CN113260310A - 用于成像lpa1受体的放射性配体 - Google Patents

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CN113260310A CN201980067881.XA CN201980067881A CN113260310A CN 113260310 A CN113260310 A CN 113260310A CN 201980067881 A CN201980067881 A CN 201980067881A CN 113260310 A CN113260310 A CN 113260310A
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Abstract

本发明涉及式(I)的放射性标记的LPA1受体拮抗剂或其药学上可接受的盐，其中所有变量是如本文所定义的，所述式(I)的放射性标记的LPA1受体拮抗剂或其药学上可接受的盐可用于哺乳动物的LPA1受体的定量成像。

Description

用于成像LPA1受体的放射性配体
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年10月15日提交的美国临时申请号62/745,524的优先权权益；将其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及新型的放射性标记的溶血磷脂酸(LPA)受体1拮抗剂以及其在哺乳动物的LPA1受体的标记和诊断成像中的用途。
背景技术
正电子发射断层成像(PET)是一种非侵入性成像技术，其可以提供关于活体受试者中的生物过程的功能信息。成像和监测体内分子事件的能力对于深入了解活体生物体中的生物化学和生理过程具有很大价值。这进而对于用于疾病的治疗、疾病的早期检测和新药物的设计的新型方法的开发是至关重要的。PET依赖于用正电子发射放射性同位素标记的分子的设计和合成。这些分子被称为放射性示踪剂或放射性配体。对于PET成像，最常用的正电子发射(PET)放射性核素是11C、18F、15O和13N，它们都是回旋加速器生产的，并且分别具有20、110、2和10分钟的半衰期。在用正电子发射放射性核素放射性标记后，典型地通过静脉内(i.v.)注射将这些PET放射性配体施用于哺乳动物。一旦在体内，随着放射性配体的衰变，它会发射一个正电子，所述正电子行进一小段距离，直到它与一个电子结合。然后发生被称为湮灭事件的事件，所述事件产生两个共线光子，其中每个光子的能量为511keV。使用能够检测从放射性配体发射的γ辐射的PET成像扫描仪，平面图像和断层图像揭示出放射性示踪剂的分布随时间的变化。PET放射性配体提供了关于人受体的靶接合和剂量依赖性受体占据率的有用体内信息。
特发性肺纤维化(IPF)是一种慢性疾病，其特征在于肺中存在瘢痕组织、呼吸困难和慢性干咳。IPF属于被称为间质性肺病(ILD)的肺障碍的家族，并且与通常被称为间质性肺纤维化(UIP)的病理模式相关。IPF存在若干个潜在的临床过程，包括缓慢进行性疾病(最常见)、以发作性急性加重为特征的疾病、或快速进行性疾病。自诊断时间起的中位存活时间在2年与5年之间。目前没有IPF的治愈方法，并且可用的治疗选项非常有限并且具有不希望的副作用。IPF的发病机理是未知的，但其中一个假设是上皮细胞的初始损伤增加溶血磷脂酸(LPA)的产生。LPA是一种生物活性磷脂，其调节细胞功能的许多方面并且已被认为是伤口愈合和组织纤维化的新型介质。LPA通过LPA受体介导其生物作用，所述LPA受体中的至少有六种同种型已被鉴定。最近的研究已在最近将LPA1同种型与肺纤维化的发病机理联系起来，并且LPA1受体已被鉴定作为IPF的潜在临床靶标。若干项发现支持LPA/LPA1通路在IPF中的作用，所述通路激活LPA1受体，导致内皮屏障破坏、炎症、和成纤维细胞的募集/增殖。IPF患者的支气管肺泡灌洗液(BAL)中的LPA升高。患有IPF的人的BAL流体(BALF)中的LPA浓度增加，并且LPA1拮抗会抑制由IPF BALF诱导的成纤维细胞迁移。此外，在博来霉素纤维化模型中，缺乏LPA1受体的敲除小鼠在肺中显示出血管渗漏减少和胶原累积减少。基于这些数据，LPA1信号传导被认为有助于肺纤维化的发展，这至少部分是通过诱导血管渗漏和刺激成纤维细胞迁移进行的。
与支持成像技术结合使用对LPA1受体具有高亲和力的特定PET放射性配体可以提供一种用于关于LPA1拮抗剂的靶接合和剂量/占据率关系两者在人肺LPA1或其他器官(诸如肾脏、肝脏、心脏或皮肤)LPA1方面的临床演变的方法。本文所述的发明涉及放射性标记的LPA1拮抗剂，其将可用于体外和体内两者的探索性和诊断性成像应用以及用于使用放射性标记的和未标记的LPA1拮抗剂的竞争研究。
美国专利申请公开号2017/0360759(PCT申请公开号WO 2017/223016)公开了溶血磷脂酸受体的某些拮抗剂，其用于治疗LPA依赖或LPA介导的病症或疾病，诸如各种器官(包括肺)的纤维化。
发明内容
本公开文本部分地基于这样的认识，即放射性标记的溶血磷脂酸(在下文为“LPA1”)受体拮抗剂可用于在哺乳动物物种的组织中LPA1受体和/或LPA1表达和/或化合物占据LPA1受体的亲和力的检测和/或定量和/或成像。已经发现，当施用于哺乳动物物种时，放射性标记的LPA1受体拮抗剂积聚在LPA1受体处或占据LPA1受体并且可以通过成像技术检测，从而为LPA1受体的存在、化合物占据LPA1受体的亲和力、和LPA1受体拮抗剂的临床评价和剂量选择提供有价值的诊断标记。另外，本文公开的放射性标记的LPA1受体拮抗剂可以用作研究工具，以在体内通过未标记的药物与放射性标记的药物之间结合至受体的竞争来研究未标记的LPA1受体拮抗剂与LPA1受体的相互作用。这些类型的研究可用于确定LPA1受体占据率与未标记的LPA1受体拮抗剂的剂量之间的关系以及用于通过各种剂量的未标记的LPA1受体拮抗剂研究受体阻断的持续时间。
作为临床工具，放射性标记的LPA1受体拮抗剂可以用于帮助限定LPA1受体拮抗剂的临床有效剂量。在动物实验中，放射性标记的LPA1受体拮抗剂可以用于提供信息，所述信息可用于在选择用于临床开发的潜在药物候选者之间进行选择。放射性标记的LPA1受体拮抗剂还可以用于研究在人和动物的活体肺组织和其他组织(诸如肾脏、心脏、肝脏和皮肤)中和在组织样品中LPA1受体的区域分布和浓度。它们可以用于研究疾病或LPA1受体浓度的药理学相关变化。
本发明提供了一种式(I)的放射性标记的化合物：
Figure BDA0003020410420000031
或其药学上可接受的盐，其中：
R2和R3独立地是C1-4烷基；
R5独立地是F、Cl、C1-4烷基或C1-4卤代烷基；并且
n独立地是0、1、2或3。
在本发明的一个实施方案中，提供了以下式(Ia)的放射性标记的化合物：
Figure BDA0003020410420000041
或其药学上可接受的盐。
在本发明的另一个实施方案中，提供了以下式(IIa)的放射性标记的化合物：
Figure BDA0003020410420000042
或其药学上可接受的盐。
根据本发明的一个实施方案，提供了药物和诊断组合物。此类药物或诊断组合物包含式(I)、(Ia)或(IIa)的放射性标记的化合物或其药学上可接受的盐；和其药学上可接受的载体。在一个实施方案中，式(I)、(Ia)或(IIa)的放射性标记的化合物或其药学上可接受的盐分别以治疗有效量和诊断有效量存在于药物和诊断组合物中。
在一个实施方案中，本发明提供了一种对已知LPA1表达的哺乳动物组织进行体内成像的方法，其包括以下步骤：
(a)向哺乳动物物种施用式(I)、(Ia)或(IIa)的放射性标记的化合物或其药学上可接受的盐；以及
(b)通过正电子发射断层成像(PET)扫描对所述放射性标记的化合物的分布进行体内成像。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于筛选非放射性标记的化合物以确定其占据哺乳动物组织中LPA1受体的结合位点的亲和力的方法，其包括以下步骤：
(a)向哺乳动物物种施用式(I)、(Ia)或(IIa)的放射性标记的化合物或其药学上可接受的盐；
(b)通过正电子发射断层成像(PET)对已知LPA1表达的组织进行体内成像以确定所述放射性标记的化合物的基线摄取；
(c)向所述哺乳动物物种施用所述非放射性标记的化合物或其药学上可接受的盐；
(d)向哺所述乳动物物种施用第二剂量的式(I)、(Ia)或(IIa)的放射性标记的化合物或其药学上可接受的盐；
(e)对所述式(I)、(Ia)或(IIa)的放射性标记的化合物在表达LPA1受体的组织中的分布进行体内成像；
(f)将在所述表达LPA1的组织中在所述基线处来自PET扫描数据的信号与在所述表达LPA1受体的组织中在施用所述非放射性标记的化合物后检索的PET扫描数据进行比较。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于监测正在用LPA1受体拮抗剂治疗的哺乳动物患者的治疗的方法，其包括以下步骤：
(a)向所述患者施用式(I)、(Ia)或(IIa)的放射性标记的化合物或其药学上可接受的盐；
(b)通过正电子发射断层成像(PET)获得表达LPA1受体的所述患者的组织的图像；以及
(c)检测所述放射性标记的化合物占据所述LPA1受体的结合位点到什么程度。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于组织成像的方法，其包括以下步骤：使含有LPA1受体的组织与式(I)、(Ia)或(IIa)的放射性标记的化合物或其药学上可接受的盐接触；以及使用正电子发射断层成像(PET)成像检测所述放射性标记的化合物。在此类方法中，可以体外或体内检测放射性标记的化合物。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于诊断哺乳动物物种的纤维化疾病的存在的方法，其包括以下步骤：
(a)向有需要的哺乳动物物种施用式(I)、(Ia)或(IIa)的放射性标记的化合物或其药学上可接受的盐，所述放射性标记的化合物或其药学上可接受的盐结合至与所述纤维化疾病的存在相关的所述LPA1受体；以及
(b)获得所述哺乳动物物种的至少一部分的放射图像以检测所述放射性标记的化合物的存在或不存在；其中高于背景的所述放射性标记的化合物的存在和位置指示所述纤维化疾病的存在或不存在。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于诊断哺乳动物物种的纤维化疾病、例如特发性肺纤维化的存在的方法，其包括以下步骤：
(a)向有需要的哺乳动物物种施用式(I)、(Ia)或(IIa)的放射性标记的化合物或其药学上可接受的盐，所述放射性标记的化合物或其药学上可接受的盐结合至与所述纤维化疾病的存在相关的所述LPA1受体；
(b)检测针对所述哺乳动物物种的所述放射性标记的化合物的放射性发射；
(c)将来自针对所述哺乳动物物种的所述放射性标记的化合物的放射性发射与标准值进行比较；以及
(d)找到针对所述哺乳动物物种检测到的放射性发射相比于标准值之间的任何显著偏差，并且将所述偏差归因于所述纤维化疾病。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于定量哺乳动物物种的患病细胞或组织的方法，其包括以下步骤：
(a)向具有患病细胞或组织的哺乳动物物种施用式(I)、(Ia)或(IIa)的放射性标记的化合物或其药学上可接受的盐，所述放射性标记的化合物或其药学上可接受的盐结合至位于所述患病细胞或组织内的LPA1受体；以及
(b)检测所述患病细胞或组织中所述放射性标记的化合物的放射性发射，其中所述放射性发射在所述患病细胞或组织中的水平和分布是所述患病细胞或组织的定量测量。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于使用碳酸钾、18F-氟化物和相转移催化剂(例如kyptofix 2.2.2.)，然后在氢氧化钠中进行皂化反应而从与式(IIc)的非对映异构体的混合物中分离出式(IIa)的优选非对映异构体的方法。
附图说明
图1描绘了18F-(1S,3S)-3-((6-(5-((((4-(氟)丁基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸的半制备型HPLC色谱图。
图2描绘了18F-(1S,3S)-3-((6-(5-((((4-(氟)丁基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸的分析型HPLC色谱图。
图3描绘了与参考标准品共注射的18F-(1S,3S)-3-((6-(5-((((4-(氟)丁基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸的分析型手性HPLC色谱图。
图4描绘了18F-(1S,3S)-3-((6-(5-((((4-(氟)丁基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸与异源表达人LPA1的CHO细胞的全细胞结合。
