CN113260627A - 工程化单克隆抗体以改善稳定性和生产滴度 - Google Patents
工程化单克隆抗体以改善稳定性和生产滴度 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113260627A CN113260627A CN202080007979.9A CN202080007979A CN113260627A CN 113260627 A CN113260627 A CN 113260627A CN 202080007979 A CN202080007979 A CN 202080007979A CN 113260627 A CN113260627 A CN 113260627A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- antibody
- variant
- increase
- antibody variant
- heavy chain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
Abstract
本文提出了涉及工程化单克隆抗体和抗体变体以改善培养中的稳定性及其产量的方法。具体地,这些单克隆抗体可以在重链残基56(AHo编号)处工程化为甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸,和/或在位置80(AHo编号)处工程化为疏水性残基例如丙氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或缬氨酸。
Description
相关申请
本申请要求于2019年1月3日提交的美国临时申请号62/787,867的权益,将其通过引用以其全文并入本文。
技术领域
提出的主题涉及蛋白质工程领域。具体地,提出的主题涉及工程化抗体,尤其是单克隆抗体及其变体,以改善其稳定性和产量。
背景技术
重组产生的单克隆抗体(mAb)(及其活性片段)是重要的治疗工具。然而,由于这些分子的复杂性,为了促进这些分子的生产、储存和治疗施用,需要面对许多挑战。
两个挑战涉及产量和稳定性。mAb是在生物反应器中由工程化细胞(例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)产生的。然而,生产水平可能是低的,并且可能随着mAb的不同而变化。低生产水平增加了生产成本,包括生产时间、人力和消耗的资源(例如,生物反应器运行所需的组分)。此外,稳定性的缺乏会影响mAb的“保质期”。降解的mAb的效力可能较低,而碎片化的mAb可能存在免疫风险。
因此,需要改善mAb的稳定性和生产滴度。
发明内容
在第一方面中,本文提供了增加第一抗体稳定性的方法,该方法包括在重链位置56(AHo编号)处取代甘氨酸、丙氨酸、或丝氨酸以产生第二抗体,其中该第二抗体比该未取代的第一抗体更稳定。例如,在重链位置56处,甘氨酸或丝氨酸可以被取代。例如,在重链位置56处,甘氨酸或丙氨酸可以被取代。例如,在重链位置56处,甘氨酸可以被取代。
在第二方面中,本文提供了增加第一抗体稳定性的方法,该方法包括在第一抗体的重链位置80(AHo编号)处取代疏水性氨基酸以产生第二抗体,其中该第二抗体比该未取代的第一抗体更稳定。疏水性氨基酸残基的实例包括丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。举例而言,疏水性氨基酸残基可以包含以下或由以下组成:丙氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或缬氨酸。举例而言,疏水性氨基酸残基可以包含以下或由以下组成:苯丙氨酸、亮氨酸或缬氨酸。
在第三方面中,本文提供了增加第一抗体稳定性的方法,该方法包括在第一抗体的重链位置80(AHo编号)处取代丙氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸或缬氨酸以产生第二抗体,其中该第二抗体比该未取代的第一抗体更稳定。例如,在重链位置80处,苯丙氨酸、亮氨酸或缬氨酸可以被取代。例如,在重链位置80处,异亮氨酸或甲硫氨酸可以被取代。例如,在重链位置80处,异亮氨酸可以被取代。例如,在重链位置80处,甲硫氨酸可以被取代。
在这前三个方面的子方面中,第二抗体的稳定性的增加通过选自下组的至少一种来证明,该组由以下组成:在细胞培养期间滴度的增加、细胞培养产率的增加、纯化后纯度的增加、高分子量物质的减少、熔点温度的升高、聚集温度的升高和熔融起始温度的升高。在一些子方面中,使用Octet Forte Bio仪器,通过结合到蛋白质A包被的探针端部的速率来测量滴度的增加;并且/或通过蛋白质A或蛋白质G捕获来测量产率的增加;并且/或通过纯化蛋白质的SEC来测量纯度的增加;并且/或通过尺寸排阻色谱法(SEC)和每个分子量的每个峰的曲线下面积来测量高分子量物质的减少;并且/或通过差示扫描荧光测定(DSF)或差示扫描量热法(DSC)来测量熔点温度的升高;并且/或通过DSF来测量聚集温度的升高;并且/或通过DSF来测量熔融起始温度的升高。
在第一方面的一些子方面中,第二抗体在重链位置80(AHo编号)处进一步被疏水性氨基酸残基取代。例如,疏水性氨基酸残基可以包含以下或由以下组成:丙氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或缬氨酸。例如,疏水性氨基酸残基可以选自下组,该组由以下组成:苯丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸。在第一方面的一些子方面中,第二抗体在位置80(AHo编号)处进一步被甲硫氨酸取代,或者,可替代地,第二抗体在位置80(AHo编号)处进一步被异亮氨酸取代。在第一方面的一些子方面中,第二抗体在位置80(AHo编号)处进一步被丙氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸或缬氨酸取代。在第一方面的一些子方面中,第二抗体在位置80(AHo编号)处进一步被苯丙氨酸、亮氨酸或缬氨酸取代。
在第二和第三方面的一些子方面中,第二抗体在位置56(AHo编号)处进一步被甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸取代。在第二和第三方面的一些子方面中,第二抗体在位置56(AHo编号)处进一步被甘氨酸或丙氨酸取代。在第二和第三方面的一些子方面中,第二抗体在位置56(AHo编号)处进一步被甘氨酸或丝氨酸取代。在第二和第三方面的一些子方面中,第二抗体在位置56(AHo编号)处进一步被甘氨酸取代。
在这前三个方面中,第一抗体是单克隆抗体,例如像人抗体或人源化抗体。此外,第一抗体是IgG抗体,例如选自下组的IgG抗体,该组由以下组成:IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体和IgG4抗体。即,IgG抗体可以是IgG1抗体,IgG抗体可以是IgG2抗体,IgG抗体可以是IgG3抗体,并且IgG抗体可以是IgG4抗体。
在第四方面中,本文披露了增加第一抗体变体稳定性的方法,该方法包括在重链位置56(AHo编号)处取代甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸以产生第二抗体变体,其中该第二抗体变体比该未取代的第一抗体变体更稳定。例如,在重链位置56处,甘氨酸或丝氨酸可以被取代。例如,在重链位置56处,甘氨酸或丙氨酸可以被取代。例如,在重链位置56处,甘氨酸可以被取代。
在第五方面中,本文披露了增加第一抗体变体稳定性的方法,该方法包括在第一抗体变体的重链位置80(AHo编号)处取代疏水性氨基酸残基(例如,丙氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或缬氨酸)以产生第二抗体变体,其中该第二抗体变体比该未取代的第一抗体变体更稳定。例如,疏水性氨基酸残基可以包含以下或由以下组成:苯丙氨酸、亮氨酸或缬氨酸。例如,疏水性氨基酸残基可以包含以下或由以下组成:甲硫氨酸或异亮氨酸。
在第六方面中,本文披露了增加第一抗体变体稳定性的方法,该方法包括在第一抗体变体的重链位置80(AHo编号)处取代丙氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸或缬氨酸以产生第二抗体变体,其中该第二抗体变体比该未取代的第一抗体变体更稳定。例如,在重链位置80处,苯丙氨酸、亮氨酸或缬氨酸可以被取代。例如,在重链位置80处,甲硫氨酸或异亮氨酸可以被取代。例如,在重链位置80处,甲硫氨酸可以被取代。例如,在重链位置80处,异亮氨酸可以被取代。
在这些第四、第五和第六方面的子方面中,第二抗体变体的稳定性的增加通过选自下组的至少一种来证明,该组由以下组成:在细胞培养期间滴度的增加、细胞培养产率的增加、纯化后纯度的增加、高分子量物质的减少、熔点温度的升高、聚集温度的升高和熔融起始温度的升高。在一些子方面中,使用Octet Forte Bio仪器,通过结合到蛋白质A包被的探针端部的速率来测量滴度的增加;并且/或通过蛋白质A或蛋白质G捕获来测量产率的增加;并且/或通过纯化蛋白质的SEC来测量纯度的增加;并且/或通过尺寸排阻色谱法(SEC)和每个分子量的每个峰的曲线下面积来测量高分子量物质的减少;并且/或通过差示扫描荧光测定(DSF)或差示扫描量热法(DSC)来测量熔点温度的升高;并且/或通过DSF来测量聚集温度的升高;并且/或通过DSF来测量熔融起始温度的升高。
在第四方面的一些子方面中,第二抗体变体在重链位置80(AHo编号)处进一步被疏水性氨基酸残基取代。例如,疏水性氨基酸残基可以选自下组,该组由以下组成:丙氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸。例如,疏水性氨基酸残基可以选自下组,该组由以下组成:苯丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸。在第四方面的一些子方面中,第二抗体变体在位置80(AHo编号)处进一步被甲硫氨酸取代,或者,可替代地,第二抗体在位置80(AHo编号)处进一步被异亮氨酸取代。在第四方面的一些子方面中,第二抗体变体在位置80(AHo编号)处进一步被丙氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸或缬氨酸取代。在第四方面的一些子方面中,第二抗体变体在位置80(AHo编号)处进一步被苯丙氨酸、亮氨酸或缬氨酸取代。
在第五和第六方面的一些子方面中,第二抗体变体在位置56(AHo编号)处进一步被甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸取代。例如,在位置56处,第二抗体变体可以被甘氨酸或丙氨酸取代。例如,在位置56处,第二抗体变体可以被甘氨酸或丝氨酸取代。例如,在位置56处,第二抗体变体可以被甘氨酸取代。
在这些第四、第五和第六方面的一些子方面中,第一抗体变体是多特异性抗体,例如双特异性或三特异性抗体。在这些第四、第五和第六方面的一些子方面中,第一抗体变体是能够结合抗原的抗体片段;该抗体片段可以选自下组,该组由以下组成:Fab片段、Fab'片段、F'(ab)2片段、Fv片段、单链抗体、双功能抗体)、双互补位肽、结构域抗体(dAb)、CDR移植的抗体、单链抗体(scFv)、单链抗体片段、嵌合抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、微型抗体、线性抗体;螯合重组抗体、三抗体、双抗体、胞内抗体、纳米抗体、小模块免疫药物(SMIP)、抗原结合结构域免疫球蛋白融合蛋白、单结构域抗体和含VHH抗体。
此外,在这些第四、第五和第六方面中,第一抗体变体是单克隆抗体变体,例如像人抗体变体或人源化抗体变体。此外,第一抗体变体是IgG抗体变体,例如选自下组的IgG抗体变体,该组由以下组成:IgG1抗体变体、IgG2抗体变体、IgG3抗体变体和IgG4抗体变体。即,IgG抗体变体可以是IgG1抗体变体,IgG抗体变体可以是IgG2抗体变体,IgG抗体变体可以是IgG3抗体变体,并且IgG抗体变体可以是IgG4抗体变体。
在第七方面中,本文披露了增加第一抗体或第一抗体变体的稳定性的方法,该方法包括
a.鉴定出该第一抗体或该抗体变体的抗体部分的重链的种系原始氨基酸序列;
b.鉴定在该第一抗体或该抗体变体的抗体部分的重链位置56(AHo编号)处和重链位置80(AHo编号)处的氨基酸残基;以及
c.在该第一抗体或该抗体变体的抗体部分中,在重链位置56和80处取代来自该种系原始氨基酸序列的已鉴定残基,从而产生第二抗体或第二抗体变体,
其中该第二抗体比该未取代的第一抗体更稳定,或者其中该第二抗体变体比该未取代的第一抗体变体更稳定。
