CN113209310B - 一种具有细胞成像和药物递送功能的复合超分子纳米粒子 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及纳米抗癌药物技术领域内一种具有细胞成像和药物递送功能的复合超分子纳米粒子,以偶联7‑(二乙基氨基)香豆素‑3‑甲酸的柱[5]芳烃(3/4/5C‑B)为主体,以抗癌药物瑞戈非尼为客体,两者混合后自组装复合构筑而成复合超分子纳米粒子。本发明的复合超分子纳米粒子中,利用功能化的柱[5]芳烃3/4/5C‑B与瑞戈非尼主客体识别作用,自组装构筑了丰富药物负载并具有细胞成像和药物递送双重性能的复合超分子纳米粒子,其中,3/4/5C‑B具有良好的活细胞荧光成像性能,复合后,该性能直接继承,同时也保留了瑞戈非尼优异的抗癌活性,在酸性的肿瘤环境下可以迅速富集,实现精准治疗消灭癌细胞。
Description
技术领域
本发明涉及纳米抗癌药物技术领域,特别涉及一种具有细胞成像和药物递送功能的复合超分子纳米粒子。
背景技术
基于主客体分子间相互作用的超分子自组装已成为用来构建新颖和多功能纳米粒子的有效方法,其中纳米粒子因为其独特的优势被广泛应用于抗癌药物的转运研究中。柱芳烃作为新一代大环主体化合物由于其柱状结构、富电子空腔、易于功能化以及生物相容性良好的特点,在超分子领域被人们广泛研究。
目前,癌症严重威胁人类健康。化学药物治疗是目前癌症治疗的主流手段之一。但因不同患者个体差异较大,传统单一给药方式往往对人体正常组织造成严重毒副作用,导致实际疗效不佳。构建新型诊疗一体化纳米平台,实现癌症个性化治疗是解决上述难题的主流策略。具有分子内电荷转移(ICT)特征的分子具有对蛋白质微环境敏感的优点。基于ICT机制开发对蛋白微环境高度敏感的复合超分子纳米粒子,实现对癌细胞成像和药物可溯化递送,满足癌症的精准治疗具有重要意义。
发明内容
本发明针对现有技术中抗癌药物的精准化和可溯化治疗的需求,提供一种具有细胞成像和药物递送功能的复合超分子纳米粒子,以解决当前癌症治疗的需求。
本发明的目的是这样实现的,一种具有细胞成像和药物递送功能的复合超分子纳米粒子,以偶联7-(二乙基氨基)香豆素-3-甲酸的柱[5]芳烃(3/4/5C-B)为主体,以抗癌药物瑞戈非尼为客体,两者混合后自组装构筑而成复合超分子纳米粒子;;所述偶联7-(二乙基氨基)香豆素-3-甲酸的柱[5]芳烃(3/4/5C-B)的化学结构式为:
其中,当n=3时简写为3C-B,当n=4时简写为4C-B,当n=4时简写为5C-B。
本发明的复合超分子纳米粒子中,利用功能化的柱[5]芳烃3/4/5C-B与瑞戈非尼主客体识别作用,自组装构筑了丰富药物负载并具有细胞成像和药物递送双重性能的复合超分子纳米粒子,其中,3/4/5C-B具有良好的活细胞荧光成像性能,复合后,该性能直接继承,同时也保留了瑞戈非尼优异的抗癌活性,在酸性的肿瘤环境下可以迅速富集,实现精准治疗消灭癌细胞。
进一步地,本发明的复合超分子纳米粒子具有较高的药物负载性能,3/4/5C-B和瑞戈非尼结合的摩尔计量比为1:1
进一步地,所述瑞戈非尼的化学结构式为:
进一步地,所述偶联7-(二乙基氨基)香豆素-3-甲酸的柱[5]芳烃(3/4/5C-B)的合成路线为:
进一步地,所述复合超分子纳米粒子的具体制备过程为:
A1、配制瑞戈非尼与无水乙醇的溶液,瑞戈非尼的浓度为(2~3)×10-3M;
A2、以A1步的瑞戈非尼乙醇溶液为溶质,以3/4/5C-B中的其中一种功能柱[5]芳烃为溶质,配制浓度为2.5~3mg/ml的3/4/5C-B混合液,并超声混合5~10min,使其混合均匀;
A3、取A2步的混合液适量与超纯水按体积比为(2~3):3的比例混合,并超声混合5~10min,使其混合均匀,得到含有复合超分子纳米粒子的溶液;