图5描绘了在野生型大鼠和博来霉素治疗的大鼠中注射18F-(1S,3S)-3-((6-(5-((((4-(氟)丁基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸后60-90分钟时的代表性PET和透射扫描共配准的总结图像。
图6描绘了18F-(1S,3S)-3-((6-(5-((((4-(氟)丁基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸在大鼠肺中的百分比置换随预给药多个剂量的LPA1拮抗剂的变化的图形表示。
图7描绘了在基线时和在施用媒介物或3、10和30mg/kg的LPA1拮抗剂后在食蟹猴中18F-(1S,3S)-3-((6-(5-((((4-(氟)丁基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸的代表性PET/MRI图像。
图8描绘了在用LPA1拮抗剂或媒介物治疗后在食蟹猴肺组织中18F-(1S,3S)-3-((6-(5-((((4-(氟)丁基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸的百分比置换的图形表示。
图9描绘了18F-(1R,3S)-3-((6-(5-((((4-(氟)丁基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸的半制备型HPLC色谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种式(I)的放射性标记的化合物：
Figure BDA0003020410420000081
或其药学上可接受的盐，其中：
R2和R3独立地是C1-4烷基；
R5独立地是F、Cl、C1-4烷基或C1-4卤代烷基；并且
n独立地是0、1、2或3。
在一个实施方案中，本公开文本提供了一种式(Ia)的放射性标记的化合物：
Figure BDA0003020410420000082
或其药学上可接受的盐。
式(Ia)的立体异构体也包括在本发明的范围内，并且包括例如以下：
Figure BDA0003020410420000083
式(I)、(Ia)或(IIa)的化合物是放射性标记的LPA1受体拮抗剂，其可用作具有LPA1受体亲和力的正电子发射分子。如本文所用的术语“放射性标记的LPA1受体拮抗剂”是指式(I)、(Ia)或(IIa)的化合物或其药学上可接受的盐。
在另一个实施方案中，本公开文本提供了一种用于成像LPA1受体的诊断组合物，所述诊断组合物包含放射性标记的LPA1受体拮抗剂(即，式(I)、(Ia)或(IIa)的化合物或其药学上可接受的盐)和其药学上可接受的载体。在仍另一个实施方案中，本公开文本提供了一种药物组合物，其包含放射性标记的LPA1受体拮抗剂(即，式(I)、(Ia)或(IIa)的化合物或其药学上可接受的盐)和其药学上可接受的载体。在又另一个实施方案中，本公开文本提供了一种已知LPA1表达的哺乳动物组织的放射自显影的方法，其包括以下步骤：向哺乳动物物种施用放射性标记的LPA1受体拮抗剂，通过正电子发射断层成像获得所述组织的图像，以及检测所述组织中的放射性标记的化合物以确定所述组织的LPA1靶接合和LPA1受体占据率。
当被适当的放射性核素标记时，放射性标记的LPA1受体拮抗剂潜在地可用于多种体外和/或体内成像应用，包括诊断成像、基础研究、和放射疗法应用。可能的诊断成像和放射疗法应用的具体例子包括确定LPA1受体的位置、相对活性和/或定量；LPA1受体拮抗剂的放射免疫测定；以及用于确定在哺乳动物或其器官或组织样品中LPA1受体的分布的放射自显影。
特别地，本发明的放射性标记的LPA1受体拮抗剂可用于在活体人和实验动物的肺、心脏、肾脏、肝脏和皮肤以及其他器官中LPA1受体的正电子发射断层成像(PET)成像。这些放射性标记的LPA1受体拮抗剂可以用作研究工具，以在体内通过未标记的药物与放射性标记的化合物之间结合至受体的竞争来研究未标记的LPA1受体拮抗剂与LPA1受体的相互作用。这些类型的研究可用于确定LPA1受体占据率与未标记的LPA1受体拮抗剂的剂量之间的关系以及用于通过各种剂量的未标记的LPA1受体拮抗剂研究受体阻断的持续时间。作为临床工具，放射性标记的LPA1受体拮抗剂可以用于帮助限定LPA1受体拮抗剂的临床有效剂量。在动物实验中，放射性标记的LPA1受体拮抗剂可以用于提供信息，所述信息可用于在选择用于临床开发的潜在药物候选者之间进行选择。放射性标记的LPA1受体拮抗剂还可以用于研究在活体实验动物的人肺、肾脏、肝脏、皮肤、心脏和其他器官中和在组织样品中LPA1受体的区域分布和浓度。放射性标记的LPA1受体拮抗剂还可以用于研究疾病或LPA1受体浓度的药理学相关变化。
例如，正电子发射断层成像(PET)示踪剂(诸如本发明的放射性标记的LPA1受体拮抗剂)可以与目前可用的PET技术一起使用以获得以下信息：候选LPA1受体拮抗剂的受体占据率水平与患者的临床功效之间的关系；在长期临床研究开始之前针对LPA1受体拮抗剂的临床试验的剂量选择；结构新颖的LPA1受体拮抗剂的对比功效；在用LPA1受体拮抗剂治疗临床靶标期间研究LPA1受体拮抗剂对体内转运体亲和力和密度的影响；在特发性肺纤维化、心脏纤维化或其他纤维化疾病的有效和无效治疗期间LPA1受体的密度和分布的变化。
本发明的放射性标记的LPA1受体拮抗剂可用于成像LPA1受体或用于关于与LPA1受体相关的多种障碍进行诊断成像。
如本文所用的术语“纤维化”或“纤维化疾病”是指与细胞和/或纤连蛋白和/或胶原的异常积累和/或成纤维细胞募集的增加相关的病症，并且包括但不限于单独器官或组织(诸如心脏、肾脏、肝脏、关节、肺、胸膜组织、腹膜组织、皮肤、角膜、视网膜、肌肉骨骼和消化道)的纤维化，诸如特发性肺纤维化、硬皮病和慢性肾病。
涉及纤维化的示例性疾病、障碍或病症包括但不限于：与纤维化相关的肺病，例如特发性肺纤维化、继发于系统性炎性疾病(诸如类风湿性关节炎)的肺纤维化、硬皮病、狼疮、隐源性纤维化肺泡炎、辐射诱导的纤维化、慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性哮喘、矽肺、石棉诱导的肺或胸膜纤维化、急性肺损伤和急性呼吸窘迫(包括细菌性肺炎诱导的、创伤诱导的、病毒性肺炎诱导的、呼吸机诱导的、非肺脓毒症诱导的和吸入诱导的)；与损伤/纤维化(肾纤维化)相关的慢性肾病，例如继发于系统性炎性疾病(诸如狼疮和硬皮病)的肾小球性肾炎、糖尿病、肾小球肾炎、局灶节段性肾小球硬化、IgA肾病、高血压、同种异体移植物和Alport；肠纤维化，例如硬皮病、和辐射诱导的肠纤维化；肝纤维化，例如肝硬化、酒精诱导的肝纤维化、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、胆管损伤、原发性胆汁性肝硬化、感染或病毒诱导的肝纤维化(例如，慢性HCV感染)、和自身免疫性肝炎；头颈部纤维化，例如辐射诱导的；角膜瘢痕，例如LASIK(激光辅助原位角膜磨镶术)、角膜移植、和小梁切除术；增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，例如烧伤诱导的或外科手术的；和其他纤维化疾病，例如结节病、硬皮病、脊髓损伤/纤维化、骨髓纤维化、血管再狭窄、动脉粥样硬化、动脉硬化、韦格纳肉芽肿病、混合性结蒂组织病、和佩罗尼氏病。
可能涉及LPA1受体的其他疾病、障碍或病症包括动脉粥样硬化、血栓形成、心脏病、血管炎、瘢痕组织形成、再狭窄、静脉炎、COPD(慢性阻塞性肺病)、肺动脉高压、肺纤维化、肺部炎症、肠粘连、膀胱纤维化和膀胱炎、鼻道纤维化、窦炎、由嗜中性粒细胞介导的炎症、和由成纤维细胞介导的纤维化、皮肤病学障碍(包括皮肤的增殖性或炎性障碍，诸如特应性皮炎、大疱性障碍、胶原病、银屑病、银屑病性病变、皮炎、接触性皮炎、湿疹、玫瑰痤疮、伤口愈合、瘢痕形成、增生性瘢痕形成、瘢痕疙瘩、川崎病、玫瑰痤疮、舍格伦-拉森
Figure BDA0003020410420000111
综合征、和荨麻疹)、呼吸系统疾病(包括哮喘、成人呼吸窘迫综合征和过敏性(外源性)哮喘、非过敏性(内源性)哮喘、急性重度哮喘、慢性哮喘、临床哮喘、夜间哮喘、过敏原诱导的哮喘、阿司匹林敏感性哮喘、运动诱导的哮喘、等二氧化碳过度通气、儿童发作性哮喘、成人发作性哮喘、咳嗽变异性哮喘、职业性哮喘、类固醇抗性哮喘、季节性哮喘)、季节性过敏性鼻炎、常年性过敏性鼻炎、慢性阻塞性肺病(包括慢性支气管炎或肺气肿)、肺动脉高血压、间质性肺纤维化和/或气道炎症和囊性纤维化、和缺氧、和炎性/免疫障碍，包括银屑病、类风湿性关节炎、血管炎、炎性肠病、皮炎、骨关节炎、哮喘、炎性肌肉疾病、过敏性鼻炎、阴道炎、间质性膀胱炎、硬皮病、湿疹、同种异体或异种移植(器官、骨髓、干细胞和其他细胞和组织)移植物排斥、移植物抗宿主病、红斑狼疮、炎性疾病、I型糖尿病、肺纤维化、皮肌炎、舍格伦
Figure BDA0003020410420000112
综合征、甲状腺炎(例如，桥本氏甲状腺炎和自身免疫性甲状腺炎)、重症肌无力、自身免疫性溶血性贫血、多发性硬化、囊性纤维化、慢性复发性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、过敏性结膜炎和特应性皮炎。
对于本发明化合物作为探索性或诊断性成像剂的用途，可以根据标准药物实践将放射性标记的化合物在药物组合物中单独地或优选在药物组合物中与药学上可接受的载体或稀释剂、任选地与已知佐剂(诸如明矾)组合地施用于哺乳动物、优选人。此类组合物可以口服或非肠道地施用，包括静脉内、肌内、腹膜内、皮下、直肠和局部施用途径。优选地，施用是静脉内的。LPA1受体拮抗剂是用短寿命的正电子发射放射性核素标记的放射性示踪剂，并且因此经由在其合成的少于一小时内经由静脉内注射来施用。这是必要的，因为所涉及的放射性核素的半衰期短。
未标记的LPA1受体拮抗剂的适当剂量水平的范围可以是从1mg至5000mg/天并且优选是从20mg至1000mg/天。当将本发明的放射性标记的LPA1受体拮抗剂施用于人受试者时，成像所需的量通常将由处方医师确定，其中剂量通常根据从放射性核素的发射的量而变化。然而，在大多数情况下，有效量将是足以产生在从约1-10mCi范围内的排放的化合物量。在一个示例性应用中，施用以在注射到哺乳动物中的0.5-20mCi的总放射性活度之间的量进行，取决于受试者的体重。上限由在啮齿动物或非人类灵长类动物中放射性标记的分子的剂量测定来设置。
当在临床上对患者进行PET成像研究时，可以使用以下说明性程序。将患者在实验日之前的某个时间用未标记的LPA1受体拮抗剂预先用药，并且禁食至少12小时，允许随意摄入水。将20G两英寸静脉导管插入对侧尺骨静脉中，用于放射性示踪剂施用。PET示踪剂的施用的时间通常与在血液中LPA1受体拮抗剂浓度的最大值(Tmax)或最小值(Tmin)的时间相符。
将患者定位在PET照相机中，并且经由i.v.导管施用示踪剂剂量的放射性标记的LPA1受体拮抗剂PET示踪剂，诸如[18F]实施例1(<20mCi)。在整个PET扫描过程中以适当的时间间隔取得动脉或静脉血液样品，以便分析和定量在血浆中[18F]实施例1的未代谢PET示踪剂的分数。在高达120min内采集图像。在注射放射性示踪剂的十分钟内和在成像时段的结束时，获得1ml血液样品以确定任何未标记的LPA1受体拮抗剂的血浆浓度，所述拮抗剂可能已经在PET示踪剂之前被施用。
通过图像重构来获得断层图像。为了确定放射性示踪剂的分布，在重构图像上绘制感兴趣区域(ROI)，包括但不限于肺、肝脏、心脏、肾脏、皮肤或其他器官和组织。使用在这些区域中随时间的放射性示踪剂摄取来生成在不存在任何干预的情况下或在未标记的LPA1受体拮抗剂的存在下在所检查的各种给药模式下获得的时间活度曲线(TAC)。数据表示为放射性活度/单位时间/单位体积(μCi/cc/mCi注射剂量)。用本领域众所周知的各种方法处理TAC数据以产生定量参数，诸如结合潜力(BP)或分布体积(VT)，其与未被占据的LPA1受体的密度成比例。然后基于与未用药状态下的BP或VT相比在LPA1受体拮抗剂的存在下在各种给药模式下通过平衡分析BP或VT的变化来计算对LPA1受体的抑制。通过绘制以上数据与LPA1受体拮抗剂的剂量(浓度)的关系，生成抑制曲线。然后基于与在未用药状态下的BP或VT相比可以通过在Emax、Tmax或Tmin时阻断药物达到的PET放射性配体的VT或BP的最大降低和其非特异性分布体积(VND)的变化和在LPA1受体拮抗剂的存在下在各种给药模式下的BP来计算对LPA1受体的抑制。ID50值通过曲线拟合剂量-速率/抑制曲线获得。
本公开文本进一步涉及一种用于对有需要的哺乳动物中的LPA1受体进行诊断成像的方法，其包括以下步骤：将放射性标记的LPA1受体拮抗剂与药物载体或赋形剂组合。
定义
除非另有说明，否则本申请(包括说明书和权利要求书)中使用的以下术语具有下面给出的定义。必须指出，如在说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一个/一种(a、an)”和“所述(the)”包括复数指示物，除非上下文另外清楚地规定。除非另有指示，否则使用质谱法、NMR、HPLC、蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的常规方法。此外，术语“包括(including)”以及其他形式诸如“包括(include)”、“包括(includes)”和“包括(included)”的使用是非限制性的。本文使用的章节标题仅出于组织目的，而不应被解释为限制所描述的主题。
