CN113248595A - 一种蛋白质长期保存的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种蛋白质长期保存的方法，通过将蛋白类药物溶解后，加入两亲性聚合物混悬液，充分混匀，纯化，得到受聚合物保护的蛋白类药物溶液。该方法既不破坏蛋白类药物原本的蛋白质结构，也不会阻碍蛋白类药物的药效，很好地解决了蛋白类普遍存在常温下贮存期短易变性变质的问题。该方法还是一种普适性的提高蛋白类药物的热稳定性的方法，显著改善了蛋白类药物的热稳定性，将扩展其在生物医药方面的应用，具有广阔的应用前景。

Description

一种蛋白质长期保存的方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，更具体地，涉及一种提高蛋白类药物热稳定性的方法。
背景技术
在生物医药方面，蛋白类药物(疫苗、激素、细胞因子等)普遍存在常温下贮存期短的问题，通常在贮存运输过程中需要冷链保护，这导致了其较高的市场价格，改善这些药物的热稳定性，将扩展其在发展中国家的应用；在酶工程中，蛋白质作为生物催化剂，经常需要耐受高温的反应条件，若能提高其在高温中的稳定性，将大大提高反应效率，使酶催化这种绿色、经济、可持续的工业生产方式得到更为广泛的应用；在食品工业中，食品蛋白质在加工、贮藏过程中不可避免的要遭受热的影响，例如高温灭菌过程，在这些过程中尽量减少蛋白质的劣化，保留其营养价值具有重要意义。大多数蛋白质的这种热不稳定性的缺点是阻碍其在生物医药、酶工程、食品工业等应用的重要因素之一，因此，对蛋白质热不稳定性的改进一直以来是一个重点和难点。因此，急需一种具有普适性的蛋白质，特别是蛋白药物长期保存的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有普适性的蛋白质长期保存的方法。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供两亲性聚合物在制备可长期保存的蛋白制剂中的应用，所述两亲性聚合物由疏水性高分子材料与水性高分子材料聚合而成。
优选地，所述疏水性高分子材料为聚马来酸酐、聚(马来酸酐-十八碳烯)、聚(马来酸酐- 十二碳烯)、聚(马来酸酐-十四碳烯)或聚(马来酸酐-十六碳烯)中的至少一种；
所述亲水性高分子材料优选为聚乙二醇、聚氧乙烯、mPEG-NH2-400、mPEG-NH2-600、mPEG-NH2-800、mPEG-NH2-1000、mPEG-NH2-2000、mPEG-NH2-4000或mPEG-NH2-5000 中的至少一种。
更优选地，所述疏水性高分子材料为聚马来酸酐、聚(马来酸酐-十八碳烯)；
所述亲水性高分子材料为聚乙二醇。
进一步地，根据本发明第一个方面所述的方法，所述两亲性聚合物的亲水性高分子材料与疏水性高分子材料的嫁接摩尔比为(1:10)～(2:1)；更优选为(1:10)～(1:1)。
进一步地，根据本发明第一个方面所述的方法，所述两亲性聚合物的制备方法为将疏水性高分子材料溶解于有机溶剂中，加入亲水性高分子材料混合反应，除去反应体系中的有机溶剂和其他杂质，制得两亲性聚合物混悬液。
优选地，其中，所述二甲基亚砜和纯水的体积比为1:(8～12)。
更优选地，所述二甲基亚砜和纯水的体积比为1:10。
本发明的第二个方面，提供一种蛋白制剂，由蛋白质与本发明第一个方面所述的两亲性聚合物混合而成。
本发明的第三个方面，提供一种蛋白质长期保存的方法，将蛋白质溶解后，逐滴滴加本发明第一个方面所述的两亲性聚合物的混悬液；搅拌均匀后纯化。
进一步地，根据本发明第三个方面所述的方法，所述搅拌为在磁力搅拌器上充分混匀。
优选地，磁力搅拌器的转速为350～450rpm，搅拌时间为1.5～2.5h。
更优选地，磁力搅拌器的转速为400rpm，搅拌时间为2h。
进一步地，根据本发明第三个方面所述的方法，所述纯化为将加入两亲性聚合物的混悬液的蛋白质混合物在纯水中透析。
优选地，透析截留分子量为3500～100000Da。
更进一步地，根据本发明第三个方面所述的方法，纯化后冻干，制成蛋白质固体制剂。
