CN113209358A - 组织粘合剂及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种组织粘合剂，所述组织粘合剂包括相互不接触的A组分和固化引发剂；所述A组分至少包括重组人釉原蛋白和高分子载体材料。本发明产品的临床应用广泛，可开发为多种组织修复用制品，可带来巨大的社会效益和经济效益。

Description

组织粘合剂及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及生物医用材料领域，特别是涉及组织粘合剂及其制备方法和用途。

背景技术

釉基质蛋白(Enamel matrix proteins,EMPs)是牙齿发育到钟状期，内釉上皮细胞分化来的成釉细胞合成并分泌的细胞外基质蛋白。釉原蛋白(Amelogenin，Am)是EMPs中最主要的成分，占90％以上，由成釉细胞中Am基因指导合成的一组分子量为5～27kD的蛋白和多肽。70年代提出EMPs参与牙根发育、牙周组织形成，并能诱导无细胞牙骨质形成。目前EMPs是唯一经临床验证能诱导实现完全牙周组织再生的生物活性蛋白。目前广泛应用于牙周再生的基础研究和临床应用的EMPs均为提取的猪釉基质蛋白。

有瑞士出产的商品

的主要成分为猪牙胚提取的釉基质蛋白衍生物，在国外应用已近20年，但一直未在国内上市。迄今为止我国尚无类似用于牙周再生的临床药物，用于基础及临床研究的蛋白制品依赖进口或由各实验室自行提取，缺乏统一标准，售价昂贵，成本较高。由于提取EMPs的来源受限，只能是动物牙胚的发育期牙釉质，而Am则是EMPs中的主要活性成分，因此应用基因工程技术制备的重组人釉原蛋白(recombinedhuman Amelogenin，rhAm)可解决EMPs来源受限的问题，但仍具有活性多肽的局限性，半衰期短，进入组织后迅速扩散，易被蛋白酶所水解等问题，因而寻找一种合适的载体，以实现rhAm在一定周期内的持续控制释放，从而增强生物学效应，降低临床使用剂量，同时获得良好的促进组织再生和骨诱导活性，乃是牙周组织再生以及骨修复材料研究的难点。

由于牙周炎症、肿瘤、以及颅颌面外伤等导致严重骨缺损，对骨组织再生材料的需求日益增加，Bio-Oss(Geistlich，瑞士)是一种去蛋白牛骨材料，是目前临床上骨组织再生手术中常用的骨替代材料。但其因不具有骨诱导能力，仅有骨引导的支架作用、可塑性较低、空间维持能力差、临床操作具有较高的技术敏感性，从而影响了它的临床表现。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种组织粘合剂及其制备方法和用途，用于解决现有技术中牙周组织再生手术中存在再生和修复不易操作、价格昂贵以及技术敏感性高的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明是通过包括如下技术方案获得的。

本发明提供一种组织粘合剂，所述组织粘合剂包括相互不接触的A组分和固化引发剂；所述A组分至少包括重组人釉原蛋白和高分子载体材料。

优选地，相对于A组分，所述固化引发剂的使用量为0.1～0.5wt％。

根据上述所述的组织粘合剂，所述重组人釉原蛋白为通过基金工程技术人工合成的。

优选地，所述高分子载体材料为选自甲基丙烯酰化改性的天然高分子材料和/或甲基丙烯酰化改性的合成可吸收高分子材料。

更优选地，所述天然高分子材料选自明胶、胶原、丝素蛋白、壳聚糖、壳聚糖、透明质酸、海藻酸盐、纤维蛋白和纤维素中的一种或多种。更优选地，所述天然高分子材料选自明胶、胶原、丝素蛋白、透明质酸或硫酸软骨素中的一种或多种。

更优选地，选用天然酶聚合反应获得的透明质酸形成的水溶液，这种透明质酸能够降低感染人畜共患病的风险。

优选地，所述合成可吸收高分子材料选自聚乳酸、聚羟基乙酸、聚己内酯、聚乳酸乙醇酸共聚物、聚乳酸己内酯共聚物和聚乙二醇共聚物中的一种或多种。更优选地，所述合成可吸收高分子材料选自聚乳酸和聚乳酸乙醇酸共聚物中的一种或多种。