如本文所用的关于配制品、组合物或成分的术语“可接受的”意指对所治疗的受试者的总体健康没有持久的有害作用。
如本文所用的术语“调节”意指与靶标直接或间接相互作用，以便改变靶标的活性，仅以举例的方式包括增强靶标的活性、抑制靶标的活性、限制靶标的活性、或扩展靶标的活性。
如本文所用的术语“调节剂”是指直接或间接与靶标相互作用的分子。相互作用包括但不限于激动剂、部分激动剂、反向激动剂和拮抗剂的相互作用。在一个实施方案中，调节剂是拮抗剂。
如本文所用的术语“激动剂”是指与特定受体结合并且触发在细胞中的反应的分子，诸如化合物、药物、酶激活剂或激素调节剂。激动剂模仿与相同受体结合的内源性配体(诸如LPA、前列腺素、激素或神经递质)的作用。
如本文所用的术语“拮抗剂”是指减弱、抑制或防止另一种分子的作用或受体位点的活性的分子，诸如化合物。拮抗剂包括但不限于竞争性拮抗剂、非竞争性拮抗剂、不竞争性拮抗剂、部分激动剂和反向激动剂。
如本文所用的术语“LPA依赖性”是指在不存在LPA的情况下将不发生或不以相同程度发生的病症或障碍。
如本文所用的术语“LPA介导的”是指是指在不存在LPA的情况下可能发生但在LPA的存在下能够发生的病症或障碍。
如本文所用的术语“共施用”等意在涵盖向单一患者施用所选择的治疗剂，并且旨在包括其中通过相同或不同的施用途径或在相同或不同的时间施用治疗剂的治疗方案。
如本文所用的术语“组合物”旨在涵盖包含指定量的指定成分的产品以及直接或间接地由指定量的指定成分的组合得到的任何产品。与药物组合物有关的此类术语旨在涵盖包含一种或多种活性成分和构成载体的一种或多种惰性成分的组合物的产品；直接或间接地由任何两种或更多种成分的组合、复合或聚集，或由一种或多种成分的解离，或由一种或忽略成分的其他类型的反应或相互作用得到的任何产品。因此，本发明的药物组合物涵盖通过将本发明的化合物和药学上可接受的载体混合制成的任何组合物。“药学上可接受的”意指载体、稀释剂或赋形剂必须与配制品的其他成分相容并且对其接受者无害。术语化合物的“施用”和或“施用”化合物应理解为意指向患者提供本发明的化合物或本发明化合物的前药。
如本文所用的术语“有效量”或“治疗有效量”是指所施用的足够量的药剂或化合物，其将在一定程度上缓和所治疗的疾病或病症的一种或多种症状。结果可以是疾病的体征、症状或病因的减轻或缓解，或生物系统的任何其他所希望的改变。例如，用于治疗用途的“有效量”是包含如本文公开的化合物的组合物的量，所述量是为提供疾病症状的临床显著减少所需的。在任何单独情况下的适当的“有效”量可以使用诸如剂量递增研究的技术来确定。
如本文所用的术语“药物组合”意指由多于一种活性成分的混合或组合得到的产品，并且包括活性成分的固定和非固定组合两者。术语“固定组合”意指将活性成分(例如，式(I)、(Ia)或(IIa)的化合物)和共药剂两者以单一实体或剂量的形式同时施用于患者。术语“非固定组合”意指活性成分(例如，式(I)、(Ia)或(IIa)的化合物)和共药剂作为分开的实体同时地、并行地或顺序地施用于患者(没有特定的干预时间限制)，其中这样的施用提供了在患者体内有效水平的两种化合物。后者还适用于混合物疗法，例如三种或更多种活性成分的施用。
术语“受试者”或“患者”涵盖哺乳动物。哺乳动物的例子包括但不限于人、黑猩猩、猿、猴、牛、马、绵羊、山羊、猪、兔、狗、猫、啮齿动物、大鼠、豚鼠等。在一个实施方案中，哺乳动物是人。
如本文所用的术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”包括缓解、舒缓或改善疾病或病症的至少一种症状，预防另外的症状，抑制疾病或病症，例如阻止疾病或病症的发展，缓解疾病或病症，使疾病或病症消退，缓解由疾病或病症引起的病症，或预防性和/或治疗性地终止疾病或病症的症状。
本文所述的化合物可以具有不对称中心。含有不对称取代的原子的此类化合物可以以光学活性形式或外消旋形式分离。本领域熟知如何制备光学活性形式，诸如通过拆分外消旋形式或通过从有光学活性的起始材料合成。除非特别指示具体的立体化学或异构形式，否则意图指结构的所有手性、非对映异构体和外消旋形式。
短语“药学上可接受的”在本文中用于指在合理的医学判断范围内，适合用于与人或动物的组织接触，而不产生过多毒性、刺激、过敏反应或者其他问题或并发症，与合理的效益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
如本文所用，“药学上可接受的盐”是指所公开的化合物的衍生物，其中母体化合物通过制备其酸盐或碱盐而被修饰。
术语药学上可接受的一种或多种“盐(salt)”和“盐(salts)”可以指与无机和有机碱形成的碱性盐。此类盐包括铵盐；碱金属盐，诸如锂盐、钠盐和钾盐；碱土金属盐，诸如钙盐和镁盐；与有机碱形成的盐，诸如胺类盐(例如，二环己胺盐、苯乍生、N-甲基-D-葡萄糖胺、和海巴明(hydrabamine)盐)；和与氨基酸(如精氨酸、赖氨酸等)形成的盐；和两性离子，即所谓的“内盐”。无毒的药学上可接受的盐是优选的，但其他盐也可用于例如分离或纯化产物。
术语药学上可接受的一种或多种“盐(salt)”和“盐(salts)”还包括酸加成盐。它们是例如与以下形成的：强无机酸，诸如矿物酸，例如硫酸、磷酸、或氢卤酸(诸如HCl或HBr)；强有机羧酸，诸如1至4个碳原子的烷羧酸，未经取代或经取代的(例如经卤素取代的)，例如乙酸，诸如饱和或不饱和的二羧酸(例如草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、邻苯二甲酸或对苯二甲酸)，诸如羟基羧酸(例如抗坏血酸、乙醇酸、乳酸、苹果酸、酒石酸或柠檬酸)，诸如氨基酸(例如天冬氨酸或谷氨酸或赖氨酸或精氨酸)，或苯甲酸；或有机磺酸，诸如(C1-C4)烷基或芳基磺酸，未经取代或经取代的(例如经卤素取代)，例如甲磺酸或对甲苯磺酸。
药学上可接受的盐可以通过常规化学方法由含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。通常，此类盐可以通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计算量的适当碱或酸在水中或在有机溶剂中或在水与有机溶剂的混合物中反应来制备；通常，如醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈等非水性介质是优选的。合适的盐的列表发现于Remington’sPharmaceutical Sciences,第17版,第1418页,Mack Publishing Company,Easton,PA,(1985)，将其公开内容通过引用特此并入。
在整个说明书中，基团及其取代基可以由本领域技术人员选择，以提供稳定的部分和化合物，以及可用作药学上可接受的化合物和/或用于制备药学上可接受的化合物的中间体化合物的化合物。
实施例
使用如在工作实施例中公开的化合物作为代表，在以下方案中说明本发明化合物的合成。
下面概述了合成式(I)未标记的化合物的方法。方案1描述了氟烷基氨基甲酰基氧基甲基三唑环己基酸8的合成。US 2017/0360759(例如，实施例1E和10F)中已经描述了起始材料环己基酯三唑醇1的合成，将其公开内容通过引用并入本文。使三唑醇1与氯甲酸4-硝基苯酯在适当的碱的存在下反应以给出相应的三唑4-硝基苯基碳酸酯2。然后使三唑4-硝基苯基碳酸酯2与适当的N-羟烷基胺3(n＝0-2)在适当的碱的存在下反应以给出三唑N-羟烷基氨基甲酸酯4。使N-羟烷基氨基甲酸酯4与适当的磺酰氯5(例如，对甲苯磺酰氯)反应以给出相应的磺酸酯6。使磺酸酯6与适当的氟阴离子源(例如，KF或Bu4NF)反应以给出环己基酯三唑N-氟烷基氨基甲酸酯7，然后使其经受酯脱保护以给出所希望的氟烷基氨基甲酰基氧基甲基三唑环己基酸8。
方案1
Figure BDA0003020410420000171
方案2描述了18F-氟烷基氨基甲酰基氧基甲基三唑环己基酸的放射合成。使磺酸酯前体6的放射合成与适当的氟-18阴离子源(例如，K18F或Bu4N18F)、适当的相转移催化剂(例如，
Figure BDA0003020410420000172
222)和适当的离子液体(例如，1-丁基-3-甲基咪唑鎓六氟磷酸盐)反应以给出18F-环己基酯三唑N-氟烷基氨基甲酸酯9，然后使其经受酯脱保护以给出所希望的18F-氟烷基氨基甲酰基氧基甲基三唑环己基酸10。
方案2
Figure BDA0003020410420000181
试剂和条件：
a)K.2.2.2K[18F]，DMSO，1-丁基-3-甲基咪唑鎓六氟磷酸盐，120℃，5min；
b)2N NaOH，乙醇，70℃，10min
HPLC条件：
方法A：Agilent 1100系列HPLC和Lab logicγram放射-HPLC检测器，使用以下方法：柱：Zorbax SB C18，4.6x250mm，3-μm颗粒；流动相：在0.1％三氟乙酸水溶液中的60％乙腈；流量：1.00mL/min；检测：在254nm处的UV。
方法B：柱：Zorbax SB C18，4.6x250mm，3-μm颗粒；流动相：29％乙醇、10％乙腈和61％的100mM KH2PO4水溶液；流量：1.00mL/min；检测：在254nm处的UV。
方法C：柱：ChiralPak AD-H-250x4.6mm 5-μm颗粒；流动相：在庚烷中的15％异丙醇；流量：0.9mL/min；检测：在254nm处的UV。
实施例1.(1S，3S)-3-((6-(5-(羟甲基)-1-甲基-1H-1，2，3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸甲酯
Figure BDA0003020410420000182
根据针对来自专利申请US 2017/0360759的相应异丙酯(实施例1E)或乙基酯(实施例10F)的制备而描述的合成序列制备标题化合物。用于制备标题化合物的起始材料是(1S，3R)-甲基3-羟基环己烷-1-甲酸酯(而不是相应的环己烷异丙基酯或乙基酯)。
实施例2.(1R，3S)-3-((6-(5-(羟甲基)-1-甲基-1H-1，2，3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸甲酯
Figure BDA0003020410420000191
向实施例1化合物(1.95g，5.41mmol)在MeOH(38.6mL)中的澄清溶液中添加5.4MNaOMe溶液(4.0mL，21.64mmol)。将反应在60℃下加热6h并且然后冷却至室温。将反应置于冰浴中，用1N HCl中和，并且然后部分浓缩以除去MeOH。将所得混浊混合物分配在1.0MK2HPO4与EtOAc之间，并且分离各层。将水层用EtOAc(1x)萃取。将有机层合并，并且用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并且浓缩以给出白色固体，称重1.66g。通过手性SFC Prep的纯化(柱：Chiralpak IA，21x250mm，5微米；流动相：20％MeOH/80％CO2；流动条件：85mL/min，150巴，40℃；检测器波长：254nm)给出呈白色固体的作为标题化合物的第二洗脱非对映异构体(740mg，38％产率)。手性分析型HPLC(柱：Chiralpak IA，4.6x250mm，5微米；流动相：25％MeOH/80％CO2；流动条件：2.0mL/min，150巴，40℃；检测器波长：254nm)指示在甲基酯立体中心处98.2％de[0.9:99.1反式(4.33min):顺式(5.48min)]。LCMS,[M+H]+＝361.1。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.10(d,J＝8.8Hz,1H),7.61-7.45(m,1H),7.29(d,J＝8.8Hz,1H),4.83(s,2H),4.33-4.21(m,1H),4.09(s,3H),3.70(s,3H),2.53-2.45(m,4H),2.44-2.38(m,1H),2.23-2.13(m,1H),2.06-1.96(m,2H),1.76-1.59(m,1H),1.56-1.39(m,3H)。
实施例3.(1S,3S)-3-((2-甲基-6-(1-甲基-5-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸甲酯
Figure BDA0003020410420000192
