CN110057294B - 光镊系统微粒轴向纳米级位移测量方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种光镊系统微粒轴向纳米级位移测量方法，包括下列步骤：在光镊系统的成像光路探测端放置CMOS相机，运行光镊系统；固定待测微粒；测量标定；测量参数设定及优化；对于实时微粒的图像，按照以上优化好的图像处理参数得到实时的平方梯度值；将平方梯度值代入拟合关系式中，最终得微粒的实时轴向位置。

Description

光镊系统微粒轴向纳米级位移测量方法

技术领域

本发明涉及光镊检测技术领域，尤其涉及一种微粒轴向位置测量方法。

背景技术

常规光镊系统多数为生物力谱测试实验而设计的。采用二维操控微粒技术，关注粒子横向位置的动态测量。通常情况下系统的主要性能指标就是横向位移分辨力，并且系统也是主要围绕这个进行搭建，探测器和控制部件都是围绕这两个方向位移的测量而选取使用的。而越来越多的生物测试需求对粒子的轴向纳米级运动提出了新的测量需求，要求在现有光镊技术基础上集成微粒的轴向测量能力。

液体环境中的粒子三维定位及跟踪方法包括：临界角法，数字全息显微法，立体成像法，色彩共焦系统法，散射光干涉法等。这些方法更改系统结构，增加探测器件，直接引用到光镊系统上会对原系统产生影响。现有技术的光学测量方法通常存在着测试流程复杂，耗时高，影响原系统，适用条件严格等缺点。

发明内容

基于上述技术问题，本发明提供一种光镊系统中微粒轴向位置的测量方法，具有测试简单，适用性强的优点。技术方案如下：

一种光镊系统微粒轴向纳米级位移测量方法，包括下列步骤：

(1)在光镊系统的成像光路探测端放置CMOS相机，运行光镊系统；

(2)固定待测微粒

1)将被测样品池装载到位移台上；

2)控制位移台，使其沿轴向方向运动Z₀，使光阱的中心位置到载玻片的距离为Z₀；

3)使用光阱捕获单个微粒；

4)计算整个光镊系统的景深DOF，根据景深DOF选取标定范围Z_c并选取微粒偏移光阱中心位移量Δz；

5)调节位移台的轴向位置，使其向着微粒的方向移动Z₀'：Z₀'＝Z₀-R_p+Δz，其中，Z₀为初始阱的中心位置到载玻片的距离，R_p为已知被测试粒子的半径；

(3)测量标定

1)使位移台以预设的步进精度沿轴向标定方向运动，每当位移台运动到一个新位置Z，CMOS相机记录全视场成像并剪裁被测对象成像部分的图像；

2)将采集的被测对象成像部分的图像滤波去噪，计算每一副图像的平方梯度G_{sq_grad}；

(3)、将G_{sq_grad}值归一化并与微粒的轴向位置对应，将二者的函数关系进行线性拟合，得出：G_n＝kz+b，其中:G_n为归一化后的梯度值，k，b为线性拟合系数；

(4)测量参数设定及优化

1)计算线性拟合产生的残差平方和，并计算其2范数得到测量偏差S；

2)利用线性拟合得到的斜率的绝对值k以及S构成系统优化判据：S<49.5k；

3)不断调试粒子形貌参数以及图像处理参数，直到拟合直线满足优化判据；

(5)测量结果

1)对于实时微粒的图像，按照以上优化好的图像处理参数得到实时的平方梯度值；

2)将平方梯度值代入拟合关系式中，最终得微粒的实时轴向位置z。

本发明光镊系统微粒轴向位移测量方法具有以下有益效果：

(1)将图像梯度离焦检测技术用于光镊系统中粒子轴向位置的测量，不仅不影响传统的光镊系统结构，而且简单快速地实现了高精度的纳米级位置测量；该方法还具有扩展性，不仅适用于光镊系统，也同样适用于其他显微系统中液体环境中粒子轴向位置的测量；