进一步优选地，所述高分子载体材料为选自甲基丙烯酰化透明质酸、甲基丙烯酰化硫酸软骨素和甲基丙烯酰化壳聚糖中的一种或多种。

优选地，所述组织粘合剂中，A组分还包括活性助剂。更优选地，所述活性助剂选自抗生素、抗炎药物、镇痛药物、生长因子、骨形态发生蛋白、羟基磷灰石或磷酸三钙中的一种或多种。

优选地，所述固化引发剂选自有机过氧化物引发剂、无机过氧化物引发剂、偶氮类引发剂以及氧化还原引发剂和光引发剂中的一种或多种。

更优选地，所述光引发剂为苯基-2,4,6-三甲基酰次膦酸锂(记为LAP)。

本申请还公开了一种组织粘合剂的制备方法，将A组分的各原料组分混合，A组分和固化引发剂分开包装，并灭菌。

优选地，所述灭菌步骤可采用γ辐照灭菌或环氧乙烷灭菌，优选地，灭菌方式采用γ辐照灭菌。

本发明还公开了如上述所述的组织粘合剂在制备用于组织修复制品中的用途。

本发明还公开了一种牙周组织再生诱导剂，包括如上述所述组织粘合剂，所述A组分含有水，且A组分中，重组人釉原蛋白有效浓度至少为20μg/mL。更优选地，所述高分子载体材料为甲基丙烯酰化透明质酸，甲基丙烯酰化透明质酸的浓度为1～5wt％。

本发明还公开了一种骨修复粘合剂，包括如上述所述组织粘合剂，所述A组分含有水，且A组分中，重组人釉原蛋白有效浓度至少为20μg/mL。优选地，所述高分子载体材料为甲基丙烯酰化硫酸软骨素，甲基丙烯酰化硫酸软骨素浓度为1～10wt％。

本发明还公开了一种软组织创口敷料，包括如上述所述组织粘合剂，所述A组分含有水，A组分中，重组人釉原蛋白有效浓度至少为40μg/mL，且含有活性助剂。优选地，所述高分子载体材料为甲基丙烯酰化壳聚糖，甲基丙烯酰化壳聚糖浓度为1～5wt％。优选地，所述软组织创口敷料还添加有醋酸地塞米松。更优选地，醋酸地塞米松的含量为0.1～0.5mg/mL。

本发明中，如上述所述的牙周组织再生诱导剂的临床应用包括：引导性牙周组织再生术、根分叉成型术、根面覆盖术、牙周加速正畸移动术、牙周骨缺损植骨术等。

本发明中，如上述所述的骨修复粘合剂的临床应用为非承重部位骨缺损的修复，包括：牙种植的同时应用骨再生术、拔牙后即刻种植体周围的骨增加术、拔牙后延期种植体周围的骨增加术、骨裂损处引导性骨再生术、局部牙槽嵴增高术、牙槽嵴扩展术、牙根切除术、囊肿切除术及残根拔除术后的骨缺损填充，用于上述植骨手术中骨替代材料的粘合固定。

本发明中，所述的软组织创口敷料的临床应用为皮肤创口的封闭止痛、口腔溃疡敷料、口腔内软组织移植物供区术后的创口封闭。

本发明提供的组织粘合剂，具有以下创新点与优势：

1)首次提出直接采用重组人釉原蛋白，可作为牙周组织再生技术中的一线用药，具有骨诱导作用的同时，可促进无细胞牙骨质形成，为功能性的牙周组织再生提供了可能；

2)从临床问题出发，通过高分子材料搭载重组人釉原蛋白，解决了活性多肽制剂半衰期短，易降解的缺点，同时可通过调控高分子材料的配比调节材料的降解周期，实现局部缺损活性制剂的缓释；

3)高分子载体材料的选择是由明胶、胶原、丝素蛋白、壳聚糖、透明质酸或硫酸软骨素等多种天然高分子材料单一或混合或改性而成，可以兼具良好的力学性能、降解性能、生物安全性和生物相容性，例如壳聚糖可提供一定的抗菌活性，保证产品即使暴露在口腔环境中也能抵御一定的细菌侵蚀；透明质酸能够促进软组织的愈合；硫酸软骨素能促进成骨活化；

4)组织粘结剂可以以凝胶的形式，负载多种生物活性因子或抗菌药物，可获得具有药物缓释作用的生物活性载药材料；

5)组织粘合剂可与骨替代材料按照一定比例混合，根据缺损形态调整塑形后固化，可提供一定的强度，维持骨组织再生所必需的空间维持作用，本发明产品的临床应用广泛，可开发为多种组织修复用制品，可带来巨大的社会效益和经济效益。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