向实施例1化合物(970mg，2.69mmol)和吡啶(1.09mL，13.5mmol)在DCM(17.9mL)中的0℃溶液中经1h逐滴添加氯甲酸4-硝基苯酯(1.09g，5.38mmol)在DCM(3mL)中的溶液。然后允许反应温热至室温并且在室温下搅拌20h，然后在真空中浓缩以给出固体。添加最少量的DCM以给出悬浮液，并且通过过滤除去固体(吡啶盐酸盐)。将滤液在真空中浓缩。将残余物进行色谱分离(120g SiO2柱；在己烷中从0-50％EtOAc的连续梯度)以给出呈淡黄色固体的标题化合物(1.12g，79％产率)。LCMS,[M+H]+＝526.3。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.33-8.28(m,2H),8.03(d,J＝8.5Hz,1H),7.43-7.38(m,2H),7.23(d,J＝8.5Hz,1H),6.06(s,2H),4.76-4.71(m,1H),4.22(s,3H),3.72(s,3H),2.89-2.80(m,1H),2.51(s,3H),2.21-2.12(m,1H),2.04-1.89(m,3H),1.83-1.72(m,1H),1.71-1.61(m,3H)。
实施例4.(1R,3S)-3-((2-甲基-6-(1-甲基-5-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸甲酯
Figure BDA0003020410420000201
按照如针对实施例3化合物的合成所述的程序通过使用实施例2化合物(而不是实施例1化合物)与氯甲酸4-硝基苯酯反应来制备标题化合物。LCMS，[M+H]+＝526.1。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.33-8.27(m,2H),8.02(d,J＝8.5Hz,1H),7.43-7.38(m,2H),7.22(d,J＝8.5Hz,1H),6.06(s,2H),4.32-4.19(m,4H),3.70(s,3H),2.54-2.45(m,4H),2.45-2.36(m,1H),2.22-2.12(m,1H),2.05-1.95(m,2H),1.77-1.64(m,1H),1.55-1.38(m,3H)。
实施例5：(1S,3S)-3-((6-(5-((((4-羟丁基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸甲酯
Figure BDA0003020410420000202
向实施例3化合物(1.90g，3.62mmol)在THF(18.1mL)中的室温溶液中添加4-(甲基氨基)丁-1-醇(0.448g，4.34mmol)，然后添加DIEA(0.76mL，4.34mmol)。在室温下搅拌18h后，将反应在真空中浓缩。将粗产物进行色谱分离(120g SiO2柱；经20min在DCM中从0-10％MeOH的连续梯度，然后等度的在DCM中的10％MeOH持续20min)以给出呈黄色油状物的标题化合物(2.1g，119％产率)。还存在反应副产物4-硝基苯酚。此材料不经进一步纯化而用于下一步骤。LCMS,[M+H]+＝490.3。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.96(d,J＝8.5Hz,1H),7.21(d,J＝8.5Hz,1H),5.84-5.71(m,2H),4.74-4.69(m,1H),4.15(s,3H),3.77-3.65(m,4H),3.54-3.45(m,1H),3.41-3.31(m,1H),3.27-3.16(m,1H),2.99-2.80(m,4H),2.52(s,3H),2.22-2.11(m,1H),2.05-1.87(m,3H),1.84-1.73(m,1H),1.71-1.36(m,8H)。一些峰似乎是旋转异构体的。
实施例6.(1S,3S)-3-((2-甲基-6-(1-甲基-5-(((甲基(4-(甲苯磺酰基氧基)丁基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸甲酯
Figure BDA0003020410420000211
向实施例5化合物(115mg，0.24mmol)、DMAP(2.9mg，0.023mmol)、和TEA(72.0μL，0.52mmol)在DCM(2.35mL)中的冷却(0℃)溶液中添加p-TsCl(53.7mg，0.28mmol)。允许所得反应温热至室温并且在室温下搅拌过夜。将反应分配在水(3mL)与Et2O(3mL)之间，并且分离各层。将水层用Et2O(1x)萃取。将合并的有机层干燥(MgSO4)并且在真空中浓缩。将粗产物进行色谱分离(24g SiO2柱；经25min在己烷中从0-60％EtOAc的连续梯度，然后是等度的在己烷中的60％EtOAc持续30min)以给出呈澄清无色的残余物的标题化合物(126mg，83％产率)。LCMS,[M+H]+＝644.2。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.95(d,J＝8.5Hz,1H),7.84-7.69(m,2H),7.38-7.31(m,2H),7.20(d,J＝8.5Hz,1H),5.81-5.69(m,2H),4.74-4.67(m,1H),4.13(s,3H),4.09-4.03(m,1H),3.90-3.84(m,1H),3.70(s,3H),3.31-3.22(m,1H),3.18-3.11(m,1H),2.91-2.76(m,4H),2.52-2.47(m,3H),2.45(s,3H),2.20-2.10(m,1H),2.03-1.86(m,3H),1.83-1.71(m,1H),1.70-1.56(m,5H),1.51-1.41(m,2H)。一些峰似乎是旋转异构体的。
实施例7.(1S,3S)-3-((2-甲基-6-(1-甲基-5-(((甲基(4-(((4-硝基-苯基)磺酰基)氧基)丁基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸甲酯
Figure BDA0003020410420000221
向实施例5化合物(90mg，0.18mmol)、DMAP(2.2mg，0.018mmol)、和TEA(56μL，0.40mmol)在DCM(1.8mL)中的0℃溶液中添加NsCl(45mg，0.20mmol)。将所得反应缓慢温热至室温。在室温下搅拌2h后，将反应分配在水(3mL)与Et2O(3mL)之间，并且分离各层。将水层用Et2O(1x)萃取。将合并的有机层干燥(MgSO4)，过滤并且在真空中浓缩。将粗产物进行色谱分离(12g SiO2柱；在己烷中从0-60％EtOAc的连续梯度)以给出呈黄色固体的标题化合物(25mg，19％产率)。LCMS,[M+H]+＝675.2。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.46-8.38(m,2H),8.14(br d,J＝8.0Hz,1H),8.08-8.00(m,1H),7.97(d,J＝8.5Hz,1H),7.22(d,J＝8.5Hz,1H),5.81-5.70(m,2H),4.76-4.69(m,1H),4.24-4.17(m,1H),4.15(s,3H),3.98-3.91(m,1H),3.72(s,3H),3.34-3.26(m,1H),3.24-3.13(m,1H),2.96-2.78(m,4H),2.53-2.46(m,3H),2.22-2.11(m,1H),2.05-1.88(m,3H),1.85-1.46(m,8H)。一些峰似乎是旋转异构体的。
实施例8.(1S,3S)-3-((6-(5-(羟甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸异丙酯
Figure BDA0003020410420000231
根据US 2017/0360759实施例1E中描述的实验程序制备标题化合物。
实施例9.(1S,3S)-3-((2-甲基-6-(1-甲基-5-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸异丙酯
Figure BDA0003020410420000232
根据US 2017/0360759实施例1F中描述的实验程序制备标题化合物。
实施例10.(1S,3S)-3-((6-(5-((((4-羟丁基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸异丙酯的制备
Figure BDA0003020410420000233
按照如针对实施例5化合物的合成所述的程序通过使用实施例9化合物(而不是实施例3化合物)与4-(甲基氨基)丁-1-醇反应来制备标题化合物。LCMS,[M+H]+＝518.3。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ7.96(d,J＝8.5Hz,1H),7.23(d,J＝8.5Hz,1H),5.85-5.71(m,2H),5.10-4.99(m,1H),4.76-4.61(m,1H),4.15(br s,3H),3.78-3.63(m,1H),3.55-3.44(m,1H),3.41-3.30(m,1H),3.26-3.14(m,1H),2.99-2.82(m,3H),2.82-2.73(m,1H),2.52(s,3H),2.14-2.07(m,1H),2.02-1.86(m,3H),1.86-1.35(m,9H),1.32-1.20(m,6H)。一些峰似乎是旋转异构体的。
实施例11.(1S,3S)-3-((2-甲基-6-(1-甲基-5-(((甲基(4-(甲苯磺酰基氧基)丁基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸异丙酯
Figure BDA0003020410420000241
向实施例10化合物(180mg，0.35mmol)在吡啶(5mL)中的冷却(0℃)溶液中添加p-TsCl(80mg，0.42mmol)。允许所得反应温热至室温，然后在室温下搅拌23h。将反应分配在水(3mL)与Et2O(3mL)之间，并且分离各层。将水层用Et2O(1x)萃取。将合并的有机层干燥(MgSO4)并且在真空中浓缩。将粗材料进行色谱分离(24g SiO2；在己烷中从0-100％EtOAc的连续梯度)以给出呈白色胶状残余物的标题化合物(75mg，32％产率)。LCMS,[M+H]+＝672.3。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.94(d,J＝8.3Hz,1H),7.83-7.67(m,2H),7.38-7.30(m,2H),7.21(d,J＝8.5Hz,1H),5.80-5.68(m,2H),5.08-4.96(m,1H),4.72-4.64(m,1H),4.12(s,3H),4.08-4.01(m,1H),3.91-3.82(m,1H),3.31-3.21(m,1H),3.18-3.08(m,1H),2.91-2.72(m,4H),2.52-2.46(m,3H),2.44(s,3H),2.12-2.04(m,1H),2.00-1.86(m,3H),1.81-1.70(m,1H),1.70-1.55(m,5H),1.50-1.40(m,2H),1.27-1.22(m,6H)。一些峰似乎是旋转异构体的。
实施例12.(1S,3S)-3-((6-(5-((((4-氟丁基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸甲酯
Figure BDA0003020410420000242
向实施例3化合物(558mg，1.06mmol)和4-氟-N-甲基丁-1-胺-HCl盐(226mg，1.59mmol)在THF(2.70mL)和DCM(2.70mL)中的悬浮液中逐滴添加TEA(0.59mL，4.25mmol)。将所得黄色悬浮液在室温下搅拌。添加另外的THF(2.70mL)和DCM(2.70mL)以促进混合。在室温下搅拌1h后，将反应混合物用EtOAc稀释，并且用1.0M K2HPO4水溶液(3x)、盐水(1x)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并且在真空中浓缩以给出澄清黄色油状物。将此材料进行色谱分离(120g SiO2柱；在己烷中从0-100％EtOAc的连续梯度)以给出呈澄清无色粘性油状物的标题化合物(440mg，84％产率)。LCMS,[M+H]+＝492.2。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.97(d,J＝8.5Hz,1H),7.21(d,J＝8.5Hz,1H),5.78(br d,J＝12.7Hz,2H),4.75-4.69(m,1H),4.58-4.40(m,1H),4.38-4.21(m,1H),4.16(br s,3H),3.71(s,3H),3.42-3.31(m,1H),3.27-3.16(m,1H),2.97-2.81(m,4H),2.52(s,3H),2.22-2.13(m,1H),2.05-1.88(m,3H),1.84-1.46(m,8H)。一些峰似乎是旋转异构体的。19F NMR(471MHz,CDCl3)δ-218.58。
实施例12(替代制备)。(1S,3S)-3-((6-(5-((((4-氟丁基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸甲酯