(2)使用光镊自身的捕获力学特性固定微粒实现标定，使得标定与测量两个过程中的被测对象保持一致，突破现有方法标定测量不同源的问题，减小测量误差，提高测量准确性；

(2)使用直线曲线拟合的方法来获得测量参照标准曲线，保证测试计算过程足够简单，提高运算速度；

(4)通过直线拟合的相关参数形成优化判据，可以对多种测量相关参数进行便捷优化，能够有效减小误差，提高精度，实现测量结果的优化；

(5)照明光路和光阱光路部分重合，实现光路优化设计，科勒照明能够有效保障视场光照的均匀性，减少背景噪声；

(6)测量过程中，通过相机监测微粒的成像并使用处理程序实时计算平方梯度便可以实时获得微粒的轴向位置信号，测量具有实时性，可动态监测微粒的位置变化。

附图说明

图1为本发明实施例轴向位置测量方法的步骤示意图。

图2为本发明实施例提供的轴向位置测量方法中使用光阱与玻片固定微粒进行标定的示意图。

图3为本发明实施例提供的轴向位置测量方法中标定拟合曲线示意图。

图4为本发明实施例提供的轴向位置测量设备的结构示意图。

【附图中本发明实施例主要元件符号说明】

10-LED； 20-压电陶瓷位移台； 30-科勒照明组件；

40-二向色镜； 50-物镜； 60-成像系统；

31-科勒镜； 32-孔径光阑； 33-视场光阑；

34-科勒成像物镜； 61-转接透镜； 62-CMOS相机；

具体实施方式

本发明实施例提供的微粒轴向位置测量方法，将图像梯度离焦检测技术用于光镊系统中粒子轴向位置的测量，不仅不影响传统的光镊系统结构，而且简单快速地实现了高精度的纳米级位置测量。

本发明的微粒轴向位移测量方法，如图1所示，包括：步骤(1)：利用CMOS相机构建适用于光镊系统的亮场显微成像光路；步骤(2)：装载样品并使用光镊捕获待测微粒，利用光学陷阱的力学特性以及玻片固定待测微粒；步骤(3)：驱动压电陶瓷样品位移台带动粒子在焦点附近沿轴向步进运动，记录图像梯度获取并拟合标定曲线；步骤(4)：改变微粒的形貌参数以及图像处理参数以优化测量能力；以及步骤(5)：根据标定曲线来实时计算微粒的轴向位移。

图2为本发明实施例提供的轴向位置测量方法中使用光阱与玻片固定微粒进行标定的示意图。

所述步骤(2)包括：装载样品并使用光镊捕获待测微粒，利用光学陷阱的力学特性以及玻片固定待测微粒。先将被测样品池装载到位移台上。光镊系统的光阱捕获微粒时，为获得良好的光阱刚度和捕获效率，通常将光阱位置调节到距载玻片Z₀处的液体环境中，即如图2a所示的状态。Z₀一般为十几微米且已知。

能够实现离焦检测的范围可以通过数字显微镜系统的景深计算式得到：

其中,n为系统油浸物镜折射率，本套系统中与水的折射率相匹配，取n＝1.33，λ＝780nm为LED照明光波长，NA为物镜的数值孔径，NA＝1.2，e为二倍的相机最小像素点尺寸，相机的标称像素尺寸为5.3μm，β和β_r分别为物镜和转接镜的放大倍率，分别为63和1，系统由于照明条件导致的物镜数值孔径达不到标称的最大值，以比例系数k调整，取k＝0.9。

