是培养体系不同造成。光发酵罐体系能严格控制藻细胞生长的温度和pH，配合两阶段调光和搅拌调控，单个藻细胞受到的光量子强度适宜，使得藻细胞生长状态最佳。而摇瓶体系培养过程中pH的改变可能会影响藻细胞的生长，同时摇瓶体系中的恒定光强，在培养后期可能带来光遮蔽效应，影响藻细胞的生长。
实施例4在5L光发酵罐体系中补料分批培养模式下不同氮源兼养培养三角褐指藻
4.1 藻种活化及种子液制备
三角褐指藻(P.tricornutum)按1.1所述方法传代培养，培养10～12天用作种子液。
4.2 5L发酵罐体系中补料分批培养模式下不同氮源对三角褐指藻的兼养培养
发酵前期相关培养基和补料溶液的配制、发酵罐及补料瓶的灭菌方法以及接种操作等同3.2中所述的方法。培养基中所用碳源均为0.10mol/L(终浓度)的甘油，两个发酵罐的氮源分别为：0.02mol/L的混合氮源(0.01mol/L尿素+0.01mol/L胰蛋白胨)、0.01mol/L的硝酸钠。整个光发酵过程在补料培养模式下进行，共培养264h。前192h的培养过程同3.2中所述，在192h时，向混合氮源组补加甘油浓度为20.23g/L的改良的f/2无氮培养基，补加体积约为0.50L，使得混合氮源组培养基中的CGly/N比由培养初始的15:1变为30:1；向硝酸钠组补加硝酸钠浓度为0.29g/L的改良的f/2培养基，补加体积约为0.50L，使硝酸钠组维持CGly/N为30:1。培养过程中，光照强度随培养时间根据细胞生长状况从100μmol/m2/s增加到160μmol/m2/s进行调光(光照强度调节的时间点同实施例3)，转速也从100rpm增加到120rpm(转速调节的时间点也同实施例3)，补料后培养至264h时结束培养。
培养过程中样品的收集和测定参照3.2中所述的方法。
4.3 产能分析结果
在补料分批培养模式下，不同种类氮源及浓度对三角褐指藻的生物量、金藻昆布多糖含量及产率等的影响见图7和图8。如图7所示，在培养结束时，混合氮源组(T/U)可以获得最大的生物量浓度为3.68g/L，显著高于硝酸钠组(P<0.05)，是硝酸钠组的1.14倍；此时生物量产率也获得最大值为355.56mg/L/d，但与硝酸钠组无显著性差异。如图8所示，在补料分批培养模式下，以胰蛋白胨和尿素为混合氮源(0.02mol/L)培养三角褐指藻，培养结束时(264h)三角褐指藻金藻昆布多糖的含量、产量及产率可达到最高分别为19.19％DW、706.83mg/L和143.77mg/L/d，分别比硝酸钠组提高了89.81％、116.23％和130.40％。这表明补料分批培养模式相对于不补料培养模式能有效地促进藻细胞金藻昆布多糖的积累。
实施例5在5L光发酵罐体系中不同调光策略下兼养培养三角褐指藻
5.1 藻种活化及种子液制备
三角褐指藻(P.tricornutum)按1.1所述方法传代培养，培养10～12天用作种子液。
5.2 5L发酵罐体系中不同调光策略下三角褐指藻的兼养培养
培养发酵前期相关培养基和补料溶液的配制、发酵罐及补料瓶的灭菌方法以及接种操作同3.2中所述的方法。培养基所用碳源均为0.10mol/L的甘油，氮源均为0.02mol/L的混合氮源(0.01mol/L尿素+0.01mol/L胰蛋白胨)。设置两个实验组，两个实验组光源均采用LED自然白灯条串联并排放置，每个发酵罐采用4块灯板，不同之处在于培养过程中光照强度的调节范围(见图9)，实验组一(阶梯式调光)：光照强度随培养时间根据细胞生长状况从100μmol/m2/s增加到260μmol/m2/s(具体为：初始光照强度为100μmol/m2/s，前96h内每48h提高20μmol/m2/s光照强度，直到140μmol/m2/s；在96～144h内，每24h提高20μmol/m2/s光照强度，直到180μmol/m2/s；144～216h内保持光照强度为180μmol/m2/s不变；216h提高20μmol/m2/s光照强度(至光照强度为200μmol/m2/s)，216～240h保持光照强度为200μmol/m2/s不变，240h之后每24h提高30μmol/m2/s光照强度，直到260μmol/m2/s，培养至结束)；实验组二(两阶段调光)：光照强度随培养时间根据细胞生长状况，光强从100μmol/m2/s增加到160μmol/m2/s(具体为：初始光照强度为100μmol/m2/s培养至120h，120h调节光电控制箱电流，使得光照强度增加到160μmol/m2/s，培养至结束)。整个光发酵过程在补料培养模式下进行，共培养288h。前192h的培养过程同3.2中所述，在192h时分别向两个光发酵罐中补加含有一定甘油浓度的改良的f/2培养基，其中实验组一和实验组二中补加的甘油浓度分别为23.80g/L和28.90g/L，补加体积约为0.50L，使得培养基中的CGly/N比由培养初始的15:1变为30:1。补料后培养至288h时结束。