在此第七方面的一个子方面中,第二抗体或第二抗体变体的稳定性的增加通过选自下组的至少一种来证明,该组由以下组成:在细胞培养期间滴度的增加、细胞培养产率的增加、纯化后纯度的增加、高分子量物质的减少、熔点温度的升高、聚集温度的升高和熔融起始温度的升高。在此第七方面的子方面中,第二抗体或第二抗体变体的稳定性的增加通过选自下组的至少一种来证明,该组由以下组成:在细胞培养期间滴度的增加、细胞培养产率的增加、纯化后纯度的增加、高分子量物质的减少、熔点温度的升高、聚集温度的升高和熔融起始温度的升高。在一些子方面中,使用Octet Forte Bio仪器,通过结合到蛋白质A包被的探针端部的速率来测量滴度的增加;并且/或通过蛋白质A或蛋白质G捕获来测量产率的增加;并且/或通过纯化蛋白质的SEC来测量纯度的增加;并且/或通过尺寸排阻色谱法(SEC)和每个分子量的每个峰的曲线下面积来测量高分子量物质的减少;并且/或通过差示扫描荧光测定(DSF)或差示扫描量热法(DSC)来测量熔点温度的升高;并且/或通过DSF来测量聚集温度的升高;并且/或通过DSF来测量熔融起始温度的升高。
在此第七方面中,第一抗体变体是多特异性抗体,例如双特异性或三特异性抗体。在这些第四、第五和第六方面的一些子方面中,第一抗体变体是能够结合抗原的抗体片段;该抗体片段可以选自下组,该组由以下组成:Fab片段、Fab'片段、F'(ab)2片段、Fv片段、单链抗体、双功能抗体)、双互补位肽、结构域抗体(dAb)、CDR移植的抗体、单链抗体(scFv)、单链抗体片段、嵌合抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、微型抗体、线性抗体;螯合重组抗体、三抗体、双抗体、胞内抗体、纳米抗体、小模块免疫药物(SMIP)、抗原结合结构域免疫球蛋白融合蛋白、单结构域抗体和含VHH抗体。
此外,在此第七方面中,第一抗体变体是单克隆抗体变体,例如像人抗体变体或人源化抗体变体。此外,第一抗体变体是IgG抗体变体,例如选自下组的IgG抗体变体,该组由以下组成:IgG1抗体变体、IgG2抗体变体、IgG3抗体变体和IgG4抗体变体。即,IgG抗体变体可以是IgG1抗体变体,IgG抗体变体可以是IgG2抗体变体,IgG抗体变体可以是IgG3抗体变体,并且IgG抗体变体可以是IgG4抗体变体。
另外,在此第七方面中,第一抗体是单克隆抗体,例如像人抗体或人源化抗体。此外,第一抗体是IgG抗体,例如选自下组的IgG抗体,该组由以下组成:IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体和IgG4抗体。即,IgG抗体可以是IgG1抗体,IgG抗体可以是IgG2抗体,IgG抗体可以是IgG3抗体,并且IgG抗体可以是IgG4抗体。
在第一至第八方面的任何一个的一些子方面中,该第二抗体或第二抗体变体在重链位置56和80(AHo编号)处分别被以下残基对中的任何一个取代:GF、GI、GL、GT、GV、AF、AI、AL、AV、AA、AM、SA、SI或ST。举例而言,需要注意的是,对于该命名法,“GF”将指在重链位置56处的“G”和在重链位置80(AHo编号)处的“F”。在第一至第八方面的任何一个的一些子方面中,该第二抗体或第二抗体变体在重链位置56和80(AHo编号)处分别被以下残基对中的任何一个取代:GF、GL、GV、AF、AL或AV。与第一抗体(或第一抗体变体)相比,此类取代可以具有更高的滴度和/或更高的Tm。在第一至第八方面的任何一个的一些子方面中,该第二抗体或第二抗体变体在重链位置56和80(AHo编号)处分别被以下残基对中的任何一个取代:AA、AL、AM、AV、GF、GL、GT、SA或ST。与第一抗体(或第一抗体变体)相比,此类取代可以具有更高的滴度。在第一至第八方面的任何一个的一些子方面中,该第二抗体或第二抗体变体在重链位置56和80(AHo编号)处分别被以下残基对中的任何一个取代:AI、AV、GI、SI或GV。与第一抗体(或第一抗体变体)相比,此类取代可以具有更高的Tm。在第一至第八方面的任何一个的一些子方面中,该第二抗体或第二抗体变体在重链位置56和80(AHo编号)处分别被以下残基对中的任何一个取代:GF、GL、GT、GV、AF、AL、AV、AA、AM、AV、SA和ST。与第一抗体(或第一抗体变体)相比,此类取代可以具有更高的滴度。在第一至第八方面的任何一个的一些子方面中,该第二抗体或第二抗体变体在重链位置56和80(AHo编号)处分别被以下残基对中的任何一个取代:GF、GI、GL、GV、AF、AL、AV、AI或SI。与第一抗体(或第一抗体变体)相比,此类取代可以具有更高的Tm。
在第八方面中,本文提供了制备药物组合物的方法,该药物组合物与任何前述方面产生的第二抗体或第二抗体变体一起配制。
在第九方面中,本文提供了根据前七方面中任一方面制备的抗体或抗体变体。
在第十方面中,本文提供了包含根据前七方面中任一方面制备的抗体或抗体变体的药物组合物。
附图说明
图1A-1D是示出两种单克隆抗体(工程化单克隆抗体及其亲本单克隆抗体)的各种特征的一系列图。
图2A是示出如下信息的图:对于mAb1,丙氨酸和甘氨酸在HC:56处具有最高滴度。HC80残基示出于X轴标记的上排。HC56残基示出于X轴标记的下排。
图2B是示出如下信息的图:对于mAb1,苯丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸在HC:80处具有最高滴度。HC56残基示出于X轴标记的上排。HC80残基示出于X轴标记的下排。
图3A是示出如下信息的图:对于mAb1,具有高滴度的HC56和HC80变体也具有高Tm。HC80残基示出于X轴标记的上排。HC56残基示出于X轴标记的下排。
图3B是示出如下信息的图:对于mAb1,在HC80处具有苯丙氨酸、亮氨酸或缬氨酸的分子具有高于65℃的Tm。HC56残基示出于X轴标记的上排。HC80残基示出于X轴标记的下排。
图4是示出如下信息的图:如通过SEC所测定的,对于mAb1,大多数高分子量(HMW)水平低于5%。HC80残基示出于X轴标记的上排。HC56残基示出于X轴标记的下排。
图5是示出如下信息的图:mAb2在HC56和HC80处具有例如疏水性残基的残基时表达良好。HC80残基示出于X轴标记的上排。HC56残基示出于X轴标记的下排。
图6是示出如下信息的图:对于在mAb2的HC56和HC80处的取代,Tm与滴度相关。HC80残基示出于X轴标记的上排。HC56残基示出于X轴标记的下排。
图7是示出针对在mAb2的HC56和HC80处的取代的高分子量物质的图。HC80残基示出于X轴标记的上排。HC56残基示出于X轴标记的下排。
具体实施方式
出人意料的是,当mAb的抗体重链残基56(AHo编号;以Kabat编号为残基49)被修饰为甘氨酸时,相比于在该位置具有经常观察到的丙氨酸残基的分子,抗体在培养中/生产过程中具有更高的滴度和更高的Tm。已在遍及大量mAb和种系的比较中观察到此影响,并且在任何情况下,其与哪种残基是种系无关。此观察与Mason等人(Mason等人2012)发表的研究形成对照,Mason等人报告了在残基56(AHo编号)处的丙氨酸改善了IgG4 mAb的表达滴度。另外,在重链位置80(AHo编号)处,以分子依赖的方式使用甲硫氨酸相比于异亮氨酸残基,会严重影响滴度。
定义
AHo编号方案是一种基于结构的编号方案,其在CDR区域引入空位以最小化与比对的结构域的平均结构的偏差(Honegger&Pluckthun 2001)。在AHo编号方案中,不同抗体中的结构等效位置将具有相同的残基编号。
“抗体”或“免疫球蛋白”意指由两条重链和两条轻链组成的四聚体糖蛋白,每条重链和轻链各自包含可变结构域(V)和恒定结构域(C)。“重链”和“轻链”意指基本上全长的标准免疫球蛋白轻链和重链;重链和轻链的可变结构域(VL和VC)构成抗体的V区,并促成抗原结合和特异性。“抗体”包括单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人抗体和人源化抗体。轻链可以分类为κ和λ轻链。重链典型地分类为μ、δ、γ、α或ε,并且将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有若干亚类,包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM具有包括IgM1和IgM2的亚类。IgA类似地细分为包括IgA1和IgA2的亚类。在全长轻链和重链内,典型地,可变区和恒定区通过约12个或更多个氨基酸的“J”区连接,其中重链还包括约10个以上的氨基酸的“D”区。各轻链/重链配对的可变区典型地形成抗原结合位点。“单克隆抗体”意指自基本上均质的抗体群体(即构成该群体的个体抗体除可少量存在的天然存在的可能突变外均一致)获得的抗体。
“抗体变体”包括抗体片段和变为标准四聚体抗体的结构的类抗体蛋白。典型的抗体变体包括变为恒定区的V区,或可替代地,任选地以非标准方式添加V区至恒定区。实例包括多特异性抗体(例如,双特异性抗体、三特异性抗体)、可结合抗原的抗体片段(例如Fab'、F'(ab)2、Fv、单链抗体、双功能抗体),包含前述各项的双互补位肽和重组肽(只要其展现所需生物活性即可)。
多特异性抗体靶向一个以上的抗原或表位。例如,“双特异性”、“双重特异性”或“双功能性”抗体是具有两个不同抗原结合位点的杂合抗体。双特异性抗体可以通过各种方法产生,包括融合杂交瘤或连接Fab'片段(Kostelny等人1992,Songsivilai&Lachmann1990)(Kostelny等人1992,Songsivilai&Lachmann 1990,Wu&Demarest2018)。双特异性抗体的两个结合位点各自与不同的表位结合。同样地,三特异性抗体具有三个结合位点并且结合三个表位。已知制备三特异性抗体的若干种方法,并正在进一步开发中(Wu&Demarest2018,Wu等人2018)
“抗体片段”包括抗体的抗原结合部分,包括,例如,Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、结构域抗体(dAb)、互补决定区(CDR)片段、CDR移植抗体、单链抗体(scFv)、单链抗体片段、嵌合抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、微型抗体、线性抗体;螯合重组抗体、三抗体或双抗体、胞内抗体、纳米抗体、小模块免疫药物(SMIP)、抗原结合结构域免疫球蛋白融合蛋白、单结构域抗体(包括骆驼化抗体)、含VHH抗体或其变体或衍生物,以及含有足够赋予对多肽的抗原特异性结合的免疫球蛋白的至少一部分(诸如一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR序列)的多肽,只要抗体保留所需结合活性即可。
方法概述
所披露的方法包括以下步骤:鉴定抗体(或修饰抗体)中在重链位置56和80(AHo编号)处的残基或在这些位置处的种系起源氨基酸残基,将位置56处的残基改变(突变)为甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸和/或将残基80改变(突变)为疏水性残基(例如甲硫氨酸或异亮氨酸)或改变(突变)为丙氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸或缬氨酸中的任一种,和使用测量抗体不同特征的各种技术中的任一种来评估修饰抗体的稳定性。在一些实施例中,重链位置56处的残基改变为甘氨酸。
以下讨论不仅适用于抗体(包括IgG(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)),也适用于抗体变体(如上文“定义”部分所述的那些)。
鉴定在位置56和/或80处的残基(AHo编号)
在第一步骤中,鉴定了在Ab的重链中的56和/或80(Aho编号)处的氨基酸残基。如果位置56处已经是甘氨酸,那么无需进行进一步的鉴定,因为Ab在此位置处不需要进一步的工程化。在大多数情况下,抗体多核苷酸序列被克隆和测序,然后该序列被翻译成氨基酸序列。可替代地,可以通过直接蛋白质测序来确定来自抗体或其区域(例如,可变区)的相关氨基酸序列。在一些实施例中,如果位置56处已经是甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸,那么无需进行进一步的鉴定,因为Ab在此位置处不需要进一步的工程化。在一些实施例中,如果位置56处已经是甘氨酸或丝氨酸,那么无需进行进一步的鉴定,因为Ab在此位置处不需要进一步的工程化。在一些实施例中,如果位置56处已经是甘氨酸或丙氨酸,那么无需进行进一步的鉴定,因为Ab在此位置处不需要进一步的工程化。在一些实施例中,如果位置56处已经是甘氨酸,那么无需进行进一步的鉴定,因为Ab在此位置处不需要进一步的工程化。
可替代地,可以使用常规程序(例如,通过使用能够与编码单克隆抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)从产生此类抗体的细胞中分离编码目的单克隆抗体或其结合片段的基因组DNA或cDNA并对其进行测序。
DNA测序可以通过本领域已知的任何技术来进行,例如Sanger等人(Sanger等人1977)所述或高通量测序方法,例如焦磷酸测序(Margulies等人2005,Nyren&Lundin 1985,Ronaghi等人1998)、合成测序(Bentley等人2008)、离子半导体(Rothberg等人2011)、单分子实时测序(Eid等人2009)、寡核苷酸连接检测测序(SOLiD)(Valouev等人2008)和纳米孔测序(讨论于Branton等人.(Branton等人2008))。
一旦获得多核苷酸序列,就确定了开放阅读框,并根据遗传密码推导出氨基酸序列。AHo编号用于确定位置56和/或80,并且确定了氨基酸残基。