根据测量范围需求，取标定范围Z_c小于景深DOF数值的一半：

Z_c＝500nm

并取微粒偏离光阱中心的位移Δz大于Z_c，以保证微粒始终偏离光阱中心并被固定。由于系统中介质折射率不匹配，引入了球差导致在整个光阱的轴向位置上的光阱刚度不是对称的。在靠近玻片时的光阱刚度比远离玻片时的大。即在标定移动的过程中，光阱刚度是逐渐变小的，而Δz也是在逐渐减小的，这就会导致在标定进行到靠近光阱中心位置的时候，微粒受的固定力过小，产生不稳定的移动。所以为增加标定过程中粒子被固定的稳定性，防止标定进行到光阱中心附近，应该适当增大Δz。实际实验中取Δz为600nm左右。

调节位移台的Z轴位置，使图2a中的载玻片向着微粒的方向移动Z₀'，Z₀'可由下式计算得到：

Z₀′＝Z₀-R_p+Δz

其中，R_p为被测试粒子的半径，Δz为微粒偏离光阱中心的位移。

这时玻片表面贴紧微粒表面，并使微粒偏离光阱中心Δz，即如图2b所示的状态，微粒将受到轴向的光阱回复力F_Z和玻片的支持力F_倰而保持力平衡，被强制固定在玻片表面。光阱回复力F_Z可由下式计算得到：

F_Z＝k_tΔz

其中，k_t为轴向的光阱刚度，它是光镊系统中光阱轴向位置的函数，因不同光镊系统而异。

此时，若在Δz的范围内沿着图2b中所示的轴向标定方向移动压电陶瓷位移台，微粒会随着玻片同步运动。在这种情况下，便可以步进控制位移台以完成标定工作。

所述步骤(3)包括：驱动压电陶瓷样品位移台带动粒子在焦点附近沿轴向步进运动，记录图像梯度获取并拟合标定曲线。随后设定位移台在标定范围Z_c内以10nm的步进精度沿轴向标定方向运动，步进的时间间隔在0.5s左右，每当位移台运动到一个新位置，相机便记录全视场成像并剪裁被测对象成像部分的图片输入到处理程序中。

通过图像滤波以及梯度算法获取成像图片的平方梯度。将获得的图片利用图像中值滤波器去噪声处理，求取每一副二维灰度图像中任意相邻两个像素点的灰度差值的平方和，即:

G_{sq_grad}＝∑_Hight∑_Width(i(x+1，y)-i(x，y))²

其中，i(x，y)表示每个像素点的灰度值，Hight和Width分别为图像的像素高度和宽度，G_{sq_grad}为图像总平方梯度和。

图3为本发明实施例提供的轴向位置测量方法中标定拟合曲线示意图。

如图3所示，其中：将G_{sq_grad}值归一化并与微粒的轴向位置z一一对应，取所需部分曲线进行线性函数拟合，可取图3中0-500nm具有较好线性关系的部分参与拟合计算，可以获得二者之间的关系为：

G_h＝kz+b

其中:G_n为归一化后的梯度值，z为微粒相对于梯度最大值处的轴向位置，线性拟合系数k<0，b＞0。

图4为本发明实施例提供的轴向位置测量设备的结构示意图。

如图4所示，本发明还提供一种轴向位置测量设备设备，包括：LED光源10，用于发射照明单色光，图4中黑色实线；压电陶瓷三维样品微动台20，用于放置被测样品以及提供测量基准和步进运动，运动精度在纳米级；光束处理装置30，与所述光源连接，用于将所述光源发出的光束调制为科勒照明光场；以及光束接收装置60，用于接收被测微粒的成像图片，并执行如下操作：步骤a：记录微粒在不同轴向位置的成像图片；步骤b：滤波并计算成像图片的平方梯度，按照线性关系与轴向位置拟合；以及步骤c：根据拟合曲线计算测量微粒的轴向位置。

光阱激光为图4中虚线，光阱激光光路和照明光路部分重合，所述轴向位移测量设备还包括：两个二向色镜40，分别设置在所述照明光源入射样品台之前41和出射样品台之后42，用于改变光阱激光的方向，并区分照明光束与光阱激光。

所述光束处理装置30包括：两组透镜，沿所述光源的出射光路设置，前组透镜为科勒镜31，后组透镜为成像物镜34；以及两个光阑，放置在两组透镜的中间，在紧靠科勒镜后放置第一个光阑32，在成像物镜的前焦平面放置第二个光阑33。分别用于限制进入科勒镜的光束孔径和照明光源的视场。

所述光束处理装置30还包括：两个参数相同的物镜50，沿所述照明光源的出射光路设置在所述样品微动台20的两侧，用于聚焦光阱激光形成光学陷阱，并将所述照明光束照射在被测微粒上；其中，所述物镜为油浸物镜且放大倍数为63倍。

在本发明的一些实施例中，所述光束接收装置60包括：转接镜61，将所述照明光束最终成像到相机的感光阵列上；以及COMS相机或CCD相机62。

至此，已经结合附图对本发明实施例进行了详细描述。需要说明的是，在附图或说明书正文中，未绘示或描述的实现方式，均为所属技术领域中普通技术人员所知的形式，并未进行详细说明。此外，上述对各元件和方法的定义并不仅限于实施例中提到的各种具体结构、形状或方式，本领域普通技术人员可对其进行简单地更改或替换。

依据以上描述，本领域技术人员应当对本发明提供的光镊系统微粒轴向位置方法及设备有了清楚的认识。

综上所述，本发明提供的微粒轴向位置测量方法及设备中，将图像梯度离焦检测技术用于光镊系统中粒子轴向位置的测量，不仅不影响传统的光镊系统结构，而且简单快速地实现了高精度的纳米级位置测量。

还需要说明的是，实施例中提到的方向用语，例如“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”等，仅是参考附图的方向，并非用来限制本发明的保护范围。贯穿附图，相同的元素由相同或相近的附图标记来表示。在可能导致对本发明的理解造成混淆时，将省略常规结构或构造。

并且图中各部件的形状和尺寸不反映真实大小和比例，而仅示意本发明实施例的内容。另外，在权利要求中，不应将位于括号之间的任何参考符号构造成对权利要求的限制。

Claims (1)

1.一种光镊系统微粒轴向纳米级位移测量方法，包括下列步骤：

(1)在光镊系统的成像光路探测端放置CMOS相机，运行光镊系统；

(2)固定待测微粒

1)将被测样品池装载到位移台上；

2)控制位移台，使其沿轴向方向运动Z₀，使光阱的中心位置到载玻片的距离为Z₀；

3)使用光阱捕获单个微粒；

4)计算整个光镊系统的景深DOF，根据景深DOF选取标定范围Z_c并选取微粒偏移光阱中心位移量Δz；

5)调节位移台的轴向位置，使其向着微粒的方向移动Z₀′：Z₀′＝Z₀-R_p+Δz，其中，Z₀为初始阱的中心位置到载玻片的距离，R_p为已知被测试粒子的半径；

(3)测量标定

1)使位移台以预设的步进精度沿轴向标定方向运动，每当位移台运动到一个新位置Z，CMOS相机记录全视场成像并剪裁被测对象成像部分的图像；

2)将采集的被测对象成像部分的图像滤波去噪，计算每一副图像的平方梯度G_{sq_grad}；

(3)、将G_{sq_grad}值归一化并与微粒的轴向位置对应，将二者的函数关系进行线性拟合，得出：G_n＝kz+b，其中:G_n为归一化后的梯度值，k,b为线性拟合系数；

(4)测量参数设定及优化

1)计算线性拟合产生的残差平方和，并计算其2范数得到测量偏差S；

2)利用线性拟合得到的斜率的绝对值k以及S构成系统优化判据：S<49.5k；

3)不断调试粒子形貌参数以及图像处理参数，直到拟合直线满足优化判据；

(5)测量结果

1)对于实时微粒的图像，按照以上优化好的图像处理参数得到实时的平方梯度值；

2)将平方梯度值代入拟合关系式中，最终得微粒的实时轴向位置z。

Images