CN113248570A - 一种抗菌肽ht11及其衍生物和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种抗菌肽HT11及其衍生物和应用，属生物技术领域；所述抗菌肽HT11的序列为：Arg‑Arg‑Leu‑{D‑Phe}‑Arg‑Arg‑Ile‑Leu‑Arg‑Trp‑Leu‑NH2；所述抗菌肽HT11分子量小，氨基酸组成简单，便于大规模合成，对Vero细胞毒性较低，基本不具溶血性，因此安全性高；抗菌肽HT11耐高温，在pH2‑7范围内可保持稳定；所述抗菌肽HT11及其衍生物可有效抑制食源性病原菌、腐败菌在食品表面的污染，可有效杀灭进入MAC‑T细胞内的金黄色葡萄球菌，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和多种镰刀菌也具有抑制作用，因此在针对以上病原菌引起的动植物感染防控中具有较好应用潜力。

Description

一种抗菌肽HT11及其衍生物和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种抗菌肽HT11及其衍生物和应用。
背景技术
抗生素在动物养殖及人类疾病防控方面发挥了重要作用，但是随着抗生素的广泛使用甚至滥用，细菌产生了严重的耐药性问题。细菌耐药性不仅影响临床治疗的效果，而且对食品安全、公共卫生和人类健康造成危害，成为当前与人类健康、经济发展、人类重大疫病流行密切相关的社会问题。因此，遏制细菌耐药性蔓延的紧迫性和必要性已成为全球科学家的共识，寻找和开发新型抗生素或其替代品成为近年来领域内科学研究的热点与前沿。目前应用于畜牧养殖业的抗生素替代品主要包括有机酸、酶制剂、低聚糖、噬菌体、中草药和微生态制剂等，但这些替代品生产成本较高，对病原微生物的抑制效果较差，在实际生产应用中并不能完全替代抗生素。
近年来，抗菌肽由于具有不同的作用靶点、独特的抗菌机制、且不易产生耐药性等优点引起了广泛的关注。抗菌肽广泛存在于多种生物，是生物体内诱导产生的具有生物活性的小分子多肽。抗菌肽分子量约为2000～7000道尔顿，由20～60个氨基酸残基组成，这类活性多肽普遍具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌等特点。目前科学家已经筛选出多个对微生物具有抑制作用的多肽，如阳离子肽(Cathelicidin)、蛙皮素(magainins)、天蚕素(cecropins)、蜂毒肽(mellitin)和防御素(defensins)等。以上抗菌肽的氨基酸个数多大于20，制备或合成的成本较高，实际生产中需要设计出氨基酸数量相对较少，同时又具有高效抗菌活性的多肽。中国农业大学刘源等设计了具有7个氨基酸的抗菌脂肽bacaucin的衍生物，其对金黄色葡萄球菌表现出较好的抗菌活性，MIC大小为4-16μg/mL，然而该类抗菌肽仅对部分革兰氏阳性细菌具有抗菌作用，对大部分革兰氏阴性细菌作用较差。在人医及兽医临床中革兰氏阴性细菌是耐药基因最主要的宿主，由多重耐药革兰氏阴性细菌(如碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌和大肠杆菌、粘菌素耐药的肠杆菌科细菌以及产超广谱β-内酰胺酶的肠杆菌科细菌)引起的感染对临床治疗造成严峻挑战。同时，临床感染多为混合感染，由革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌以及真菌等共同造成，并且某些细菌如金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和结核杆菌等可在机体细胞内定植，造成胞内感染，以躲避抗生素的直接杀灭作用。