将实施例6化合物(79mg，0.12mmol)在TBAF中的澄清淡黄色溶液(在THF中的1.0M溶液，2.45mL，2.45mmol)在室温下搅拌1.5h，然后分配在水与Et2O之间，并且分离各层。将有机层用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并且在真空中浓缩以给出澄清残余物。将粗产物进行色谱分离(12g SiO2柱；在己烷中从0-60％EtOAc的连续梯度)以给出呈澄清无色油状物的标题化合物(0.0354g，58％产率)。LCMS,[M+H]+＝492.4。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.97(d,J＝8.5Hz,1H),7.21(d,J＝8.5Hz,1H),5.78(br d,J＝12.7Hz,2H),4.75-4.69(m,1H),4.58-4.40(m,1H),4.38-4.21(m,1H),4.16(br s,3H),3.71(s,3H),3.42-3.31(m,1H),3.27-3.16(m,1H),2.97-2.81(m,4H),2.52(s,3H),2.22-2.13(m,1H),2.05-1.88(m,3H),1.84-1.46(m,8H)。一些峰似乎是旋转异构体的。19F NMR(471MHz,CDCl3)δ-218.58。
实施例13.(1R,3S)-3-((6-(5-((((4-氟丁基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸甲酯
Figure BDA0003020410420000261
按照如针对实施例12化合物的合成所述的程序通过使用实施例4化合物(而不是实施例3化合物)与4-氟-N-甲基丁-1-胺-HCl反应来制备标题化合物。LCMS,[M+H]+＝492.3。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.97(d,J＝8.3Hz,1H),7.20(d,J＝8.5Hz,1H),5.78(br d,J＝12.1Hz,2H),4.58-4.40(m,1H),4.37-4.20(m,2H),4.16(s,3H),3.70(s,3H),3.41-3.30(m,1H),3.27-3.16(m,1H),2.98-2.81(m,3H),2.53-2.44(m,4H),2.44-2.37(m,1H),2.22-2.12(m,1H),2.05-1.95(m,2H),1.78-1.64(m,3H),1.58-1.40(m,5H)。
实施例14.(1S,3S)-3-((6-(5-((((4-氟丁基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸
Figure BDA0003020410420000262
在室温下向实施例12化合物(0.300g，0.610mmol)在THF(4.1mL)中的溶液中添加1.0M LiOH水溶液(3.0mL，3.0mmol)。将反应在室温下搅拌19h，然后用1N HCl水溶液酸化至pH约4至5，并且然后用EtOAc(2x)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并且在真空中浓缩以给出澄清无色残余物。将粗产物进行色谱分离(80g SiO2柱，在DCM中从0-10％MeOH的连续梯度)以在冻干后给出呈白色固体的标题化合物(241mg，82％产率)。LCMS,[M+H]+＝478.2。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ12.21(br s,1H),7.85(d,J＝8.5Hz,1H),7.48(d,J＝8.8Hz,1H),5.65(br d,J＝13.5Hz,2H),4.82-4.76(m,1H),4.53-4.36(m,1H),4.31-4.15(m,1H),4.10(s,3H),3.27-3.20(m,1H),3.16-3.09(m,1H),2.85-2.73(m,3H),2.68-2.59(m,1H),2.42(s,3H),2.08-1.96(m,1H),1.92-1.74(m,3H),1.69-1.34(m,8H)。一些峰似乎是旋转异构体的。19F NMR(471MHz,DMSO-d6)δ-216.79,-216.84。手性分析型HPLC(Chiralpak OJ-H，4.6x250mm，5微米。流动相：10％MeOH/90％CO2。流动条件：2mL/min，150巴，40℃。检测器波长：220nm)指示在羧酸立体中心处97％de[98.6:1.4反式(8.61min):顺式(11.58min)]。(参见US 2017/0360759，如实施例192)
实施例14(替代制备)。(1S,3S)-3-((6-(5-((((4-氟丁基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸，三氟乙酸盐
在室温下向实施例12(替代制备；0.023g，0.046mmol)在THF(0.31mL)中的溶液中添加1.0M LiOH水溶液(0.23mL，0.23mmol)。将反应在室温下搅拌22h，然后在真空中浓缩以除去THF。将残余物溶解在水和MeCN中，并且用TFA酸化。将此材料通过制备型HPLC纯化(柱：Sunfire Prep C18 OBD 5μm；30x100mm。溶剂A：10:90:0.1MeCN:H2O:TFA；溶剂B：90:10:0.1MeCN:H2O:TFA。40mL/分钟的流速，使用10％-100％溶剂B的梯度洗脱，同时在220nm处监测UV)以在冻干后给出呈白色固体的作为TFA盐的标题化合物(0.0195g，71％产率)。LCMS,[M+H]+＝478.4。1H NMR(500MHz,DMSO-d6和D2O)δ7.85(d,J＝8.5Hz,1H),7.50(br d,J＝8.5Hz,1H),5.64(br d,J＝12.4Hz,2H),4.81-4.77(m,1H),4.53-4.36(m,1H),4.31-4.15(m,1H),4.10(s,3H),3.28-3.18(m,1H),3.16-3.05(m,1H),2.84-2.72(m,3H),2.67-2.61(m,1H),2.43(s,3H),2.08-1.99(m,1H),1.90-1.75(m,3H),1.70-1.35(m,8H)。一些峰似乎是旋转异构体的。19F NMR(471MHz,DMSO-d6和D2O)δ-74.66,-216.78,-216.84。手性分析型HPLC(Chiralpak ID，4.6x250mm，5微米。流动相：20％MeOH/80％CO2。流动条件：2mL/min，150巴，40℃。检测器波长：220nm)指示在羧酸立体中心处83％de[91.6:8.4反式(8.47min):顺式(9.56min)]。
实施例15.(1R,3S)-3-((6-(5-((((4-氟丁基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸
Figure BDA0003020410420000281
按照如针对实施例14化合物的合成所述的程序通过使用实施例13化合物(而不是实施例12化合物)与LiOH反应来制备标题化合物。LCMS,[M+H]+＝478.2。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ12.28-12.14(m,1H),7.84(d,J＝8.5Hz,1H),7.53(d,J＝8.5Hz,1H),5.69-5.60(m,2H),4.54-4.35(m,2H),4.32-4.14(m,1H),4.10(s,3H),3.28-3.09(m,2H),2.84-2.71(m,3H),2.48-2.39(m,1H),2.37(s,3H),2.36-2.19(m,1H),2.11-2.02(m,1H),1.92-1.79(m,2H),1.67-1.50(m,2H),1.50-1.23(m,6H)。19F NMR(377MHz,DMSO-d6)δ-216.80,-216.84.一些峰似乎是旋转异构体的。手性分析型HPLC(Chiralpak OJ-H，4.6x250mm，5微米。流动相：10％MeOH/90％CO2。流动条件：2mL/min，150巴，40℃。检测器波长：220nm)指示在羧酸立体中心处98％de[0.7:99.3反式(8.61min):顺式(11.58min)]。
实施例16.18F-(1S,3S)-3-((6-(5-((((4-(氟)丁基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸的制备(方法A)
Figure BDA0003020410420000282
将18F-氟化物水溶液(2.0mL，111GBq(3000mCi))递送至QMA轻固相萃取筒柱(在使用前，将筒柱顺序地用5ml 0.5M碳酸氢钾、5ml去离子水和5ml乙腈预调整)。转移完成后，通过添加碳酸钾(在0.1ml蒸馏水(DI)中2.0mg)、4,7,13,16,21,24-六氧杂-1,10-二氮杂双环[8.8.8]二十六烷(10mg，0.027mmol)和1.5ml乙腈的混合物，从QMA释放出[18F]-氟化物水溶液。在90℃的温和氮气流和真空下蒸发溶剂以生成K.2.2.2/K[18F]F复合物。在此过程完成后，将2mg实施例6化合物(甲基(1S,3S)-3-((2-甲基-6-(1-甲基-5-(((甲基(4-(甲苯磺酰基氧基)丁基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸酯)(2mg，3.11μmol)溶解在0.7ml DMSO中，并且将1-丁基-3-甲基咪唑鎓六氟磷酸盐(300μl，1.441mmol)添加到干燥的kyptand中。将此所得溶液在120℃下加热5分钟。在此加热时间段完成后，将粗反应混合物冷却至45℃。接下来，将4.0ml含有溶解在0.1％三氟乙酸水溶液中的37.5％乙腈的溶液转移到含有70mlDI水的稀释烧瓶中。在此转移后，将稀释烧瓶的内容物装载到C18 Plus(360mg)固相萃取筒柱上。在此样品完全转移后，倒数第二个用2ml乙醇从筒柱释放到含有0.5ml 2N NaOH的合成反应器中。将此所得反应在70℃下加热10分钟。在此时间后，将反应冷却至45℃，并且向此反应混合物中添加1ml 1N HCl和1.5ml50mM磷酸一钾缓冲液(pH 5.0)。将此粗反应混合物装载到Zorbax C18 9.6x250mm HPLC柱上，并且使用以下HPLC纯化方法进行纯化：以3.5ml/min，在100mM磷酸一钾缓冲液(在pH5.0下)的29％乙醇10％乙腈。254nm和压力：1700PSI。在色谱图的38-41分钟标记之间分离18F-(1S,3S)-3-((6-(5-((((4-(氟)丁基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸，并且将此样品收集到稀释烧瓶中，所述稀释烧瓶含有50ml在pH 8.0下的250mM Tris缓冲液，如图1所示。将此溶液转移至C18轻(130mg)固相萃取筒柱。在合成之前，将此筒柱用5ml乙醇预活化，然后用10ml无菌水预活化。转移后，将筒柱用7ml 0.5mg/ml抗坏血酸钠pH 7.0洗涤，然后用7ml无菌水洗涤，并且然后最后用2.0ml乙醇洗脱到无菌产品小瓶中。分离7.5GBq(204mCi)的18F-(1S,3S)-3-((6-(5-((((4-(氟)丁基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸，并且通过反相HPLC分析化学特征(共注射非放射性标准品)、放射化学和化学纯度以及比活度，如图2所示。分离的产物与非放射性参考标准品共洗脱。样品是100％放射性化学纯的，97％化学纯的，100％非对映异构体过量，并且比活度为0.15GBq(4mCi)/nmol。使用以下方法使用分析型反相HPLC来确定结构特征、放射化学纯度和化学纯度：Zorbax SB-C18-250x4.6mm-5um半制备型HPLC柱，使用等度方法，所述等度方法由以下组成：29％乙醇、10％乙腈和61％100mM KH2PO4水溶液的溶液，使用流速1.0ml/min，同时在254nm处监测UV。18F-(1S,3S)-3-((6-(5-((((4-(氟)丁基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸的保留时间是26.5分钟。
使用分析型手性HPLC使用以下参数测量非对映异构体过量。ChiralPak AD-H-250x4.6mm柱，使用等度HPLC方法，使用15％异丙醇在庚烷中的溶液；流速为0.9ml/min，同时在254nm处监测UV。18F-(1S,3S)-3-((6-(5-((((4-(氟)丁基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸的保留时间是30分钟。