培养过程中样品的收集和测定参照3.2中所述的方法。
5.3 产能分析结果
在混合氮源的补料分批培养条件下，不同调光策略对三角褐指藻的生物量、金藻昆布多糖含量及产率等的影响见图10和图11。如图10所示，培养结束时，三角褐指藻在阶梯式调光体系下获得最大的生物量浓度和产率分别为4.60g/L和437.50mg/L/d，均极显著地高于两阶段调光体系(P<0.01)，分别是两阶段调光组的1.14倍和1.22倍。如图11所示，三角褐指藻细胞内金藻昆布多糖的含量主要在补料分批培养后期(192～288h)剧增，在阶梯式调光策略(100～260μmol/m2/s)下，培养结束时三角褐指藻胞内金藻昆布多糖含量、产量及产率达到最高值分别为27.02％DW、1242.92mg/L/d和218.25mg/L/d，相对于两阶段调光(100～160μmol/m2/s)策略分别提高了26.44％、44.20％和43.95％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种提高硅藻中金藻昆布多糖产量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、种子液培养：将硅藻接种至种子培养基中，培养至对数生长期，得到硅藻种子液；
S2、光发酵培养：将步骤S1得到的硅藻种子液接种至装有发酵培养基的光发酵罐中，采用阶梯式调光的方式进行光发酵培养，在192 h时向光发酵罐中补加23.80 g/L的甘油，补加体积为0.50 L，使得培养基中的碳氮比由培养初始的15:1变为30:1，并控制发酵体系的pH值为8.0；其中，阶梯式调光的方式如下：初始光照强度为100 μmol/m2/s，前96 h内每48h提高20 μmol/m2/s光照强度，直到140 μmol/m2/s；在96 ~ 144 h内，每24 h提高20 μmol/m2/s光照强度，直到180 μmol/m2/s；144 ~ 216 h内保持光照强度为180 μmol/m2/s不变；216 h提高20 μmol/m2/s光照强度至光照强度为200 μmol/m2/s，216 ~ 240 h保持光照强度为200 μmol/m2/s不变，240 h之后每24 h提高30 μmol/m2/s光照强度，直到260 μmol/m2/s，培养至288 h时结束；
步骤S1中所述的硅藻为三角褐指藻（P. tricornutum）；
步骤S1中所述的种子培养基为f/2培养基，由如下组分组成：海盐2×104 mg/L；NaNO375 mg/L；NaH2PO4·2H2O 10.0 mg/L；Na2SiO3·5H2O 30 mg/L；Na2EDTA·2H2O 4.36 mg/L；CuSO4·5H2O 9.8×10-3 mg/L；Na2MoO4·2H2O 6.3×10-3 mg/L；ZnSO4·7H2O 22.0×10-3mg/L；FeCl3·6H2O 3.15×10-3 mg/L； CoCl2·6H2O 10.0×10-3 mg/L；MnCl2·4H2O 180.0×10-3 mg/L；pH为 8.0；
步骤S1中所述的培养的温度为20 ℃；
步骤S1中所述的培养的时间为10 ~ 12天；
步骤S1中所述的培养的pH值为8.0；
步骤S1中所述的培养为在光照恒温摇床上进行的培养，其转速为160 rpm；
步骤S1中所述的培养的光照强度为20 μmol/m2/s；
步骤S2中所述的硅藻种子液的接种量为按其在发酵体系的终浓度为1.0×107 cells/mL添加计算；
步骤S2中所述的发酵培养基为无硅发酵培养基，由如下组分组成：海盐2×104 mg/L；甘油0.10 mol/L；尿素0.01 mol/L；胰蛋白胨0.01 mol/L；NaH2PO4·2H2O 10.0 mg/L；Na2EDTA·2H2O 4.36 mg/L；CuSO4·5H2O 9.8×10-3 mg/L；Na2MoO4·2H2O 6.3×10-3 mg/L；ZnSO4·7H2O 22.0×10-3 mg/L；FeCl3·6H2O 3.15×10-3 mg/L； CoCl2·6H2O 10.0×10-3mg/L；MnCl2·4H2O 180.0×10-3 mg/L；pH为 8.0；
步骤S2中光发酵培养条件为：温度20 ℃，搅拌转速100 ~ 120 rpm，通气量1.0 ~ 1.5vvm。
2.权利要求1所述的提高硅藻中金藻昆布多糖产量的方法在培养硅藻和/或生产金藻昆布多糖中的应用，其特征在于：所述的硅藻为三角褐指藻（P. tricornutum）。
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