进一步地，根据本发明第三个方面所述的方法，所述蛋白类药物包括蛋白类疫苗、酶、激素和细胞因子中的至少一种。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种蛋白质长期保存的方法，既不破坏蛋白类药物原本的蛋白质结构，也不会阻碍蛋白类药物的药效，很好地解决了疫苗、激素、细胞因子等普遍存在常温下贮存期短易变性变质的问题。进一步地解决了疫苗、激素、细胞因子等蛋白类药物通常在贮存运输过程中需要冷链保护，从而导致了其较高的市场价格。本发明提供了一种普适性的提高蛋白类药物的热稳定性的方法，显著改善了这些药物的热稳定性，将扩展其在生物医药方面的应用，具有广阔的应用前景。
通过本发明方法制备得到的蛋白质药物实现了疫苗等药物在常温下保存并维持其药物活性，从而避免了在贮存运输过程中需要严格的冷链运输保护的条件，这导致了其较高的市场价格和应用技术门槛，本发明改善这些疫苗的热稳定性，推动生物医药技术的进步，将大大拓展该技术其在生物医药方面的应用。
本发明提供的蛋白质长期保存的方法，操作简单，参数可控，重现性良好。相比于对蛋白氨基酸序列进行化学修饰，反应在水环境中进行，条件温和，对初始蛋白的结构影响小。与现有技术相比，该方法没有涉及对蛋白一级结构进行改造，因此最大程度上保留蛋白原始活性。同时，该方法对蛋白没有具体要求，基于蛋白普遍表面具有亲疏水性位点，两亲性聚合物可与大多数蛋白通过疏水作用力进行结合，从而产生高温保护作用。因此，该方法适用于大多数蛋白质，具备实际应用价值，可以广泛应用在蛋白质，RNA药物，DNA药物等大分子药物的常温，高温条件下的保存。
附图说明
图1不同比例PEG嫁接的两亲高分子聚合物表征结果。A：傅立叶变换红外吸收光谱图； B：不同嫁接比例的两亲性聚合物的核磁表征。其中1.1-1.3ppm：C18链的CH2；3.8-3.5ppm： PEG的CH2。
图2水相中两亲性聚合物自组装成胶束的粒径大小。
图3水相中两亲性聚合物自组装成胶束的电势。
图4高热稳定的牛血清白蛋白的耐高温能力。其中A图为照片，B图为圆二色谱检测结果，C图为远紫外检测结果。
图5受聚合物保护的牛血清白蛋白的长期稳定性。A图为圆二色谱检测结果，B图为蛋白质在室温条件下不同放置时间后蛋白结构的变化图。
图6受聚合物保护的肌红蛋白的稳定性。
图7受聚合物保护的转铁蛋白的稳定性。
具体实施方式
下面结合具体实施例与附图进一步说明本发明的技术方案。下述实施例仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的试剂原料为常规市购或商业途径获得的试剂原料。除非特别说明，下述实施例中使用的系统为本领域常规使用的设备。
聚(马来酸酐-ALT-1-十八碳烯)，Poly(Maleic anhydride-alt-1-octadecene)，PMHC18，分子量10～100kDa。
1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐 (1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC)。
蛋白类药物热稳定性分析的检测方法：
将纯化后的受聚合物保护的疫苗等大分子药物溶液浓度稀释成0.25mg/mL。同时设置 0.25mg/mL的单疫苗等大分子药物溶液作为阴性对照组。分别取500μL样品于1mL离心管中, 放置于金属浴中进行热处理。金属浴的温度设置为30～100℃，样品在每隔10℃下放置5min。进行热处理后的样品放置室温过夜，用圆二色光谱仪(CD spectrometer)扫描波长范围190～ 260nm来检测疫苗等大分子药物二级结构随处理温度的变化情况。
实施例1两亲性聚合物的制备
按照以下步骤制备两亲性聚合物：
S01.将疏水性高分子材料溶解于有机溶剂中，加入亲水性高分子材料混合反应，除去反应体系中的有机溶剂和其他杂质，得混合物A；
S02.将混合物A用水复溶，纯化后收集产物即得。
S03.收集透析后产物，-80℃冷冻过夜，随后在冻干机上冻干，即得到白色絮状物质。
亲水性高分子材料包括聚乙二醇、聚氧乙烯、mPEG-NH2-400、mPEG-NH2-600、mPEG-NH2-800、mPEG-NH2-1000、mPEG-NH2-2000、mPEG-NH2-4000、mPEG-NH2-5000 或mPEG-NH2-10000中的至少一种；本实施例中选用聚乙二醇。
