CN113219643A - 一种基于非相干成像边缘模糊的光学显微镜对焦稳定方法及系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于非相干成像边缘模糊的光学显微镜对焦稳定方法及系统。本发明由非相干光照射光阑，分别成像在光学显微镜焦面和相机传感器面附近，相机记录的光阑成像边缘径向强度传输至计算机拟合误差函数提取自变量系数作为模糊参数，由模糊参数对应显微镜物镜和样品间距的关系，获得显微镜焦面沿光轴的离焦距离和方向，实现离焦检测；通过将连接显微镜原样品台和待测样品的纳米平移台反向移动，实现样品的位置快速恢复到显微镜焦面，即实现离焦补偿。本发明可对目前广泛使用的高倍率显微镜提供实时、并行地检测和补偿离焦功能，保障其长时间的稳定使用，在微纳传感、精密成像及其生物化学探测领域中有广泛的辅助应用前景。

Description

一种基于非相干成像边缘模糊的光学显微镜对焦稳定方法及 系统

技术领域

本发明涉及非相干光成像领域，尤其涉及一种基于非相干成像边缘模糊的光学显微镜对焦稳定方法及系统。

背景技术

随着显微成像光谱技术的发展，借助显微镜高倍成像光路完成的工作越来越多，相应地，也对测量精度有着越来越高的要求。对显微镜高倍物镜而言，由于对光强大的汇聚能力和相当短的工作距离，其正常工作会严重受到样品离焦的影响，比如其汇聚在焦面的接近衍射极限的高斯光束的瑞利距离一般仅几百纳米，而显微镜在数分钟内也常会出现百纳米的离焦，这是必须避免的。因此实现显微镜的稳定对焦是一个重要的课题。

近年来，对稳定的显微镜对焦有多种不同的方法被提出，如基于图像的相关法、基于激光的背焦面检测、使用荧光或散射基准标记跟踪漂移。这些方法各自存在原理复杂、对实验波长有所限制、需要对样品进行额外加工等要求，难以被普适地应用。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提出了一种基于非相干成像边缘模糊的光学显微镜对焦稳定方法及系统。本发明的器件设置由非相干光照射光阑，经成像系统和光学显微镜成像至显微镜焦面和相机，相机记录并拟合光阑边缘径向强度的误差函数提取模糊参数，对应获得显微镜焦面沿光轴的离焦距离和方向；进而控制连接显微镜原样品台和待测样品的纳米平移台反向等距移动，实现样品位置快速恢复到显微镜焦面。其中，为获得最佳的稳定显微镜效果，保证相机传感器与物镜焦面共轭，光阑位置被设置为稍偏离物镜焦面共轭面至模糊参数对离焦距离导数为峰值的状态。本方法成像实现装置简单，对常见的透射、反射式显微镜均可兼容。相比于一般的显微镜稳定方法，本发明具有兼容性强、结构简单、离焦敏感性高、调试方便、不需要额外样品加工等优点。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明一方面提供一种基于非相干成像边缘模糊的光学显微镜对焦稳定方法，包括离焦检测和离焦补偿两个步骤；

离焦检测：由非相干光照射光阑，分别成像在光学显微镜焦面和相机传感器面附近，相机记录的光阑成像边缘径向强度传输至计算机拟合误差函数提取自变量系数作为模糊参数，由模糊参数对应显微镜物镜和样品间距的关系，获得显微镜焦面沿光轴的离焦距离和方向；

离焦补偿：通过将连接显微镜原样品台和待测样品的纳米平移台反向移动，实现样品的位置快速恢复到显微镜焦面，完成快速实时补偿离焦，由此实现显微镜长时间稳定对焦；

离焦检测和离焦补偿过程连续重复交替，即实现显微镜对焦成像稳定。

进一步地，将非相干光经过传播扩散照射到光阑上，作为离焦检测部分的检测光源。

进一步地，光阑可以但不限于为多边形光阑，可以推广为其他挡光器件。

进一步地，光阑经过透镜成像系统和显微镜物镜，成像在物镜焦面附近。

进一步地，搭建的相机传感器面位于物镜焦面的共轭面，成物镜焦面放大的像。

进一步地，相机记录的光阑成像边缘径向强度I传输至计算机，强度I与径向位置x的关系由误差函数I(x)＝k·erf[B(x-a)]+h拟合，其中k正比于检测光源的光强，h正比于本底强度，a为边缘中心位置，自变量系数B为模糊参数且不受检测光源强度和本底强度影响。

进一步地，模糊参数通过沿光阑像边缘方向多列像素强度求平均来减小误差。

进一步地，通过调节光阑在光轴方向的位置，使物镜焦面处的模糊参数对离焦距离导数为峰值，即模糊参数对离焦的敏感性为最优状态，同时得到模糊参数与离焦距离的关系，实现由模糊参数获得离焦距离和方向。

进一步地，根据模糊参数获得离焦距离和方向，数据传输至纳米平移台，控制移动方向与离焦方向相反，移动距离为离焦距离。

本发明另一方面提供一种基于非相干成像边缘模糊的光学显微镜对焦稳定系统，该系统包括依次连接的非相干离焦检测系统、离焦分析系统和离焦补偿系统；

所述非相干离焦检测系统以光阑出射非相干光为检测光源，分别经过成像系统在光学显微镜焦面和相机传感器面附近成像，输出光阑成像边缘径向强度信号；

所述离焦分析系统通过接收非相干离焦检测系统的输出信号，拟合误差函数提取自变量系数作为模糊参数，由模糊参数对应显微镜物镜和样品间距的关系，输出显微镜焦面沿光轴的离焦距离和方向；

所述离焦补偿系统根据离焦分析系统输出的离焦距离和方向，通过连接显微镜原样品台和待测样品的纳米平移台控制器控制纳米平移台反向移动，即可完成对焦稳定的一次刷新。

本发明有益效果如下：本发明所设计的一种基于非相干成像边缘模糊的光学显微镜对焦稳定方法及系统，对于光源，选择非相光能很好地兼容正置或倒置显微镜光路，实现长时间测量，不需要对样品做额外加工，测量过程拟合模糊参数，可快捷地换算为离焦距离，不受入射光强和环境本底光影响使得对光源稳定性要求大大降低；对于离焦检测，得到的用于获取离焦距离和方向的模糊参数，通过平均阑像边缘方向多个像素强度求平均来减小模糊参数的误差，通过光阑稍偏离物镜焦面共轭面来提供离焦敏感性最优；对于离焦补偿，反向补偿由纳米平移台控制，准确度可达几纳米，刷新间隔基本等于硬件到计算机的信号传递存储时间。本发明提供一种样品与显微镜兼容性强、结构简单、调试方便、离焦敏感性高、离焦距离换算快捷、不需要对样品额外加工的高倍显微镜对焦稳定的方法，完成快速检测和实时补偿离焦，在微纳探针、精密成像及其生物化学探测领域中有广泛的辅助应用前景。

附图说明

图1为本发明方法流程图；

图2为本发明系统结构示意图；

图3为本发明实施例的装置结构图；

图4为显微镜离焦光阑边缘模糊示意图；

图5为模糊参数与离焦距离的结果图；

图6为实施效果对比图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

如图1所示的基于非相干成像边缘模糊的光学显微镜对焦稳定方法，包括以下步骤：非相干光源照射光阑、成像至物镜焦面附近、成像至相机传感器、传输至计算机提取模糊参数、计算机由模糊参数获得离焦距离和方向、传输至纳米平移台控制器、纳米平移台反向等距移动离焦距离。

所述的非相干光源照射光阑过程，将非相干光经过传播扩散照射到光阑上，光阑可以但不限于为多边形光阑，可以推广为其他挡光器件。

所述的成像至物镜焦面附近过程，为光阑经过透镜成像系统和显微镜物镜，成像在物镜焦面附近。

所述的成像至相机传感器过程，由放大的成像系统完成。同时，相机拍摄并取光阑边缘的像，沿光阑像边缘方向多列像素强度求平均来减小误差得到光阑成像边缘径向强度信号I。

所述的计算机提取模糊参数过程，为径向强度I与径向位置x的关系由误差函数I(x)＝k·erf[B(x-a)]+h拟合，提取的模糊参数B不受非相干光入射光阑强度和环境本底信号影响；随后进一步优化装置，通过前后移动光阑的位置实现样品在物镜焦面时模糊参数对离焦的敏感性最优，即模糊参数随焦面位置的离焦变化率最大，同时获得最优化的模糊参数和离焦距离关系。

所述的由模糊参数获得离焦距离和方向过程，利用已确定的模糊参数和离焦距离关系和本次提取的模糊参数，获得离焦距离和方向。

所述的离焦距离和方向传输至纳米平移台控制器，并控制连接显微镜原样品台和待测样品的纳米平移台反向等距移动离焦距离。

重复循环相机传感器拍摄到纳米平移台移动的过程，即实现显微镜对焦成像稳定。

如图2所示的基于非相干成像边缘模糊的光学显微镜对焦稳定系统，包括：非相干离焦检测系统、离焦分析系统和离焦补偿系统；所述各个系统的输出依次与下一个系统的输入相连。

所述的非相干离焦检测系统以光阑出射非相干光为检测光源，其通过成像系统与待稳定显微镜物镜光路合束至物镜焦面，出射后在通过另一成像系统到相机传感器面。拍摄并取光阑边缘的像，沿光阑像边缘方向多列像素强度求平均来减小误差。其中光阑物面与物镜焦面对应的共轭面稍错位，用于调整至离焦分析系统的敏感性最优。该系统输出光阑成像边缘径向强度信号I。

所述的离焦分析系统首先由计算机通过接收非相干离焦检测系统的输出信号，由径向强度I与径向位置x的关系由误差函数I(x)＝k·erf[B(x-a)]+h拟合，提取的模糊参数B不受非相干光入射光阑强度和环境本底信号影响。再由已确定的模糊参数与离焦距离的对应关系，输出离焦距离和方向；

所述的离焦补偿系统在接收离焦分析系统输出的离焦距离和方向时，通过纳米平移台控制器控制连接显微镜原样品台和待测样品的纳米平移台沿光轴方向进行与离焦距离反向等值的位移，即可完成一次稳定刷新。

如图3所示，为基于非相干成像边缘模糊的光学显微镜对焦稳定方法的实施例，包括：待稳定光学显微镜、离焦检测和离焦补偿部分。

所述的待稳定光学显微镜，为使用高倍物镜的正置或倒置显微镜，包括显微镜架、物镜、样品台，本实例以倒置显微镜配备100倍物镜为例。

所述的离焦检测部分为LED光源以直径5厘米宽正入射到直径1毫米的多边形光阑面上，从光阑面透射的光强为匀强分布。

经过焦距100毫米的透镜1和原显微镜物镜成像至样品面附近，其中半透半反镜实现外置光阑光路与显微镜物镜光路合束，其中光阑物面与物镜焦面对应的共轭面稍错位，光阑像边缘位置可根据被稳定显微镜的具体应用场景和样品对入射光的要求作调整。非相干光经样品出射后由物镜和焦距200毫米的透镜将物镜焦面成放大的像至相机传感器面上。如果原待稳定的实验有需求，可通过滤波、锁相测量等方式将本方法所用非相干光与待测实验光束加以分离。本方法运行前需先初始调节光阑的光轴方向位置，使物镜焦面处的模糊参数对离焦距离导数为峰值，即模糊参数对离焦的敏感性为最优状态，同时得到模糊参数与离焦距离的关系。

离焦检测部分的工作过程为，传感器拍摄光阑边缘成像，并沿边缘方向多列像素强度求平均来减小误差，得到光阑成像边缘径向强度信号，传输至计算机，得到径向强度I与径向位置x的关系由误差函数I(x)＝k·erf[B(x-a)]+h拟合，提取的模糊参数B不受非相干光入射光阑强度和环境本底信号影响，再由已确定的模糊参数与离焦距离的对应关系，输出离焦距离和方向。该过程单次花费时间约0.3秒。

所述的离焦补偿部分，选取压电陶瓷平台为所述的纳米平移台，选取相应的压电陶瓷控制器作为纳米平移台控制器。

离焦补偿部分的工作过程为，根据模糊参数获得离焦距离和方向，数据由计算机传输至纳米平移台控制器，控制纳米平移台移动方向与离焦方向相反，移动距离为离焦距离，从而实现补偿补偿。其反馈补偿的响应时间和精度由选择压电陶瓷平台决定，一般响应时间不超过0.05秒，精度可达纳米级别。

离焦检测和离焦补偿的工作过程连续重复交替，即实现显微镜对焦成像稳定。

如图4所示，为实施例显微镜离焦光阑边缘模糊示意图，图4中a示意了在100倍物镜下，样品离焦距离z_s与汇聚到半径接近衍射极限的光束发散角相比往往较大，说明对焦稳定十分重要，图4中b-d说明了对所述的非相干光阑在样品离焦发生时经图3所示光路在相机传感器面上的成像定性的状态，其远离边缘的中心位置强度均匀，远离边缘的光阑外为本底强度，其边缘对应不同的离焦距离z_s从而将被提取出不同模糊参数。

图5所示为模糊参数与离焦距离的检测结果图，对应所述的模糊参数B对离焦距离z_s的敏感性最优的关系。首先由离焦检测系统中相机获取光阑左侧边缘的像，例如图5中a-e为五个样品离焦距离的拍摄结果。处理图像沿边缘方向平均，获取降噪的边缘径向强度变化，对应地如图5中f-j灰色点。计算机对边缘径向强度拟合误差函数并获得模糊参数B，对应地如图5中f-j分别为黑色拟合实线和左下角拟合参数B。不同离焦距离z_s和距离的正负方向下获得不同的模糊参数分布如图5中k图黑点所示，相应的理论线性为黑色实线，相应的距离敏感性大小即沿离焦距离的导数的实验和理论结果为黑色空心点和黑色虚线，实现了在焦面处模糊参数对样品离焦导数为0.101(μm·pix)^-1，达敏感性最优状态。

图6为实施效果对比图。其描述的是利用本发明对在100倍物镜的显微镜光路中利用空间调制光谱法测量纳米颗粒消光截面的稳定性效果。由于纳米材料相比于大尺寸材料有独特的性质，常利用光与物质相互作用实现光谱表征来衡量。近年来，利用纳米结构的光谱表征作为传感探针被广泛应用于在化学、生物领域，如纳米尺度的介质、形貌、折射率的探测，不同环境下生物分子或化学基团的探测等。这些传感探测对象由于其仅纳米尺寸以及相当微弱的光学信号，往往需要借助显微镜进行相关测量，同时长时间持续测量对传感探针而言是非常有必要的。

图6中a应用了本方法记录了100次点，其中黑色空心点为补偿反馈后的模糊参数值，其仅有微小的波动对应微小的相机噪声拟合模糊参数误差、压电陶瓷平台补偿误差和两次刷新短间隔的样品离焦，对应其剩余离焦的波动标准差仅17纳米，黑色实心点为同时利用该显微镜测量150纳米直径的纳米立方体的消光截面的100次实验结果，其不确定度仅0.92％；图6中b为同样条件下关闭离焦补偿系统，仅开启离焦检测系统，黑色是空心点和实心点分别是100次测量过程中模糊参数B和消光截面的结果，两者均波动很大。对应离焦距离的标准差高达203纳米，消光截面不确定度高达17.9％。从图a和b的对比可以得到，被稳定实验测量的消光截面结果标准差由该方法和系统下降了一个数量级，从而验证了本发明方法和系统的可行性。

上文中，参照附图描述了本发明的具体实施方式。但是，本领域中的普通技术人员能够理解，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，还可以对本发明的具体实施方式作各种变更和替换。这些变更和替换都落在本发明权利要求书所限定的范围内。

Claims (10)

1.一种基于非相干成像边缘模糊的光学显微镜对焦稳定方法，其特征在于，包括离焦检测和离焦补偿两个步骤；

离焦检测：由非相干光照射光阑，分别成像在光学显微镜焦面和相机传感器面附近，相机记录的光阑成像边缘径向强度传输至计算机拟合误差函数提取自变量系数作为模糊参数，由模糊参数对应显微镜物镜和样品间距的关系，获得显微镜焦面沿光轴的离焦距离和方向；

离焦补偿：通过将连接显微镜原样品台和待测样品的纳米平移台反向移动，实现样品的位置快速恢复到显微镜焦面；

离焦检测和离焦补偿过程连续重复交替，即实现显微镜对焦成像稳定。

2.根据权利要求1所述的一种基于非相干成像边缘模糊的光学显微镜对焦稳定方法，其特征在于，将非相干光经过传播扩散照射到光阑上，作为离焦检测部分的检测光源。

3.根据权利要求1所述的一种基于非相干成像边缘模糊的光学显微镜对焦稳定方法，其特征在于，所述光阑为多边形光阑，或其他挡光器件。

4.根据权利要求1所述的一种基于非相干成像边缘模糊的光学显微镜对焦稳定方法，其特征在于，所述光阑经过透镜成像系统和显微镜物镜，成像在物镜焦面附近。

5.根据权利要求1所述的一种基于非相干成像边缘模糊的光学显微镜对焦稳定方法，其特征在于，搭建的相机传感器面位于物镜焦面的共轭面，成物镜焦面放大的像。

6.根据权利要求1所述的一种基于非相干成像边缘模糊的光学显微镜对焦稳定方法，其特征在于，相机记录的光阑成像边缘径向强度I传输至计算机，强度I与径向位置x的关系由误差函数I(x)＝k·erf[B(x-a)]+h拟合，其中k正比于检测光源的光强，h正比于本底强度，a为边缘中心位置，自变量系数B为模糊参数且不受检测光源强度和本底强度影响。

7.根据权利要求1所述的一种基于非相干成像边缘模糊的光学显微镜对焦稳定方法，其特征在于，模糊参数通过沿光阑像边缘方向多列像素强度求平均来减小误差。

8.根据权利要求1所述的一种基于非相干成像边缘模糊的光学显微镜对焦稳定方法，其特征在于，通过调节光阑在光轴方向的位置，使物镜焦面处的模糊参数对离焦距离导数为峰值，即模糊参数对离焦的敏感性为最优状态，同时得到模糊参数与离焦距离的关系，实现由模糊参数获得离焦距离和方向。

9.根据权利要求1所述的一种基于非相干成像边缘模糊的光学显微镜对焦稳定方法，其特征在于，根据模糊参数获得离焦距离和方向，数据传输至纳米平移台，控制移动方向与离焦方向相反，移动距离为离焦距离。

10.一种基于非相干成像边缘模糊的光学显微镜对焦稳定系统，其特征在于，该系统包括依次连接的非相干离焦检测系统、离焦分析系统和离焦补偿系统；

所述非相干离焦检测系统以光阑出射非相干光为检测光源，分别经过成像系统在光学显微镜焦面和相机传感器面附近成像，输出光阑成像边缘径向强度信号；

所述离焦分析系统通过接收非相干离焦检测系统的输出信号，拟合误差函数提取自变量系数作为模糊参数，由模糊参数对应显微镜物镜和样品间距的关系，输出显微镜焦面沿光轴的离焦距离和方向；

所述离焦补偿系统根据离焦分析系统输出的离焦距离和方向，通过纳米平移台控制器控制连接显微镜原样品台和待测样品的纳米平移台反向移动，即可完成对焦稳定的一次刷新。

Images