A4、将A3步所得含有复合超分子纳米粒子的溶液利用透析袋对pH为7.4,浓度为0.05M的磷酸盐缓冲溶液透析,滤去未被包封组分,至外液无瑞戈非尼检出。
进一步地,所述复合超分子纳米粒子具有细胞成像和抗癌药物递送的功能,在肿瘤组织的偏酸性环境迅速团聚,并具有良好细胞成像性能。
附图说明
图1、图2、图3为3C-B、4C-B、5C-B的核磁氢谱图,溶剂为CDCl3。
图4为3/4/5C-B与瑞戈非尼复合后的瑞戈非尼质子Hm相对化学位移变化绘制的JOB曲线。
图5为3/4/5C-B与瑞戈非尼的复合超分子纳米粒子透射电镜图。
图6为3/4/5C-B与瑞戈非尼的复合超分子纳米粒子粒径分布图。
图7为3/4/5C-B与瑞戈非尼的复合超分子纳米粒子ζ-电位图。
图8为3/4/5C-B与瑞戈非尼的复合超分子纳米粒子在生理环境中(pH=7.4)的分散态和在偏酸性环境中(pH=6.0)的聚集态照片。
图9为癌细胞(HepG2)在不同浓度的瑞戈非尼、3/4/5C-B以及基于3/4/5C-B与瑞戈非尼的复合超分子纳米粒子溶液孵化24h后的相对细胞存活率对比图。
图10为癌细胞(HepG2)在浓度为8×10-6M的3/4/5C-B以及3/4/5C-B与瑞戈非尼的复合超分子纳米粒子溶液中孵育4h后的荧光成像图(绿色光路,λex=494nm)。细胞核用Hoechst 33342染色(蓝色光路,λex=345nm)。
具体实施方式
以下实施方式中所用的抗癌药物瑞戈非尼结构如下:
首先制备偶联7-(二乙基氨基)香豆素-3-甲酸的柱[5]芳烃(3/4/5C-B),通过如下过程合成:
第一步,合成化合物3/4/5a:于100mL的圆底烧瓶中加入正丁氧基苯酚(10.00mmoL,1.66g),加入丙酮溶液50mL,搅拌使正丁氧基苯酚完全溶解;称取1,3-二溴丙烷(20.00mmoL,4.04g),K2CO3(20.00mmoL,2.76g)加入前述圆底烧瓶的溶液中,60℃搅拌反应4h,反应结束后,趁热抽滤除去K2CO3,得到的滤液使用旋转蒸发仪浓缩,0℃条件下冷却浓缩液至析出固体,抽滤得到产物3a。另外,将上述1,3-二溴丙烷替换为1,4-二溴丁烷和1,5-二溴戊烷,按照同样的方法得到产物4a和5a,其反应过程如下式:
第二步,单溴取代柱[5]芳烃3/4/5b的合成:于250mL单口烧瓶中加入上步制备的3a(10.00mmoL,3.00g),对苯二甲醚(50.00mmoL,6.91g),以及多聚甲醛(55.00mmoL,1.65g),并加入150mL 1,2-二氯乙烷,搅拌均匀得到初步反应液;量取三氟化硼乙醚(56.00mmoL,9.53g)倒入恒压滴液漏斗中,缓慢滴入前述初步反应液,常温反应2h,反应结束后,加入20mL甲醇淬灭反应,再加入40mL二氯甲烷,100mL饱和碳酸氢钠水溶液多次萃取去除过量的三氟化硼乙醚,用无水硫酸钠干燥有机层并进一步浓缩,加入200-300目硅胶,柱层析方法(石油醚:二氯甲烷:乙酸乙酯=100:75:1)分离得到产物3b。另将3a替换为4a、5a,按照同样方法操作可以分别得到4b、5b,反应过程如下式:
第三步,单取代柱[5]芳烃烷基邻苯二甲酰亚胺3/4/5c的合成:在100mL单口烧瓶中称取3b(2.0mmoL,1.77g)和邻苯二甲酰亚胺钾盐(2.5mmoL,0.47g),再向单口烧瓶中加入50mL的N,N-二甲基甲酰胺,50℃搅拌反应过夜,反应结束后倒入200mL饱和食盐水中,析出大量黄色固体,抽滤,干燥得粗产品,柱层析方法(石油醚:乙酸乙酯=3:1)分离得黄色固体3c。将3b替换4b、5b,按照同样方法操作可以分别得到4c、5c。反应过程如下式:
第四步,单取代柱[5]芳烃脂肪胺3/4/5C-NH2的合成:在250mL单口烧瓶中称取3c(2.0mmoL,1.90g)和水合肼(41mmoL,2.0mL,),再加入150mL的四氧呋喃;搅拌混合均匀后,加热回流24h;反应结束后冷却到室温抽滤,收集滤液,旋干得粗产品;柱层析方法(二氯甲烷∶甲醇=3∶1)分离得到白色固体3C-NH2。另将3c替换为4c、5c,按照同样方法操作可以分别得到4C-NH2、5C-NH2,反应过程如下式:
第5步,化合物3C-B的合成:在50mL单口烧瓶中称取化合物3C-NH2(0.1g,0.12mmoL),加入7-(二乙基氨基)香豆素-3-甲酸(0.026g,0.1mmoL),HOBT(0.020g,0.15mmoL)和EDCI(0.029g,0.15mmoL),在烧瓶中加入10mL干燥氯仿,回流3h。反应结束后,使用旋转蒸发仪浓缩反应液,薄层色谱(CH2Cl2∶MeOH=30∶1)分离提纯得到目标化合物3C-B(0.072g,产率为67.3%);制备的3C-B的核磁氢谱如图1所示,1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:8.92(m,1H,ArH),8.70(s,1H,ArH),7.44(d,J=8.9Hz,1H,ArH),6.78-6.73(m,10H,ArH),6.65(d,J=8.9Hz,1H,ArH),6.50(s,1H,ArH),3.92-3.43(m,44H,CH2),2.09(dt,J=10.6,4.8Hz,2H,CH2),1.73(dd,J=14.3,6.7Hz,2H,CH2),1.50-1.47(m,2H,CH2),1.25(t,J=7.0Hz,6H,CH3),0.94(t,J=6.9Hz,3H,CH3);
另外,将化合物3C-NH2替换为化合物4C-NH2,按照本步上述同样的方法操作可以分别得到黄色固体4C-B(0.082g,产率为75.4%)。制备的4C-B的核磁氢谱如图2所示,1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:8.85(m,1H,NH),8.71(s,1H,ArH),7.45(d,J=8.9Hz,1H,ArH),6.76-6.72(m,11H,ArH),6.59(s,1H,ArH),3.86-3.42(m,44H,CH2),1.89-1.81(m,4H,CH2),1.74-1.67(m,2H,CH2),1.52-1.44(m,2H,CH2),1.24(t,J=6.9Hz,6H,CH3),0.92(t,J=7.3Hz,3H,CH3);
将化合物3C-NH2替换为化合物5C-NH2,按照本步上述同样方法操作可以分别得到黄色固体5C-B(0.069g,产率为62.7%)。制备的5C-B的核磁氢谱如图3所示,1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:8.86-8.83(m,1H,NH),8.70(s,1H,ArH),7.43(d,J=9.2Hz,1H,ArH),6.78-6.73(m,10H,ArH),6.70-6.67(m,1H,ArH),6.53(s,1H,ArH),3.86-3.43(m,44H,CH2),1.87-1.81(m,2H,CH2),1.75-1.68(m,4H,CH2),1.66-1.60(m,2H,CH2),1.50(q,J=7.5Hz,2H,CH2),1.25(t,J=7.0Hz,6H,CH3),0.94(t,J=7.3Hz,3H,CH3)。本步的反应过程如下式:
实施例1
本实施例以上述功能化柱[5]芳烃和瑞戈非尼为原料,自组装合成复合超分子纳米粒子,具体过程为:
首先将6mg的瑞戈非尼溶于5mL无水乙醇中,超声使其完全溶解,最终配制成浓度为2.5×10-3M的瑞戈非尼乙醇溶液;称取1.1mg的3C-B溶于0.4mL浓度为2.5×10-3M的瑞戈非尼乙醇溶液,超声5~10min,使其混合均匀得到自组装混合液;取前述自组装混合液0.2mL,快速注入超纯水,定容至10mL,超声10min,使其充分混匀,并持续超声得到含有复合超分子纳米粒子的溶液;将前述复合超分子纳米粒子的溶液利用透析袋透析,滤去未被包封组分至外液无瑞戈非尼检出,得到本实施例3C-B+瑞戈非尼复合的复合超分子纳米粒子溶液。按上述同样的合成方法,分别用4C-B和5C-B代替3C-B,分别制得4C-B+瑞戈非尼的复合超分子纳米粒子溶液和5C-B+瑞戈非尼的复合超分子纳米粒子溶液。
控制3/4/5C-B和瑞戈非尼的总摩尔浓度一致,改变瑞戈非尼摩尔浓度占比,利用核磁测得对应溶液中瑞戈非尼质子Hm相对化学位移值绘制JOB曲线,给出3/4/5C-B和瑞戈非尼相互作用的摩尔计量比。方法如下:控制[3C-B+瑞戈非尼]的总浓度为1×10-2M,改变两者摩尔比,依次为1∶9;2∶8;3∶7;4∶6;5∶5;6∶4;7∶3;8∶2;9∶1,利用核磁测得对应溶液中瑞戈非尼质子Hm的相对化学位移值。采用与上述相同的方法测得系列4C-B+瑞戈非尼和5C-B+瑞戈非尼溶液中的瑞戈非尼质子Hm的相对化学位移值。如图4所示,以瑞戈非尼质子Hm的相对化学位移值与瑞戈非尼摩尔浓度占比的对应关系绘制JOB曲线图,确定3/4/5C-B与瑞戈非尼结合的摩尔计量比为1∶1。
如图5所示,通过透射电镜观察到基于3C-B+瑞戈非尼、4C-B+瑞戈非尼和5C-B+瑞戈非尼的复合超分子纳米粒子为球形纳米粒子的电镜透射图。
利用激光纳米粒度仪测出3C-B+瑞戈非尼、4C-B+瑞戈非尼和5C-B+瑞戈非尼的复合超分子纳米粒子平均粒径分别为138.6nm、149.7nm、169.2nm的纳米粒子,其粒径分布如图6所示。
利用ZEN3690粒度分析仪测出基于3C-B+瑞戈非尼、4C-B+瑞戈非尼、5C-B+瑞戈非尼的复合超分子纳米粒子的ζ-电位分别为-21.7mV、-19.2mV、-17.2mV,如图7所示。
将本实施例的复合超分子纳米粒子的药物递送和细胞成像性能通过如下方法验证:
分别将本实施例的3C-B+瑞戈非尼、4C-B+瑞戈非尼和5C-B+瑞戈非尼的复合超分子纳米粒子水溶液加适量乙醇超声振荡使其充分溶解,经0.22μm有机滤膜过滤,用高效液相色谱仪定量分析,确定3C-B+瑞戈非尼、4C-B+瑞戈非尼、5C-B+瑞戈非尼的复合超分子纳米粒子中瑞戈非尼的载药率分别为91.7%、91.5%、92.2%,说明该纳米粒子的瑞戈非尼载药率高。
验证例
将实施例1合成的3C-B+瑞戈非尼、4C-B+瑞戈非尼和5C-B+瑞戈非尼复合超分子纳米粒子分别注入生理环境(0.05M磷酸盐缓冲,pH=7.4)和偏酸性环境(0.05M磷酸盐缓冲,pH=6.0)液中,如图8所示,各复合超分子纳米粒子在生理环境稳定存在,在偏酸性环境迅速团聚,说明该纳米粒子在偏酸性环境中具有pH刺激响应性能。
将瑞戈非尼、3/4/5C-B(分别代表3C-B、4C-B和5C-B)以及基于3/4/5C-B+瑞戈非尼(分别代表3C-B+瑞戈非尼、4C-B+瑞戈非尼、5C-B+瑞戈非尼)的复合超分子纳米粒子分别与癌细胞(HepG2)孵化24小时后,利用MTT法检测各组活细胞的相对数量。癌细胞(HepG2)在不同浓度的瑞戈非尼、3/4/5C-B以及基于3/4/5C-B与瑞戈非尼构筑的复合超分子纳米粒子溶液中进行孵化24小时后的相对细胞存活率对比图如图9所示。图9中表明,3/4/5C-B对癌细胞的毒性远低于瑞戈非尼,而3/4/5C-B与瑞戈非尼主客体作用基础上形成的复合超分子纳米粒子保留了瑞戈非尼对癌细胞优异的细胞毒性。
利用Hoechst 33342对癌细胞(HepG2)染色基础上,将3/4/5C-B以及基于3/4/5C-B+瑞戈非尼的复合超分子纳米粒子分别与癌细胞(HepG2)孵化4小时,利用荧光倒置显微镜评估它们对活细胞成像性能。图10为癌细胞(HepG2)在浓度为8×10-6M的3/4/5C-B以及3/4/5C-B+瑞戈非尼的复合超分子纳米粒子溶液中孵育4h后的荧光成像图。图10表明,3C-B、4C-B和5C-B本身具有良好的活细胞荧光成像性能,3/4/5C-B+瑞戈非尼复合的复合超分子纳米粒子继承了3/4/5C-B良好的细胞成像性能。
综合上述验证过程,本发明的自组装复合超分子纳米粒子具有优异的细胞成像和药物递送功能,并且在癌细胞存在的弱酸性环境下,迅速团聚,实现对癌细胞的精准灭杀,并且制备方法简单,在癌症精准治疗领域应用前景广阔。
尽管本发明的实施方案已公开如上,但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言,可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下,本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
Claims (5)
1.一种具有细胞成像和药物递送功能的复合超分子纳米粒子,其特征在于,以偶联7-(二乙基氨基)香豆素-3-甲酸的柱[5]芳烃为主体,以抗癌药物瑞戈非尼为客体,两者混合后自组装复合构筑而成复合超分子纳米粒子;所述偶联7-(二乙基氨基)香豆素-3-甲酸的柱[5]芳烃的化学结构式为:
其中,当n=3时简写为3C-B,当n=4时简写为4C-B,当n=5时简写为5C-B。
2.根据权利要求1所述的具有细胞成像和药物递送功能的复合超分子纳米粒子,其特征在于,所述复合超分子纳米粒子中,偶联7-(二乙基氨基)香豆素-3-甲酸的柱[5]芳烃和瑞戈非尼结合的摩尔计量比为1:1。
3.根据权利要求1所述的具有细胞成像和药物递送功能的复合超分子纳米粒子,其特征在于,所述瑞戈非尼的化学结构式为:
4.根据权利要求1所述的具有细胞成像和药物递送功能的复合超分子纳米粒子,其特征在于,所述偶联7-(二乙基氨基)香豆素-3-甲酸的柱[5]芳烃的合成路线为:
5.根据权利要求1所述的具有细胞成像和药物递送功能的复合超分子纳米粒子,其特征在于,
所述复合超分子纳米粒子的具体制备过程为:
A1、配制瑞戈非尼与无水乙醇的溶液,瑞戈非尼的浓度为浓度为(2~3)×10-3M;
A2、以A1步的瑞戈非尼乙醇溶液为溶质,以偶联7-(二乙基氨基)香豆素-3-甲酸的柱[5]芳烃中的其中一种功能柱[5]芳烃为溶质,配制浓度为2.5~3mg/ml的偶联7-(二乙基氨基)香豆素-3-甲酸的柱[5]芳烃的混合液,并超声混合5~10min,使其混合均匀;
A3、取A2步的混合液适量与超纯水按体积比为(2~3):3的比例混合,并超声混合5~10min,使其混合均匀,得到含有复合超分子纳米粒子的溶液;
A4、将A3步所得含有复合超分子纳米粒子的溶液利用透析袋用pH为7.4,浓度为0.05M的磷酸盐缓冲溶液透析,滤去未被包封组分,至外液无瑞戈非尼检出,得到。
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基于天然小分子化合物的超分子自组装;高玉霞;胡君;巨勇;;化学学报(第04期);全文 * |
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