因此，针对以上问题，亟需开发出一种抗菌谱广(能够同时针对革兰氏阳性、阴性细菌和真菌感染)，同时能够针对胞内菌感染，并且安全性较高的抗菌短肽。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗菌肽HT11及其衍生物和应用，以解决上述现有技术存在的问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种抗菌肽HT11，所述抗菌肽HT11的序列为：
Arg-Arg-Leu-{D-Phe}-Arg-Arg-Ile-Leu-Arg-Trp-Leu-NH2；
其中，所述Phe为D型氨基酸。
本发明还提供一种根据所述的抗菌肽HT11的衍生物，所述衍生物包括HT11-1X,HT11-D,HT11-(PEG)n或HT11-Cyc；
所述HT11-1X为所述抗菌肽HT11的第一位氨基酸被其它氨基酸取代得到的多肽；
所述HT11-D为所述抗菌肽HT11的任意一个或多个氨基酸转换为D型而得到的多肽；
所述HT11-(PEG)n为所述抗菌肽HT11的氨基端进行PEG修饰后的物质，其中n≥2；
所述HT11-Cyc为所述抗菌肽HT11的氨基端和羧基端进行连接得到的环状多肽。
本发明还提供一种抗菌肽HT11的应用，所述应用包括下列任一项：
(1)根据所述的抗菌肽HT11在抑制和/或杀灭细菌和/或真菌中的应用；
(2)根据所述的抗菌肽HT11在制备抑制和/或杀灭细菌和/或真菌产品中的应用；
(3)根据所述的抗菌肽HT11在制备治疗皮肤感染的产品中的应用；
(4)根据所述的抗菌肽HT11在制备细胞内杀菌产品中的应用；
(5)根据所述的抗菌肽HT11在清除细菌生物被膜中的应用；
(6)根据所述的抗菌肽HT11在制备清除细菌生物被膜产品中的应用；
(7)根据所述的抗菌肽HT11在消毒防腐中的应用；
(8)根据所述的抗菌肽HT11在预防和/或治疗小麦赤霉病中的应用。
进一步的，所述皮肤感染是由细菌引起的皮肤感染。
进一步的，所述小麦赤霉病为真菌引起的小麦赤霉病。
本发明还提供一种根据所述的衍生物的应用，所述应用包括下列任一项：
(1)根据所述的衍生物在抑制和/或杀灭细菌和/或真菌中的应用；
(2)根据所述的衍生物在制备抑制和/或杀灭细菌和/或真菌产品中的应用；
(3)根据所述的衍生物在制备治疗皮肤感染的产品中的应用；
(4)根据所述的衍生物在制备细胞内杀菌产品中的应用；
(5)根据所述的衍生物在清除细菌生物被膜中的应用；
(6)根据所述的衍生物在制备清除细菌生物被膜产品中的应用；
(7)根据所述的衍生物在消毒防腐中的应用；
(8)根据所述的衍生物在预防和/或治疗小麦赤霉病中的应用。
进一步的，所述皮肤感染是由细菌引起的皮肤感染。
进一步的，所述小麦赤霉病为真菌引起的小麦赤霉病。
本发明还提供一种清除细菌生物被膜的方法，所述方法为：将所述的抗菌肽HT11或者所述的衍生物与细菌混合。
本发明还提供一种抑制微生物生长的方法，所述方法为：将所述的抗菌肽HT11或者所述的衍生物与微生物混合。
本发明公开了以下技术效果：本发明公开的抗菌肽HT11及其衍生物对细菌和真菌均具有抑制作用，最小抑菌浓度为3-25μg/mL；HT11分子量小，氨基酸组成简单，便于大规模合成，且对Vero细胞毒性较低，基本不具有溶血性，因此安全性较高。此外，抗菌肽HT11耐高温，在pH2-7范围内可以保持稳定。本发明的小分子抗菌肽HT11不仅可以有效地抑制食源性病原菌、腐败菌在食品表面的污染，同时可以有效杀灭进入MAC-T细胞内的金黄色葡萄球菌，对于小鼠浅表皮肤感染的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和引起小麦赤霉病的多种镰刀菌也具有较好的抑制作用，因此在针对以上病原菌引起的动植物感染防控中具有较好的应用潜力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例3中抗菌肽HT11的细胞毒性实验结果；
图2为实施例4中抗菌肽HT11的细菌生物被膜清除实验结果；
图3为实施例5中抗菌肽HT11的细胞内杀菌实验结果；
图4为实施例6中抗菌肽HT11对食品表面微生物的消毒及防腐实验结果；