本申请实施例中提供一种组织粘合剂，用于组织再生，其优势在于：具有组织再生和骨再生诱导能力，可降解，生物相容性好，生物安全性好。

在一个优选的实施方式中，所述组织粘合剂包括相互不接触的A组分和固化引发剂；所述A组分至少包括重组人釉原蛋白和高分子载体材料。相对于A组分，所述固化引发剂的使用量为0.1～0.5wt％。所述固化引发剂选自有机过氧化物引发剂、无机过氧化物引发剂、偶氮类引发剂以及氧化还原引发剂和光引发剂中的一种或多种。

在一个优选的实施方式中，所述高分子载体材料为选自甲基丙烯酰化改性的天然高分子材料和/或甲基丙烯酰化改性的合成可吸收高分子材料。所述天然高分子材料选自明胶、胶原、丝素蛋白、壳聚糖、壳聚糖、透明质酸、海藻酸盐、纤维蛋白和纤维素中的一种或多种；所述合成可吸收高分子材料选自聚乳酸、聚羟基乙酸、聚己内酯、聚乳酸乙醇酸共聚物、聚乳酸己内酯共聚物和聚乙二醇共聚物中的一种或多种。

在一个优选的实施方式中，所述组织粘合剂中，A组分还包括活性助剂，所述活性助剂选自抗生素、抗炎药物、镇痛药物、生长因子、骨形态发生蛋白、羟基磷灰石或磷酸三钙中的一种或多种。

本发明一个优选的实施方式中，还公开了采用如上述所述的组织粘合剂形成的一种牙周组织再生诱导剂，所述A组分含有水，且A组分中，重组人釉原蛋白有效浓度至少为20μg/mL。更优选地，所述高分子载体材料为甲基丙烯酰化透明质酸，甲基丙烯酰化透明质酸的浓度为1～5wt％。本发明中，如上述所述的牙周组织再生诱导剂的临床应用包括：引导性牙周组织再生术、根分叉成型术、根面覆盖术、牙周加速正畸移动术、牙周骨缺损植骨术等。

本发明一个优选的实施方式中，还公开了采用如上述所述的组织粘合剂形成的骨修复粘合剂，所述A组分含有水，且A组分中，重组人釉原蛋白有效浓度至少为20μg/mL。优选地，所述高分子载体材料为甲基丙烯酰化硫酸软骨素，甲基丙烯酰化硫酸软骨素浓度为1～10wt％。本发明中，如上述所述的骨修复粘合剂的临床应用为非承重部位骨缺损的修复，包括：牙种植的同时应用骨再生术、拔牙后即刻种植体周围的骨增加术、拔牙后延期种植体周围的骨增加术、骨裂损处引导性骨再生术、局部牙槽嵴增高术、牙槽嵴扩展术、牙根切除术、囊肿切除术及残根拔除术后的骨缺损填充，用于上述植骨手术中骨替代材料的粘合固定。

本发明一个优选的实施方式中，还公开了采用如上述所述的组织粘合剂形成的软组织创口敷料，所述A组分含有水，A组分中，重组人釉原蛋白有效浓度至少为40μg/mL。优选地，所述高分子载体材料为甲基丙烯酰化壳聚糖，甲基丙烯酰化壳聚糖浓度为1～5wt％。优选地，所述软组织创口敷料还添加有醋酸地塞米松。更优选地，醋酸地塞米松的含量为0.1～0.5mg/mL。本发明中，所述的软组织创口敷料的临床应用为皮肤创口的封闭止痛、口腔溃疡敷料、口腔内软组织移植物供区术后的创口封闭。

实施例1

本实施例中公开了一种重组人釉原蛋白的基因工程合成方法，具体步骤如下：

1)通过Genebank获得全长人釉原蛋白的cDNA编码序列，筛选该序列中不存在而在质粒pET28a(+)中存在克隆位点的内切酶将目的基因克隆入载体；

2)合成所述的全长人釉原蛋白基因，合成的全长人釉原蛋白基因上下游分别携带BamHI和XhoI酶切位点，通过双酶切将所述的全长人釉原蛋白基因插入改造后的载体质粒pET28a-SUMO；

3)将所述的质粒pET28a-SUMO-hAm送测序鉴定，将经鉴定的质粒pET28a-SUMO-hAm转化表达菌株E.coli.BL21感受态细胞，得到克隆表达菌株；

