CN113200903A - 刺萼龙葵中对二十八星瓢虫具有拒食防御功能的吡咯生物碱类化合物及其分离提取方法 - Google Patents

刺萼龙葵中对二十八星瓢虫具有拒食防御功能的吡咯生物碱类化合物及其分离提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于农业技术领域，具体涉及刺萼龙葵中对二十八星瓢虫具有拒食功能的吡咯生物碱类化合物及其分离提取方法。方法如下：取干燥的刺萼龙葵叶片乙醇冷浸提取，提取液经减压浓缩后得浸膏；浸膏依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取；正丁醇萃取层依次采用水、30％乙醇水、60％乙醇水、95％乙醇水大孔吸附柱色谱洗脱；60％乙醇水洗脱部分采用硅胶柱色谱分离，得到Fr.A～Fr.F六个部分；Fr.B部分采用凝胶柱色谱洗脱，得到Fr.B‑1～Fr.B‑5五个部分；Fr.B‑2部分依次采用半制备HPLC、手性HPLC分离得到目标化合物。本发明分离制备方法简单，重现性好，所分离得到的化合物含量大、纯度高且对二十八星瓢虫具有显著的拒食活性。

Description

刺萼龙葵中对二十八星瓢虫具有拒食防御功能的吡咯生物碱 类化合物及其分离提取方法
技术领域
本发明属于农业技术领域，具体涉及刺萼龙葵中新吡咯生物碱类化合物及其分离提取方法。此外，还公开了这些新化合物的结构解析及其对二十八星瓢虫拒食活性等。
背景技术
近年来，外来入侵植物严重危害农、林、牧、渔业的可持续发展，对我国社会经济、生态环境和人畜健康均构成了严重威胁。外来入侵植物与本地植食性昆虫之间往往存在着化学防御作用，化学防御作用的影响也是导致外来植物入侵成功的重要因素之一。面对本地植食性昆虫，外来入侵植物体内能合成特定的次生代谢产物抵御本地植食性昆虫的取食或抑制它们的生长发育，从而获得竞争优势。因此，充分开发入侵植物对本地植食性昆虫的化学防御作用，探究两者之间的化学联系，挖掘其中具有安全高效特点的昆虫拒食化合物，不仅对于揭示外来植物的入侵机制具有重要意义，还能开拓入侵植物利用的新途径。
刺萼龙葵(Solanum rostratum D.)又名黄花刺茄，为茄科茄属一年生草本植物，于20世纪80年代初传入我国东北，目前已在我国东北地区广泛蔓延，对自然植被、农作物生产、畜牧业等造成了巨大危害，已成为亟待防除的外来恶性杂草。究其原因，除了刺萼龙葵本身具有强大的生命力和繁殖力外，还与其对本地植食性昆虫成功的化学防御有着密切关系。据报道，刺萼龙葵不同溶剂的提取物对棉铃虫、小菜蛾、蚜虫等植食性昆虫均具有显著的胃毒、拒食、生长抑制等活性。此外，刺萼龙葵植物本身含有大量结构高度异化的次生代谢产物，迄今为止国内外学者从刺萼龙葵中分离并鉴定的次生代谢产物包括生物碱类、黄酮类、萜类、甾体类等化合物，其中生物碱类化合物是刺萼龙葵的主要化学成分，且具有复杂多变的结构骨架，包括甾体糖苷类生物碱、吡咯类生物碱、酰胺类生物碱等。大量研究表明，生物碱类化合物在植物的化学防御作用中占有重要位置，对植食性昆虫具有显著的拒食和抑制生长等作用，且已有很多这类物质被开发成植物源农药，比如苦参碱、烟碱、小檗碱等化合物。
二十八星瓢虫(Henosepilachna vigintioctopunctata)，瓢虫科，鞘翅目，是危害茄子、马铃薯和番茄等茄科植物的典型有害昆虫。其幼虫和成虫主要啃食叶肉，仅留表皮，甚至可将叶片吃成穿孔，导致叶片干枯或只剩粗大的叶脉，无法进行光合作用。近年来，随着农业种植产业结构的调整以及蔬菜种植面积的扩大，二十八星瓢虫发生与危害日趋严重，已成为提高茄科作物产量与品质的重要障碍。此外，由于长期大量不合理使用化学合成农药，导致二十八星瓢虫的抗药性也不断增强，使其防治变得更加困难，同时也加剧了环境的污染。野外观察发现二十八星瓢虫能够取食刺萼龙葵，但取食量很少且几乎不在上面产卵。这些现象提示，刺萼龙葵对二十八星瓢虫存在化学防御作用。
因此，从刺萼龙葵中挖掘和开发对二十八星瓢虫具有拒食防御功能的生物碱类化合物将有助于从化学防御角度揭示其入侵机制，并期望这些化合物成为具有植物源抗虫农药应用前景的先导活性物质，以减少化学合成农药的投入和对环境的危害，为刺萼龙葵的开发利用提供科学依据，实现真正的变废为宝，同时也为二十八星瓢虫的综合防治提供新的思路。