抗体的直接蛋白质测序也是可能的。蛋白质测序方法包括,例如,使用质谱法,以及使用蛋白质测序仪的埃德曼降解法(Edman degradation approaches)。在埃德曼降解的情况下,由于靶抗体可能长于50-70个氨基酸,因此可以使用内肽酶(例如胰蛋白酶或胃蛋白酶)或以化学方法使用溴化氰、BNPS-粪臭素、甲酸或氯胺T来消化抗体。埃德曼降解的靶片段大小为50-70个氨基酸。一旦抗体片段化,就可以使用蛋白质测序器以自动化方式分析肽,蛋白质测序器进行埃德曼降解反应并通过检测方法(例如高压液相色谱法(HPLC))读取每个释放的氨基酸。对于质谱法,该抗体可以用蛋白酶(通常是胰蛋白酶)碎片化,用液相色谱法(LC)分离片段,并且用质谱仪使用从头肽测序算法分析片段;Medzihradszky和Chalkley对此方法进行了讨论(Medzihradszky&Chalkley 2015)。
如上所述,一旦确定序列并且应用AHo编号,就可以确定在位置56和/或80处的氨基酸。
工程化一个或多个残基为靶残基
无论选择何种方法来鉴定抗体重链在AHo位置56和/或80处的残基,都要决定是否在多核苷酸水平上突变该残基。在一些实施例中,如果在位置56处的残基不是甘氨酸,那么该残基是待改变的候选物。举例而言,在最常见的场景下,在位置56处,当该残基不是甘氨酸时,其是丙氨酸。因此,可以形成A56G突变。同样地,对于位置80处,如果该残基不是疏水性残基(或者不是丙氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸或缬氨酸中的任一种),则该残基是待改变为疏水性残基(或待改变为丙氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸或缬氨酸中的任一种,例如甲硫氨酸)的候选物。举例而言,在一些实施例中,在此位置(80)处的情况下,该残基不是甲硫氨酸,该残基是待改变为甲硫氨酸的候选物。举例而言,在一些实施例中,在此位置(80)处的情况下,如果该残基不是异亮氨酸,那么该残基是待改变为异亮氨酸的候选物。在此位置(80)处的情况下,即使该残基是疏水性残基,例如甲硫氨酸或异亮氨酸,该位置仍然是待改变为不同疏水性残基(例如分别为异亮氨酸或甲硫氨酸,因为这些氨基酸(Met、Ile)中的任一种可以在培养中增加表达和稳定性)的候选物。在一些实施例中,在此位置(80)处的情况下,该残基可以改变为丙氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸或缬氨酸中的任一种,或改变为疏水性残基(例如丙氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸),即使该残基已经是丙氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸或缬氨酸中的一个不同的残基、或不同的疏水性残基。如果在位置56处的残基不是甘氨酸,那么该残基也可以是待改变(例如为甘氨酸)的候选物。疏水性氨基酸残基的实例包括丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。在一些实施例中,对于本文所述的任何方法,在重链位置80处的情况下,该疏水性氨基酸残基选自下组,该组由以下组成:苯丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸。
任何已知的方法都可以用于修饰编码目的抗体的多核苷酸。在确定在位置56和/或80处的氨基酸残基后,修饰核酸序列以使在位置56处编码为甘氨酸(或丙氨酸或丝氨酸),并且/或者在位置80处编码为丙氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸或缬氨酸(或疏水性氨基酸残基、或甲硫氨酸或异亮氨酸)。为了进行这种改变,鉴定在位置56和/或80处的编码氨基酸的密码子,并且根据表1选择一个或多个突变,该表示出了遗传密码。
表1
遗传密码
大多数氨基酸由一个以上的密码子编码,如表1所示。例如,丙氨酸由四个密码子编码:GCU、GCC、GCA和GCG;然而,只有Trp和Met各自由单个密码子编码(分别为TGG和ATG)。当选择一个或多个突变时,可顾及对例如,密码子偏好的考虑(Quax等人2015)。
可使用标准技术在编码本披露的抗体的核苷酸序列中引入突变,包括产生靶向氨基酸取代的定点诱变和聚合酶链反应(PCR)介导的诱变。可以实现将突变引入核酸的商业试剂盒也是可获得的,例如GeneArtTM系统和Phusion试剂盒(赛默飞世尔科技公司;马萨诸塞州沃尔瑟姆(ThermoFisher Scientific;Waltham,MA));定点诱变试剂盒(纽英伦生物技术公司;马萨诸塞州伊普斯维奇(New England BioLabs;Ipswich,MA));以及来自公民生物科学(Civic Bioscience)(加拿大蒙特利尔(Montreal,Canada))的可定制试剂盒。
可替代地,可以使用现有技术合成多核苷酸片段,并在包含完整编码序列的多核苷酸内进行取代。在一些情况下,合成了具有一个或多个靶向突变的整个编码序列。
在任何情况下,氨基酸突变方法只要能有效地实现位点突变,就没有特别的局限性。
细胞选择和工程化多核苷酸的转染
产生抗体的重组DNA方法是熟知的。可以将编码抗体的DNA(例如,编码VH结构域、VL结构域、单链可变片段(scFv)或其片段和组合的DNA)(靶多核苷酸)插入到合适的表达载体中,然后可以将该表达载体转染到合适的宿主细胞(例如大肠杆菌(Escherichia coli)细胞、COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、或骨髓瘤细胞)(这些细胞否则不会产生抗体)中,以获得所需的抗体。
本领域已知合适的表达载体,其包含,例如编码连接到启动子的靶多肽的多核苷酸。此类载体可包括编码抗体分子的恒定区的核苷酸序列,并且可以将抗体的可变结构域克隆到此类载体中以表达重链、整个轻链或整个重链和轻链(或其片段)。可以通过常规技术将表达载体转移到宿主细胞中,并且可以培养转染的细胞以产生抗体。
可以使用任何可以表达或被工程化为表达功能性抗体或抗体片段的细胞系。例如,合适的哺乳动物细胞系包括可获自美国典型培养物保藏中心(弗吉尼亚州马纳萨斯)的永生化细胞系,包括中国仓鼠卵巢(CH))细胞、海拉细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如,Hep G2)和人上皮肾293细胞。此外,可以选择细胞系或宿主系统以确保抗体的正确修饰和加工。可以使用具有用于初级转录物的适当加工、基因产物的糖基化和磷酸化的细胞机器的真核宿主细胞。这些包括CHO、VERY、BHK、海拉(Hela)、COS、MDCK、293、3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT20和T47D、NS0(一种不内源性产生任何功能性免疫球蛋白链的鼠骨髓瘤细胞系)、SP20、CRL7030和HsS78Bst细胞。也可以使用通过永生化人淋巴细胞产生的人细胞系。人细胞系(杨森公司;新泽西州泰特斯维尔(Janssen;Titusville,NJ))可用于重组产生单克隆抗体。也可使用的非哺乳动物细胞的实例包括昆虫细胞(例如,Sf21/Sf9、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)Bti-Tn5bl-4)、或酵母细胞(例如,酵母属(Saccharomyces)(例如酿酒酵母(S.cerevisiae)、毕赤酵母属(Pichia)等))、植物细胞或鸡细胞。
使用常规方法,抗体可以在细胞系中稳定表达。稳定表达可以用于重组蛋白的长期、高产率生产。为了稳定表达,宿主细胞可以用适当工程化的载体转化,该工程化的载体包括表达控制元件(例如,启动子、增强子、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)和可选择标记物基因。本领域已知生产高产率的稳定细胞系的方法,而试剂是可商购的。瞬时表达也可以用常规方法来实现。
可以将表达抗体的细胞系维持在细胞培养基中,并维持在带来抗体的表达和生产的培养条件下。细胞培养基可以基于可商购培养基配制品,包括,例如,DMEM或Ham的F12(Ham's F12)。另外,可以修饰该细胞培养基以支持细胞生长和生物蛋白表达的增加。当然,针对特定细胞培养,可以优化细胞培养基,包括经配制以促进细胞生长的细胞培养生长培养基或经配制以促进重组蛋白生产的细胞培养生产培养基。
已知许多细胞培养基和细胞培养营养素和补充剂。例如,合适的基础培养基包括杜尔贝科改良型伊戈尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium,DMEM)、DME/F12、最低必需培养基(MEM)、基础培养基伊戈尔(Basal Medium Eagle,BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、a-最低必需培养基(a-MEM)、格拉斯哥最低必需培养基(Glasgow's MinimalEssential Medium,G-MEM)、PF CHO和伊思考夫改良型杜尔贝科培养基(Iscove'sModified Dulbecco's Medium)。其他可使用的基础培养基的实例包括BME基础培养基、杜尔贝科改良型伊戈尔培养基。
该基础培养基可以是无血清的(这意味着该培养基不含有血清(例如,胎牛血清(FBS)))或是无动物蛋白培养基或化学成分明确的培养基。可以对基础培养基进行修饰,以去除基础培养基中可见的某些非营养性组分,例如各种无机和有机缓冲液、一种或多种表面活性剂和氯化钠。该细胞培养基可以含有基础细胞培养基(经修饰的或未经修饰的)和以下中的至少一种:铁源、重组生长因子;缓冲液;表面活性剂;渗透压调节剂;能量源;和非动物水解物。另外,经修饰的基础细胞培养基可以任选地含有氨基酸、维生素或氨基酸和维生素两者的组合。经修饰的基础培养基可以进一步含有谷氨酰胺,例如L-谷氨酰胺和/或甲氨蝶呤。
纯化
一旦抗体已经产生,就可以通过常规方法,例如,通过色谱法(例如,离子交换、亲和法(特别是通过对特异性抗原、蛋白质A、蛋白质G的亲和法)或分级柱色谱法)、离心、差别溶解度,或者通过用于纯化蛋白质的任何其他标准技术将其纯化。此外,该抗体可以与异源多肽序列(“标签”)融合以促进纯化。
评估稳定性
培养中的滴度
可以例如,使用平台仪器(佛特比奥公司(Pall FortéBio);加利福尼亚州佛利蒙市(Fremont,CA))分析来自表达工程化的多核苷酸的细胞培养物的上清液。该平台为许多不同的分析物提供生物传感器,包括用于抗人IgG定量(AHQ)、抗鼠IgG定量(AMQ)、抗FLAG(FLG)、蛋白质A(ProA)、蛋白质G(ProG)、蛋白质L(ProL)、抗五His(Anti-Penta-His,HIS)、链霉亲和素(SA)、抗人Fab-cH1(FAb)、抗GST(GST)和Ni-NTA(NTA)的生物传感器。其他选择包括使用传统的ELISA形式,以及HPLC和放射免疫测定(RIA)。
熔融温度(差示扫描荧光测定(DSF)和差示扫描量热法(DSC))
可以方便地使用通过差示扫描荧光测定(DSF)(也称为蛋白质热移位分析(Protein Thermal Shift Assay);(Lo等人2004,Pantoliano等人2001,Semisotnov等人1991))进行的热稳定性分析以测定蛋白质的熔融温度,Tm。DSF利用了优先结合至未折叠(变性)蛋白质的荧光染料。通常使用实时聚合酶链反应(PCR)仪器,通过测量染料的荧光变化来监测热诱导的蛋白质变性。有用的染料的实例包括Orange(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific);马萨诸塞州沃尔瑟姆(Waltham,MA))、8-苯胺萘-1-磺酸(ANS)、N-[4-(7-二乙氨基-4-甲基-3-香豆素基)苯基]马来酰亚胺(CPM)、和4-(双氰基乙烯基)久洛尼定(DCVJ)。通常使用Lo等人的方法,利用了常用的RE-PCR仪器和Orange(Lo等人2004)。
通常,混合所分析的染料和一种或多种蛋白质,确定熔融曲线,并根据熔融曲线计算Tm。
除了DSF之外,还可以使用任何已知的技术来确定蛋白质的Tm。例如,可以使用利用了固有荧光信号(例如来自色氨酸)的技术,以及利用了不同的监测蛋白质折叠/解折叠的方式(例如光散射)的技术。其他技术包括快速平行蛋白质水解(Minde等人2012)和细胞热移位测定(Jafari等人2014)。
差示扫描量热法(DSC)也可以用于确定蛋白质的Tm。(Makhatadze 1998),尽管因为DSC也可以提供关于解折叠模式的信息,可以获得多个Tm值。
通常,使用分光光度计来确定主题蛋白质的光谱以定量该蛋白质(或可替代地,使用不同的方法来定量该蛋白质)。然后,用分光光度计的DSC程序对该蛋白质进行分析。
产率(如通过蛋白质A捕获的抗体所测量的)
一种用于从澄清的细胞培养上清液纯化抗体的通用方法含有利用蛋白质A亲和色谱法的捕获步骤;然后是阴离子和阳离子交换色谱法的结合(Fahrner等人2001,Kelley2009)