4)将所述的克隆表达菌株接种到含有卡那霉素的液体LB培养基中，活化过夜，按20％接种37℃培养2h，OD600值达0.6时，诱导，将细菌沉淀，冰上重悬，加入溶菌酶超声破菌，离心，取上清；

5)将所述的上清用滤器过滤后上镍柱，反复洗涤镍柱去除未结合的杂蛋白，加入蛋白酶，22℃消化过夜，收集蛋白rhAm。

实施例2

本实施例中公开了一种具体的组织粘合剂及其制备方法，用于牙周组织再生诱导剂。

牙周组织再生诱导剂是一种载重组人釉原蛋白的甲基丙烯酰化透明质酸水凝胶，可采用包括以下步骤的方法制得：

1)透明质酸(HA)的预处理：将一定量的透明质酸(HA)溶于水溶液中，搅拌至完全溶解，冷冻干燥后，4℃条件下储存备用；

2)取4g冻干的透明质酸粉末，加入200ml去离子水，磁力搅拌至完全溶解；

3)缓慢加入132ml二甲基甲酰胺，搅拌直至形成澄清的混合液后，再向其中缓慢加入582μl甲基丙烯酸酐，搅拌反应2小时；

4)加入500ml预冷的无水乙醇形成胶状沉淀；

5)最后将胶状沉淀取出后溶于100ml去离子水中，透析并冻干得到甲基丙烯酰化透明质酸(HAMA)；

6)将实施例1中获得的重组人釉原蛋白(rhAm)溶解于50mM醋酸中，配置母液浓度为2g/mL；

7)用含有0.2％光引发剂LAP的纯水配置2wt％HAMA，量取rhAm母液，与2wt％HAMA混合，使rhAm的终浓度达到20μg/mL，搅拌至完全溶解得到均一的药物缓释水溶液。

实施例3

本实施例中公开了一种具体的组织粘合剂及其制备方法，用于骨修复粘合剂。

骨修复粘合剂是一种载重组釉原蛋白的甲基丙烯酰化硫酸软骨素水凝胶，可采用以下步骤的方法制得：

1)将含有70％的4-硫酸软骨素和30％的6-硫酸软骨素溶解于去离子水中，配置质量体积比为25％的均相溶液；

2)在4℃磁力搅拌的条件下，按照1:8比例缓慢加入甲基丙烯酸酐，磁力搅拌24小时，至完全溶解；

3)通过添加氢氧化钠，调整pH值，使pH保持在8；所得产物甲基丙烯酸硫酸软骨素(ChSMA)在预冷的甲醇中沉淀，获得胶状沉淀；

4)取出胶状沉淀溶解于去离子水中，透析48小时后通过冷冻干燥回收，获得干燥的甲基丙烯酸硫酸软骨素(ChSMA)；

5)将实施例1中获得的重组人釉原蛋白(rhAm)溶解于50mM醋酸中，配置母液浓度为2g/mL；

6)用含有0.2％光引发剂LAP的纯水配置5wt％ChSMA，量取rhAm母液，与5wt％ChSMA混合，使rhAm的终浓度达到20μg/mL，搅拌至完全溶解得到均一的药物缓释水溶液。

实施例4

本实施例中公开了一种具体的组织粘合剂及其制备方法，用于软组织创口敷料。

软组织创口敷料是一种载重组釉原蛋白及活性助剂的甲基丙烯酰化壳聚糖水凝胶，可采用以下步骤方法制得：

1)将壳聚糖溶于去离子水中，制备质量体积比为10％的均相溶液；

2)在磁力搅拌条件下，按照0.1ml甲基丙烯酸酐/克壳聚糖比例缓慢加入到壳聚糖溶液中，磁力搅拌3小时，至完全溶解，获得甲基丙烯酰化壳聚糖(CSMA)；

3)用去离子水透析CSMA，去除未反应的甲基丙烯酸酐和其他副产物，冷冻干燥后回收；

4)将实施例1中获得的重组人釉原蛋白(rhAm)溶解于50mM醋酸中，配置rhAm母液浓度为2g/mL；

5)用含有0.2％光引发剂LAP的纯水配置5wt％CSMA，量取rhAm母液，与5wt％CSMA混合，使rhAm的终浓度达到40μg/mL，并加入醋酸地塞米松粉末，配置浓度为0.3mg/mL，搅拌至完全溶解得到均一的药物缓释水溶液。

