CN106885795B - 一种运动单粒子的荧光寿命信息获取方法及系统 - Google Patents

一种运动单粒子的荧光寿命信息获取方法及系统 Download PDF

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Abstract

本发明适用于光学显微成像技术领域，提供了一种运动单粒子的荧光寿命信息获取方法及系统。该方法包括：对样品进行宽场激发，获取样品中被激发的运动单粒子的荧光图像，对荧光图像中的运动单粒子进行定位，根据定位结果确定扫描区域，对确定的扫描区域内的运动单粒子进行扫描，根据扫描结果获取运动单粒子的荧光寿命信息，判断运动单粒子的位置是否超出预置的检测范围，若否，则执行获取样品中被激发的运动单粒子的荧光图像的步骤。相较于现有技术，本发明能够根据对单粒子的定位结果，实时调整扫描区域，从而实时掌控运动单粒子的运动位置并据此获取其荧光寿命信息，解决了现有技术中无法检测运动粒子的寿命信息的问题。

Description

一种运动单粒子的荧光寿命信息获取方法及系统
技术领域
本发明属于光学显微成像技术领域，尤其涉及一种运动单粒子的荧光寿命信息获取方法及系统。
背景技术
光学显微成像技术早已成为生命科学研究领域的重要工具，随着科技的发展和对生命结构认识的不断深入，人们对光学成像方法的要求也逐渐提高。在诸多光学成像方法中，荧光寿命显微成像技术由于不受激发光强度、荧光团浓度以及光漂白等因素的影响而受到广泛关注。由于粒子的荧光寿命与粒子所处的微环境密切相关，因此可根据荧光寿命值对粒子所处的微环境中的许多物理、生化参量进行定量测量，比如PH值、离子浓度等。然而这种技术目前由于多采用扫描方式，单幅图像的采集时间受单像素采集到的光子数限制，一般最少在几秒到几十秒的量级，有的样品甚至需要几分钟，因此一般不能用来对运动粒子的寿命进行成像，更无法对运动粒子在细胞内运动过程中与微环境的相互作用进行快速实时的监测(如研究特定蛋白沿微管运动过程中与周围微环境的相互作用情况等)。
发明内容
本发明实施例所要解决的技术问题在于提供一种运动单粒子的荧光寿命信息获取方法及系统，旨在解决现有技术中无法检测运动粒子的荧光寿命变化信息的问题。
本发明实施例第一方面提供了一种运动单粒子的荧光寿命信息获取方法，所述方法包括：
对样品进行宽场激发；
获取所述样品中被激发的运动单粒子的荧光图像；
对所述荧光图像中的所述运动单粒子进行定位；
根据定位结果确定扫描区域，对确定的扫描区域内的所述运动单粒子进行扫描，根据扫描结果获取所述运动单粒子的荧光寿命信息；
判断所述运动单粒子的位置是否超出预置的检测范围，若否，则执行所述获取所述样品中被激发的运动单粒子的荧光图像的步骤。
本发明实施例第二方面提供了一种运动单粒子的荧光寿命信息获取系统，所述系统包括：
宽场激发模块，用于对样品进行宽场激发；
图像获取模块，用于获取所述样品中被激发的运动单粒子的荧光图像；
定位模块，用于对所述荧光图像中的所述运动单粒子进行定位；
扫描模块，用于根据定位结果确定扫描区域，对确定的扫描区域内的所述运动单粒子进行扫描；
寿命获取模块，用于根据扫描结果获取所述运动单粒子的荧光寿命信息；
判断模块，用于判断所述运动单粒子的位置是否超出预置的检测范围，若否，则获取所述样品中被激发的运动单粒子的荧光图像。
从上述本发明实施例可知，本发明通过对样品进行宽场激发，获取样品中被激发的运动单粒子的荧光图像，对荧光图像中的运动单粒子进行定位，根据定位结果确定扫描区域，对确定的扫描区域内的运动单粒子进行扫描，根据扫描结果获取运动单粒子的荧光寿命信息，判断运动单粒子的位置是否超出预置的检测范围，若否，则执行获取样品中被激发的运动单粒子的荧光图像的步骤。相较于现有技术，本发明能够根据对单粒子的定位结果，实时调整扫描区域，从而实时掌控运动单粒子的运动位置并据此获取其荧光寿命信息，解决了现有技术中无法检测运动粒子的寿命信息的问题。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