疏水性高分子材料优选包括聚马来酸酐、聚(马来酸酐-十八碳烯)、聚(马来酸酐-十二碳烯)、聚(马来酸酐-十四碳烯)或聚(马来酸酐-十六碳烯)中的至少一种；本实施例中选用聚(马来酸酐-十八碳烯)。
有机溶剂一般选用二氯甲烷、二甲基亚砜、丙酮、乙醇，本实施例中选用二氯甲烷。
亲水性高分子材料与疏水性高分子材料的嫁接比例PmMn为(1:10)～(2:1)，分别制备得到P1M10、P1M5、P2M1、P1M1、P2M1五种不同嫁接比例的两亲性高分子聚合物。
检测所制备的两亲性高分子聚合物的试剂PEG化程度，结果如下表1所示。
表1两亲性聚合物的试剂PEG化程度
Figure RE-GDA0003108270030000041
图1为不同比例PEG嫁接的两亲性聚合物的表征结果，图1中A的虚线框中的部分为两亲性聚合物的特征峰，从图中可以看出反应后有PEG的特征峰，说明两亲聚合物顺利接上了 PEG。
表征所制备的两亲高分子，核磁表征结果如附图1中B所示；其中1.1-1.3ppm：C18链的CH2；3.8-3.5ppm：PEG的CH2。结果说明该高分子在水相中具有优异的蛋白药物包裹效率，并且在生理环境下能够缓慢释放出蛋白药物，从而使蛋白药物发挥持续的作用。
实施例2两亲性聚合物的制备以及自组装情况检测
按照以下步骤制备两亲性聚合物
S01.将聚(马来酸酐-ALT-1-十八碳烯)溶解于有机溶剂中，按比例加mPEG-NH2混合反应，除去反应体系中的有机溶剂和其他杂质，得混合物A；
S02.将混合物A用水复溶，装入透析袋在纯水中进行透析；
S03.收集透析后产物，-80℃冷冻过夜，随后在冻干机上冻干，即得到白色絮状物质。
有机溶剂一般选用二氯甲烷、二甲基亚砜、丙酮、乙醇，本实施例中选用二氯甲烷。
mPEG-NH2与聚(马来酸酐-ALT-1-十八碳烯)的嫁接比例PmMn为(1:10)～(2:1)，分别制备得到P1M10、P1M5、P2M1、P1M1、P2M1五种不同嫁接比例的两亲性聚合物。
通过DLS方法检测不同嫁接比例的两亲性聚合物的自主装胶束的粒径。
将聚合物溶解在纯水中，随后，将这些两亲性聚合物溶液进行超声处理15分钟，使其分散均匀。DLS测量是在马尔文纳米粒子粒度仪(Nano S Zetasizer Nano系列仪器)上进行的。仪器的测试温度设置为25℃，溶剂选择水，参照物选择聚合物。在每次测试之前，平衡时间为120秒。每个样品重复测试6次，取平均值作为最终测量结果。
图2为不同嫁接比例的两亲性聚合物在水相中自组装成胶束的粒径大小，可以看出，这些两亲性聚合物可在水中自组装形成纳米胶束，且在嫁接比例P1M10～P2M1的范围内，所述两亲性聚合物自组装成纳米胶束的粒径在20～150nm之间。
通过Zeta方法检测同嫁接比例的两亲性聚合物的自主装胶束的电势，结果见图2。
从图3中可以看，随着与聚合物共价的PEG密度的增加，这些纳米颗粒显示出逐渐降低的Zeta电势，产生这一现象的原因可能是聚合物上的羧基数目逐渐减少导致的电负性减小，或是随PEG链密度增加而产生的屏蔽效应，说明PEG化的聚合物能够自组装成胶束，且降低制剂的电荷，适合应用于生物体内。
实施例3牛血清白蛋白长期保存的方法
(1)将牛血清白蛋白溶于水中，得到牛血清白蛋白水溶液；将步骤(1)所述两亲性聚合物P1M10和助溶剂(DMSO)溶于水中，得到两亲性聚合物混悬液。
(2)将步骤(1)所述的两亲性聚合物混悬液按照质量比2:1逐滴滴加入牛血清白蛋白水溶液中，在磁力搅拌器上搅拌至澄清，搅拌转速约400rpm，搅拌约2h。
(3)将步骤(2)得到的蛋白-聚合物混合溶液进行透析纯化，选择对应截留分子量的透析袋，除去未与聚合物结合的蛋白，得到所述的高热稳定的牛血清白蛋白。
通过目测法检测所制备的高热稳定的牛血清白蛋白的耐高温能力。
将白蛋白，受聚合物保护的白蛋白分别在不同温度下加热一段时间，然后再转移到96孔板，观察形态变化，并拍照。
结果见图4，从图4中A中可以看出，没有受两亲性聚合物保护的牛血清白蛋白在55℃开始出现明显的浑浊，说明蛋白开始变性并开始析出沉淀，随着温度的升高，白色絮状沉淀越发明显。而受两亲性聚合物保护的牛血清白蛋白在37℃～100℃的条件下都保持澄清透明。说明两亲性聚合物对蛋白具有良好的保护作用。