发明内容
本发明旨在从刺萼龙葵叶片中寻找对二十八星瓢虫具有化学防御功能的生物碱类化合物，提供了6个新吡咯生物碱类化合物的分离制备方法。此外，还公开了这些新化合物的结构解析及其对二十八星瓢虫的拒食活性。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：刺萼龙葵中对二十八星瓢虫具有拒食防御功能的吡咯生物碱类化合物，所述的吡咯生物碱类化合物为3对対映异构体，化合物1a、2a、3a、1b、2b、3b化学结构分别如(I)、(Ⅱ)、(III)、(Ⅳ)、(Ⅴ)、(Ⅵ)所示：
Figure BDA0003063579180000021
上述的刺萼龙葵中对二十八星瓢虫具有拒食防御功能的新吡咯生物碱类化合物的分离制备方法，包括如下步骤：
1)取干燥的刺萼龙葵叶片用50～90％的乙醇冷浸提取3～6次，每次3～8天，乙醇提取液经旋转蒸发仪减压浓缩后得提取浸膏；
2)提取浸膏经水混悬后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，正丁醇萃取液经旋转蒸发仪减压浓缩后得萃取浸膏；
3)正丁醇萃取浸膏采用D101型大孔吸附柱色谱分离，依次采用水、30％乙醇水、60％乙醇水、95％乙醇水大孔吸附树脂洗脱，得到水、30％乙醇水、60％乙醇水、95％乙醇水四个洗脱部分；
4)60％乙醇水洗脱部分采用硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷：甲醇系统梯度洗脱，共收集30～40个馏分，经硅胶薄层色谱分析，合并为Fr.A～Fr.F六个部分；
5)Fr.B部分采用Sephadex LH-20型凝胶柱色谱分离，以甲醇：水系统等度洗脱，共收集40～60个馏分，经硅胶薄层色谱分析，合并为Fr.B-1～Fr.B-5五个部分；
6)Fr.B-2部分采用半制备HPLC分离，以乙腈：水系统为等度洗脱流动相，制备得到化合物1、2、3；
7)化合物1、2、3分别采用手性HPLC拆分分离，以正己烷：异丙醇系统为等度洗脱流动相，制备得到目标化合物1a、1b、2a、2b、3a、3b。
上述的分离制备方法，步骤1)中，按固液比，干燥的刺萼龙葵叶片：50～90％的乙醇＝1kg：5～10L。
上述的提取分离方法，步骤2)中，按固液比，提取浸膏：水：石油醚：乙酸乙酯：正丁醇＝1:1～3:1～3:1～3。
上述的提取分离方法，步骤4)中，按体积比，二氯甲烷：甲醇为20:1～1:1。
上述的提取分离方法，步骤5)中，按体积比，甲醇：水为1:5～1:1。
上述的提取分离方法，步骤6)中，按体积比，乙腈：水为1:5～1:1。
上述的提取分离方法，步骤7)中，按体积比，正己烷：异丙醇为5:1～2:1。
上述的刺萼龙葵中新吡咯生物碱类化合物在二十八星瓢虫拒食活性方面中的应用。
本发明具有以下有益效果：从刺萼龙葵中首次发现对二十八星瓢具有拒食防御功能的新吡咯生物碱类化合物有助于从化学防御角度揭示其入侵机制，并期望这些化合物成为具有植物源抗虫农药应用前景的先导活性物质，以减少化学合成农药的投入和对环境的危害，为刺萼龙葵的开发利用提供科学依据，实现真正意义上的变废为宝，同时也为二十八星瓢虫的综合防治提供新的思路。
附图说明
图1是刺萼龙葵中新吡咯生物碱类化合物对二十八星瓢虫的拒食活性。
图2是化合物1a和1b的HR-ESIMS谱图。
图3是化合物1a和1b的1H-NMR谱图。
图4是化合物1a和1b的13C-NMR谱图。
图5是化合物1a和1b的HSQC谱图。
图6是化合物1a和1b的HMBC谱图。
图7是化合物1a和1b的关键HMBC信号图。
图8是化合物1a和1b的计算和实测ECD谱图。
图9是化合物1a和1b的手性HPLC拆分图。
图10是化合物2a和2b的HR-ESIMS谱图。
图11是化合物2a和2b的1H-NMR谱图。
图12是化合物2a和2b的13C-NMR谱图。
图13是化合物2a和2b的HSQC谱图。
图14是化合物2a和2b的HMBC谱图。
图15是化合物2a和2b的关键HMBC信号图。
图16是化合物2a和2b的计算和实测ECD谱图。
图17是化合物2a和2b的手性HPLC拆分图。