图5为实施例7中抗菌肽HT11治疗小鼠浅表皮肤细菌感染实验结果；
图6实施例8中抗菌肽HT11抑制植物病原菌镰刀菌的实验结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
本发明所使用的材料、仪器及试剂如无特殊说明，均可由商业途径获得；所使用的实验方法如无特殊说明，均为本领域常规实验方法。
以下实施例中使用的菌的来源：金黄色葡萄球菌ATCC29213和ATCC33591、大肠杆菌ATCC25922、表皮葡萄球菌ATCC29887、无乳链球菌ATCC13813、单增李斯特菌ATCC19115、沙门氏菌ATCC14028、空肠弯曲菌ATCC 33291、蜡样芽孢杆菌ATCC14579、腐败希瓦氏菌ATCC49138、白色念珠菌ATCC10231购买自美国典型培养物保藏中心(ATCC),粪肠球菌JH2-2、粪肠球菌32(optrA),致病性大肠杆菌A3(O157：H7),大肠杆菌XG-E1(NDM-5+mcr-1)，大肠杆菌47EC(tet(X4)),肺炎克雷伯氏菌XG-Kpn03(NDM-5),鲍曼不动杆菌34AB(tet(X3)),铜绿假单胞菌42，荧光假单胞菌AC04和尖孢镰刀菌LD21来自本实验室分离保藏的菌株。
实施例1抗菌肽HT11及衍生物的制备与抗微生物活性测定
1.1抗菌肽HT11及其衍生物的制备
抗菌肽HT111的化学分子式如式1所示，其中D代表氨基酸为D型，其它默认为L型,并且HT11的羧基端进行了一个氨基的修饰，Arg-Arg-Leu-{D-Phe}-Arg-Arg-Ile-Leu-Arg-Trp-Leu-NH2(式1)(SEQ ID NO：1)。
选择抗菌肽HT11及其衍生物HT11-1M，HT-1A,HT-1D,HT-2D,HT-3D,HT-5D,HT-6D,HT-7D,HT-8D,HT-9D,HT-10D,HT-11D,HT11-All-D，HT11-(PEG)2和HT11-Cyc作为考察对象，其中HT-1M,HT-1A为HT11的第一位氨基酸分别被替代为甲硫氨酸和丙氨酸的物质，HT-1D,HT-2D,HT-3D,HT-5D,HT-6D,HT-7D,HT-8D,HT-9D,HT-10D,HT-11D,HT11-All-D分别为HT11的第1位，第2位，第3位，第5位，第6位，第7位，第8位，第9位，第10位，第11位及所有位氨基酸转换为D型的物质，HT11-(PEG)2为HT11的氨基端进行了一个(PEG)2修饰的产物，HT11-Cyc为HT11的氨基端第一个氨基酸和羧基端最后一个氨基酸进行连接而形成的环状多肽。所有多肽委托南京金斯瑞生物科技公司通过固相合成方式进行合成，合成的抗菌肽HT11的纯度＞99％，并且易溶解于纯水中。
1.2抗菌肽HT11及其衍生物的抗微生物活性测定
将抗菌肽溶解在纯水中配制成1mg/mL的母液，参照美国临床实验室标准化协会(CLSI)推荐的微量肉汤稀释法测试其对多种微生物的最小抑菌浓度(MIC)。其中HT11测试的菌株包括多种标准菌株和临床多重耐药菌株，如金黄色葡萄球菌ATCC29213和ATCC33591,表皮葡萄球菌ATCC29887，粪肠球菌JH2-2,粪肠球菌32(optrA),无乳链球菌ATCC13813,单增李斯特菌ATCC19115，大肠杆菌ATCC25922,致病性大肠杆菌A3(O157：H7),大肠杆菌XG-E1(NDM-5+mcr-1)，大肠杆菌47EC(tet(X4)),沙门氏菌ATCC14028,肺炎克雷伯氏菌XG-Kpn03(NDM-5),空肠弯曲菌ATCC 33291，鲍曼不动杆菌34AB(tet(X3)),铜绿假单胞菌42，蜡样芽孢杆菌ATCC14579,荧光假单胞菌AC04，腐败希瓦氏菌ATCC49138，白色念珠菌ATCC10231，尖孢镰刀菌LD21。为了评价HT11衍生物的抗菌活性，选择典型革兰氏阳性细菌(金黄色葡萄球菌ATCC29213)，革兰氏阴性菌(大肠杆菌ATCC25922),腐败菌(腐败希瓦氏菌ATCC 49138)，真菌(白色念珠菌ATCC10231和尖孢镰刀菌LD21)作为测试菌株。结果表明抗菌肽HT11对各种微生物，包括革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、腐败菌和真菌均具有较好的抑制作用，MIC范围为3-25μg/mL(表1)；抗菌肽衍生物HT-1M,HT-1A,HT-All-D,HT-(PEG)2对典型微生物的MIC与HT11相比没有明显变化，而衍生物HT11-D(HT11-1D,HT11-2D,HT11-3D,HT11-5D,HT11-6D,HT11-7D,HT11-8D,HT11-9D,HT11-10D,HT11-11D)和HT11-cyc对典型微生物的MIC与HT11相比均有所升高，说明以上衍生物的抗菌活性较HT11稍差(表2)。
表1抗菌肽HT11对多种微生物的MIC
菌株 携带耐药基因 MIC(μg/mL)
金葡菌ATCC29213 - 3
金葡菌ATCC33591 mecA 6
表皮葡萄球菌ATCC29887 - 3
粪肠球菌JH2-2 - 12
粪肠球菌32 optrA 12
无乳链球菌ATCC13813 - 3
单增李斯特菌ATCC19115 - 3
大肠杆菌ACTT25922 - 6
致病性大肠杆菌O157：H7 CTX-M-65 3
大肠杆菌XG-E1 NDM-5,mcr-1 3
大肠杆菌47EC tet(X4) 3
沙门氏菌ATCC14028 - 6
肺炎克雷伯氏菌XG-Kpn03 NDM-5 25
空肠弯曲菌ATCC 33291 - 6
鲍曼不动杆菌34AB tet(X3) 3
铜绿假单胞菌42 OXA-58 12
蜡样芽孢杆菌ATCC14579 - 6
荧光假单胞菌AC04 - 3
腐败希瓦氏菌ATCC 49138 - 6
白色念珠菌ATCC10231 - 12
尖孢镰刀菌LD21 - 12
表2.抗菌肽HT11衍生物对典型微生物的MIC
Figure BDA0003126046270000091
Figure BDA0003126046270000101
实施例2抗菌肽HT11的热稳定性和酸碱耐受性
2.1热稳定性
将100μg/mL的HT11溶液(pH＝7)分别在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃的温度下孵育1h，然后恢复到常温，测定其对大肠杆菌ATCC25922的MIC，使用没有经过处理的HT11作为对照。结果如表3所示，说明抗菌肽HT11可以耐受80℃及以下的温度而抗菌活性不受影响。
表3抗菌肽HT11的温度耐受性结果
作用温度(℃) MIC(μg/mL)
40 6
50 6
60 6
70 6
80 6
90 12
100 25
对照 6
2.2酸碱耐受性
将100μg/mL的HT11分别在pH为2、3、4、5、6、7、8的缓冲液中37℃孵育1h，然后将pH调节至7.0，测定其对大肠杆菌ATCC25922的MIC，使用没有经过处理的HT11作为对照。结果如表4所示，说明抗菌肽HT11可以耐受pH＝2-7的酸碱范围而抗菌活性不受影响。
表4抗菌肽HT11的酸碱耐受性结果
作用pH MIC(μg/mL)
2.0 6
3.0 6
4.0 6
5.0 6
6.0 6
7.0 6
8.0 12
对照 6
实施例3抗菌肽HT11的安全性评价
通过溶血性试验评价HT11及衍生物对羊血红细胞的溶血性，从而判断HT11及衍生物对组织的相容性；选择其中组织相容性最好的抗菌肽，利用Vero细胞测试其细胞毒性。
3.1溶血性
选择HT11及其衍生物HT11-1X(HT11-1M,HT11-1A),HT11-D(HT11-1D,HT11-2D,HT11-3D,HT11-5D,HT11-6D,HT11-7D,HT11-8D,HT11-9D,HT11-10D,HT11-11D,HT11-All-D),HT11-(PEG)2,HT11-Cyc作为考察对象，在96孔板分别加入100μL各种抗菌肽，其浓度分别为50μg/mL和150μg/mL，每种浓度三个重复；然后向每孔中加入一层100μL 8％红细胞悬浮液(脱纤维羊血3000g，离心10min后去除血清，PBS清洗两次后制备成100％红细胞悬浮液，将8mL该悬浮液与92mL的PBS混合得到8％红细胞悬浮液)，37℃孵育1h后，离心，吸取上清液100μL，测定其OD576nm吸光值。利用PBS和蜂毒肽分别作为阴性对照(N)和阳性对照(P)。溶血率＝(待测液体OD值-阴性对照OD值)/(阳性对照OD值-阴性对照OD值)×100％。结果如表5所示，50μg/mL HT11对红细胞的溶血率为0.11％，其它抗菌肽为0.31％～4.83％，两者相差不大；而150μg/mL的HT11对红细胞的溶血率为1.34％，其它抗菌肽为7.56％～50.51％，说明高浓度HT11与红细胞仍然具有较好的组织相容性。
表5.抗菌肽HT11及衍生物对绵羊红细胞的溶血率
Figure BDA0003126046270000121
3.2细胞毒性
采用WST-1测定HT11细胞毒性。96孔板先加入100μL含1％的青霉素和链霉素的MEM培养基，然后加入100μL HT11，其终浓度分别为500μg/mL，250μg/mL、125μg/mL、60μg/mL、30μg/mL、15μg/mL、7.5μg/mL和3μg/mL，每种浓度三个重复；然后向每孔中加入一层Vero细胞，每孔细胞数为104；37℃孵育24h后，弃去100μL液体，每孔加入10μL的WST-1，孵育1h后测定其450nm吸光值，使用PBS作为阴性对照，结果如图1所示，表明HT11具有较高的安全性，125μg/mL及该浓度以下的抗菌肽HT11对Vero的毒性较低，细胞存活率>95％。
实施例4.细菌生物被膜清除实验
以抗菌肽HT11及其衍生物HT-1M,HT11-All-D,HT11-(PEG)2和HT11-Cyc为考察对象，准备96孔板，将100μL 105CFU/mL金黄色葡萄球菌ATCC29213菌液加入到96孔板中(每排加8孔，做三个平行)，过夜培养18h左右，弃去细菌培养液，使用0.01mol/L、pH 7.4的无菌PBS小心清洗3次；加入不同浓度抗菌肽(0μg/mL,0.75μg/mL,1.5μg/mL,3μg/mL,6μg/mL,12μg/mL,25μg/mL,50μg/mL)各100μL作用30min后，弃去抗菌肽；使用0.01mol/L、pH 7.4的无菌PBS小心清洗3次。100μL无水甲醇固定15min，自然风干，0.1％的结晶紫染色15min，弃去结晶紫后用33％无水乙醇溶解，酶标仪测定OD590吸光值。结果如图2所示，与不加抗菌肽相比，HT11及其衍生物对金黄色葡萄球菌形成的生物被膜具有较好的清除作用，且浓度越高，清除作用越强。
实施例5细胞内杀菌实验
以抗菌肽HT11及其衍生物HT-1M,HT11-All-D,HT11-(PEG)2和HT11-Cyc为考察对象，将12孔板分为8组，每组3孔然后向每孔中加入一层MAC-T细胞共1mL，每孔细胞数为104个，37℃孵育24h后，弃去1mL液体，其中1到7组加入100μL 105CFU/mL的ATCC29213菌液，然后加入900μL不含双抗的DMEM-10％FBS培养液，37℃感染1h，第8组作为空白对照组(只加入900μL不含双抗的DMEM-10％FBS培养液)。感染1h后，弃去培养液，使用PBS洗涤三次，然后加入1mL含100μg/mL卡那霉素的DMEM-10％FPS培养液(不含双抗)，37℃作用2h以杀灭细胞外细菌，弃去培养液后使用PBS洗涤三次。第1组到第7组分别加入50μg/mL的卡那霉素、HT11、HT-1M,HT11-All-D,HT11-(PEG)2、HT11-Cyc和PBS，作用2h后弃去培养液使用PBS洗涤三次。然后所有组均加入1ml 0.1％Triton-100作用1h，收集裂解液倍比稀释后，取适当稀释度于LB平板培养计数。结果如图3所示，相对阳性对照，卡那霉素不能够进入到MAC-T细胞内杀菌，而抗菌肽HT11及其衍生物可以有效的杀灭胞内的细菌，其中HT11、HT-1M、HT11-All-D,HT11-(PEG)2的胞内菌杀灭率超过了96％，HT11-Cyc的胞内菌杀灭率为77％。
实施例6抗菌肽在食品消毒及防腐方面的应用
以抗菌肽HT11及其衍生物HT-1M,HT11-All-D,HT11-(PEG)2和HT11-Cyc为考察对象，选择冷鲜鸡肉作为实验对象，每份大概500g,分别将103CFU的金黄色葡萄球菌ATCC29213，单增李斯特菌ATCC19115，致病性大肠杆菌O157:H7临床株A3,沙门氏菌ATCC14028,空肠弯曲菌ATCC 33291和腐败希瓦氏菌ATCC 49138均匀涂布于不同鸡肉表面，1h后分别使用50μg/mL的HT11、HT-1M、HT11-All-D、HT11-(PEG)2和HT11-Cyc进行鸡肉表面喷洒消毒，使用量为2mL，每种抗菌肽的消毒做三个平行，同时设立细菌污染对照组。然后将所有样品置于4℃冰箱24h后，取出样品使用选择性培养基进行相应细菌的分离计数。结果如图4所示，相对于细菌污染对照组，使用抗菌肽HT11及其衍生物消毒的鸡肉表面各种病原菌数量下降1～3个数量级，说明以上抗菌肽可用于食品表面微生物的消毒及防腐。
实施例7抗菌肽在治疗小鼠浅表皮肤细菌感染中的应用
以抗菌肽HT11及其衍生物HT-1M,HT11-All-D,HT11-(PEG)2和HT11-Cyc为考察对象，选择耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)为攻毒菌，将48只ICR雌性小鼠(～18g)平均分成8组，每组6只小鼠，分别为：氨苄西林治疗组、HT11治疗组、HT-1M治疗组,HT11-All-D治疗组,HT11-(PEG)2治疗组、HT11-Cyc治疗组和PBS对照组。各组小鼠造模前用脱毛膏于背部皮肤脱毛(面积1cm×2cm)，造模当日按照10mg/kg剂量腹腔注射10％乌拉坦麻醉，由同一操作者使用相同力度将3M医用胶带于脱毛处皮肤紧密黏粘后撕脱，连续多次以去除角质层。将MRSA标准菌株ATCC33591培养至对数生长期然后调整至5×106CFU/mL，于损伤处皮肤接种相应菌液10μL。然后2h后进行皮肤表面感染治疗，给药剂量为50μg/只，对照组皮肤表面涂抹PBS溶液，24h后将所有小鼠处死，取感染创面皮肤，匀浆后使用金黄色葡萄球菌鉴别培养基测定细菌数。结果如图5所示，表明HT11及其衍生物可以有效降低MRSA菌株对小鼠皮肤表面的感染数量，而氨苄西林对于MRSA引起的小鼠皮肤感染治疗基本无效。
实施例8抗菌肽在植物病原菌防控方面的应用
以抗菌肽HT11及其衍生物HT-1M,HT11-All-D,HT11-(PEG)2和HT11-Cyc为考察对象，选择引起小麦赤霉病的主要病原菌镰刀菌为对象，包括尖孢镰刀菌、轮枝镰刀菌、层出镰刀菌和藤仓镰刀菌4个种属，将4种镰刀菌的孢子均匀喷洒在土豆-葡萄糖培养基上，然后将100μg/mL的HT11、HT-1M、HT11-All-D、HT11-(PEG)2、HT11-Cyc和20％三唑酮点样于各个培养基上，每种药物点样10μL。将平板置于37℃培养箱中培养5天后进行观察。结果如图6所示，与防治镰刀菌的传统药物三唑酮相比，HT11及其衍生物均在培养上形成了明显的空斑，说明以上抗菌肽对4种镰刀菌均具有良好的抑制作用。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (8)

1.一种抗菌肽HT11，其特征在于，所述抗菌肽HT11的序列为：
Arg-Arg-Leu-{D-Phe}-Arg-Arg-Ile-Leu-Arg-Trp-Leu-NH2；
其中，所述Phe为D型氨基酸。
2.一种根据权利要求1所述的抗菌肽HT11的衍生物，其特征在于，所述衍生物包括HT11-1X,HT11-D,HT11-(PEG)n或HT11-Cyc；
所述HT11-1X为所述抗菌肽HT11的第一位氨基酸被其它氨基酸残基取代得到的多肽；
所述HT11-D为所述抗菌肽HT11的任意一个或多个氨基酸转换为D型而得到的多肽；
所述HT11-(PEG)n为所述抗菌肽HT11的氨基端进行PEG修饰后的物质，其中n≥2；
所述HT11-Cyc为所述抗菌肽HT11的氨基端和羧基端进行连接得到的环状多肽。
3.一种抗菌肽HT11的应用，其特征在于，所述应用包括下列任一项：
(1)根据权利要求1所述的抗菌肽HT11在抑制和/或杀灭细菌和/或真菌中的应用；
(2)根据权利要求1所述的抗菌肽HT11在制备抑制和/或杀灭细菌和/或真菌产品中的应用；
(3)根据权利要求1所述的抗菌肽HT11在制备治疗皮肤感染的产品中的应用；
(4)根据权利要求1所述的抗菌肽HT11在制备细胞内杀菌产品中的应用；
(5)根据权利要求1所述的抗菌肽HT11在清除细菌生物被膜中的应用；
(6)根据权利要求1所述的抗菌肽HT11在制备清除细菌生物被膜产品中的应用；
(7)根据权利要求1所述的抗菌肽HT11在消毒防腐中的应用；
(8)根据权利要求1所述的抗菌肽HT11在预防和/或治疗小麦赤霉病中的应用。
4.一种抗菌肽HT11衍生物的应用，其特征在于，所述应用包括下列任一项：
(1)根据权利要求2所述的衍生物在抑制和/或杀灭细菌和/或真菌中的应用；
(2)根据权利要求2所述的衍生物在制备抑制和/或杀灭细菌和/或真菌产品中的应用；
(3)根据权利要求2所述的衍生物在制备治疗皮肤感染的产品中的应用；
(4)根据权利要求2所述的衍生物在制备细胞内杀菌产品中的应用；
(5)根据权利要求2所述的衍生物在清除细菌生物被膜中的应用；
(6)根据权利要求2所述的衍生物在制备清除细菌生物被膜产品中的应用；
(7)根据权利要求2所述的衍生物在消毒防腐中的应用；
(8)根据权利要求2所述的衍生物在预防和/或治疗小麦赤霉病中的应用。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述皮肤感染是由细菌引起的皮肤感染。
6.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述小麦赤霉病为真菌引起的小麦赤霉病。
7.一种清除细菌生物被膜的方法，其特征在于，所述方法为：将权利要求1所述的抗菌肽HT11或者权利要求2所述的衍生物与细菌混合。
8.一种抑制微生物生长的方法，其特征在于，所述方法为：将权利要求1所述的抗菌肽HT11或者权利要求2所述的衍生物与微生物混合。
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Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018231058A2 (en) * 2017-06-13 2018-12-20 Rijksuniversiteit Groningen Antimicrobial peptides and admixtures thereof showing antimicrobial activity against gram-negative pathogens

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
INÊS M. TORCATO等: "Design and characterization of novel antimicrobial peptides, R-BP100 and RW-BP100,with activity against Gram-negative and Gram-positive bacteria", 《BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA》 *

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