使用4点标准曲线(分析型HPLC峰面积(Y)对标准浓度(X：nmol))确定比活度。使用反相HPLC使用以下参数确定拟合线方程：Zorbax C18-250x4.6-5um HPLC柱，使用流速为1.0ml/min的在0.1％TFA水溶液中的60％乙腈的流动相，同时在254nm处监测UV。
图1示出了标题化合物的半制备型HPLC纯化。
图2示出了使用分析型反向HPLC的(1S,3S)-3-(6-(5-(((4-[18F]-氟丁基)(甲基)氨基甲酰基氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基氧基)环己烷甲酸以及参考标准品(1S,3S)-3-(6-(5-(((4-氟丁基)(甲基)氨基甲酰基氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基氧基)环己烷甲酸和(1R,3S)-3-(6-(5-(((4-氟丁基)(甲基)氨基甲酰基氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基氧基)环己烷甲酸的混合物的共注射。
图3示出了使用分析型手性HPLC的(1S,3S)-3-(6-(5-(((4-[18F]-氟丁基)(甲基)氨基甲酰基氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基氧基)环己烷甲酸以及参考标准品(1S,3S)-3-(6-(5-(((4-氟丁基)(甲基)氨基甲酰基氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基氧基)环己烷甲酸和(1R,3S)-3-(6-(5-(((4-氟丁基)(甲基)氨基甲酰基氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基氧基)环己烷甲酸的混合物的共注射。
实施例16(替代制备)。18F-(1S,3S)-3-((6-(5-((((4-(氟)丁基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸的合成(方法B)
将18F-氟化物水溶液(2.0mL，111GBq，3000mCi)递送至QMA轻固相萃取筒柱(在使用前，将筒柱顺序地用5ml 0.5M碳酸氢钾、5ml去离子水和5ml乙腈预调整)。转移完成后，通过添加碳酸钾(在0.1ml蒸馏水(DI)中2.0mg)、4,7,13,16,21,24-六氧杂-1,10-二氮杂双环[8.8.8]二十六烷(10mg，0.027mmol)和1.5ml乙腈的混合物，从QMA释放出18F-氟化物水溶液。
在90℃的温和氮气流和真空下蒸发溶剂以生成K.2.2.2/K[18F]F复合物。在此过程完成后，将2mg甲基(1S,3S)-3-((2-甲基-6-(1-甲基-5-(((甲基(4-(甲苯磺酰基氧基)丁基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸酯(2mg，3.11μmol)溶解在0.7ml DMSO中，并且将1-丁基-3-甲基咪唑鎓六氟磷酸盐(300μl，1.441mmol)添加到干燥的kyptand中。将此所得溶液在120℃下加热5分钟。在此加热时间段完成后，将粗反应混合物冷却至45℃。接下来，将4.0ml 0.1％三氟乙酸水溶液添加到粗反应中，并且使用Zorbax C18 9.6x250mm HPLC柱使用以下HPLC方法将此溶液纯化：5ml/min的在0.1％三氟乙酸水溶液中的50％乙腈。在色谱图的7.5-8.5分钟之间分离倒数第二个，并且将此样品收集到稀释烧瓶中，所述稀释烧瓶含有另外70ml在DI水中的0.1％三氟乙酸水溶液。然后将此溶液转移至C18 plus 360mg固相萃取筒柱。在此转移后，将稀释烧瓶的内容物装载到C18 Plus(360mg)固相萃取筒柱上。装载后，将倒数第二个用5ml DI水洗涤，然后用1ml乙腈洗脱到1ml 2N NaOH溶液中，并且将所得溶液在70℃下加热25分钟。在此时间完成后，将粗反应混合物转移到稀释烧瓶中，所述稀释烧瓶含有10ml 2N NaOH和40ml DI水。然后将稀释烧瓶的内容物添加到C18轻(130mg)固相萃取筒柱。转移完成后，将筒柱进一步用10ml 0.5mg/ml抗坏血酸溶液洗涤，然后注射10ml无菌水，并且最后使用1ml乙醇将纯化的18F-(1S,3S)-3-((6-(5-((((4-(氟)丁基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸从筒柱释放到无菌小瓶中。分离出7.8GBq(212mCi)的最终产物，将所得溶液通过0.2微米过滤器过滤并且用4ml盐水稀释。使用如先前所述的分析型HPLC方法测量在共注射非放射性标准品的情况下的化学特征、放射化学纯度和化学纯度、比活度。分离的产物与非放射性参考标准品共洗脱。样品是100％放射性化学纯的，97％化学纯的，并且比活度为0.14GBq(3.8mCi)/nmol。
18F-(1S,3S)-3-((6-(5-((((4-(氟)丁基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸可以用于多种体外和/或体内成像应用，包括诊断成像、基础研究、和放射疗法应用。可能的诊断成像和放射疗法应用的具体例子包括确定位置、相对活性和/或定量LPA1阳性组织、LPA1阳性组织的放射免疫测定、以及用于确定在哺乳动物或其器官或组织样品中LPA1阳性组织的分布的放射自显影。特别地，18F-(1S,3S)-3-((6-(5-((((4-(氟)丁基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸可用于在人和实验动物的肺、心脏、肾脏、肝脏和皮肤以及其他器官中LPA1阳性肿瘤的正电子发射断层成像(PET)成像。使用[18F]-(1S,3S)-3-((6-(5-((((4-(氟)丁基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸的PET成像可以用于获得以下信息：
药剂中的LPA1拮抗剂候选者的组织占据率水平与患者的临床功效之间的关系；在长期临床研究开始之前，LPA1治疗药剂的临床试验剂量选择；结构新颖的LPA1治疗药剂的对比功效；在用LPA1治疗药剂治疗临床靶标期间研究LPA1治疗药剂对体内转运体亲和力和密度的影响；在有效和无效治疗期间LPA1阳性组织的密度和分布的变化。
实施例17.[18F]-(1R,3S)-3-((6-(5-((((4-(氟)丁基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸的制备(方法A)
Figure BDA0003020410420000321
将18F-氟化物水溶液(2.0mL，111GBq(3000mCi))递送至QMA轻固相萃取筒柱(在使用前，将筒柱顺序地用5ml 0.5M碳酸氢钾、5ml去离子水和5ml乙腈预调整)。转移完成后，通过添加碳酸钾(在0.1ml蒸馏水(DI)中2.0mg)、4,7,13,16,21,24-六氧杂-1,10-二氮杂双环[8.8.8]二十六烷(12mg，0.032mmol)和1.5ml乙腈的混合物，从QMA释放出[18F]-氟化物水溶液。在90℃的温和氮气流和真空下蒸发溶剂以生成K.2.2.2/K[18F]F复合物。在此过程完成后，将2mg甲基(1S,3S)-3-((2-甲基-6-(1-甲基-5-(((甲基(4-(甲苯磺酰基氧基)丁基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸酯(2mg，3.11μmol)溶解在0.7ml DMSO中，并且将1-丁基-3-甲基咪唑鎓六氟磷酸盐(300μl，1.441mmol)添加到干燥的kyptand中。将此所得溶液在120℃下加热15分钟。在此加热时间段完成后，将粗反应混合物冷却至45℃。接下来，将4.0ml含有溶解在0.1％三氟乙酸水溶液中的37.5％乙腈的溶液转移到含有70mlDI水的稀释烧瓶中。在此转移后，将稀释烧瓶的内容物装载到C18 Plus(360mg)固相萃取筒柱上。在此样品完全转移后，倒数第二个用2ml乙醇从筒柱释放到含有0.5ml 2N NaOH的合成反应器中。将此所得反应在70℃下加热10分钟。在此时间后，将反应冷却至45℃，并且向此反应混合物中添加1ml 1N HCl和1.5ml 50mM磷酸一钾缓冲液(pH 5.0)。将此粗反应混合物装载到Zorbax C18 9.6x250mm HPLC柱上，并且使用以下HPLC纯化方法进行纯化：以3.5ml/min，在100mM磷酸一钾缓冲液(在pH 5.0下)的29％乙醇10％乙腈。254nm和压力：1700PSI。在色谱图的28-31分钟标记之间分离[18F]-(1R,3S)-3-((6-(5-((((4-(氟)丁基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸，并且将此样品收集到稀释烧瓶中，所述稀释烧瓶含有50ml在pH 8.0下的250mM Tris缓冲液。将此溶液转移至C18轻(130mg)固相萃取筒柱。在合成之前，将此筒柱用5ml乙醇预活化，然后用10ml无菌水预活化。转移后，将筒柱用7ml 0.5mg/ml抗坏血酸钠pH 7.0洗涤，然后用7ml无菌水洗涤，并且然后最后用2.0ml乙醇洗脱到无菌产品小瓶中。分离4.1GBq(112mCi)的[18F]-(1R,3S)-3-((6-(5-((((4-(氟)丁基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸，并且通过反相HPLC分析化学特征(共注射非放射性标准品)、放射化学和化学纯度以及比活度。分离的产物与非放射性参考标准品共洗脱。样品是100％放射性化学纯的，97％化学纯的，100％非对映异构体过量，并且比活度为0.15GBq(4mCi)/nmol。使用以下方法使用分析型反相HPLC来确定结构特征、放射化学纯度和化学纯度：Zorbax SB-C18-250x4.6mm-5um半制备型HPLC柱，使用等度方法，所述等度方法由以下组成：29％乙醇、10％乙腈和61％100mM KH2PO4水溶液的溶液，使用流速1.0ml/min，同时在254nm处监测UV。[18F]-(1R,3S)-3-((6-(5-((((4-(氟)丁基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸的保留时间是26.5分钟。
使用分析型手性HPLC使用以下参数测量非对映异构体过量。ChiralPak AD-H-250x4.6mm柱，使用等度HPLC方法，使用15％异丙醇在庚烷中的溶液；流速为0.9ml/min，同时在254nm处监测UV。[18F]-(1R,3S)-3-((6-(5-((((4-(氟)丁基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸的保留时间是37.5分钟。
使用4点标准曲线(分析型HPLC峰面积(Y)对标准浓度(X：nmol))确定比活度。使用反相HPLC使用以下参数确定拟合线方程：Zorbax C18-250x4.6-5um HPLC柱，使用流速为1.0ml/min的在0.1％TFA水溶液中的60％乙腈的流动相，同时在254nm处监测UV。
可替代地，将18F-氟化物水溶液(2.0mL，111GBq(3000mCi))递送至QMA轻固相萃取筒柱(在使用前，将筒柱顺序地用5ml 0.5M碳酸氢钾、5ml去离子水和5ml乙腈预调整)。转移完成后，通过添加碳酸钾(在0.1ml蒸馏水(DI)中1.0mg)、4,7,13,16,21,24-六氧杂-1,10-二氮杂双环[8.8.8]二十六烷(10mg，0.032mmol)和0.9ml乙腈的混合物，从QMA释放出[18F]-氟化物水溶液。在120℃的温和氮气流和真空下蒸发溶剂以生成K.2.2.2/K[18F]F复合物。在此过程完成后，将2mg甲基(1S,3S)-3-((2-甲基-6-(1-甲基-5-(((甲基(4-(甲苯磺酰基氧基)丁基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸酯(2mg，3.11μmol)溶解在0.7ml DMSO中，添加到干燥的kyptand中。将此所得溶液在120℃下加热5分钟。在此加热时间段完成后，将粗反应混合物冷却至45℃。接下来，将4.0ml含有溶解在0.1％三氟乙酸水溶液中的37.5％乙腈的溶液转移到含有70mlDI水的稀释烧瓶中。在此转移后，将稀释烧瓶的内容物装载到C18 Plus(360mg)固相萃取筒柱上。在此样品完全转移后，倒数第二个用1.9ml乙醇从筒柱释放到含有0.5ml 2N NaOH的合成反应器中。将此所得反应在70℃下加热10分钟。在此时间后，将反应冷却至45℃，并且向此反应混合物中添加1ml 1N HCl和1.5ml 50mM磷酸一钾缓冲液(pH 5.0)。将此粗反应混合物装载到ZorbaxC18 9.6x250mm HPLC柱上，并且使用以下HPLC纯化方法进行纯化：以3.5ml/min，在100mM磷酸一钾缓冲液(在pH 5.0下)的29％乙醇10％乙腈。254nm和压力：1700PSI。在色谱图的28-31分钟标记之间分离[18F]-(1R,3S)-3-((6-(5-((((4-(氟)丁基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸，并且将此样品收集到稀释烧瓶中，所述稀释烧瓶含有50ml在pH 8.0下的250mM Tris缓冲液、200mg抗坏血酸钠。将此溶液转移至C18轻(130mg)固相萃取筒柱。在合成之前，将此筒柱用5ml乙醇预活化，然后用10ml无菌水预活化。转移后，将筒柱用7ml 1mg/ml抗坏血酸钠pH 7.0洗涤，用1.0ml乙醇洗脱，然后通过0.22微米过滤器7ml含有7mg抗坏血酸钠的盐水进入无菌产品小瓶中。分离3.6GBq(97mCi)的[18F]-(1R,3S)-3-((6-(5-((((4-(氟)丁基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸，并且通过反相HPLC分析化学特征(共注射非放射性标准品)、放射化学和化学纯度以及比活度。分离的产物与非放射性参考标准品共洗脱。样品是100％放射性化学纯的，97％化学纯的，100％非对映异构体过量，并且比活度为0.15GBq(4mCi)/nmol。使用以下方法使用分析型反相HPLC来确定结构特征、放射化学纯度和化学纯度：柱：Gemini NX C18，5μm，4.6x250mm；流动相：37％乙腈和63％0.1M甲酸铵，含有0.5％乙酸，pH 4.2；流速：2mL/min；同时在251nm处监测UV。