实施例5

本实施例为含有rhAm组织粘合剂的降解试验。

通过无菌操作技术在37℃将实施例2、实施例3、实施例4样品可见光光照固化10s-30s后放置在DMEM培养基中，进行体外降解试验。

在0周(培养前)及培养2周、4周、8周分别取样，干燥后进行扫描电镜观察和拉伸强度测试。

实施例6

本实施例为含有rhAm组织粘合剂的细胞细胞相容性试验。

将人牙周膜细胞接种到实施例2、实施例3的混合液中，将人牙龈成纤维细胞接种到实施例4的混合液中，可见光光照固化30s后放置在DMEM培养基中进行2D培养，14天后活死细胞染色观察细胞在材料上的生长状况。

实施例7

本实施例为含有rhAm及抗菌药物的软组织辅料的抑菌活性试验。

首先将实施例4所得含有rhAm及活性助剂的软组织辅料滴入涂布有大肠杆菌或金黄色葡萄球菌的平板上光固化后形成凝胶块，对照组为不含rhAm及抗菌药物的软组织辅料，培养过夜，然后观察两者菌落生长情况。

实施例8

本实施例为含有rhAm的牙周组织再生诱导剂在牙周组织再生中的应用。

将实施例2中合成的溶液与人牙周膜细胞混合，涂抹载刮除牙骨质的人牙本质根片上，可见光固化后共培养，制作扫描电镜标本，观察根面的形态结构；倒置相差显微镜下观察细胞与根面的附着情况，如果观察到细胞附着于根面后，将其植入裸鼠皮下，8周后处死裸鼠，进行大体和组织学观察。

实施例9

本实施例为含有rhAm的骨修复粘合剂在骨缺损填充中的应用。

将实施例3中合成的混合溶液与骨替代材料按照体积：质量＝1:1混合，置于大鼠颅骨顶5mm缺损中，可见光固化后缝合，对照组为实施例3中不含rhAm的骨修复粘结剂+骨替代材料、rhAm水溶液+骨替代材料、单纯骨替代材料，术后4周、8周处死大鼠，micro CT观察成骨效果，并进行组织化学染色观察。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种组织粘合剂，其特征在于，所述组织粘合剂包括相互不接触的A组分和固化引发剂；所述A组分至少包括重组人釉原蛋白和高分子载体材料。

2.根据权利要求1所述的组织粘合剂，其特征在于，相对于A组分，所述固化引发剂的使用量为0.1～0.5wt％；

和/或，所述固化引发剂选自有机过氧化物引发剂、无机过氧化物引发剂、偶氮类引发剂以及氧化还原引发剂和光引发剂中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的组织粘合剂，其特征在于，所述高分子载体材料为选自甲基丙烯酰化改性的天然高分子材料和/或甲基丙烯酰化改性的合成可吸收高分子材料。

4.根据权利要求3所述组织粘合剂，其特征在于，所述天然高分子材料选自明胶、胶原、丝素蛋白、壳聚糖、壳聚糖、透明质酸、海藻酸盐、纤维蛋白和纤维素中的一种或多种；所述合成可吸收高分子材料选自聚乳酸、聚羟基乙酸、聚己内酯、聚乳酸乙醇酸共聚物、聚乳酸己内酯共聚物和聚乙二醇共聚物中的一种或多种。

5.根据权利要求1所述组织粘合剂，其特征在于，所述组织粘合剂中，A组分还包括活性助剂，所述活性助剂选自抗生素、抗炎药物、镇痛药物、生长因子、骨形态发生蛋白、羟基磷灰石或磷酸三钙中的一种或多种。

6.一种如权利要求1～5任一项所述组织粘合剂的制备方法，将A组分的各原料组分混合，A组分和固化引发剂分开包装，并灭菌。

7.如权利要求1～5任一项所述的组织粘合剂在制备用于组织修复制品中的用途。

8.一种牙周组织再生诱导剂，其特征在于，包括如权利要求1～5任一项所述的组织粘合剂，所述A组分含有水，且A组分中，重组人釉原蛋白有效浓度至少为20μg/mL。

9.一种骨修复粘合剂，其特征在于，包括如权利要求1～5任一项所述的组织粘合剂，所述A组分含有水，且A组分中，重组人釉原蛋白有效浓度至少为20μg/mL。

10.一种软组织创口敷料，其特征在于，包括如权利要求1～5任一项所述组织粘合剂，所述A组分含有水，A组分中，重组人釉原蛋白有效浓度至少为40μg/mL，且含有活性助剂。