可以使用本领域已知的任何方法来进行蛋白质定量。这些方法包括在280nm处的UV-Vis光谱(A280);基于色氨酸和酪氨酸残基的吸光度(或可替代地,在205nm处的吸光度(A205),检测蛋白质骨架;布拉福德测定法(Bradford assay)(通常基于考马斯亮蓝G-250染料(Coomassie Brilliant Blue G-250dye)的使用和吸光度);缩二脲试验衍生的测定,例如劳里(Lowry)和二辛可宁酸(BCA)测;氨基酸分析(取决于经修饰的氨基酸的定向检测);凝胶电泳(如通过凝胶带强度所观察)或染料标记蛋白质(因此将染料信号的检测与蛋白质数量相关联),染料的实例包括荧光胺(fluorescamine)和氨基黑10B。此外,还可以使用HPLC和LC/MS方法。
为了保存样本和方便测量,可以使用NanoDrop分光光度计,例如从赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)(特拉华州威尔明顿(Wilmington,DE))获得的分光光度计。此装置有助于几种定量蛋白质的方法。
如通过尺寸排阻色谱法(SEC)确定的高分子量(HMW)和主峰(MP)物质
使用了一种用于SEC的一般方法来比较蛋白质A洗脱材料的物质,其中该蛋白质通过葡聚糖聚合物多孔珠粒的柱以根据尺寸来分离物质。通过测量SEC峰曲线下的面积来确定HMW百分比和MP百分比。
聚集(T聚集)和熔融起始(T熔融起始或T起始熔融)
T聚集通过差示扫描荧光测定(DSF)测量,并且使用300nm的激发波长和350/330nm的发射波长,测量了30nm聚集粒子形成时的温度。
通过DSF测量T熔融起始,并在350/330nm处测量荧光。T起始是当350/330nm发射波长的一阶导数上升到基础水平以上时的温度,这一时间也表示折叠蛋白质开始解折叠的时间
药物组合物配制品和组分
根据本文所披露的方法制备的抗体和抗体变体可以配制成适合向患者施用的药物组合物。
可接受的药物组分优选地在所用的剂量和浓度下对患者无毒。药物组合物可以包含用于修饰、维持或保持该组合物的例如pH、容积渗透浓度、黏度、澄清度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附或渗透的药剂。
通常,可以基于赋形剂抵抗各种化学和物理压力来稳定蛋白质的机制对赋形剂进行分类。一些赋形剂减轻特定压力的影响或调节特定多肽的具体敏感性。其他赋形剂通常更会影响蛋白质的物理和共价稳定性。
液体和冻干蛋白质配制品的常用赋形剂如表2所示(另见(Kamerzell等人2011))。
表2
多肽配制品的赋形剂组分实例
本领域已知其他赋形剂(例如,参见(Powell等人1998)。本领域技术人员可以确定在任何特定配制品中可以包括多少量或范围的赋形剂,以获得促进保留生物药物的稳定性的生物药物组合物。例如,可以基于最终溶液的所需重量摩尔渗透压浓度(即,等渗、低渗或高渗)以及在配制品中要包括的其他组分的量和重量摩尔渗透压浓度来选择在生物药物组合物中要包括的盐的量和类型。
实施例
以下实施例表示为本文披露的方法的实例,是非限制性的。实例部分在此实施例部分的后面。
实施例1.一种增加第一抗体稳定性的方法,该方法包括在重链位置56(AHo编号)处取代甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸以产生第二抗体,其中该第二抗体比该未取代的第一抗体更稳定。例如,在重链位置56处,甘氨酸可以被取代。例如,在重链位置56处,甘氨酸或丙氨酸可以被取代。例如,在位置56处,甘氨酸或丝氨酸可以被取代。
实施例2.如实施例1所述的方法,其中在重链位置56处,该甘氨酸被取代。
实施例3.如实施例1-2中任一项所述的方法,其中该第二抗体在重链位置80(AHo编号)处进一步被疏水性氨基酸残基取代。
实施例4.如实施例3所述的方法,其中该疏水性氨基酸残基选自下组,该组由以下组成:丙氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸。
实施例5.如实施例3所述的方法,其中该疏水性氨基酸残基选自下组,该组由以下组成:苯丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸。
实施例6.如实施例1-2中任一项所述的方法,其中该第二抗体在位置80(AHo编号)处进一步被甲硫氨酸取代。
实施例7.如实施例1和2中任一项所述的方法,其中该第二抗体在位置80(AHo编号)处进一步被异亮氨酸取代。
实施例8.一种增加第一抗体稳定性的方法,该方法包括在该第一抗体的重链位置80(AHo编号)处取代疏水性氨基酸残基以产生第二抗体,其中该第二抗体比该未取代的第一抗体更稳定。
实施例9.如实施例8所述的方法,其中该疏水性氨基酸残基选自下组,该组由以下组成:丙氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸。
实施例10.如实施例8所述的方法,其中该疏水性氨基酸残基选自下组,该组由以下组成:苯丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸。
实施例11.一种增加第一抗体稳定性的方法,该方法包括在该第一抗体的重链位置80(AHo编号)处取代丙氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸或缬氨酸以产生第二抗体,其中该第二抗体比该未取代的第一抗体更稳定。
实施例12.如实施例11所述的方法,其中在该第一抗体的重链位置80处,该甲硫氨酸被取代。
实施例13.如实施例11所述的方法,其中在该第一抗体的重链位置80处,该异亮氨酸被取代。
实施例14.如实施例8-13中任一项所述的方法,其中该第二抗体在重链位置56(AHo编号)处进一步被丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸取代。
实施例15.如实施例8-13中任一项所述的方法,其中该第二抗体在重链位置56(AHo编号)处进一步被丙氨酸或甘氨酸取代。
实施例16.如实施例8-13中任一项所述的方法,其中该第二抗体在重链位置56(AHo编号)处进一步被甘氨酸取代
实施例17.如实施例1-16中任一项所述的方法,其中该第二抗体的稳定性的增加通过选自下组的至少一种来证明,该组由以下组成:在细胞培养期间滴度的增加、细胞培养产率的增加、纯化后纯度的增加、高分子量物质的减少、熔点温度的升高、聚集温度的升高和熔融起始温度的升高。
实施例18.如实施例17所述的方法,其中使用Octet Forte Bio仪器,通过结合到蛋白质A包被的探针端部的速率来测量滴度的增加。
实施例19.如实施例17所述的方法,其中通过蛋白质A或蛋白质G捕获来测量产率的增加。
实施例20.如实施例17所述的方法,其中通过纯化抗体的尺寸排阻色谱法(SEC)来测量纯度的增加。
实施例21.如实施例17所述的方法,其中通过尺寸排阻色谱法(SEC)和在每个分子量处每个峰的曲线下面积来测量高分子量物质的减少。
实施例22.如实施例17所述的方法,其中通过差示扫描荧光测定(DSF)或差示扫描量热法(DSC)来测量熔点温度的升高。
实施例23.如实施例17所述的方法,其中通过DSF来测量聚集温度的升高。
实施例24.如实施例17所述的方法,其中通过DSF来测量熔融起始温度的升高。
实施例25.如任一前述实施例所述的方法,其中该第一抗体是单克隆抗体。
实施例26.如任一前述实施例所述的方法,其中该第一抗体是人单克隆抗体或人源化单克隆抗体。
实施例27.如任一前述实施例所述的方法,其中该第一抗体是IgG抗体。
实施例28.如实施例27所述的方法,其中该IgG抗体选自下组,该组由以下组成:IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体和IgG4抗体。
实施例29.如实施例27所述的方法,其中该IgG抗体是IgG1抗体。
实施例30.如实施例27所述的方法,其中该IgG抗体是IgG2抗体。
实施例31.如实施例27所述的方法,其中该IgG抗体是IgG3抗体。
实施例32.如实施例27所述的方法,其中该IgG抗体是IgG4抗体。
实施例33.一种增加第一抗体变体稳定性的方法,该方法包括在重链位置56(AHo编号)处取代甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸以产生第二抗体变体,其中该第二抗体变体比该未取代的第一抗体变体更稳定。
实施例34.如实施例33所述的方法,其中在重链位置56处,该甘氨酸被取代。
实施例35.如实施例33和34中任一项所述的方法,其中该第二抗体变体在重链位置80(AHo编号)处进一步被疏水性氨基酸残基取代。
实施例36.如实施例35所述的方法,其中该疏水性氨基酸残基选自下组,该组由以下组成:丙氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸。
实施例37.如实施例35所述的方法,其中该疏水性氨基酸残基选自下组,该组由以下组成:苯丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸。
实施例38.一种增加第一抗体变体稳定性的方法,该方法包括在该第一抗体变体的重链位置80(AHo编号)处取代疏水性氨基酸残基以产生第二抗体变体,其中该第二抗体变体比该未取代的第一抗体变体更稳定。
实施例39.如实施例38所述的方法,其中该疏水性氨基酸残基选自下组,该组由以下组成:丙氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸。
实施例40.如实施例38所述的方法,其中该疏水性氨基酸残基选自下组,该组由以下组成:苯丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸。
实施例41.一种增加第一抗体变体稳定性的方法,该方法包括在该第一抗体变体的重链位置80(AHo编号)处取代丙氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸或缬氨酸以产生第二抗体变体,其中该第二抗体变体比该未取代的第一抗体变体更稳定。
实施例42.如实施例41所述的方法,其中在该第一抗体变体的重链位置80处,该甲硫氨酸被取代。
实施例43.如实施例41所述的方法,其中在该第一抗体变体的重链位置80处,该异亮氨酸被取代。
实施例44.如实施例38-43中任一项所述的方法,其中该第二抗体变体在重链位置56(AHo编号)处进一步被丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸取代。
实施例45.如实施例38-43中任一项所述的方法,其中该第二抗体变体在重链位置56(AHo编号)处进一步被丙氨酸或甘氨酸取代。
实施例46.如实施例38-43中任一项所述的方法,其中该第二抗体变体在重链位置56(AHo编号)处进一步被甘氨酸取代
实施例47.如实施例33-46中任一项所述的方法,其中第二抗体变体的稳定性的增加通过选自下组的至少一种来证明,该组由以下组成:在细胞培养期间滴度的增加、细胞培养产率的增加、纯化后纯度的增加、高分子量物质的减少、熔点温度的升高、聚集温度的升高和熔融起始温度的升高。
实施例48.如实施例47所述的方法,其中使用Octet Forte Bio仪器,通过结合到蛋白质A包被的探针端部的速率来测量滴度的增加。
实施例49.如实施例47所述的方法,其中通过蛋白质A或蛋白质G捕获来测量产率的增加。
实施例50.如实施例47所述的方法,其中通过该纯化抗体的SEC来测量纯度的增加。
实施例51.如实施例47所述的方法,其中通过SEC和在每个分子量处每个峰的曲线下面积来测量高分子量物质的减少。
实施例52.如实施例47所述的方法,其中通过DSF或DSC来测量熔点温度的升高。
实施例53.如实施例47所述的方法,其中通过DSF来测量聚集温度的升高。
实施例54.如实施例47所述的方法,其中通过DSF来测量熔融起始温度的升高。
实施例55.如实施例33-54中任一项所述的方法,其中该第一抗体变体是多特异性抗体。
实施例56.如实施例55所述的方法,其中该多特异性抗体是双特异性抗体或三特异性抗体。
实施例57.如实施例33-56中任一项所述的方法,其中该第一抗体变体是能够结合抗原的抗体片段。
实施例58.如实施例57所述的方法,其中该抗体片段选自下组,该组由以下组成:Fab片段、Fab'片段、F'(ab)2片段、Fv片段、单链抗体、双功能抗体)、双互补位肽、结构域抗体(dAb)、CDR移植的抗体、单链抗体(scFv)、单链抗体片段、嵌合抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、微型抗体、线性抗体;螯合重组抗体、三抗体、双抗体、胞内抗体、纳米抗体、小模块免疫药物(SMIP)、抗原结合结构域免疫球蛋白融合蛋白、单结构域抗体和含VHH抗体。
实施例59.如实施例33-58中任一项所述的方法,其中该第一抗体变体是人单克隆抗体或人源化单克隆抗体变体。
实施例60.如实施例33-59中任一项所述的方法,其中该第一抗体变体是IgG抗体变体。
实施例61.如实施例60所述的方法,其中该IgG抗体变体选自下组,该组由以下组成:IgG1抗体变体、IgG2抗体变体、IgG3抗体变体和IgG4抗体变体。
实施例62.如实施例61所述的方法,其中该IgG抗体变体是IgG1抗体变体。
实施例63.如实施例61所述的方法,其中该IgG抗体变体是IgG2抗体变体。