实施例18.[18F]-(1S,3S)-3-((6-(5-((((4-(氟)丁基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸的体外全细胞结合
本发明化合物作为LPA1抑制剂的有效性可以如下在LPA1结合测定中确定：将过表达人LPA1的中国仓鼠卵巢细胞保持在补充有10％胎牛血清和1mg/ml潮霉素(Invitrogen#10687-010)的F12培养基(Gibco#11765)中。在测定当天，将亚融合细胞的150cm2烧瓶用TripLE Express解离试剂(Gibco#12605-010)收获，计数，离心，并且以2x106个细胞/ml重悬于冰冷的结合测定缓冲液(BAB：50mM HEPES pH 7.2，100mM NaCl，2mM EDTA)中。将细胞保存在冰上直到使用。通过以下方式制备测试化合物稀释板：在DMSO中连续稀释测试化合物(在100％DMSO中的2mM储备液，1:3.26稀释度)，然后在BAB中以1:50稀释以产生12个半log测试浓度，最终浓度为4X。在室温下在非结合表面96孔板(Corning#3605)中进行结合测定持续1小时。如下构建测定：将50μl 4X化合物和75μl 18F示踪剂(4000Ci/mmol，最终测定浓度3.8nM)添加到每个孔中，然后通过添加75μl细胞悬浮液(总共150000个细胞/孔)开始测定。在室温下孵育1h后，将板通过在Unifilter-96GF/B过滤板上真空过滤进行收获(Perkin-Elmer#6005177，用在水中的0.3％聚乙烯亚胺预润湿)。将过滤板用350μl PBS/0.01％Triton X-100洗涤3次，并且风干20min。从过滤板上切下单独的过滤盘，并且在γ计数器中计数。通过将数据拟合到4参数逻辑斯蒂方程(GraphPad Prism，圣地亚哥，加利福尼亚州)来确定IC50值。图4示出了19F-未标记的PET示踪剂化合物(A)能够以浓度依赖的方式抑制[18F]-(1S,3S)-3-((6-(5-((((4-(氟)丁基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸结合的与过表达人LPA1受体的CHO细胞的结合(IC50＝24.5nM)。另外，两种其他已知的LPA1选择性化合物(B、C)也能够以浓度依赖的方式与示踪剂竞争，其中IC50值分别为13.9和35.2nM。这些数据证明F-18标记的示踪剂与LPA1结合。
实施例19.用[18F]-(1S,3S)-3-((6-(5-((((4-(氟)丁基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸进行体内PET成像以验证在野生型大鼠和博来霉素治疗的大鼠模型中的靶标表达
测试[18F]-(1S,3S)-3-((6-(5-((((4-(氟)丁基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸以证实在年龄匹配的野生型(Sprague Dawley大鼠，Charles River Laboratory，PA)和博来霉素诱导的肺纤维化大鼠模型中其对LPA1受体的特性、特异性和靶向。在经由口咽滴注施用博来霉素(2μL/g)的麻醉大鼠中产生博来霉素诱导的肺纤维化大鼠模型。对于口咽滴注，将麻醉大鼠(异氟烷，在100％O2中4％)放置在斜板/倾斜工作站上，并且将博来霉素滴到声带上，促进抽吸。然后将大鼠放回其笼中，直到它们完全从麻醉中恢复，并且在实验的持续时间内每天进行监测。在此实验中，测试如以上实施例中所述产生的[18F]-标记的LPA1拮抗剂的其在野生型大鼠的正常肺与博来霉素大鼠疾病模型中肺LPA1表达增加之间进行区分的能力。博来霉素处理的大鼠在博来霉素处理后第14天和第15天使用。在第14天(基线)和第15天(在PET扫描前30分钟施用10mg/kg口服剂量的LPA1拮抗剂进行阻断)采集PET图像。将两组大鼠用于PET成像研究-年龄匹配的野生型大鼠(组1，n＝4)和博来霉素治疗的大鼠(组2，n＝4)。所有动物接受基线PET成像扫描和在单一10mg/kg口服剂量的LPA1拮抗剂后的重复PET成像扫描。对于PET图像采集，将大鼠放置在麻醉诱导室中，并且以1-1.5L/min的速率在100％O2中递送3％异氟烷吸入麻醉。一旦镇静，就将大鼠从诱导室中移出并且放置到在PET系统(
Figure BDA0003020410420000361
F220TM，Siemens Preclinical Solutions，诺克斯维尔，美国田纳西州)的桶架中的plexiglass 2室支架(由BMS-Applied Biotechnology group定制的)中，在研究的持续时间内将它们保留在其中。将1％-1.5％异氟烷吸入麻醉经由鼻锥以2L/min的速率递送在100％O2中来维持麻醉。使用外部独立式温度调节单元(M2M Imaging Corp)将动物保持温暖以防止在成像过程中体温过低。在成像程序过程中连续监测大鼠呼吸，并且根据麻醉深度调整异氟烷。为了最终PET图像的衰减校正和用于感兴趣区域(ROI)分析的肺定位的确认的目的，首先使用57Co点源采集10分钟透射图像。扫描区域的位置从颈部区域开始并且向每只动物的后肢延伸，以便将肺放置在7.6cm microPET系统轴向视野(FOV)内。在透射扫描完成后，每只大鼠经由尾静脉导管接受在19.5-29.7MBq(542-803μCi)之间的[18F]-(1S,3S)-3-((6-(5-((((4-(氟)丁基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸示踪剂的施用，然后进行2小时动态PET发射扫描。
对于阻断研究，在10mg/kg口服剂量的LPA1拮抗剂后30分钟运行相同的方案。使用最大后验概率(MAP)算法重构图像，其中使用收集的透射图像进行衰减校正并且对放射性同位素衰变进行校正。然后使用解剖标志(肺中的空气)和动物支架的边界将PET图像与相应的透射图像共配准。通过Inveon Research Workstation(Siemens Medical SolutionsUSA Inc.，宾夕法尼亚州)分析图像。使用共配准的透射图像对每只大鼠进行分析，其中感兴趣区域(ROI)绘制在每个全肺和肝切片上。存在为每个肺体积(左全肺和右全肺)绘制的3-4个ROI以及在肝切片上绘制的3个ROI。在全肺内部绘制ROI以避免来自心脏和肝脏的溢出信号。用相同的方法在肝脏切片上绘制ROI。基于来自这些ROI(nCi/cc)的定量值，计算注射剂量％/cc(％ID/g)。使用在放射性配体注射后60-90分钟之间的时间段比较这些组中肺组织的放射性示踪剂摄取。使用这种方法，在基线时在肺组织中放射性示踪剂摄取的平均和标准误差(SE)在野生型大鼠(组1)中和在博来霉素治疗的大鼠(组2)中分别是0.080％+/-0.007％注射剂量/克(％ID/g)和0.116％+/-0.011％ID/g。在疾病诱导模型中[18F]-(1S,3S)-3-((6-(5-((((4-(氟)丁基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸的肺摄取代表肺放射性配体信号比在野生型动物中看到的信号增加46％(p<0.05，t-检验：假设方差相等的两个样本)，如表1所示。在用10mg/kg口服剂量的LPA1拮抗剂治疗后在肺组织中的平均放射性配体摄取在野生型大鼠(组1)中和在博来霉素治疗的大鼠(组2)中分别是0.036％+/-0.003％ID/g和0.046％+/-0.001％ID/g。当比较在博来霉素治疗的大鼠和野生型大鼠两者的肺组织的PET放射性配体结合时，当将动物用如表1和图5所示的10mg/kg口服剂量的LPA1拮抗剂预治疗时在肺组织中看到放射性配体结合的显著降低(在博来霉素治疗的大鼠中为61％，p<0.05，并且在野生型动物中为55％，p<0.05，t-检验：假设方差相等的两个样本)。这些结果提供了[18F]-(1S,3S)-3-((6-(5-((((4-(氟)丁基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸对LPA1的特异性和靶向的体内证据。
表1：野生型大鼠和博来霉素治疗的大鼠的采集数据和肺摄取
Figure BDA0003020410420000381
Figure BDA0003020410420000391
图5示出了从在以下中注射[18F]-(1S,3S)-3-((6-(5-((((4-(氟)丁基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸后60-90分钟总结的代表性共配准PET透射和发射图像：A)野生型大鼠，B)博来霉素治疗的大鼠。C)在PET扫描前30分钟用10mg/kg的LPA1拮抗剂治疗的野生型大鼠。D)在PET扫描前30分钟用10mg/kg的LPA1拮抗剂治疗的博来霉素治疗的大鼠。
实施例20：在博来霉素治疗的大鼠模型中用[18F]-(1S,3S)-3-((6-(5-((((4-(氟)丁基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸体内PET成像以确定LPA1拮抗剂的LPA1靶接合
测试[18F]-(1S,3S)-3-((6-(5-((((4-(氟)丁基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸以验证在博来霉素诱导的肺纤维化大鼠模型中使用的LPA1拮抗剂的靶接合。博来霉素诱导的肺纤维化大鼠模型的产生、[18F]-标记的LPA1拮抗剂的产生、PET成像的时间、用于PET成像的动物处理、PET图像的采集、和PET图像的后处理如实施例14中所述。在此实验中，使用[18F]-标记的LPA1拮抗剂来测量在博来霉素治疗的大鼠中在不同口服剂量施用下LPA1拮抗剂的靶接合(或置换％)。对于靶接合研究，将博来霉素治疗的大鼠分为五组：将组1(n＝6)的大鼠用1mg/kg的LPA1拮抗剂预治疗；将组2(n＝6)中的大鼠用3mg/kg预治疗；将组3(n＝6)中的大鼠用10mg/kg预治疗；将组4(n＝7)中的大鼠用30mg/kg预治疗；将组5(n＝6)中的大鼠用100mg/kg预治疗。每只动物在博来霉素治疗后第14天接受基线PET扫描。在第二天(在博来霉素治疗后第15天)，如先前所述，在[18F]-(1S,3S)-3-((6-(5-((((4-(氟)丁基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸施用之前30分钟时和在PET扫描开始时将每组中的动物口服给药LPA1拮抗剂。使用实施例14中描述的方法，针对基线和治疗(阻断)图像两者计算在博来霉素治疗的大鼠的肺组织中放射性示踪剂摄取(％ID/g)的平均值和标准误差。在基线时的测量示踪剂信号是0.12％±0.01％ID/g，组1(1mg/kg)；0.10％±0.01％ID/g，组2(3mg/kg)；0.12％±0.02％ID/g，组3(10mg/kg)；0.09％±0.01％ID/g，组4；0.10％±0.01％ID/g，组5。将这些值与在如表2所示的口服剂量的LPA1拮抗剂后30分钟针对每只大鼠肺组织计算的％ID/g进行比较。[18F]-(1S,3S)-3-((6-(5-((((4-(氟)丁基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸的百分比置换的平均值和标准误差显示出LPA1拮抗剂的剂量依赖性置换：-37.9％±8.7％，组1(1mg/kg)，-48.8％±11.5％，组2(3mg/kg)，-58.9％±7.7％，组3(10mg/kg)，-66.4％±2.3％，组4(30mg/kg)，和-56.0％±2.8％，组5(100mg/kg)。这些结果提供了体内证据，即[18F]-(1S,3S)-3-((6-(5-((((4-(氟)丁基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸可以用于确定LPA1拮抗剂的LPA1靶接合和百分比置换。