图18是化合物3a和3b的HR-ESIMS谱图。
图19是化合物3a和3b的1H-NMR谱图。
图20是化合物3a和3b的13C-NMR谱图。
图21是化合物3a和3b的HSQC谱图。
图22是化合物3a和3b的HMBC谱图。
图23是化合物3a和3b的关键HMBC信号图。
图24是化合物3a和3b的计算和实测ECD谱图。
图25是化合物3a和3b的手性HPLC拆分图。
具体实施方式
实施例1刺萼龙葵中对二十八星瓢虫具有拒食防御功能的新吡咯生物碱类化合物的分离制备
1)取干燥的刺萼龙葵叶片10kg用80L 70％的乙醇冷浸提取4次，每次5天，乙醇提取液经旋转蒸发仪减压浓缩后得提取浸膏0.8kg。
2)提取浸膏(0.8kg)经水混悬后，依次用2.2L石油醚、2.2L乙酸乙酯、2.2L正丁醇萃取，正丁醇萃取液经旋转蒸发仪减压浓缩后得萃取浸膏60g。
3)正丁醇萃取浸膏(60g)采用D101型大孔吸附柱色谱分离，依次采用水、30％乙醇水、60％乙醇水、95％乙醇水大孔吸附树脂洗脱，得到水、30％乙醇水、60％乙醇水、95％乙醇水四个洗脱部分，其中得到60％乙醇水洗脱部分8.5g。
4)60％乙醇水洗脱部分(8.5g)采用硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷：甲醇系统梯度洗脱，其体积比依次为，20:1、10:1、5:1、3:1，每300mL为一个馏分，共收集40个馏分，经硅胶薄层色谱分析，合并为Fr.A～Fr.F六个部分，其中得到Fr.B部分1.1g。
5)Fr.B部分(1.1g)采用Sephadex LH-20型凝胶柱色谱分离，以甲醇：水系统等度洗脱，其体积比为1:3，每10mL为一个馏分，共收集55个馏分，经硅胶薄层色谱分析，合并为Fr.B-1～Fr.B-5五个部分，其中得到Fr.B-2部分125mg。
6)Fr.B-2部分(125mg)采用半制备HPLC分离，以乙腈：水系统为等度洗脱流动相，其体积比为1:4，制备得到化合物1(24.1mg)、2(18.3mg)、3(17.6mg)。
7)化合物1(24.1mg)采用手性HPLC拆分分离，以正己烷：异丙醇系统为等度洗脱流动相，其体积比为4:1，制备得到目标化合物1a(10.4mg)、1b(11.2mg)；化合物2(18.3mg)采用手性HPLC拆分分离，以正己烷：异丙醇系统为等度洗脱流动相，其体积比为5:1，制备得到目标化合物2a(6.9mg)、2b(9.3mg)；化合物3(17.6mg)采用手性HPLC拆分分离，以正己烷：异丙醇系统为等度洗脱流动相，其体积比为4:1，制备得到目标化合物3a(7.4mg)、3b(8.1mg)。
实施例2刺萼龙葵中对二十八星瓢虫具有拒食防御功能的新吡咯生物碱类化合物的分离制备
1)取干燥的刺萼龙葵叶片8kg用60L 75％的乙醇冷浸提取6次，每次4天，乙醇提取液经旋转蒸发仪减压浓缩后得提取浸膏0.7kg。
2)提取浸膏(0.7kg)经水混悬后，依次用1.6L石油醚、1.6L乙酸乙酯、1.6L正丁醇萃取，正丁醇萃取液经旋转蒸发仪减压浓缩后得萃取浸膏52g。
3)正丁醇萃取浸膏(52g)采用D101型大孔吸附柱色谱分离，依次采用水、30％乙醇水、60％乙醇水、95％乙醇水大孔吸附树脂洗脱，得到水、30％乙醇水、60％乙醇水、95％乙醇水四个洗脱部分，其中得到60％乙醇水洗脱部分7.4g。
4)60％乙醇水洗脱部分(7.4g)采用硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷：甲醇系统梯度洗脱，其体积比依次为，20:1、10:1、8:1、5:1、2:1，每250mL为一个馏分，共收集35个馏分，经硅胶薄层色谱分析，合并为Fr.A～Fr.F六个部分，其中得到Fr.B部分0.9g。
5)Fr.B部分(0.9g)采用Sephadex LH-20型凝胶柱色谱分离，以甲醇：水系统等度洗脱，其体积比为1:3，每10mL为一个馏分，共收集60个馏分，经硅胶薄层色谱分析，合并为Fr.B-1～Fr.B-5五个部分，其中得到Fr.B-2部分108mg。
6)Fr.B-2部分(108mg)采用半制备HPLC分离，以乙腈：水系统为等度洗脱流动相，其体积比为1:5，制备得到化合物1(22.4mg)、2(15.8mg)、3(14.5mg)。