实施例64.如实施例61所述的方法,其中该IgG抗体变体是IgG3抗体变体。
实施例65.如实施例61所述的方法,其中该IgG抗体变体是IgG4抗体变体。
实施例66.一种增加第一抗体或第一抗体变体的稳定性的方法,该方法包括
a.鉴定出该第一抗体或该抗体变体的抗体部分的重链的种系原始氨基酸序列;
b.鉴定在该第一抗体或该抗体变体的抗体部分的重链位置56(AHo编号)处和重链位置80(AHo编号)处的氨基酸残基;以及
c.在该第一抗体或该抗体变体的抗体部分中,在重链位置56和80处取代来自该种系原始氨基酸序列的已鉴定残基,从而产生第二抗体或第二抗体变体,
其中该第二抗体比该未取代的第一抗体更稳定,或者其中该第二抗体变体比该未取代的第一抗体变体更稳定。
实施例67.如实施例66所述的方法,其中该第二抗体或第二抗体变体的稳定性的增加通过选自下组的至少一种来证明,该组由以下组成:在细胞培养期间滴度的增加、细胞培养产率的增加、纯化后纯度的增加、高分子量物质的减少、熔点温度的升高、聚集温度的升高和熔融起始温度的升高。
实施例68.如实施例67所述的方法,其中使用Octet Forte Bio仪器,通过结合到蛋白质A包被的探针端部的速率来测量滴度的增加。
实施例69.如实施例67所述的方法,其中通过蛋白质A或蛋白质G捕获来测量产率的增加。
实施例70.如实施例67所述的方法,其中通过纯化蛋白质的SEC来测量纯度的增加。
实施例71.如实施例67所述的方法,其中通过SEC和在每个分子量处峰的曲线下面积来测量高分子量物质的减少
实施例72.如实施例67所述的方法,其中通过DSF或DSC来测量熔点温度的升高。
实施例73.如实施例67所述的方法,其中通过DSF来测量聚集温度的升高。
实施例74.如实施例67所述的方法,其中通过DSF来测量熔融起始温度的升高。
实施例75.如实施例66-74中任一项所述的方法,其中该第一抗体是单克隆抗体。
实施例76.如实施例75所述的方法,其中该第一抗体是人单克隆抗体或人源化单克隆抗体。
实施例77.如实施例66-76中任一项所述的方法,其中该第一抗体是IgG抗体。
实施例78.如实施例77所述的方法,其中该IgG抗体选自下组,该组由以下组成:IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体和IgG4抗体。
实施例79.如实施例78所述的方法,其中该IgG抗体是IgG1抗体。
实施例80.如实施例78所述的方法,其中该IgG抗体是IgG2抗体。
实施例81.如实施例78所述的方法,其中该IgG抗体是IgG3抗体。
实施例82.如实施例78所述的方法,其中该IgG抗体是IgG4抗体。
实施例83.如实施例66-82中任一项所述的方法,其中该第一抗体变体是多特异性抗体。
实施例84.如实施例83所述的方法,其中该多特异性抗体是双特异性抗体或三特异性抗体。
实施例85.如实施例66-84中任一项所述的方法,其中该第一抗体变体是能够结合抗原的抗体片段。
实施例86.如实施例85所述的方法,其中该抗体片段选自下组,该组由以下组成:Fab片段、Fab'片段、F'(ab)2片段、Fv片段、单链抗体、双功能抗体)、双互补位肽、结构域抗体(dAb)、CDR移植的抗体、单链抗体(scFv)、单链抗体片段、嵌合抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、微型抗体、线性抗体;螯合重组抗体、三抗体、双抗体、胞内抗体、纳米抗体、小模块免疫药物(SMIP)、抗原结合结构域免疫球蛋白融合蛋白、单结构域抗体和含VHH抗体。
实施例87.如实施例66-86中任一项所述的方法,其中该第一抗体变体是人单克隆抗体或人源化单克隆抗体变体。
实施例88.如实施例66-87中任一项所述的方法,其中该第一抗体变体是IgG抗体变体。
实施例89.如实施例66-88中任一项所述的方法,其中该IgG抗体变体选自下组,该组由以下组成:IgG1抗体变体、IgG2抗体变体、IgG3抗体变体和IgG4抗体变体。
实施例90.如实施例89所述的方法,其中该IgG抗体变体是IgG1抗体变体。
实施例91.如实施例89所述的方法,其中该IgG抗体变体是IgG2抗体变体。
实施例92.如实施例89所述的方法,其中该IgG抗体变体是IgG3抗体变体。
实施例93.如实施例89所述的方法,其中该IgG抗体变体是IgG4抗体变体。
实施例94.如实施例1-93中任一项所述的方法,其中该第二抗体或第二抗体变体在重链位置56和80(AHo编号)处分别被以下残基对中的任何一个取代:GF、GI、GL、GT、GV、AF、AI、AL、AV、AA、AM、SA、SI或ST。举例而言,在此命名法下“GF”将指在位置56处的“G”和在位置80处的“F”(AHo编号)。
实施例95.如实施例1-94中任一项所述的方法,该方法进一步包括将该第二抗体或第二抗体变体配制为药物组合物。
实施例96.一种抗体或抗体变体,该抗体或抗体变体通过如实施例1-95中任一项所述的方法制备。
实施例97.一种药物组合物,该药物组合物包含如实施例96所述的抗体或抗体变体。
以下实例部分仅举例给出且并非为了以任何方式限制本发明或权利要求书而陈述。
实例
实例1-实验设计
抗体突变是通过设计密码子变化和具有相应地合成的核苷酸来实现的。使用金门(Golden Gate)克隆方法将经修饰的片段整合到开放阅读框中(Engler等人2009,Engler等人2008)。除非另有说明,抗体在HEK 293-6E细胞(一种悬浮细胞系,其表达爱泼斯坦巴尔病毒核抗原(Epstein Barr virus nuclear antigen,EBNA)1的截短变体(Durocher等人2002)中表达。使用连接到固体支持物上的蛋白质A来纯化所产生的抗体。
检查了以下种系家族:VH1/VK4、VH4/VL1、VH3/VK3、VH6/VK1、和VH2/VL2。在重链中,测试了56A和56G,以及80I和80M。
该测量参数为:
收获时滴度(mg/L)
熔融温度(Tm;如通过差示扫描荧光测定(DSF)或差示扫描量热法(DSC)所测定,后者给出两个输出:Tm1和Tm2)
产率(如通过蛋白质A捕获的抗体所测量的)
高分子量(HMW)物质,如通过尺寸排阻色谱法(SEC)和峰分子量(Mp,定义为最高峰的分子量)所测定的。
实例2-VH1种系
在此实例中,检测了抗体(mAb1(IgG1),源自VH1种系(VH1/VK4))中的突变,并且如实例1中所述对抗体进行分析。
表2.1
对来自VH1/VK4种系的单克隆抗体,mAb1的观察
+表示在指定位置(AHo编号)处的氨基酸
*是指在指定位置处的种系残基
∧mAb1=mAb1的“野生型”。后缀是指分别见于位置56和80处的残基。
ND,无数据
~mAb1的变体,其在位置56和80处分别具有野生型残基(G和L);数据来自一组单独的实验
&数据来自DSC实验并且代表Tm1和Tm2。
**当通过DSC测量时,Tm1为76.9,而Tm2为84.4
在这些实验中,当mAb1在位置56处具有A而在位置80处具有M时,在观察的被测抗体中,该抗体(mAb1AM)具有最低滴度。类似地,mAb1AI也具有低滴度。然而,在观察的被测抗体中,mAb1GM具有最高滴度;mAb1GI具有第二高滴度。
实例3-VH3种系
在此实例中,检测了抗体(mAb2(IgG2 Ab),源自VH3种系(VH3/VK3))中的突变,并且如实例1中所述对抗体进行分析。
表3.1
对来自VH3/VK3种系的单克隆抗体,mAb2的观察
+表示在指定位置(AHo编号)处的氨基酸
*是指在指定位置处的种系残基
ND,无数据
在这些实验中,当mAb2在位置56处具有A而在位置80处具有M时,在观察的被测抗体中,该抗体(mAb2AM)具有最低滴度,以及最低熔点(Tm),这表明此抗体稳定性较差。然而,mAb2AI和mAb2GM在被测抗体中具有更高的滴度和熔点。
实例4-VH4种系
在此实例中,检测了抗体(mAb3(IgG1 Ab),源自VH4种系(VH4/VL1))中的突变,并且如实例1中所述对抗体进行分析。
表4.1
对来自VH4/VL1种系的单克隆抗体,mAb3的观察
+表示在指定位置(AHo编号)处的氨基酸
*是指在指定位置处的种系残基
在这些实验中,当mAb3在位置56处具有A而在位置80处具有M或I时,在观察的被测抗体中,这些抗体(mAb3AM和mAb3AI)具有最低滴度,以及最低熔点(Tm),这表明这些抗体稳定性较差。然而,mAb3(GI)和mAb3GM在被测抗体中具有更高的滴度和熔点。
实例5-VH6种系
在此实例中,检测了抗体(mAb4(IgG1 Ab),源自VH6种系(VH6/VK1))中的突变,并且如实例1中所述对抗体进行分析。
表5.1
对来自VH6/VK1种系的单克隆抗体,mAb4的观察
+表示在指定位置(AHo编号)处的氨基酸
*是指在指定位置处的种系残基
ND,无数据
在这些实验中,当mAb4在位置56处具有A而在位置80处具有M时,在观察的被测抗体中,该抗体(mAb4AM)具有最低滴度;没有测定熔点。然而,mAb4(GI)(种系)和mAb4GM在被测抗体中具有更高的滴度和熔点,其中mAb4GI优于mAb4GM。
实例6-VH2种系
在此实例中,检测了抗体(mAb5(IgG1 Ab),源自VH2种系(VH2/VL2))中的突变,并且如实例1中所述对抗体进行分析。
表6.1
对来自VH2/VL2种系的单克隆抗体,mAb5的观察
+表示在指定位置(AHo编号)处的氨基酸
*是指在指定位置处的种系残基
在这些实验中,两个被测抗体均具有高滴度和良好的熔点。
当通过中国仓鼠卵巢(CHO)细胞表达这些抗体时,与mAb5(AI)(种系;图1中的“WT”)抗体相比,跨克隆和MTX水平,mAb5GM(图1中的“突变体”)具有更高的滴度(图1A)、更少的HMW物质(图1B)和更高的MP纯度(图1C)。
实例7-根据IgG亚型和HC56和HC80突变进行的抗体滴度比较
确定了mAb1和mAb3(后者为不同的亚型)的收获滴度。表7.1示出了结果。在本实验中,重链变体HC:56G、HC:80M示出了最理想的最终生长特征。HC:56G、HC:80M变体在IgG1、IgG2和IgG4分子中也产生较高的滴度(第6天),mAb3(IgG4形式)除外;相反,此分子在HC:56A、HV:80M组取代的情况下,展示了最高滴度。
表7.1
具有不同HC56和HC80取代的IgG亚型的收获滴度
实例8-IgG1HC:56和HC:80的氨基酸鉴定
在此实例中,使用两种方法鉴定了可用于IgG1 HC:56和HC:80处的氨基酸的其他选择,一种是深入的系统发育分析和筛选,而另一种是基于全部400种H:56H:80组合的Rosetta模型。值得注意的是,这些实验提供了对在HC:56和HC:80处的可能的选择的额外测试和分析。将在一个或多个计算筛选中具有中等结果的氨基酸配对突变为模型分子,然后比较从293-6E细胞培养物中收获时的表达水平和通过DSF获得的Tm。
为了进行系统发育分析,在蛋白质NR(e=0.0001)中进行了mAb1和mAb2的blast搜索。对为每个分子鉴定的~10,000个序列进行CD-hit聚类,并且鉴定了最常见的残基并根据频率排序。将靠前的氨基酸克隆到mAb1和mAb2中。
对于mAb1的系统发育分析,下表8.1中示出了最常见的残基对(测试了加粗的残基对;星号表示种系残基):
表8.1
对于mAb2的系统发育分析,下表8.2示出了最常见的残基对(测试了加粗的残基对):
表8.2
H56 | H80 |
A | I |
A | V |
G | F |
G | I |
G | L |
G | M |
G | V |
S | I |
M | V |
T | I |
V | I |
对于Rosetta分析,使用Rosetta软件测量在mAb1和mAb2中HC:56和HC:80处全部氨基酸组合的能量得分。不受理论束缚,可以设想,在这种方法下,Rosetta使用标准遗传编码氨基酸,尝试了全部400种可能的H56:H80氨基酸组合。在Rosetta分析中,根据Rosetta“总分”和“p_aa_pp”得分,对HC:56和HC:80氨基酸组合进行比较,并按1:1加权z得分进行排序。将系统发育分析中尚未出现的具有良好能量得分的变体克隆到mAb1和mAb2中进行进一步测试。
在HC:56处,mAb1的结果表明,最高的滴度可以通过HC:56G或HC:56A,次之通过HC:56S实现(参见,例如,图2A-2B)。mAb2的结果表明,最高的滴度可以通过HC:56A、HC:56G或HC:56S实现(参见,例如,图5)。不受理论束缚,值得注意的是,与全种类的氨基酸相比,这些残基在它们相对较小的尺寸方面最为相似。
在HC:80处,mAb1的结果表明,最高的滴度可以通过HC:80F、HC:80L或HC:80V实现。mAb2的结果表明,最高的滴度可以通过HC:80L、HC:80M、HC:80A、HC:80V、HC:80F、HC:80I实现。另外,在两种情况下,HC:80T导致相对高的表达。不受理论束缚,这些结果的概括是,在HC:80处使用疏水性残基会产生更高的滴度。
在mAb1的工程化变体中,滴度最高的六个变体与Tm最高的六个变体相关(见图2A-2B和图3A-3B)。在mAb2的变体中,Tm方面的差异不很明显,尽管低滴度变体仍然具有较低的Tm(见图6)。另外,在HC:80处使用疏水性残基与更高的Tm相关。
下表8.3总结了在每个mAb1和mAb2中的重链位置56和重链位置80(AHo编号)处残基组合的影响。在表8的命名法中,第一残基是指重链位置56(AHo编号),而第二残基是指重链位置80(AHo编号)。因此,举例而言,“GF”将指在重链位置56(AHo编号)处的“G”和在重链位置80(AHo编号)处的“F”:
表8.3
参考文献
Bentley DR,Balasubramanian S,Swerdlow HP,Smith GP,Milton J,etal.2008.Accurate whole human genome sequencing using reversible terminatorchemistry.Nature 456:53-9
Branton D,Deamer DW,Marziali A,Bayley H,Benner SA,et al.2008.Thepotential and challenges of nanopore sequencing.Nat Biotechnol 26:1146-53
Durocher Y,Perret S,Kamen A.2002.High-level and high-throughputrecombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells.Nucleic Acids Res 30:E9
Eid J,Fehr A,Gray J,Luong K,Lyle J,et al.2009.Real-time DNAsequencing from single polymerase molecules.Science 323:133-8
Engler C,Gruetzner R,Kandzia R,Marillonnet S.2009.Golden gateshuffling:a one-pot DNA shuffling method based on type IIs restrictionenzymes.PLoS One 4:e5553
Engler C,Kandzia R,Marillonnet S.2008.A one pot,one step,precisioncloning method with high throughput capability.PLoS One 3:e3647
Fahrner RL,Knudsen HL,Basey CD,Galan W,Feuerhelm D,etal.2001.Industrial purification of pharmaceutical antibodies:development,operation,and validation of chromatography processes.Biotechnol Genet Eng Rev18:301-27
Honegger A,Pluckthun A.2001.Yet another numbering scheme forimmunoglobulin variable domains:an automatic modeling and analysis tool.J MolBiol 309:657-70
Jafari R,Almqvist H,Axelsson H,Ignatushchenko M,Lundback T,etal.2014.The cellular thermal shift assay for evaluating drug targetinteractions in cells.Nat Protoc 9:2100-22
Kamerzell TJ,Esfandiary R,Joshi SB,Middaugh CR,VolkinDB.2011.Protein-excipient interactions:mechanisms and biophysicalcharacterization applied to protein formulation development.Adv Drug DelivRev 63:1118-59
Kelley B.2009.Industrialization of mAb production technology:thebioprocessing industry at a crossroads.MAbs 1:443-52
Kostelny SA,Cole MS,Tso JY.1992.Formation of a bispecific antibody bythe use of leucine zippers.J Immunol 148:1547-53
Lo MC,Aulabaugh A,Jin G,Cowling R,Bard J,et al.2004.Evaluation offluorescence-based thermal shift assays for hit identification in drugdiscovery.Anal Biochem 332:153-9
Makhatadze G.1998.Measuring protein thermostability by differentialscanning calorimetry.Curr.Protocols Protein Sci.12:7.9.1-7.9.14
Margulies M,Egholm M,Altman WE,Attiya S,Bader JS,et al.2005.Genomesequencing in microfabricated high-density picolitre reactors.Nature 437:376-80
Mason M,Sweeney B,Cain K,Stephens P,Sharfstein ST.2012.Identifyingbottlenecks in transient and stable production of recombinant monoclonal-antibody sequence variants in Chinese hamster ovary cells.Biotechnol Prog 28:846-55
Medzihradszky KF,Chalkley RJ.2015.Lessons in de novo peptidesequencing by tandem mass spectrometry.Mass Spectrom Rev 34:43-63
Minde DP,Maurice MM,Rudiger SG.2012.Determining biophysical proteinstability in lysates by a fast proteolysis assay,FASTpp.PLoS One 7:e46147
Nyren P,Lundin A.1985.Enzymatic method for continuous monitoring ofinorganic pyrophosphate synthesis.Anal Biochem 151:504-9
Pantoliano MW,Petrella EC,Kwasnoski JD,Lobanov VS,Myslik J,etal.2001.High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategyfor drug discovery.J Biomol Screen 6:429-40
Powell MF,Nguyen T,Baloian L.1998.Compendium of excipients forparenteral formulations.PDA journal of pharmaceutical science and technology52:238-311
Quax TE,Claassens NJ,Soll D,van der Oost J.2015.Codon Bias as a Meansto Fine-Tune Gene Expression.Mol Cell 59:149-61
Ronaghi M,Uhlen M,Nyren P.1998.A sequencing method based on real-timepyrophosphate.Science 281:363,65
Rothberg JM,Hinz W,Rearick TM,Schultz J,Mileski W,et al.2011.Anintegrated semiconductor device enabling non-optical genome sequencing.Nature475:348-52
Sanger F,Nicklen S,Coulson AR.1977.DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.Proc Natl Acad Sci U S A 74:5463-7
Semisotnov GV,Rodionova NA,Razgulyaev OI,Uversky VN,Gripas AF,Gilmanshin RI.1991.Study of the"molten globule"intermediate state in proteinfolding by a hydrophobic fluorescent probe.Biopolymers 31:119-28
Songsivilai S,Lachmann PJ.1990.Bispecific antibody:a tool fordiagnosis and treatment of disease.Clin Exp Immunol 79:315-21
Valouev A,Ichikawa J,Tonthat T,Stuart J,Ranade S,et al.2008.A high-resolution,nucleosome position map of C.elegans reveals a lack of universalsequence-dictated positioning.Genome Res 18:1051-63
Wu X,Demarest SJ.2018.Building blocks for bispecific and trispecificantibodies.Methods
Wu X,Yuan R,Bacica M,Demarest SJ.2018.Generation of orthogonal Fab-based trispecific antibody formats.Protein Eng Des Sel 31:249-56
前述一般描述和以下详细描述均仅为示例性和解释性的且不具限制性。除非另外特定地规定,否则单数的使用包括复数。除非另外规定,否则“或”的使用意指“和/或”。术语“包括(including)”以及其他形式(例如“包括(includes)”和“包括(included)”)的使用不具限制性。除非另外特定地规定,否则例如“元素”或“组分”的术语涵盖包含一个单元的元素和组分与包含超过一个子单元的元素和组分。术语“部分(portion)”的使用可包括一种部分(moiety)的部分或整个部分。当提及数值范围(例如,1-5)时,明确地包括所有介于中间的值,例如1、2、3、4和5,以及其分数,例如1.5、2.2、3.4和4.1。
“约(about)”或“约(~)”意指当修饰一个量时(例如,“约”3mM),围绕该经修饰的量的变化可发生。这些变化可通过多种方式,例如典型测量和处置程序、因疏忽所致的错误、成分纯度及其类似方式而发生。
“包含(comprising)”和“包含(comprises)”旨在意指配制品和方法包括列出的要素但不排除其他未列出的要素。当在所披露的方法中使用时,术语“基本上由……组成(consisting essentially of)”和“基本上由……组成(consists essentially of)”包括列出的要素,排除改变配制品和/或方法的基本性质的未列出的要素,但是不排除其他未列出的要素。基本上由要素组成的配制品将不排除痕量的其他要素,诸如来自任何分离和纯化方法的污染物或药学上可接受的载体(例如,磷酸盐缓冲盐水)、防腐剂等,但将排除例如另外的未指定的氨基酸。当用于定义配制品和方法时,术语“由......组成”(“consistingof”和“consists of”)排除了不只是其他成分和用于施用本文所述的组合物的实质性方法步骤的痕量要素。这些过渡术语中的每一个定义的实施例都在本披露内容的范围内。
Claims (100)
1.一种增加第一抗体稳定性的方法,该方法包括在重链位置56(AHo编号)处取代甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸以产生第二抗体,其中该第二抗体比该未取代的第一抗体更稳定。
2.如权利要求1所述的方法,其中在重链位置56处,该甘氨酸被取代。
3.如权利要求1-2中任一项所述的方法,其中该第二抗体在重链位置80(AHo编号)处进一步被疏水性氨基酸残基取代。
4.如权利要求3所述的方法,其中该疏水性氨基酸残基选自下组,该组由以下组成:丙氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸。
5.如权利要求3所述的方法,其中该疏水性氨基酸残基选自下组,该组由以下组成:苯丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸。