表2总结了在基线时和在LPA1拮抗剂治疗后[18F]-标记的拮抗剂的采集数据和肺摄取。
Figure BDA0003020410420000411
Figure BDA0003020410420000421
Figure BDA0003020410420000431
Figure BDA0003020410420000441
图6示出了[18F]-(1S,3S)-3-((6-(5-((((4-(氟)丁基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸在大鼠肺中的百分比置换随预给药多个剂量的LPA1拮抗剂的变化的图形表示。代表的误差条是用LPA1拮抗剂预治疗的各组的标准误差。
实施例21.在非人类灵长类动物中用[18F]-(1S,3S)-3-((6-(5-((((4-(氟)丁基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸进行体内PET成像以确定LPA1拮抗剂的LPA1靶接合。
测试作为LPA1 PET放射性配体的[18F]-(1S,3S)-3-((6-(5-((((4-(氟)丁基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸以验证在正常健康食蟹猴中使用的LPA1拮抗剂的靶接合以及支持此药剂作为PET放射性配体的未来临床用途。在此实验中，进行在正常健康食蟹猴(n＝3)中的特异性结合LPA1、PET成像。在基线时和再次在口服施用LPA1拮抗剂(3、10、和30mg/kg)或仅媒介物溶液(0.5％Methocel A4M：0.1％Tween 80(聚山梨醇酯80)：99.4％水)后采集PET图像。LPA1拮抗剂或媒介物的口服给药时间是在[18F]-标记的拮抗剂注射之前3小时。在成像日的早晨开始将研究中的食蟹猴禁食。兽医科学家在术前用0.02mg/kg阿托品和5mg/kg Telazol、0.1mg/kg氢化吗啡酮IM的混合物诱导初始麻醉。在镇静状态下，准备猴用于经由用异氟烷维持麻醉的成像、插管、安装两个导管(分别是，一个导管在隐静脉中用于注射[18F]-标记的拮抗剂，并且另一个在头静脉中用于盐水输注)以及放置到用于成像的动物支架上。在整个成像研究中连续监测生命体征。首先获得T2加权磁共振图像，以便将来自PET图像的功能信息与来自MRI的解剖信息组合。在PET成像之前在具有呼吸门控的4.7-T MRI仪器(BrukerBiospin，比勒利卡，马萨诸塞州)上获得此研究中的所有MR图像。然后将猴定位在腹部卧位，并且附接常规MRI兼容性监视器。将动物包裹在毯中，并且定位在正交21cm线圈内，用于射频发射和接收。在初始定位(scout)图像之后，使用具有以下参数的Bruker RARE序列采集高分辨率冠状图像：TR/TE＝3100/40ms，FOV＝18cm2，矩阵＝2562，切片厚度＝5mm，获得33个轴向切片，具有四个信号平均值和15分钟的采集时间以从脑覆盖到肺区域。在MRI完成后，将在相同的扩展成像床中的麻醉猴立即从MRI系统输送到microPET系统(
Figure BDA0003020410420000451
F220TM，Siemens Preclinical Solutions，诺克斯维尔，田纳西州)。为了最终PET图像的衰减校正和用于感兴趣区域(ROI)分析的肺定位的确认的目的，首先使用57Co点源采集肺区域的10分钟透射扫描。在透射扫描完成后，然后经由隐静脉向每只猴注射100.3-59.2MBq(2.7-1.6mCi)的[18F]-(1S,3S)-3-((6-(5-((((4-(氟)丁基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸示踪剂，然后采集2小时动态PET发射扫描。对于治疗中(阻断研究)成像，在如较前所述的口服剂量的LPA1拮抗剂或媒介物后3小时，遵循相同的方案。在成像完成后，将猴移出支架以在覆盖的加热垫上进行恢复并且施用补充的氧气。在恢复意识状态后，将猴转移到具有食物和水的隔离室中，直到放射性活度衰变到背景水平。
使用最大后验概率(MAP)算法重构PET图像，其中使用收集的透射图像进行衰减校正并且对放射性同位素衰变进行校正。使用AMIDE软件系统(0.9.1版，amide.sourceforge.net)，在基准和解剖标志的引导下，将PET图像与相应的MRI图像手动共配准。在轴向共配准的PET/MRI中手动绘制两个肺中的ROI。计算平均标准化摄取值(SUV)，将其通过动物体重(kg)和注射放射剂量(mCi)归一化。在基线时，单独动物的平均SUV是0.398(动物B6203)、0.321(动物B7111)、和0.391(动物B7112)。对于从基线研究计算置换％，使用在示踪剂施用后从60-90min的平均SUV，并且对于每只单独动物，与基线值进行比较。表3示出了采集数据、在给药后3h血浆中的LPA1拮抗剂暴露、和每只猴每次成像扫描从60-90min的平均SUV。图7示出了在基线时和在施用媒介物或在3、10和30mg/kg下的LPA1拮抗剂后的代表性PET图像。与基线相比针对每个治疗组计算的百分比置换(平均值±标准误差)如下：7.7％±1.1％(媒介物)、-30.8％±12.0％(3mg/kg LPA1拮抗剂)、-53.7％±3.7％(10mg/kg LPA1拮抗剂)、和-60.3％±7.4％(30mg/kg LPA1拮抗剂)(图6)。这些结果证明，[18F]-(1S,3S)-3-((6-(5-((((4-(氟)丁基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸可以是用于评估LPA1表达和靶接合的可行的PET成像放射性配体。
表3总结了在基线时和在用LPA1拮抗剂预治疗的情况下用[18F]-(1S,3S)-3-((6-(5-((((4-(氟)丁基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸的健康食蟹猴的PET采集数据和肺摄取(从60-90min的平均SUV)。
Figure BDA0003020410420000471
图7示出了在基线时和在施用媒介物或3、10和30mg/kg的LPA1拮抗剂后[18F]-(1S,3S)-3-((6-(5-((((4-(氟)丁基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸在食蟹猴中的代表性PET/MRI图像。
图8示出了在用LPA1拮抗剂或媒介物治疗后[18F]-(1S,3S)-3-((6-(5-((((4-(氟)丁基)(甲基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-1-甲基-1H-1,2,3-三唑-4-基)-2-甲基吡啶-3-基)氧基)环己烷-1-甲酸在食蟹猴肺组织中的百分比置换的图形表示。误差条表示为每组的标准误差。
已经发现，本发明的化合物提供了若干优点和设计特征，这使其成为确定LPA1靶结合和剂量依赖性受体占据率的更有用的PET放射性配体。例如，1)本发明的PET放射性配体具有在5％-11％内的无蛋白质结合的游离级分，从而导致在肺组织内更多放射性配体信号用于定量；2)在注射后90分钟时，其放射性代谢是80％完整的，其中在肺组织中更多放射性配体信号用于LPA1受体的定量；3)它具有改善的肝脏与肺的比率(在野生型大鼠中肝脏与肺的比率达到8:1，在博来霉素治疗的大鼠中为5:1并且在非人类灵长类动物中为7:1)，这导致在肺组织内的信号更可量化；以及4)它具有增加的分离的放射化学产率(370mCi对25mCi)，用氟-18标记(与具有20分钟半衰期的碳-11相比，氟-18具有110分钟的半衰期)，具有更高的有效比活度(5.0mCi/nmol对2.2mCi/nmol)。所有这些因素组合，导致在肺组织内的信号更加可量化。

Claims (14)

1.一种式(I)的放射性标记的化合物：
Figure FDA0003020410410000011
或其药学上可接受的盐，其中：
R2和R3独立地是C1-4烷基；
R5独立地是F、Cl、C1-4烷基或C1-4卤代烷基；并且
n独立地是0、1、2或3。
2.一种式(Ia)的放射性标记的化合物：
Figure FDA0003020410410000012
或其药学上可接受的盐。
3.根据权利要求2所述的放射性标记的化合物，其具有以下结构：
Figure FDA0003020410410000013
或其药学上可接受的盐。
4.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至3中任一项所述的放射性标记的化合物或其药学上可接受的盐；和其药学上可接受的载体。
5.一种对已知LPA1表达的哺乳动物组织进行体内成像的方法，其包括以下步骤：
(a)向哺乳动物物种施用根据权利要求1至3中任一项所述的放射性标记的化合物或其药学上可接受的盐；以及
(b)通过正电子发射断层成像(PET)扫描对所述放射性标记的化合物的分布进行体内成像。
6.一种用于筛选非放射性标记的化合物以确定其占据哺乳动物组织中LPA1受体的结合位点的亲和力的方法，其包括以下步骤：
(a)向哺乳动物物种施用根据权利要求1至3中任一项所述的放射性标记的化合物或其药学上可接受的盐；
(b)通过正电子发射断层成像(PET)对已知LPA1表达的组织进行体内成像以确定所述放射性标记的化合物的基线摄取；
(c)向所述哺乳动物物种施用所述非放射性标记的化合物或其药学上可接受的盐；
(d)向所述哺乳动物物种施用第二剂量的所述放射性标记的化合物；
(e)对所述放射性标记的化合物在所述表达LPA1受体的组织中的分布进行体内成像；
(f)将在所述表达LPA1的组织中在所述基线处来自PET扫描数据的信号与在所述表达LPA1受体的组织中在施用所述非放射性标记的化合物后检索的PET扫描数据进行比较。
7.一种用于监测正在用LPA1受体拮抗剂治疗的哺乳动物患者的治疗的方法，其包括以下步骤：
(a)向所述患者施用根据权利要求1至3中任一项所述的放射性标记的化合物或其药学上可接受的盐；
(b)通过正电子发射断层成像(PET)获得表达LPA1受体的所述患者的组织的图像；以及
(c)检测所述放射性标记的化合物占据所述LPA1受体的结合位点到什么程度。
8.一种用于组织成像的方法，其包括以下步骤：
使含有LPA1受体的组织与根据权利要求1至3中任一项所述的放射性标记的化合物或其药学上可接受的盐接触；以及
使用正电子发射断层成像(PET)成像检测所述放射性标记的化合物。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述放射性标记的化合物是体外检测的。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述放射性标记的化合物是体内检测的。
11.一种用于诊断哺乳动物物种的纤维化疾病的存在的方法，其包括以下步骤：
(a)向有需要的哺乳动物物种施用根据权利要求1至3中任一项所述的放射性标记的化合物或其药学上可接受的盐，所述放射性标记的化合物或其药学上可接受的盐结合至与所述纤维化疾病的存在相关的LPA1受体；以及
(b)获得所述哺乳动物物种的至少一部分的放射图像以检测所述放射性标记的化合物的存在或不存在；其中高于背景的所述放射性标记的化合物的存在和位置指示所述纤维化疾病的存在或不存在。
12.一种用于诊断哺乳动物物种的纤维化疾病的存在的方法，其包括以下步骤：
(a)向有需要的哺乳动物物种施用根据权利要求1至3中任一项所述的放射性标记的化合物或其药学上可接受的盐，所述放射性标记的化合物或其药学上可接受的盐结合至与所述纤维化疾病的存在相关的LPA1受体；
(b)检测针对所述哺乳动物物种的所述放射性标记的化合物的放射性发射；
(c)将来自针对所述哺乳动物物种的所述放射性标记的化合物的放射性发射与标准值进行比较；以及
(d)找到针对所述哺乳动物物种检测到的放射性发射相比于标准值之间的任何显著偏差，并且将所述偏差归因于所述纤维化疾病。
13.根据权利要求11或权利要求12所述的方法，其中所述纤维化疾病是特发性肺纤维化。
14.一种用于定量哺乳动物物种的患病细胞或组织的方法，其包括以下步骤：
(a)向具有患病细胞或组织的哺乳动物物种施用根据权利要求1至3中任一项所述的放射性标记的化合物或其药学上可接受的盐，所述放射性标记的化合物或其药学上可接受的盐结合至位于所述患病细胞或组织内的LPA1受体；以及
(b)检测所述患病细胞或组织中所述放射性标记的化合物的放射性发射，其中所述放射性发射在所述患病细胞或组织中的水平和分布是所述患病细胞或组织的定量测量。
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