7)化合物1(22.4mg)采用手性HPLC拆分分离，以正己烷：异丙醇系统为等度洗脱流动相，其体积比为4:1，制备得到目标化合物1a(8.1mg)、1b(9.2mg)；化合物2(15.8mg)采用手性HPLC拆分分离，以正己烷：异丙醇系统为等度洗脱流动相，其体积比为4:1，制备得到目标化合物2a(5.7mg)、2b(7.4mg)；化合物3(14.5mg)采用手性HPLC拆分分离，以正己烷：异丙醇系统为等度洗脱流动相，其体积比为5:1，制备得到目标化合物3a(5.8mg)、3b(6.1mg)。
实施例3刺萼龙葵中对二十八星瓢虫具有拒食防御功能的新吡咯生物碱类化合物的分离制备
1)取干燥的刺萼龙葵叶片12kg用100L 80％的乙醇冷浸提取3次，每次7天，乙醇提取液经旋转蒸发仪减压浓缩后得提取浸膏0.9kg。
2)提取浸膏(0.9kg)经水混悬后，依次用2.5L石油醚、2.5L乙酸乙酯、2.5L正丁醇萃取，正丁醇萃取液经旋转蒸发仪减压浓缩后得萃取浸膏75g。
3)正丁醇萃取浸膏(75g)采用D101型大孔吸附柱色谱分离，依次采用水、30％乙醇水、60％乙醇水、95％乙醇水大孔吸附树脂洗脱，得到水、30％乙醇水、60％乙醇水、95％乙醇水四个洗脱部分，其中得到60％乙醇水洗脱部分9.6g。
4)60％乙醇水洗脱部分(9.6g)采用硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷：甲醇系统梯度洗脱，其体积比依次为，20:1、15:1、8:1、5:1、2:1，每300mL为一个馏分，共收集38个馏分，经硅胶薄层色谱分析，合并为Fr.A～Fr.F六个部分，其中得到Fr.B部分1.2g。
5)Fr.B部分(1.2g)采用Sephadex LH-20型凝胶柱色谱分离，以甲醇：水系统等度洗脱，其体积比为1:1，每10mL为一个馏分，共收集58个馏分，经硅胶薄层色谱分析，合并为Fr.B-1～Fr.B-5五个部分，其中得到Fr.B-2部分132mg。
6)Fr.B-2部分(132mg)采用半制备HPLC分离，以乙腈：水系统为等度洗脱流动相，其体积比为1:3，制备得到化合物1(27.3mg)、2(21.5mg)、3(20.8mg)。
7)化合物1(27.3mg)采用手性HPLC拆分分离，以正己烷：异丙醇系统为等度洗脱流动相，其体积比为4:1，制备得到目标化合物1a(12.6mg)、1b(13.1mg)；化合物2(21.5mg)采用手性HPLC拆分分离，以正己烷：异丙醇系统为等度洗脱流动相，其体积比为4:1，制备得到目标化合物2a(8.6mg)、2b(12.7mg)；化合物3(20.8mg)采用手性HPLC拆分分离，以正己烷：异丙醇系统为等度洗脱流动相，其体积比为3:1，制备得到目标化合物3a(8.2mg)、3b(9.3mg)。
实施例4
实施例1、2、3所提取分离的化合物1为白色粉末，[α]20D-0.71°(c 0.10,CH3OH)。
对化合物1进行HR-ESIMS、1H-NMR、13C-NMR、HSQC、HMBC分析检测。从图2中可以看出，HR-ESIMS谱图给出准分子离子峰m/z 412.1005[M+Na]+(calcd for C19H19NO8Na,412.1008)，确定该化合物的分子量为389，分子式为C19H19NO8，计算其不饱和度为11。
化合物1的1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)谱如表1和图3所示，δ9.42(1H,s,H-1)提示为一个醛基上的氢信号，δ7.43(1H,d,J＝12.5Hz,H-3”)和6.12(1H,d,J＝12.5Hz,H-2”)提示为一组顺式双键上的氢信号，δ7.05(1H,d,J＝2.0Hz,H-5”),6.92(1H,dd,J＝8.4,2.0Hz,H-9”),6.74(1H,d,J＝8.4Hz,H-8”)提示为一组1,3,4取代苯环上的氢信号，δ5.44(1H,br s,H-2'),4.42(1H,d,J＝13.0Hz,H-6),4.37(1H,d,J＝13.0Hz,H-6)提示为连有吸电子诱导原子的氢信号，δ1.92(3H,s,H-7)和1.52(3H,d,J＝7.2Hz,H-3')提示为两个甲基上的氢信号。
化合物1的13C-NMR(150MHz,DMSO-d6)谱如表1和图4所示，δ180.3(C-1)提示存在一个醛基上的碳信号，δ175.1(C-1')提示存在一个羧基上的碳信号，δ165.7(C-1”),145.9(C-3”),113.8(C-2”)提示为一组α,β不饱和酮上的碳信号，δ148.5(C-7”)和145.6(C-6”)提示为苯环上邻二氧取代的碳信号，δ58.2(C-2')和54.8(C-6)提示为两个连有吸电子诱导原子的碳信号，δ19.2(C-3')和8.2(C-7)提示为两个甲基上的碳信号。
如图5所示，在HSQC谱中，确认了化合物1的H和C直接相关。
如图6和图7所示，在HMBC谱中，H-3'与C-1'和C-2'相关，H-2'与C-5和C-3'相关，H-1与C-2和C-3相关，H-6与C-4和C-5相关，H-7与C-2,C-3,C-4相关，以上信息提示存在一个吡咯生物碱的基本母核。H-2”与C-1”,C-3”,C-4”相关，H-3”与C-1”,C-2”,C-4”,C-5”相关，H-5”与C-4”,C-6”,C-7”相关，H-8”与C-6”,C-7”,C-9”相关，H-9”与C-4”,C-7”,C-8”相关，以上信息提示存在一个顺式咖啡酸片段。H-2”与C-4远程相关，提示顺式咖啡酸片段连在吡咯生物碱母核的4位，以上信息确定了化合物1的平面结构。
为了确认化合物1的绝对构型，对化合物1进行ECD和旋光分析检测，但只显示出弱的CD Cotton效应和弱的旋光值，因此推测化合物1可能以一对对映异构体的混合物形式存在。如图9所示，对化合物1采用手性HPLC拆分分离，以正己烷：异丙醇系统为等度洗脱流动相，制备得到目标化合物1a和1b。如图8所示，化合物1a和1b的绝对构型是通过计算ECD的方法来确定的，采用TDDFT理论，计算了一对对映异构体(2′R-1,2′S-1)的ECD曲线。结果表明，化合物1a的实测ECD曲线与2′R-1的计算ECD曲线趋势基本一致，说明化合物1a 2′位的绝对构型为R构型，即2′R-1a，化合物1b的实测ECD曲线与2′S-1的计算ECD曲线趋势基本一致，说明化合物1b 2′位的绝对构型为S构型，即2′S-1b。
综上所述，最终确定了化合物1a和1b的化学结构，经Scifinder Scholar数据库检索，为一对未见文献报道的新化合物，分别命名为2′R-Caffeicpyrrole A和2′S-Caffeicpyrrole A。化合物1a和1b的化学结构式如下：
Figure BDA0003063579180000071
表1化合物1的1H(600MHz)and 13C(150MHz)NMR数据
Figure BDA0003063579180000072
实施例5
实施例1、2、3所提取分离的化合物2为白色粉末，[α]20D-1.19°(c 0.10,CH3OH)。
对化合物2进行HR-ESIMS、1H-NMR、13C-NMR、HSQC、HMBC分析检测。从图11中可以看出，HR-ESIMS谱图给出准分子离子峰m/z 426.1166[M+Na]+(calcd for C20H21NO8Na,426.1165)，确定该化合物的分子量为403，分子式为C20H21NO8，计算其不饱和度为11。
化合物2的1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)谱如表2和图11所示，δ9.40(1H,s,H-1)提示为一个醛基上的氢信号，δ7.45(1H,d,J＝12.6Hz,H-3”)和6.14(1H,d,J＝12.6Hz,H-2”)提示为一组顺式双键上的氢信号，δ7.06(1H,d,J＝2.2Hz,H-5”),6.92(1H,dd,J＝8.5,2.2Hz,H-9”),6.71(1H,d,J＝8.5Hz,H-8”)提示为一组1,3,4取代苯环上的氢信号，δ5.27(1H,br s,H-2'),4.47(1H,d,J＝12.6Hz,H-6),4.42(1H,d,J＝12.6Hz,H-6)提示为连有吸电子诱导原子的氢信号，δ3.26(3H,s,OCH3-6)提示为一个甲氧基上的氢信号，δ1.96(3H,s,H-7)和1.54(3H,d,J＝7.3Hz,H-3')提示为两个甲基上的氢信号。
化合物2的13C-NMR(150MHz,DMSO-d6)谱如表2和图12所示，δ179.5(C-1)提示存在一个醛基上的碳信号，δ172.3(C-1')提示存在一个羧基上的碳信号，δ164.5(C-1”),146.2(C-3”),114.3(C-2”)提示为一组α,β不饱和酮上的碳信号，δ148.9(C-7”)和145.1(C-6”)提示为苯环上邻二氧取代的碳信号，δ64.4(C-6)和56.0(C-2')提示为两个连有吸电子诱导原子的碳信号，δ57.5(6-OCH3)提示为一个甲氧基上的碳信号，δ18.7(C-3')和8.1(C-7)提示为两个甲基上的碳信号。
如图13所示，在HSQC谱中，确认了化合物2的H和C直接相关。
如图14和图15所示，在HMBC谱中，H-3'与C-1'和C-2'相关，H-2'与C-2和C-1'相关，H-1与C-2和C-3相关，H-6与C-4、C-5、6-OCH3相关，H-7与C-3和C-4相关，OCH3-6与C-6相关，以上信息提示存在一个吡咯生物碱的基本母核。H-2”与C-1”,C-3”,C-4”相关，H-3”与C-1”,C-2”,C-5”相关，H-5”与C-4”,C-6”,C-7”相关，H-8”与C-6”,C-7”,C-9”相关，H-9”与C-3”,C-4”,C-5”,C-7”相关，以上信息提示存在一个顺式咖啡酸片段。H-2”与C-4远程相关，提示顺式咖啡酸片段连在吡咯生物碱母核的4位，以上信息确定了化合物2的平面结构。
为了确认化合物2的绝对构型，对化合物2进行ECD和旋光分析检测，但只显示出弱的CD Cotton效应和弱的旋光值，因此推测化合物2可能以一对对映异构体的混合物形式存在。如图17所示，对化合物2采用手性HPLC拆分分离，以正己烷：异丙醇系统为等度洗脱流动相，制备得到目标化合物2a和2b。如图16所示，化合物2a和2b的绝对构型是通过计算ECD的方法来确定的，采用TDDFT理论，计算了一对对映异构体(2′R-2,2′S-2)的ECD曲线。结果表明，化合物2a的实测ECD曲线与2′R-2的计算ECD曲线趋势基本一致，说明化合物2a 2′位的绝对构型为R构型，即2′R-2a，化合物2b的实测ECD曲线与2′S-2的计算ECD曲线趋势基本一致，说明化合物2b 2′位的绝对构型为S构型，即2′S-2b。
综上所述，最终确定了化合物2a和2b的化学结构，经Scifinder Scholar数据库检索，为一对未见文献报道的新化合物，分别命名为2′R-Caffeicpyrrole B和2′S-Caffeicpyrrole B。化合物2a和2b的化学结构式如下：
Figure BDA0003063579180000081
表2化合物2的1H(600MHz)and 13C(150MHz)NMR数据
Figure BDA0003063579180000091
实施例6
实施例1、2、3所提取分离的化合物3为白色粉末，[α]20D-1.46°(c 0.10,CH3OH)。
对化合物3进行HR-ESIMS、1H-NMR、13C-NMR、HSQC、HMBC分析检测。从图20中可以看出，HR-ESIMS谱图给出准分子离子峰m/z 440.1323[M+Na]+(calcd for C21H23NO8Na,440.1321)，确定该化合物的分子量为417，分子式为C21H23NO8，计算其不饱和度为11。
化合物3的1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)谱如表3和图19所示，δ9.44(1H,s,H-1)提示为一个醛基上的氢信号，δ7.42(1H,d,J＝12.7Hz,H-3”)和6.15(1H,d,J＝12.7Hz,H-2”)提示为一组顺式双键上的氢信号，δ7.11(1H,d,J＝2.2Hz,H-5”),6.96(1H,dd,J＝8.4,2.2Hz,H-9”),6.75(1H,d,J＝8.4Hz,H-8”)提示为一组1,3,4取代苯环上的氢信号，δ5.19(1H,br s,H-2'),4.63(1H,d,J＝12.8Hz,H-6),4.58(1H,d,J＝12.8Hz,H-6)提示为连有吸电子诱导原子的氢信号，δ3.58(3H,s,OCH3-1')和3.24(3H,s,OCH3-6)提示为两个甲氧基上的氢信号，δ1.95(3H,s,H-7)和1.58(3H,d,J＝7.3Hz,H-3')提示为两个甲基上的氢信号。
化合物3的13C-NMR(150MHz,DMSO-d6)谱如表3和图20所示，δ178.8(C-1)提示存在一个醛基上的碳信号，δ169.1(C-1')提示存在一个酯羰基上的碳信号，δ165.4(C-1”),145.6(C-3”),113.7(C-2”)提示为一组α,β不饱和酮上的碳信号，δ148.9(C-7”)和145.2(C-6”)提示为苯环上邻二氧取代的碳信号，δ65.1(C-6)和54.1(C-2')提示为两个连有吸电子诱导原子的碳信号，δ56.9(6-OCH3)和51.6(1'-OCH3)提示为两个甲氧基上的碳信号，δ18.9(C-3')和7.9(C-7)提示为两个甲基上的碳信号。
如图21所示，在HSQC谱中，确认了化合物3的H和C直接相关。
如图22和图23所示，在HMBC谱中，H-3'与C-1'和C-2'相关，H-2'与C-5,C-1',C-3'相关，H-1与C-2和C-3相关，H-6与C-4和C-5相关，H-7与C-2,C-3,C-4相关，OCH3-6与C-6相关，OCH3-1'与C-1'相关，以上信息提示存在一个吡咯生物碱的基本母核。H-2”与C-1”,C-3”,C-4”相关，H-3”与C-1”,C-2”,C-5”,C-9”相关，H-5”与C-4”,C-6”,C-7”,C-9”相关，H-8”与C-6”,C-7”,C-9”相关，H-9”与C-3”,C-4”,C-5”,C-7”,C-8”相关，以上信息提示存在一个顺式咖啡酸片段。H-2”与C-4远程相关，提示顺式咖啡酸片段连在吡咯生物碱母核的4位，以上信息确定了化合物3的平面结构。
为了确认化合物3的绝对构型，对化合物3进行ECD和旋光分析检测，但只显示出弱的CD Cotton效应和弱的旋光值，因此推测化合物3可能以一对对映异构体的混合物形式存在。如图25所示，对化合物3采用手性HPLC拆分分离，以正己烷：异丙醇系统为等度洗脱流动相，制备得到目标化合物3a和3b。如图24所示，化合物3a和3b的绝对构型是通过计算ECD的方法来确定的，采用TDDFT理论，计算了一对对映异构体(2′R-3,2′S-3)的ECD曲线。结果表明，化合物3a的实测ECD曲线与2′R-3的计算ECD曲线趋势基本一致，说明化合物3a 2′位的绝对构型为R构型，即2′R-3a，化合物3b的实测ECD曲线与2′S-3的计算ECD曲线趋势基本一致，说明化合物3b 2′位的绝对构型为S构型，即2′S-3b。
综上所述，最终确定了化合物3a和3b的化学结构，经Scifinder Scholar数据库检索，为一对未见文献报道的新化合物，分别命名为2′R-Caffeicpyrrole C和2′S-Caffeicpyrrole C。化合物3a和3b的化学结构式如下：
Figure BDA0003063579180000101
表3化合物3的1H(600MHz)and 13C(150MHz)NMR数据
Figure BDA0003063579180000102
Figure BDA0003063579180000111
实施例12
1.拒食活性实验材料
1.1受试样品：化合物1a、1b、2a、2b、3a、3b、印楝素乳油(Neem oil,contain 1％Azadirachtin)。
1.2受试昆虫：二十八星瓢虫(沈阳农业大学后山捕捉得到)。
2.拒食活性实验方法
采用叶碟法进行二十八星瓢虫拒食活性测试。先用打孔器将厚度均匀、干净新鲜的马铃薯(Solanum tuberosum)叶片打成直径为1cm2的圆形小叶碟，再准确称量供试化合物并用甲醇溶解配成不同浓度梯度(100μg/mL,50μg/mL,25μg/mL)，处理组取供试化合物溶液50μL均匀涂于叶片背面，空白对照组涂相同体积的甲醇溶液，待叶碟自然晾干后，放入预先垫有滤纸保湿的培养皿(直径9cm)中，每个培养皿中放入2片处理叶碟和2片对照叶碟，十字交叉放置。每个培养皿接入2只饥饿12h的二十八星瓢虫成虫，并将培养皿放入25℃光照培养箱中，12～24h后(以高浓度中对照被取食80％左右时间为截止时间)用坐标方格纸测量每片叶碟被取食的面积，据此计算出拒食率：拒食率(％)＝(AC-AT)/(AC+AT)×100，其中，AC、AT分别表示空白对照组和样品处理组叶碟被取食的面积。实验重复至少5次以上。
3.统计方法
全部数据采用SPSS 13.0统计软件进行检验分析。各组数据差异比较采用单因素ANOVA评价。
4.实验结果
从表4和图1中可以看出，本发明所涉及的6个新吡咯生物碱类化合物对二十八星瓢虫均具有不同程度的拒食活性。其中化合物1a、1b、2a、2b显示出中等到强程度的拒食活性，特别是化合物1a和2a的拒食作用最为明显，在浓度为100μg/mL时拒食率分别为85.28±7.65％和87.21±7.90，甚至超过了阳性对照药-印楝素乳油(82.66±6.85％)。
本发明所涉的新吡咯生物碱类化合物，对二十八星瓢虫均具有不同程度的拒食活性，可以开发成为植物源抗虫农药应用前景的先导活性物质，以减少当前化学合成农药的投入和对环境的危害，同时也可以为入侵植物刺萼龙葵的开发利用提供科学依据，实现真正意义上的变废为宝。
表4化合物对二十八星瓢虫的拒食活性
Figure BDA0003063579180000121

Claims (9)

1.刺萼龙葵中对二十八星瓢虫具有拒食防御功能的吡咯生物碱类化合物，其特征在于：所述的吡咯生物碱类化合物为3对対映异构体，化合物1a、2a、3a、1b、2b、3b化学结构分别如(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)、(Ⅳ)、(Ⅴ)、(Ⅵ)所示：
Figure FDA0003063579170000011
2.权利要求1所述的刺萼龙葵中对二十八星瓢虫具有拒食防御功能的新吡咯生物碱类化合物的分离制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)取干燥的刺萼龙葵叶片用50～90％的乙醇冷浸提取3～6次，每次3～8天，乙醇提取液经旋转蒸发仪减压浓缩后得提取浸膏；
2)提取浸膏经水混悬后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，正丁醇萃取液经旋转蒸发仪减压浓缩后得萃取浸膏；
3)正丁醇萃取浸膏采用D101型大孔吸附柱色谱分离，依次采用水、30％乙醇水、60％乙醇水、95％乙醇水大孔吸附树脂洗脱，得到水、30％乙醇水、60％乙醇水、95％乙醇水四个洗脱部分；
4)60％乙醇水洗脱部分采用硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷：甲醇系统梯度洗脱，共收集30～40个馏分，经硅胶薄层色谱分析，合并为Fr.A～Fr.F六个部分；
5)Fr.B部分采用Sephadex LH-20型凝胶柱色谱分离，以甲醇：水系统等度洗脱，共收集40～60个馏分，经硅胶薄层色谱分析，合并为Fr.B-1～Fr.B-5五个部分；
6)Fr.B-2部分采用半制备HPLC分离，以乙腈：水系统为等度洗脱流动相，制备得到化合物1、2、3；
7)化合物1、2、3分别采用手性HPLC拆分分离，以正己烷：异丙醇系统为等度洗脱流动相，制备得到目标化合物1a、1b、2a、2b、3a、3b。
3.根据权利要求2所述的分离制备方法，其特征在于，步骤1)中，按固液比，干燥的刺萼龙葵叶片：50～90％的乙醇＝1kg：5～10L。
4.根据权利要求2所述的提取分离方法，其特征在于，步骤2)中，按固液比，提取浸膏：水：石油醚：乙酸乙酯：正丁醇＝1:1～3:1～3:1～3。
5.根据权利要求2所述的提取分离方法，其特征在于，步骤4)中，按体积比，二氯甲烷：甲醇为20:1～1:1。
6.根据权利要求2所述的提取分离方法，其特征在于，步骤5)中，按体积比，甲醇：水为1:5～1:1。
7.根据权利要求2所述的提取分离方法，其特征在于，步骤6)中，按体积比，乙腈：水为1:5～1:1。
8.根据权利要求2所述的提取分离方法，其特征在于，步骤7)中，按体积比，正己烷：异丙醇为5:1～2:1。
9.权利要求1所述的刺萼龙葵中新吡咯生物碱类化合物在二十八星瓢虫拒食活性方面中的应用。
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