图4中B为没有受两亲性聚合物保护的牛血清白蛋白和受两亲性聚合物保护的牛血清白蛋白在不同温度条件下圆二色谱的检测结果，说明受两亲性聚合物保护的牛血清白蛋白二级结构没有发生变化，高温条件下两亲性聚合物能够保护蛋白的二级结构不受破坏。
图4中C为没有受两亲性聚合物保护的牛血清白蛋白和受两亲性聚合物保护的牛血清白蛋白在不同温度条件下远紫外的检测结果。说明受两亲性聚合物保护的牛血清白蛋白三级结构没有发生变化，高温条件下两亲性聚合物能够保护蛋白的三级结构不受破坏。
表2高温孵育后P1M10保护下的牛血清白蛋白(BSA)的二级结构含量
Figure RE-GDA0003108270030000061
从结果中可以看出聚合物保护的BSA在高温处理后和未经过聚合物保护的BSA相比具有结构完整性，说明聚合物保护的BSA在高温下能够维持BSA的结构稳定性。
采用相同的方法，也制备了P1M5保护下的牛血清白蛋白(BSA)，结果见附图5，从图中可以看出P1M5保护下的牛血清白蛋白(BSA)在刚刚制备到2个月的时间里，相比没有P1M5保护下的牛血清白蛋白(BSA)具有更稳定的性质，二级结构不会发生明显变化，可以保持原本的功能/作用。
实施例4耐高温肌红蛋白的制备
将肌红蛋白溶于纯水中，将实施例2中的两亲性聚合物P1M5混悬在二甲基亚砜和纯水 1:10(v:v)的混合溶剂中，形成P1M5混悬液。随后利用移液枪吸取P1M5混悬液逐滴滴加至肌红蛋白大分子溶液中，在磁力搅拌器(转速为400rpm)上搅拌2h。反应结束后，将得到的溶液装入截留分子量为100000Da的透析袋在纯水中进行透析，每2～3h更换新的纯水，透析一天，除去未参与反应的蛋白质大分子和助溶剂二甲基亚砜。即得到受聚合物保护的肌红蛋白溶液。
两亲性聚合物P1M5由mPEG-NH2和聚(马来酸酐-ALT-1-十八碳烯)聚合而成。具体来说，将mPEG-NH2和聚(马来酸酐-ALT-1-十八碳烯)加入二氯甲烷中，并且加入催化剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和三乙胺。在反应容器中按比例投料进行反应，磁力搅拌器上搅拌，转速约800rpm，反应约24h，得到的反应产物进行纯化、冻干制得。
通过上文中提供的蛋白类药物热稳定性分析的检测方法检测所制备的受聚合物保护的肌红蛋白的耐高温能力。
结果见附图6，从图中可以看出两亲性聚合物保护的肌红蛋白二级结构没有发生变化，高温条件下两亲性聚合物能够保护肌红蛋白的二级结构不受破坏。根据结果可知在30～ 100℃的温度范围内，受聚合物保护的蛋白质大分子相比于单纯蛋白质大分子的特征峰处没有明显的变化，即受聚合物保护的蛋白质大分子的二级结构没有明显变化。由此可说明该方法显著提高了蛋白质大分子的热稳定性，因此可以在常温或高温下长期保存。
实施例5耐高温转铁蛋白的制备
将转铁蛋白溶于纯水中，将两亲性聚合物P1M5混悬在二甲基亚砜和纯水1:10(v:v)的混合溶剂中，形成P1M5混悬液。随后利用移液枪吸取P1M5混悬液逐滴滴加至转铁蛋白大分子溶液中，在磁力搅拌器(转速为400rpm)上搅拌2h。反应结束后，将得到的溶液装入截留分子量为100000Da的透析袋在纯水中进行透析，每2～3h更换新的纯水，透析一天，除去未参与反应的蛋白质大分子和助溶剂二甲基亚砜。即得到受聚合物保护的转铁蛋白溶液。
两亲性聚合物P1M5由mPEG-NH2和聚(马来酸酐-ALT-1-十八碳烯)聚合而成。具体来说，将mPEG-NH2和聚(马来酸酐-ALT-1-十八碳烯)加入二氯甲烷中，并且加入催化剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和三乙胺。在反应容器中按比例投料进行反应，磁力搅拌器上搅拌，转速约800rpm，反应约24h，得到的反应产物进行纯化、冻干制得。
通过上文中提供的光谱法检测所制备的耐高温转铁蛋白的耐高温能力。
结果见附图7，从图中可以看出两亲性聚合物保护的转铁蛋白的二级结构没有发生变化，高温条件下两亲性聚合物能够保护转铁蛋白的二级结构不受破坏。