6.如权利要求1-2中任一项所述的方法,其中该第二抗体在位置80(AHo编号)处进一步被甲硫氨酸取代。
7.如权利要求1-2中任一项所述的方法,其中该第二抗体在位置80(AHo编号)处进一步被异亮氨酸取代。
8.一种增加第一抗体稳定性的方法,该方法包括在该第一抗体的重链位置80(AHo编号)处取代疏水性氨基酸残基以产生第二抗体,其中该第二抗体比该未取代的第一抗体更稳定。
9.如权利要求8所述的方法,其中该疏水性氨基酸残基选自下组,该组由以下组成:丙氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸。
10.如权利要求8所述的方法,其中该疏水性氨基酸残基选自下组,该组由以下组成:苯丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸。
11.一种增加第一抗体稳定性的方法,该方法包括在该第一抗体的重链位置80(AHo编号)处取代丙氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸或缬氨酸以产生第二抗体,其中该第二抗体比该未取代的第一抗体更稳定。
12.如权利要求11所述的方法,其中在该第一抗体的重链位置80处,该甲硫氨酸被取代。
13.如权利要求11所述的方法,其中在该第一抗体的重链位置80处,该异亮氨酸被取代。
14.如权利要求8-13中任一项所述的方法,其中该第二抗体在重链位置56(AHo编号)处进一步被丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸取代。
15.如权利要求8-13中任一项所述的方法,其中该第二抗体在重链位置56(AHo编号)处进一步被丙氨酸或甘氨酸取代。
16.如权利要求8-13中任一项所述的方法,其中该第二抗体在重链位置56(AHo编号)处进一步被甘氨酸取代。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法,其中该第二抗体的稳定性的增加通过选自下组的至少一种来证明,该组由以下组成:在细胞培养期间滴度的增加、细胞培养产率的增加、纯化后纯度的增加、高分子量物质的减少、熔点温度的升高、聚集温度的升高和熔融起始温度的升高。
18.如权利要求17所述的方法,其中使用Octet Forte Bio仪器,通过结合到蛋白质A包被的探针端部的速率来测量滴度的增加。
19.如权利要求17所述的方法,其中通过蛋白质A或蛋白质G捕获来测量产率的增加。
20.如权利要求17所述的方法,其中通过纯化抗体的尺寸排阻色谱法(SEC)来测量纯度的增加。
21.如权利要求17所述的方法,其中通过尺寸排阻色谱法(SEC)和在每个分子量处每个峰的曲线下面积来测量高分子量物质的减少。
22.如权利要求17所述的方法,其中通过差示扫描荧光测定(DSF)或差示扫描量热法(DSC)来测量熔点温度的升高。
23.如权利要求17所述的方法,其中通过DSF来测量聚集温度的升高。
24.如权利要求17所述的方法,其中通过DSF来测量熔融起始温度的升高。
25.如任一前述权利要求所述的方法,其中该第一抗体是单克隆抗体。
26.如任一前述权利要求所述的方法,其中该第一抗体是人单克隆抗体或人源化单克隆抗体。
27.如任一前述权利要求所述的方法,其中该第一抗体是IgG抗体。
28.如权利要求27所述的方法,其中该IgG抗体选自下组,该组由以下组成:IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体和IgG4抗体。
29.如权利要求27所述的方法,其中该IgG抗体是IgG1抗体。
30.如权利要求27所述的方法,其中该IgG抗体是IgG2抗体。
31.如权利要求27所述的方法,其中该IgG抗体是IgG3抗体。
32.如权利要求27所述的方法,其中该IgG抗体是IgG4抗体。
33.一种增加第一抗体变体稳定性的方法,该方法包括在重链位置56(AHo编号)处取代甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸以产生第二抗体变体,其中该第二抗体变体比该未取代的第一抗体变体更稳定。
34.如权利要求33所述的方法,其中在重链位置56处,该甘氨酸被取代。
35.如权利要求33-34中任一项所述的方法,其中该第二抗体变体在重链位置80(AHo编号)处进一步被疏水性氨基酸残基取代。
36.如权利要求35所述的方法,其中该疏水性氨基酸残基选自下组,该组由以下组成:丙氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸。
37.如权利要求35所述的方法,其中该疏水性氨基酸残基选自下组,该组由以下组成:苯丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸。
38.一种增加第一抗体变体稳定性的方法,该方法包括在该第一抗体变体的重链位置80(AHo编号)处取代疏水性氨基酸残基以产生第二抗体变体,其中该第二抗体变体比该未取代的第一抗体变体更稳定。
39.如权利要求38所述的方法,其中该疏水性氨基酸残基选自下组,该组由以下组成:丙氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸。
40.如权利要求38所述的方法,其中该疏水性氨基酸残基选自下组,该组由以下组成:苯丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸。
41.一种增加第一抗体变体稳定性的方法,该方法包括在该第一抗体变体的重链位置80(AHo编号)处取代丙氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸或缬氨酸以产生第二抗体变体,其中该第二抗体变体比该未取代的第一抗体变体更稳定。
42.如权利要求41所述的方法,其中在该第一抗体变体的重链位置80处,该甲硫氨酸被取代。
43.如权利要求41所述的方法,其中在该第一抗体变体的重链位置80处,该异亮氨酸被取代。
44.如权利要求38-43中任一项所述的方法,其中该第二抗体变体在重链位置56(AHo编号)处进一步被丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸取代。
45.如权利要求38-43中任一项所述的方法,其中该第二抗体变体在重链位置56(AHo编号)处进一步被丙氨酸或甘氨酸取代。
46.如权利要求38-43中任一项所述的方法,其中该第二抗体变体在重链位置56(AHo编号)处进一步被甘氨酸取代。
47.如权利要求33-46中任一项所述的方法,其中该第二抗体变体的稳定性的增加通过选自下组的至少一种来证明,该组由以下组成:在细胞培养期间滴度的增加、细胞培养产率的增加、纯化后纯度的增加、高分子量物质的减少、熔点温度的升高、聚集温度的升高和熔融起始温度的升高。
48.如权利要求47所述的方法,其中使用Octet Forte Bio仪器,通过结合到蛋白质A包被的探针端部的速率来测量滴度的增加。
49.如权利要求47所述的方法,其中通过蛋白质A或蛋白质G捕获来测量产率的增加。
50.如权利要求47所述的方法,其中通过纯化抗体的SEC来测量纯度的增加。
51.如权利要求47所述的方法,其中通过SEC和在每个分子量处每个峰的曲线下面积来测量高分子量物质的减少。
52.如权利要求47所述的方法,其中通过DSF或DSC来测量熔点温度的升高。
53.如权利要求47所述的方法,其中通过DSF来测量聚集温度的升高。
54.如权利要求47所述的方法,其中通过DSF来测量熔融起始温度的升高。
55.如权利要求33-54中任一项所述的方法,其中该第一抗体变体是多特异性抗体。
56.如权利要求55所述的方法,其中该多特异性抗体是双特异性抗体或三特异性抗体。
57.如权利要求33-56中任一项所述的方法,其中该第一抗体变体是能够结合抗原的抗体片段。
58.如权利要求57所述的方法,其中该抗体片段选自下组,该组由以下组成:Fab片段、Fab'片段、F'(ab)2片段、Fv片段、单链抗体、双功能抗体)、双互补位肽、结构域抗体(dAb)、CDR移植的抗体、单链抗体(scFv)、单链抗体片段、嵌合抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、微型抗体、线性抗体;螯合重组抗体、三抗体、双抗体、胞内抗体、纳米抗体、小模块免疫药物(SMIP)、抗原结合结构域免疫球蛋白融合蛋白、单结构域抗体和含VHH抗体。
59.如权利要求33-58中任一项所述的方法,其中该第一抗体变体是人单克隆抗体或人源化单克隆抗体变体。
60.如权利要求33-59中任一项所述的方法,其中该第一抗体变体是IgG抗体变体。
61.如权利要求60所述的方法,其中该IgG抗体变体选自下组,该组由以下组成:IgG1抗体变体、IgG2抗体变体、IgG3抗体变体和IgG4抗体变体。
62.如权利要求61所述的方法,其中该IgG抗体变体是IgG1抗体变体。
63.如权利要求61所述的方法,其中该IgG抗体变体是IgG2抗体变体。
64.如权利要求61所述的方法,其中该IgG抗体变体是IgG3抗体变体。
65.如权利要求61所述的方法,其中该IgG抗体变体是IgG4抗体变体。
66.一种增加第一抗体或第一抗体变体的稳定性的方法,该方法包括
a.鉴定出该第一抗体或该抗体变体的抗体部分的重链的种系原始氨基酸序列;
b.鉴定在该第一抗体或该抗体变体的抗体部分的重链位置56(AHo编号)处和重链位置80(AHo编号)处的氨基酸残基;以及
c.在该第一抗体或该抗体变体的抗体部分中,在重链位置56和80处取代来自该种系原始氨基酸序列的已鉴定残基,从而产生第二抗体或第二抗体变体,
其中该第二抗体比该未取代的第一抗体更稳定,或者其中该第二抗体变体比该未取代的第一抗体变体更稳定。
67.如权利要求66所述的方法,其中该第二抗体或第二抗体变体的稳定性的增加通过选自下组的至少一种来证明,该组由以下组成:在细胞培养期间滴度的增加、细胞培养产率的增加、纯化后纯度的增加、高分子量物质的减少、熔点温度的升高、聚集温度的升高和熔融起始温度的升高。
68.如权利要求67所述的方法,其中使用Octet Forte Bio仪器,通过结合到蛋白质A包被的探针端部的速率来测量滴度的增加。
69.如权利要求67所述的方法,其中通过蛋白质A或蛋白质G捕获来测量产率的增加。
70.如权利要求67所述的方法,其中通过纯化蛋白质的SEC来测量纯度的增加。
71.如权利要求67所述的方法,其中通过SEC和在每个分子量处峰的曲线下面积来测量高分子量物质的减少。
72.如权利要求67所述的方法,其中通过DSF或DSC来测量熔点温度的升高。
73.如权利要求67所述的方法,其中通过DSF来测量聚集温度的升高。
74.如权利要求67所述的方法,其中通过DSF来测量熔融起始温度的升高。
75.如权利要求66-74中任一项所述的方法,其中该第一抗体是单克隆抗体。
76.如权利要求75所述的方法,其中该第一抗体是人单克隆抗体或人源化单克隆抗体。
77.如权利要求66-76中任一项所述的方法,其中该第一抗体是IgG抗体。
78.如权利要求77所述的方法,其中该IgG抗体选自下组,该组由以下组成:IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体和IgG4抗体。
79.如权利要求78所述的方法,其中该IgG抗体是IgG1抗体。
80.如权利要求78所述的方法,其中该IgG抗体是IgG2抗体。
81.如权利要求78所述的方法,其中该IgG抗体是IgG3抗体。
82.如权利要求78所述的方法,其中该IgG抗体是IgG4抗体。
83.如权利要求66-82中任一项所述的方法,其中该第一抗体变体是多特异性抗体。
84.如权利要求83所述的方法,其中该多特异性抗体是双特异性抗体或三特异性抗体。
85.如权利要求66-84中任一项所述的方法,其中该第一抗体变体是能够结合抗原的抗体片段。
86.如权利要求85所述的方法,其中该抗体片段选自下组,该组由以下组成:Fab片段、Fab'片段、F'(ab)2片段、Fv片段、单链抗体、双功能抗体)、双互补位肽、结构域抗体(dAb)、CDR移植的抗体、单链抗体(scFv)、单链抗体片段、嵌合抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、微型抗体、线性抗体;螯合重组抗体、三抗体、双抗体、胞内抗体、纳米抗体、小模块免疫药物(SMIP)、抗原结合结构域免疫球蛋白融合蛋白、单结构域抗体和含VHH抗体。
87.如权利要求66-86中任一项所述的方法,其中该第一抗体变体是人单克隆抗体或人源化单克隆抗体变体。
88.如权利要求66-87中任一项所述的方法,其中该第一抗体变体是IgG抗体变体。
89.如权利要求66-88中任一项所述的方法,其中该IgG抗体变体选自下组,该组由以下组成:IgG1抗体变体、IgG2抗体变体、IgG3抗体变体和IgG4抗体变体。
90.如权利要求89所述的方法,其中该IgG抗体变体是IgG1抗体变体。
91.如权利要求89所述的方法,其中该IgG抗体变体是IgG2抗体变体。
92.如权利要求89所述的方法,其中该IgG抗体变体是IgG3抗体变体。
93.如权利要求89所述的方法,其中该IgG抗体变体是IgG4抗体变体。
94.如权利要求1-93中任一项所述的方法,其中该第二抗体或第二抗体变体在重链位置56和80(AHo编号)处分别被以下残基对中的任何一个取代:GF、GI、GL、GT、GV、AF、AI、AL、AV、AA、AM、SA、SI或ST。