附图1是本发明第一实施例提供的运动单粒子的荧光寿命信息获取方法的实现流程示意图；
附图2是本发明第二实施例提供的运动单粒子的荧光寿命信息获取方法的实现流程示意图；
附图3是本发明第三实施例提供的运动单粒子的荧光寿命信息获取系统的结构示意图；
附图4是本发明第四实施例提供的运动单粒子的荧光寿命信息获取系统的结构示意图；
附图5是本发明第四实施例提供的运动单粒子的荧光寿命信息获取系统的具体结构示意图；
附图6是甘油实验中荧光珠的运动轨迹图；
附图7是甘油实验中荧光珠的荧光寿命轨迹图。
具体实施方式
为使得本发明实施例的发明目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而非全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅附图1，附图1为本发明第一实施例提供的运动单粒子的荧光寿命信息获取方法的实现流程示意图。如附图1所示，该方法主要包括以下步骤：
S101、对样品进行宽场激发；
宽场激发是指宽场照明激发，是以激光或汞灯为激发光源对样品进行照射。
具体地，在本步骤中需要使用荧光探针，该荧光探针应满足尺寸较小的同时具有较高的光子效率，可以选用小尺寸的荧光珠或量子点等。将荧光探针与样品中所要观察的目标物进行特异性结合(如在研究特定蛋白沿微管运动过程中，将荧光粒子与蛋白进行特异性结合)，采用宽场照明激发方式激发荧光粒子。
S102、获取样品中被激发的运动单粒子的荧光图像；
通过电荷耦合器件(Charge-Coupled Device，CCD)、增强型电荷耦合器件(Intensifier Charge-Coupled Device，ICCD)、电子倍增电荷耦合器件(ElectronMultiplying Charge-Coupled Device，EMCCD)或其他面阵探测器接收样品所被照射区域内所有荧光信号，并进行快速成像。
S103、对荧光图像中的运动单粒子进行定位；
通过单粒子定位算法得到荧光粒子的精确坐标位置信息，可达纳米级定位精度。
单粒子定位能够实现横向达到纳米级的定位精度。虽然对于显微系统来说，一个点光源的像为由系统点扩展函数(PSF)决定的艾里斑，但是点光源的空间位置可以通过其荧光图像的质心求出，定位精度(标准差)和系统探测到的来自该点源的光子数的平方根成反比，与系统本身点扩散函数的标准差成正比，因此可以获得高达纳米的定位精度。横向的单粒子定位也可以直接用高斯函数拟合实现。轴向单粒子定位需要结合某些轴向分辨辅助手段，例如改造点扩展函数，使得不同轴向位置上的点扩展函数携带有z轴的坐标信息，例如利用柱面镜像散或螺旋点扩展函数等，也能将轴向分辨率提高到50纳米甚至更高的水平。
S104、根据定位结果确定扫描区域，对确定的扫描区域内的运动单粒子进行扫描，根据扫描结果获取运动单粒子的荧光寿命信息；
控制声光偏转器迅速将入射的脉冲激光聚焦到S103步骤中得到的荧光粒子的坐标位置，并以该荧光粒子坐标为中心的一个预设的微小区域进行扫描，以激发荧光粒子。该微小区域可以是一个9×9像素的区域。
荧光粒子被激发后所发出的荧光，经光电倍增管和时间相关单光子计数器记录后，在终端中得到扫描区域中每个像素的荧光光子随时间分布情况。
在终端中对每个像素探测到的荧光光子计数结果进行数据拟合处理，即可获得运动荧光粒子的荧光寿命信息。根据光子随时间的分布信息，通过负指数函数拟合，从而得到发光分子的荧光寿命。单组分拟合公式为I(t)＝I0e-t/τ，其中t为时间，τ为荧光寿命，I0为t＝0时的荧光强度，I(t)为t时刻的荧光强度；双组分拟合公式为I(t)＝I0(a1e-t/τ1+a2e-t/τ2)，其中a1为第一组分的占比，τ1为第一组分的荧光寿命，a2为第二组分的占比，τ2为第二组分的荧光寿命；其余多组分拟合公式可类推。
S105、判断运动单粒子的位置是否超出预置的检测范围。
若是，则结束流程。
若否，则执行步骤S102。
当运动单粒子的位置在预置的检测范围内时，将循环执行步骤S102-S105。当运动单粒子位置发生变化时，能够根据对该运动单粒子的定位实时调整扫描区域，从而能够获取运动的单粒子的荧光寿命。
于本发明另一实施例中，可以在每次获取样品中被激发的运动单粒子的荧光图像之前，都进行宽场激发。
在本步骤中，预先设置目标运动区域，若运动单粒子的位置超出预置的目标运动区域，则判断运动单粒子的位置超出预置的检测范围，若运动单粒子的位置未超出预置的目标运动区域，则判断运动单粒子的位置未超出预置的检测范围。
设置方式可以但不限于包括：用户设置或系统自动设置。
于本发明另一实施例中，判断运动单粒子的位置是否超出预置的检测范围的标准在于，判断该运动单粒子是否超出面阵探测器的拍摄范围。
本发明实施例提供的运动单粒子的荧光寿命信息获取方法，通过对样品进行宽场激发，获取样品中被激发的运动单粒子的荧光图像，对荧光图像中的运动单粒子进行定位，根据定位结果确定扫描区域，对确定的扫描区域内的运动单粒子进行扫描，根据扫描结果获取运动单粒子的荧光寿命信息，判断运动单粒子的位置是否超出预置的检测范围，若否，则执行获取样品中被激发的运动单粒子的荧光图像的步骤。相较于现有技术，本发明能够根据对单粒子的定位结果，实时调整扫描区域，从而实时掌控运动单粒子的运动位置并据此获取其荧光寿命信息，解决了现有技术中无法检测运动粒子的寿命信息的问题。
请参阅附图2，附图2为本发明第二实施例提供的运动单粒子的荧光寿命信息获取方法的实现流程示意图。如附图2所示，该方法主要包括以下步骤：
S201、对样品进行宽场激发；
宽场激发是指宽场照明激发，是以激光或汞灯为激发光源对样品进行照射。
具体地，在本步骤中需要使用荧光探针，该荧光探针应满足尺寸较小的同时具有较高的光子效率，可以选用小尺寸的荧光珠或量子点等。将荧光探针与样品中所要观察的目标物进行特异性结合(如在研究特定蛋白沿微管运动过程中，将荧光粒子与蛋白进行特异性结合)，采用宽场照明激发方式激发荧光粒子。
S202、获取样品中被激发的运动单粒子的荧光图像；
通过电荷耦合器件、增强型电荷耦合器件、电子倍增电荷耦合器件或其他面阵探测器接收样品所被照射区域内所有荧光信号，并进行快速成像。
S203、通过单粒子定位算法，对荧光图像中的运动单粒子进行定位；
通过单粒子定位算法得到荧光粒子的精确坐标位置信息，可达纳米级定位精度。
单粒子定位能够实现横向达到纳米级的定位精度。虽然对于显微系统来说，一个点光源的像为由系统点扩展函数决定的艾里斑，但是点光源的空间位置可以通过其荧光图像的质心求出，定位精度和系统探测到的来自该点源的光子数的平方根成反比，与系统本身点扩散函数的标准差成正比，因此可以获得高达纳米的定位精度。横向的单粒子定位也可以直接用高斯函数拟合实现。轴向单粒子定位需要结合某些轴向分辨辅助手段，例如改造点扩展函数，使得不同轴向位置上的点扩展函数携带有z轴的坐标信息，例如利用柱面镜像散或螺旋点扩展函数等，也能将轴向分辨率提高到50纳米甚至更高的水平。
S204、将以定位结果中运动单粒子的坐标所在位置为中心的预置范围，确定为扫描区域，对确定的扫描区域内的运动单粒子进行扫描；
控制声光偏转器迅速将入射的脉冲激光聚焦到S203步骤中得到的荧光粒子的坐标位置，并以该荧光粒子坐标为中心的一个预设的微小区域进行扫描，以激发荧光粒子。该微小区域可以是一个9×9像素的区域。
S205、对扫描区域的荧光光子进行时间相关单光子计数，并根据时间相关单光子计数结果拟合计算扫描区域的运动单粒子的荧光寿命信息；
荧光粒子被激发后所发出的荧光，经光电倍增管和时间相关单光子计数器记录后，在终端中得到扫描区域中每个像素的荧光光子随时间分布情况。
在终端中对每个像素探测到的荧光光子计数结果进行数据拟合处理，即可获得运动荧光粒子的荧光寿命信息。根据光子随时间的分布信息，通过负指数函数拟合，从而得到发光分子的荧光寿命。单组分拟合公式为I(t)＝I0e-t/τ，其中t为时间，τ为荧光寿命，I0为t＝0时的荧光强度，I(t)为t时刻的荧光强度；双组分拟合公式为I(t)＝I0(a1e-t/τ1+a2e-t/τ2)，其中a1为第一组分的占比，τ1为第一组分的荧光寿命，a2为第二组分的占比，τ2为第二组分的荧光寿命；其余多组分拟合公式可类推。
S206、判断运动单粒子的位置是否超出预置的检测范围；
若否，则执行步骤S202。
若是，则结束循环流程，并执行步骤S207。
当运动单粒子的位置在预置的检测范围内时，将循环执行步骤S202-S206。当运动单粒子位置发生变化时，能够根据对该运动单粒子的定位实时调整扫描区域，从而能够获取运动的单粒子的荧光寿命。
在本步骤中，预先设置目标运动区域，若运动单粒子的位置超出预置的目标运动区域，则判断运动单粒子的位置超出预置的检测范围，若运动单粒子的位置未超出预置的目标运动区域，则判断运动单粒子的位置未超出预置的检测范围。
设置方式可以但不限于包括：用户设置或系统自动设置。
于本发明另一实施例中，判断运动单粒子的位置是否超出预置的检测范围的标准在于，判断该运动单粒子是否超出面阵探测器的拍摄范围。
S207、根据获取的定位结果和定位结果对应的运动单粒子的荧光寿命信息，构建运动单粒子的荧光寿命轨迹图像。
结合各个时刻得到的运动粒子的质心定位结果和荧光寿命信息，构建出运动粒子的荧光寿命轨迹图像，图像中各个点代表了运动粒子不同时刻的位置，该点所对应像素的颜色，表示此时粒子的荧光寿命。
本发明实施例提供的运动单粒子的荧光寿命信息获取方法，通过对样品进行宽场激发，获取样品中被激发的运动单粒子的荧光图像，对荧光图像中的运动单粒子进行定位，根据定位结果确定扫描区域，对确定的扫描区域内的运动单粒子进行扫描，根据扫描结果获取运动单粒子的荧光寿命信息，判断运动单粒子的位置是否超出预置的检测范围，若否，则执行获取样品中被激发的运动单粒子的荧光图像的步骤。相较于现有技术，本发明能够根据对单粒子的定位结果，实时调整扫描区域，从而实时掌控运动单粒子的运动位置并据此获取其荧光寿命信息，解决了现有技术中无法检测运动粒子的寿命信息的问题。
请参阅附图3，附图3是本发明第三实施例提供的运动单粒子的荧光寿命信息获取系统的结构示意图，为了便于说明，仅示出了与本发明实施例相关的部分。附图3示例的运动单粒子的荧光寿命信息获取系统，主要包括：宽场激发模块301、图像获取模块302、定位模块303、扫描模块304、寿命获取模块305、判断模块306。
宽场激发模块301，用于对样品进行宽场激发。
图像获取模块302，用于获取样品中被激发的运动单粒子的荧光图像。
定位模块303，用于对荧光图像中的运动单粒子进行定位。
扫描模块304，用于根据定位结果确定扫描区域，对确定的扫描区域内的运动单粒子进行扫描。
寿命获取模块305，用于根据扫描结果获取运动单粒子的荧光寿命信息。
判断模块306，用于判断运动单粒子的位置是否超出预置的检测范围。
若否，则通过图像获取模块302获取样品中被激发的运动单粒子的荧光图像。
上述各功能模块实现各自功能的具体过程，可参考前述第一实施例提供的运动单粒子的荧光寿命信息获取方法的相关内容，此处不再赘述。
本发明实施例提供的运动单粒子的荧光寿命信息获取系统，通过对样品进行宽场激发，获取样品中被激发的运动单粒子的荧光图像，对荧光图像中的运动单粒子进行定位，根据定位结果确定扫描区域，对确定的扫描区域内的运动单粒子进行扫描，根据扫描结果获取运动单粒子的荧光寿命信息，判断运动单粒子的位置是否超出预置的检测范围，若否，则执行获取样品中被激发的运动单粒子的荧光图像的步骤。相较于现有技术，本发明能够根据对单粒子的定位结果，实时调整扫描区域，从而实时掌控运动单粒子的运动位置并据此获取其荧光寿命信息，解决了现有技术中无法检测运动粒子的寿命信息的问题。
请参阅附图4，附图4是本发明第四实施例提供的运动单粒子的荧光寿命信息获取系统的结构示意图，为了便于说明，仅示出了与本发明实施例相关的部分。附图4示例的运动单粒子的荧光寿命信息获取系统，主要包括：宽场激发模块401、图像获取模块402、定位模块403、扫描模块404、寿命获取模块405、判断模块406、数据处理模块407。
宽场激发模块401，用于对样品进行宽场激发。
图像获取模块402，用于获取样品中被激发的运动单粒子的荧光图像。
定位模块403，用于通过单粒子定位算法，对荧光图像中的运动单粒子进行定位。
扫描模块404，用于将以定位结果中运动单粒子的坐标所在位置为中心的预置范围，确定为扫描区域，对确定的扫描区域内的运动单粒子进行扫描。
寿命获取模块405，用于对扫描区域的荧光光子进行时间相关单光子计数，并根据时间相关单光子计数结果拟合计算扫描区域的运动单粒子的荧光寿命信息。
判断模块406，用于判断运动单粒子的位置是否超出预置的检测范围。
若否，则通过图像获取模块402获取样品中被激发的运动单粒子的荧光图像。
数据处理模块407，用于根据获取的定位结果和定位结果对应的运动单粒子的荧光寿命信息，构建运动单粒子的荧光寿命轨迹图像。
宽场激发模块401包括：第一激光器、第一透镜对、第一双色镜、第一管镜、第二双色镜及第一物镜；
图像获取模块402包括：第二物镜、第三管镜、第二滤光片、面阵探测器及终端设备；
定位模块403具体为：终端设备；
扫描模块404包括：第二激光器、第二透镜对、棱镜、反射镜组、声光偏转器、第一双色镜、第一管镜、第二双色镜、第一物镜及终端设备；
寿命获取模块405包括：第一物镜、第二双色镜、第二管镜、第一滤光片、光电倍增管、时间相关单光子计数器及终端设备；
判断模块406具体为终端设备；
数据处理模块407具体为终端设备
上述各功能模块实现各自功能的具体过程，可参考前述第一实施例和第二实施例提供的运动单粒子的荧光寿命信息获取方法的相关内容，此处不再赘述。
附图5是本发明第四实施例提供的运动单粒子的荧光寿命信息获取系统的具体结构示意图，本实施例提供的系统具体包括：
第一激光器Laser1、第二激光器Laser2、棱镜Prism、声光偏转器AOD、第一双色镜DM1、第二双色镜DM2、第一透镜对Lens1、第二透镜对Lens2、反射镜组Reflector、第一管镜TL1、第二管镜TL2、第三管镜TL3、第一物镜O1、第二物镜O2、样品Sample、第一滤光片Filter1、第二滤光片Filter2、光电倍增管PMT、时间相关单光子计数器TCSPC、面阵探测器、终端(图中未示出)，其中样品Sample设置于载物台上。在本实施例中，面阵探测器采用电子倍增型电荷耦合器件。
第一透镜对Lens1，设置于第一激光器Laser1与第一双色镜DM1之间；第二透镜对Lens2、棱镜Prism、反射镜组Reflector、声光偏转器AOD依次设置于第二激光器Laser2与第一双色镜DM1之间；第一管镜TL1、第二双色镜DM2、第一物镜O1依次设置于第一双色镜DM1和样品Sample之间；第一物镜O1、第二双色镜DM2、第二管镜TL2、第一滤光片Filter1依次设置于样品Sample和光电倍增管PMT之间；第二物镜O2、第三管镜TL3、第二滤光片Filter2依次设置于样品Sample和面阵探测器EMCCD之间；
光电倍增管PMT和时间相关单光子计数器TCSPC之间电性连接；
终端分别与第二激光器Laser2、时间相关单光子计数器TCSPC、面阵探测器EMCCD及声光偏转器AOD电性连接。
第一激光器Laser1用于对样品中荧光粒子进行全场照射，第二激光器Laser2则用于扫描激发焦点处的荧光粒子，棱镜用于对脉冲激光进行色散补偿，提高光束质量，如果缺少棱镜，激光会由于AOD的色散作用造成聚焦光斑发散，严重影响系统分辨率和成像效果。第一双色镜DM1用于将两个激光器发出的光合为一束，其中第一激光器Laser1所发出的光以45度角射到第一双色镜DM1一侧表面上产生反射，第二激光器Laser2所发出的光经过棱镜Prism和声光偏转器AOD后，入射到第一双色镜DM1另一侧产生透射。光电倍增管PMT与时间单光子计数器TCSPC通过电缆连接，用于对接收到的光子按光子到达时间进行计数统计。终端同时连接EMCCD、声光偏转器AOD、第二激光器Laser2和时间相关单光子计数器TCSPC，用于荧光图像记录、单粒子定位、判断、反馈控制、寻址扫描、光子收集和计数。电脑主机还用于进行数据拟合处理和运动粒子荧光寿命运动轨迹的构建。
Laser1可选用输出波长为488纳米(与荧光粒子吸收波长对应)的CW半导体激光器，采用面照明的方式，利用第一物镜O1对样品进行全场激发，并通过面阵探测器采用电子倍增型CCD探测器EMCCD获取粒子荧光图像，用于选取目标粒子。Laser2可选用输出波长为800纳米的蓝宝石飞秒脉冲激光器，作为寿命探测的激发光源。在光路中，脉冲激发光经棱镜Prism和声光偏转器AOD聚焦到样品上做快速寻址扫描，用于激发样品中感兴趣的粒子。样品发出的荧光光子用相对的两个物镜O1和O2收集，分别送入PMT和EMCCD，前者将接收到的光子信号送入TCSPC用于光子计数，后者将接收到的荧光图像送入主机，通过调用单粒子定位程序计算得到粒子坐标，并控制AOD以粒子坐标为中心扫描一个9×9像素(以能涵盖粒子光斑为准)的区域。扫描过程中同时开启CCD记录该时刻粒子的荧光图像，用于新一轮的粒子定位计算和AOD扫描区域控制，并以此循环。
上述元器件中，EMCCD可以更换为CMOS相机或其他灵敏度较高的面阵探测器，PMT可更换为雪崩二极管(APD)等点探测器，棱镜可以更换为棱镜对或光栅对，双物镜对焦的探测方式可以更换为单物镜收集加双色镜分光探测的模式。
以甘油中运动的直径100纳米荧光珠的实验为例，实验步骤如下：
(1)打开CW激光器Laser1，通过Laser1的控制器或设于第一透镜对Lens1前侧的中性密度滤光片(图中未示出)来控制照明强度；打开脉冲激光器Laser2并调整波长至800纳米；打开EMCCD、PMT、TCSPC、AOD的控制器或电源。
(2)调节物镜O2的位置以实现对样品的对焦，调整样品Sample所在载物台的位置以确定目标荧光珠，终端控制EMCCD实时拍摄荧光珠的强度图像，EMCCD将拍摄到的图像发送给终端，终端根据EMCCD拍摄的图像，运用单粒子定位算法程序计算粒子坐标，并通过粒子坐标信息和选框大小信息控制AOD以粒子坐标为中心扫描与预设选框等大的区域。同时PMT记录荧光信号并送入TCSPC进行单光子计数，TCSPC将计数结果发送给终端。
(3)在AOD扫描一个区域的同时，EMCCD实时拍摄荧光珠的强度图像，以获取该时刻的荧光图像，终端根据EMCCD实时上传的图像重新计算粒子坐标，并根据重新计算得到的粒子坐标信息控制下一轮的AOD扫描、PMT探测和TCSPC计数。该过程循环进行，直至程序结束。即每当终端发现粒子的坐标发生了改变，就会调整AOD的扫描区域，以使AOD能实时准确地对运动粒子进行扫描获取荧光寿命信息。程序结束的方式可以但不限于包括：粒子坐标超出EMCCD的拍摄范围或用户终止程序。
进一步地，可以预先设置一个感兴趣的区域，当检测到粒子坐标超出该感兴趣区域时结束程序。
(4)数据采集结束后，读取单粒子定位程序每一时刻计算得到的粒子坐标数据，即可直接构建粒子的运动轨迹图(如图6所示)；对AOD每一帧、每个像素得到的TCSPC单光子计数结果进行单指数或多指数拟合，可获取每个像素对应的荧光寿命值；将粒子运动轨迹和粒子在每个位置的荧光寿命信息结合在一起，可构建一条以荧光寿命值为彩色标记的运动粒子荧光寿命轨迹(如图7所示)，直观显示粒子在其运动过程中荧光寿命值的变化情况，反映粒子运动过程中与其周围(沿其运动路径)微环境的相互作用过程。也可以将AOD每一帧扫描得到的各个像素的光子数合并统计，计算出粒子在每一时刻的平均寿命值。图6为粒子运动轨迹信息图，图7为粒子的荧光寿命轨迹图，图7中通过粒子颜色的不同来表示粒子运动到各个坐标点时的荧光寿命值的不同，由于专利申请附图中无法显示颜色，因此无法在图中看出。在图7中我们用数字来表示其运动轨迹，图中运动粒子按数字1到49的顺序运动。
本发明实施例提供的运动单粒子的荧光寿命信息获取系统，通过对样品进行宽场激发，获取样品中被激发的运动单粒子的荧光图像，对荧光图像中的运动单粒子进行定位，根据定位结果确定扫描区域，对确定的扫描区域内的运动单粒子进行扫描，根据扫描结果获取运动单粒子的荧光寿命信息，判断运动单粒子的位置是否超出预置的检测范围，若否，则执行获取样品中被激发的运动单粒子的荧光图像的步骤。相较于现有技术，本发明能够根据对单粒子的定位结果，实时调整扫描区域，从而实时掌控运动单粒子的运动位置并据此获取其荧光寿命信息，解决了现有技术中无法检测运动粒子的寿命信息的问题。
需要说明的是，对于前述的各方法实施例，为了简便描述，故将其都表述为一系列的动作组合，但是本领域技术人员应该知悉，本发明并不受所描述的动作顺序的限制，因为依据本发明，某些步骤可以采用其它顺序或者同时进行。其次，本领域技术人员也应该知悉，说明书中所描述的实施例均属于优选实施例，所涉及的动作和模块并不一定都是本发明所必须的。
在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详述的部分，可以参见其它实施例的相关描述。
以上为对本发明所提供的运动单粒子的荧光寿命信息获取方法及系统的描述，对于本领域的技术人员，依据本发明实施例的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (6)

1.一种运动单粒子的荧光寿命信息获取方法，其特征在于，所述方法包括：
对样品进行宽场激发；
获取所述样品中被激发的运动单粒子的荧光图像；
对所述荧光图像中的所述运动单粒子进行定位；
根据定位结果确定扫描区域，对确定的扫描区域内的所述运动单粒子进行扫描，根据扫描结果获取所述运动单粒子的荧光寿命信息；
所述根据定位结果确定扫描区域，对确定的扫描区域内的所述运动单粒子进行扫描，根据扫描结果获取所述运动单粒子的荧光寿命信息，包括：
将以定位结果中运动单粒子的坐标所在位置为中心的预置范围，确定为扫描区域，对确定的扫描区域内的所述运动单粒子进行扫描；在扫描过程中同时获取该时刻粒子的荧光图像，用于新一轮的粒子定位计算和确定扫描区域；
对所述扫描区域的荧光光子进行时间相关单光子计数，并根据时间相关单光子计数结果拟合计算扫描区域的运动单粒子的荧光寿命信息；
判断所述运动单粒子的位置是否超出预置的检测范围，若否，则执行所述获取所述样品中被激发的运动单粒子的荧光图像的步骤；
其中，宽场激发，是以激光或汞灯为激发光源对样品进行照射，所述运动单粒子为运动荧光粒子；
所述判断所述运动单粒子的位置是否超出预置的检测范围，包括：若所述运动单粒子的位置超出预置的目标运动区域，则判断所述运动单粒子的位置超出预置的检测范围；或，若所述运动单粒子的位置超出所述荧光图像的获取范围，则判断所述运动单粒子的位置超出预置的检测范围。
2.如权利要求1所述的运动单粒子的荧光寿命信息获取方法，其特征在于，所述方法还包括：
根据获取的所述定位结果和所述定位结果对应的所述运动单粒子的荧光寿命信息，构建所述运动单粒子的荧光寿命轨迹图像。
3.如权利要求2所述的运动单粒子的荧光寿命信息获取方法，其特征在于，所述对所述荧光图像中的所述运动单粒子进行定位，包括：
通过单粒子定位算法，对所述荧光图像中的所述运动单粒子进行定位。
4.一种运动单粒子的荧光寿命信息获取系统，其特征在于，所述系统包括：
宽场激发模块，用于对样品进行宽场激发；
图像获取模块，用于获取所述样品中被激发的运动单粒子的荧光图像；
定位模块，用于对所述荧光图像中的所述运动单粒子进行定位；
扫描模块，用于根据定位结果确定扫描区域，对确定的扫描区域内的所述运动单粒子进行扫描；
寿命获取模块，用于根据扫描结果获取所述运动单粒子的荧光寿命信息；
判断模块，用于判断所述运动单粒子的位置是否超出预置的检测范围，若否，则获取所述样品中被激发的运动单粒子的荧光图像；
其中，宽场激发，是以激光或汞灯为激发光源对样品进行照射，所述运动单粒子为运动荧光粒子；
所述定位模块，具体用于通过单粒子定位算法，对所述荧光图像中的所述运动单粒子进行定位；
所述扫描模块，具体用于将以定位结果中运动单粒子的坐标所在位置为中心的预置范围，确定为扫描区域，对确定的扫描区域内的所述运动单粒子进行扫描；在扫描过程中同时获取该时刻粒子的荧光图像，用于新一轮的粒子定位计算和确定扫描区域；
所述寿命获取模块，具体用于对所述扫描区域的荧光光子进行时间相关单光子计数，并根据时间相关单光子计数结果拟合计算扫描区域的运动单粒子的荧光寿命信息；
所述判断模块，具体用于若所述运动单粒子的位置超出预置的目标运动区域，则判断所述运动单粒子的位置超出预置的检测范围，或，若所述运动单粒子的位置超出所述荧光图像的获取范围，则判断所述运动单粒子的位置超出预置的检测范围。
5.如权利要求4所述的运动单粒子的荧光寿命信息获取系统，其特征在于，所述系统还包括：
数据处理模块，用于根据获取的所述定位结果和所述定位结果对应的所述运动单粒子的荧光寿命信息，构建所述运动单粒子的荧光寿命轨迹图像。
6.如权利要求5所述的运动单粒子的荧光寿命信息获取系统，其特征在于，所述宽场激发模块包括：第一激光器、第一透镜对、第一双色镜、第一管镜、第二双色镜及第一物镜；
所述图像获取模块包括：第二物镜、第三管镜、第二滤光片、面阵探测器及终端设备；
所述定位模块具体为：所述终端设备；
所述扫描模块包括：第二激光器、第二透镜对、棱镜、反射镜组、声光偏转器、第一双色镜、第一管镜、第二双色镜、第一物镜及所述终端设备；
所述寿命获取模块包括：第一物镜、第二双色镜、第二管镜、第一滤光片、光电倍增管、时间相关单光子计数器及所述终端设备；
所述判断模块具体为所述终端设备；
所述数据处理模块具体为所述终端设备；
所述第一透镜对，设置于所述第一激光器与所述第一双色镜之间；
所述第二透镜对、所述棱镜、所述反射镜组、所述声光偏转器依次设置于所述第二激光器与所述第一双色镜之间；
所述第一管镜、所述第二双色镜、所述第一物镜依次设置于所述第一双色镜和所述样品之间；
所述第一物镜、所述第二双色镜、所述第二管镜、所述第一滤光片依次设置于所述样品和所述光电倍增管之间；
所述第二物镜、所述第三管镜、所述第二滤光片依次设置于所述样品和所述面阵探测器之间；
所述光电倍增管和所述时间相关单光子计数器之间电性连接；
所述终端设备分别与所述第二激光器、所述时间相关单光子计数器、所述面阵探测器及所述声光偏转器电性连接。
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