根据结果可知在30～100℃的温度范围内，受聚合物保护的蛋白质大分子相比于单纯蛋白质大分子的特征峰208nm处没有明显的变化，即受聚合物保护的蛋白质大分子的二级结构没有明显变化。由此可说明该方法显著提高了蛋白质大分子的热稳定性，因此可以在常温或高温下长期保存。
经过上述实施例验证，说明实施例1或2中提供的聚合物具有很好的蛋白质包裹效率，该聚合物保护的蛋白的二级结构不会发生变化，高温条件下两亲性聚合物能够保护蛋白的二级结构不受破坏；同时可以在常温，甚至高温条件下保存。该方法也可以应用于提高其他蛋白质大分子的热稳定性，受聚合物保护的蛋白质大分子的二级结构不会发生明显变化，可以保持原本的功能/作用。因此该聚合物是一种具有普适性的包裹蛋白质的聚合物，可以用于制备各种类型的蛋白质固体制剂，包括但不限于蛋白药物、蛋白类疫苗、酶、激素和细胞因子。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.两亲性聚合物在制备可长期保存的蛋白制剂中的应用，所述两亲性聚合物由疏水性高分子材料与水性高分子材料聚合而成；
其中，所述疏水性高分子材料为聚马来酸酐、聚(马来酸酐-十八碳烯)、聚(马来酸酐-十二碳烯)、聚(马来酸酐-十四碳烯)或聚(马来酸酐-十六碳烯)中的至少一种；
所述亲水性高分子材料优选为聚乙二醇、聚氧乙烯、mPEG-NH2-400、mPEG-NH2-600、mPEG-NH2-800、mPEG-NH2-1000、mPEG-NH2-2000、mPEG-NH2-4000、mPEG-NH2-5000或mPEG-NH2-10000中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述两亲性聚合物的亲水性高分子材料与疏水性高分子材料的嫁接摩尔比为(1:10)～(2:1)；优选为(1:10)～(1:1)。
3.根据权利要求1或2所述的应用，所述两亲性聚合物的制备方法为将疏水性高分子材料溶解于有机溶剂中，加入亲水性高分子材料混合反应，除去反应体系中的有机溶剂和其他杂质，制得两亲性聚合物混悬液。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述两亲性聚合物混悬液为两亲性聚合物在二甲基亚砜和纯水的混合溶剂中的混悬液；
其中，所述二甲基亚砜和纯水的体积比优选为1:(8～12)，最优选为1:10。
5.一种蛋白制剂，由蛋白质与权利要求1至4中任一项所述的两亲性聚合物混合而成。
6.一种蛋白质长期保存的方法，其特征在于，将蛋白质溶解后，逐滴滴加权利要求1至4中任一项所述的两亲性聚合物的混悬液；搅拌均匀后纯化。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述搅拌为在磁力搅拌器上充分混匀，磁力搅拌器的转速优选为350～450rpm，搅拌时间优选为1.5～2.5h。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述纯化为将加入两亲性聚合物的混悬液的蛋白质混合物在纯水中透析，透析截留分子量优选为3500～100000Da。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，纯化后冻干，制成蛋白质固体制剂。
10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述蛋白质包括蛋白类疫苗、酶、激素和细胞因子中的至少一种。
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马庆溪: "基于聚乙二醇修饰的铂纳米粒的肿瘤成像和联合治疗的应用研究", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(博士)工程科技Ⅰ辑》 *
马庆溪: "基于聚乙二醇修饰的铂纳米粒的肿瘤成像和联合治疗的应用研究", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(博士)工程科技Ⅰ辑》, no. 6, 15 June 2020 (2020-06-15), pages 27 *

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