95.如权利要求1-94中任一项所述的方法,该方法进一步包括将该第二抗体或第二抗体变体配制为药物组合物。
96.一种抗体或抗体变体,该抗体或抗体变体通过如权利要求1-95中任一项所述的方法制备。
97.一种药物组合物,该药物组合物包含如权利要求96所述的抗体或抗体变体。
98.如权利要求1-93中任一项所述的方法,该方法进一步包括将该第二抗体或第二抗体变体配制为药物组合物。
99.一种抗体或抗体变体,该抗体或抗体变体通过如权利要求1-93中任一项所述的方法制备。
100.一种药物组合物,该药物组合物包含如权利要求99所述的抗体或抗体变体。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201962787867P | 2019-01-03 | 2019-01-03 | |
US62/787867 | 2019-01-03 | ||
PCT/US2020/012057 WO2020142611A2 (en) | 2019-01-03 | 2020-01-02 | Engineering monoclonal antibodies to improve stability and production titer |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN113260627A true CN113260627A (zh) | 2021-08-13 |
Family
ID=69374408
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202080007979.9A Pending CN113260627A (zh) | 2019-01-03 | 2020-01-02 | 工程化单克隆抗体以改善稳定性和生产滴度 |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20220144920A1 (zh) |
EP (1) | EP3906258A2 (zh) |
JP (2) | JP2022516622A (zh) |
KR (1) | KR20210111791A (zh) |
CN (1) | CN113260627A (zh) |
AU (1) | AU2020204904A1 (zh) |
BR (1) | BR112021013175A2 (zh) |
CA (1) | CA3125453A1 (zh) |
CL (1) | CL2021001767A1 (zh) |
EA (1) | EA202191857A1 (zh) |
IL (1) | IL284562A (zh) |
MX (1) | MX2021007997A (zh) |
SG (1) | SG11202107129QA (zh) |
WO (1) | WO2020142611A2 (zh) |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009000099A2 (en) * | 2007-06-25 | 2008-12-31 | Esbatech Ag | Methods of modifying antibodies, and modified antibodies with improved functional properties |
US20090155255A1 (en) * | 2007-09-27 | 2009-06-18 | Biogen Idec Ma Inc. | Cd23 binding molecules and methods of use thereof |
CN103890005A (zh) * | 2011-10-20 | 2014-06-25 | 艾斯巴技术-诺华有限责任公司 | 稳定的多抗原结合抗体 |
-
2020
- 2020-01-02 US US17/420,231 patent/US20220144920A1/en active Pending
- 2020-01-02 WO PCT/US2020/012057 patent/WO2020142611A2/en unknown
- 2020-01-02 JP JP2021538467A patent/JP2022516622A/ja active Pending
- 2020-01-02 EA EA202191857A patent/EA202191857A1/ru unknown
- 2020-01-02 AU AU2020204904A patent/AU2020204904A1/en active Pending
- 2020-01-02 KR KR1020217023888A patent/KR20210111791A/ko active Search and Examination
- 2020-01-02 MX MX2021007997A patent/MX2021007997A/es unknown
- 2020-01-02 EP EP20702529.7A patent/EP3906258A2/en active Pending
- 2020-01-02 BR BR112021013175-2A patent/BR112021013175A2/pt unknown
- 2020-01-02 SG SG11202107129QA patent/SG11202107129QA/en unknown
- 2020-01-02 CA CA3125453A patent/CA3125453A1/en active Pending
- 2020-01-02 CN CN202080007979.9A patent/CN113260627A/zh active Pending
-
2021
- 2021-07-01 IL IL284562A patent/IL284562A/en unknown
- 2021-07-02 CL CL2021001767A patent/CL2021001767A1/es unknown
-
2024
- 2024-02-05 JP JP2024015463A patent/JP2024059658A/ja active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009000099A2 (en) * | 2007-06-25 | 2008-12-31 | Esbatech Ag | Methods of modifying antibodies, and modified antibodies with improved functional properties |
CN102838673A (zh) * | 2007-06-25 | 2012-12-26 | 艾斯巴技术,爱尔康生物医药研究装置有限责任公司 | 修饰抗体的方法和具有改善的功能性质的修饰抗体 |
US20090155255A1 (en) * | 2007-09-27 | 2009-06-18 | Biogen Idec Ma Inc. | Cd23 binding molecules and methods of use thereof |
CN103890005A (zh) * | 2011-10-20 | 2014-06-25 | 艾斯巴技术-诺华有限责任公司 | 稳定的多抗原结合抗体 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
A HONEGGER等: "Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool", J MOL BIOL, vol. 309, no. 3, pages 657 - 670, XP004626893, DOI: 10.1006/jmbi.2001.4662 * |
EVA MARIA HEROLD等: "Determinants of the assembly and function of antibody variable domains", SCI REP, vol. 7, no. 1, XP093032465, DOI: 10.1038/s41598-017-12519-9 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CL2021001767A1 (es) | 2021-12-17 |
EA202191857A1 (ru) | 2021-09-03 |
IL284562A (en) | 2021-08-31 |
WO2020142611A2 (en) | 2020-07-09 |
WO2020142611A3 (en) | 2020-09-03 |
MX2021007997A (es) | 2021-08-16 |
JP2024059658A (ja) | 2024-05-01 |
JP2022516622A (ja) | 2022-03-01 |
SG11202107129QA (en) | 2021-07-29 |
CA3125453A1 (en) | 2020-07-09 |
US20220144920A1 (en) | 2022-05-12 |
AU2020204904A1 (en) | 2021-07-22 |
BR112021013175A2 (pt) | 2021-09-28 |
EP3906258A2 (en) | 2021-11-10 |
KR20210111791A (ko) | 2021-09-13 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
TWI719894B (zh) | 抗原結合分子類和使用彼等之方法 | |
JP6185584B2 (ja) | 電荷の斥力相互作用を使用することによりホモダイマータンパク質の混合物を調製するための方法 | |
US20200377609A1 (en) | Anti-idiotypic antibodies directed to the antigen-binding portion of an bcma-binding molecule | |
TWI787594B (zh) | 抗原結合分子和使用彼之方法 | |
US20200299402A1 (en) | Methods of Controlling the Formation of Disulfide Bonds in Protein Solutions | |
KR20200130821A (ko) | 마이크로칩 모세관 전기영동 분석 및 시약 | |
US20170088611A1 (en) | Single-chain multivalent binding protein compositions and methods | |
CN113272651B (zh) | 鉴别蛋白质中的游离巯基的方法 | |
BR112020013009B1 (pt) | Métodos para identificar sítios de interação não covalente ou interfaces de dimerização em um medicamento proteico, para produzir e para fabricar um anticorpo | |
JP2023106414A (ja) | 真核宿主細胞において多量体タンパク質を産生する方法 | |
CN113260627A (zh) | 工程化单克隆抗体以改善稳定性和生产滴度 | |
EP4048696A1 (en) | Anti-idiotypic antigen binding molecules and methods of use thereof | |
US20210333235A1 (en) | Microchip capillary electrophoresis assays and reagents | |
TW202346856A (zh) | 分析多肽變體的方法及系統 | |
CA3220848A1 (en) | Microchip capillary electrophoresis assays and reagents | |
AU2021221277A1 (en) | Anti-idiotype antibodies targeting anti-CD19 chimeric antigen receptor | |
JP2023139186A (ja) | 薬剤生成物不純物を特性決定するためのシステム及び方法 | |
EA045662B1 (ru) | Водный электрофоретический буфер (варианты), способ выявления загрязнений или примесей в образце белкового лекарственного средства, набор для микрочипового капиллярного электрофореза |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |