CN113186324B - 大豆皱叶症抗性鉴定的kasp分子标记及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及农业生物学技术领域，具体公开了一种用于大豆皱叶症抗性鉴定的KASP分子标记及应用。所述KASP分子标记引物序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，该KASP分子标记能够实现对大豆皱叶症抗性进行高效、准确、低成本鉴定及基因分型，鉴定检测有效性达99.58%，准确度达到100%。

Description

大豆皱叶症抗性鉴定的KASP分子标记及应用
技术领域
本发明属于农业生物学技术领域，特别涉及大豆皱叶症抗性鉴定的KASP分子标记及应用。
背景技术
广西、广东、福建、贵州等地生产上出现的一种大豆叶片皱缩现象，这种皱叶症状表征为：叶脉间有明显的“皱褶”，叶片上有边缘不明显的淡黄色斑，叶缘微黄，叶片难以伸展，主叶脉顶部向下弯曲，整片叶片呈“勾手”状，叶片基部较叶片顶部症状轻。据调查，该症状在生产上早已存在，只是以前多被误认为病毒病所致；皱叶症为环境中某中未知因子诱发所致，在某些地点可以稳定出现；皱叶在大豆种质间存在较大的差异，且可稳定遗传，皱叶严重时可使大豆减产20-30％，选育抗皱叶症大豆品种对发展南方大豆生产有着重要的意义。
由于皱叶症出现受环境影响，且生长中期才表现性状，单纯的依靠表型鉴定，不仅耗时长，而且具有一定的局限性。而DNA分子标记技术具有不受环境影响、不受发育阶段、技术简单快速等特点而被广泛用于育种，加快育种的进度有选择的有效性。随着测序技术的发展，不仅测序的成本大大降低，而且可以获得大量的SNP和INDEL数据，为开发和目标基因紧密连锁的分子标记进行高通量标记检测提供了便利。KASP即竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allele-Specific PCR)，原理上和TaqMan检测方法相似，但它基于独特的ARM PCR原理，使用通用荧光引物进行位点检测，而不需要每个SNP位点都合成特异的荧光引物，因此成本低且可实现高通量检测，KASP标记检测技术已在医学、农学等领域得到广泛应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于大豆皱叶症抗性鉴定的KASP分子标记及应用，从而实现对大豆皱叶症抗性进行高效、准确、低成本鉴定及基因分型
为实现上述目的，本发明提供了一种用于大豆皱叶症抗性鉴定的KASP分子标记引物，所述KASP分子标记引物序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示
另一方面，提供了大豆皱叶症抗性的基因分型方法，通过提取大豆基因组DNA，用SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的KASP标记引物对提取的基因组DNA进行PCR扩增。
进一步，所述PCR扩增方法为：
PCR反应体系：DNA 2.5μL、KASP引物混合物0.07μL、2×KASP Master mix 2.5μL。
PCR反应程序：94℃预变性15min；94℃变性20s，61-55℃梯度PCR，每循环降低0.6℃，共10个循环；94℃变性20s，55℃复性及扩增60s，共26个循环。
所述的KASP引物混合物包括FAM上游引物、HEX上游引物、通用下游引物和纯水
进一步，所述KASP引物混合物由浓度均为100μM的FAM上游引物、HEX上游引物、通用下游引物与纯水按6:6:15:23体积比混合而成。
再一方面，上述的大豆皱叶症抗性鉴定的KASP分子标记引物在大豆皱叶症抗性鉴定中的应用。
进一步，所述鉴定方法如下：
(1)获得待测样品基因组DNA；
(2)以基因组DNA为模板，利用上述的KASP分子标记引物进行竞争性等位基因特异性PCR反应扩增；
(3)PCR反应结束后，收集每个反应孔产生的荧光信号，根据荧光信号的类型判断分子标记的基因型，进而鉴定出待鉴定个体的皱叶症抗性。
另一方面，上述的大豆皱叶症抗性鉴定的KASP分子标记在辅助大豆育种中的应用。
另一方面，提供了一种大豆皱叶症抗性检测试剂盒，包括上述的大豆皱叶症抗性鉴定的KASP分子标记引物。
与现有的技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.在抗性基因附近开发紧密连锁的KASP分子标记，该标记应用到高通量技术可以实现大豆的皱叶症抗性高效率、快速、价格便宜的鉴定及基因分型。
2.通过对478份待测后代材料进行KASP基因分型，成功分型的个体有476个，鉴定准确的个体476个，皱叶症抗性鉴定检测有效性达99.58％，准确度达到100％，检测成功率高，抗性鉴定准确度高。
具体实施方式
下面结合具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
实施例1
1)遗传群体构建及皱叶抗性田间鉴定：利用两个皱叶症抗性差异大的材料桂春8号(正常)和Y2017-1(皱叶症级4)杂交，去除假杂种后得到F1单株。F1单株种子株行种植，得到F2单株，F2单株的嫩叶样本，利用DNA提取试剂盒提取样本DNA按编号保存，同时参考陈文杰等(2020)(陈文杰，陈渊，韦清源，郭小红，汤复跃，杨萌，叶万典，梁江.一种大豆皱叶症发生特性及材料症级鉴定[J].大豆科学,2020,39(3))皱叶症鉴定方法鉴定F2单株的皱叶症级。F2单株的F2:3种子株行种植，并鉴定每个株行皱叶症级级皱叶纯合杂合情况。
2)极端性状混池重测序(BSA-seq)：结合F2单株和F2:3株行的皱叶鉴定结果，构建27(皱叶症级4)+27(皱叶症级0)的混池，每个混池中DNA等量混合，建成测序文库后用Illumina Novaseq 6000平台进行测序，数据下机过滤后，利用BWA软件将Clean Data比对到参考基因组序列上。
3)皱叶抗性基因定位：对经过滤和筛选所得到的样本间SNP和InDel位点，分别计算突变型混池(和野生型混池)中每个位点的(SNP或/和InDel)index值，然后根据Delta/Δindex进行BSA关联分析，以99％置信区间进行关联位点扫描，皱叶抗性基因被定位于大豆12号染色体的37.22M-39.30M位置。在此区间初步设计出能用于成功分型的KASP分子标记，并以此对桂春8号和Y2017-1构建的F2单株(正常单株，皱叶单株：)进行基因分型。利用Jionmap4.0进行局部连锁图谱构建，然后用QTLmap6.0对皱叶症抗性基因进行定位，并结合筛选重组子，进一步把皱叶症抗性基因定位在39.10M-39.51M范围内。
进一步在39.10M-39.51M范围设计紧密连锁的分子标记，开发出能成功用于基因分型的KASP分子标记，具体过程及引物序列信息如下：
KASP标记：SEQ ID NO.1(TGAGGATGGCCATTAATTTCTCA)和SEQ ID NO.2(TGAGGATGGCCATTAATTTCTCC)分别在5’末端连上FAM荧光标签和HEX荧光标签接头序列，作为其KASP FAM上游引物(FAM Forward primer，5’-3’)和HEX上游引物(HEX Forwardprimer，5’-3’)。通用下游引物(Reverse primer，5’-3’)序列为SEQ ID NO.3(TGCGGCATGGTGGATTATGTTAG)。
实施例2
利用大豆皱叶症抗性KASP分子标记测定两个皱叶症级差异大的材料桂春8号(皱叶症级0)和Y2017-1(皱叶症级4)以及由这两个材料杂交产生20个皱叶症级为0的F5单株。
1.田间大豆植株皱叶症级鉴定
参考陈文杰等(2020)(陈文杰，陈渊，韦清源，郭小红，汤复跃，杨萌，叶万典，梁江.一种大豆皱叶症发生特性及材料症级鉴定[J].大豆科学,2020,39(3))的大豆单株皱叶症级鉴定方法鉴定各个单株的皱叶症级，其中，皱叶症症级划分5个症级标准：
0级：正常，观测期冠层豆叶片无皱褶状，叶片平展；
1级：较正常，观测期冠层叶片轻微皱褶但不出现“勾手”状，叶片能平展；
2级：较敏感，观测期冠层叶片皱褶明显，有轻微的“勾手”状；
3级：敏感，观测期冠层大豆叶片皱褶严重，有明显的“勾手”状；
4级：严重敏感，观测期冠层叶片皱褶十分严重，“勾手”状严重，且叶片向下弯曲已基本不能张开。
1.分子标记检测
(1)PCR反应体系：
DNA 2.5μL(每个反应5-50ng)、KASP引物混合物0.07μL、2×KASP Master mix 2.5μL。KASP引物混合物由浓度均为100uM的FAM上游引物、HEX上游引物、通用下游引物与纯水按6:6:15:23体积比混合而成
(2)PCR反应程序：
94℃预变性15min；94℃变性20s，61—55℃梯度PCR，每循环降低0.6℃，共10个循环；94℃复性20s，55℃复性及扩增60s，共26个循环。
(3)分子标记检测步骤：
用植物基因组DNA提取试剂盒(天根生化DP305)提取亲本及后代的基因组DNA，以每个材料样本基因组DNA为模板，把样本DNA浓度调好后取2.5ul分装到PCR孔板中，并在PCR孔板相应位置设空白对照，以KASP标记引物进行PCR扩增，PCR结束后，取出孔板，参照《ABI7900 HT Fast RealTime PCR system实验操作规程》进行数据扫描，其中FAM、HEX、对照荧光ROX的激发波长分别为485、528和575nm，发射波长分别为520、560和610nm。利用软件KrakenTM进行数据分析，在图像坐标上，被FAM或HEX荧光序列标签的等位基因数据分别聚合在接近X轴(蓝色)或接近Y轴(红色)上的位置，位于坐标中间的(绿色)则是包含2个等位基因的杂合型，接近坐标原点的黑色斑点为空白对照，获得的结果见表1。
表1：标记分型及大豆皱叶症级鉴定结果
Figure GDA0003660552330000061
由表1可知对已知皱叶症级进行基因分型，基因分型结果与皱叶症级完全吻合，基因分型成功率高。
实施例3
利用分子标记预测桂春8号(皱叶症级0)和Y2017-1(皱叶症级为4)衍生的品系的皱叶症抗性。
待测大豆：桂春8号为母本，以Y2017-1为父本衍生的不同品系材料，其中F5单株253个，BC2F2单株205个。
田间大豆植株皱叶症级鉴定：参照实例1中的鉴定方法。
分子标记检测：参照实例1中检测方法，检测结果如表2，Undetermined表示检测失败
表2：标记分型及大豆皱叶症级鉴定结果
Figure GDA0003660552330000071
Figure GDA0003660552330000081
Figure GDA0003660552330000091
Figure GDA0003660552330000101
Figure GDA0003660552330000111
Figure GDA0003660552330000121
由表2可知通过基因分型对大豆皱叶症抗性预测，并通过田间试验结果验证，478个体成功分型的个体有476个，准确预测的476个体，皱叶症抗性鉴定检测有效性达99.58％，准确度达到100％，检测成功率高，抗性鉴定准确度高。
综上所述，本发明的大豆皱叶症抗性鉴定的KASP分子标记对大豆皱叶症抗性鉴定及基因分型高效、准确、低成本。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
序列表
<110> 广西壮族自治区农业科学院
<120> 大豆皱叶症抗性鉴定的KASP分子标记及应用
<141> 2021-02-04
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（）
<400> 1
tgaggatggc cattaatttc tca 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（）
<400> 2
tgaggatggc cattaatttc tcc 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（）
<400> 3
tgcggcatgg tggattatgt tag 23

Claims (7)

1.大豆皱叶症抗性鉴定的KASP分子标记引物，其特征在于，所述KASP分子标记引物序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
2.大豆皱叶症抗性的基因分型方法，其特征在于，提取大豆基因组DNA，用SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的KASP标记引物对提取的基因组DNA进行PCR扩增。
3.根据权利要求2所述的大豆皱叶症抗性的基因分型方法，其特征在于，所述PCR扩增方法为：
PCR反应体系：DNA 2.5µL、KASP引物混合物 0.07μL、2×KASP Master mix 2.5μL；
PCR反应程序：94℃预变性15 min；94℃变性20 s，61-55℃梯度PCR ，每循环降低0.6℃，共10个循环；94℃变性20 s，55℃复性及扩增60 s，共26个循环；
所述的KASP引物混合物包括FAM上游引物、HEX上游引物、通用下游引物和纯水。
4.根据权利要求3所述的大豆皱叶症抗性的基因分型方法，其特征在于，所述KASP引物混合物由浓度均为100µM的FAM上游引物、HEX上游引物、通用下游引物与纯水按6:6:15:23体积比混合而成。
5.如权利要求1所述的大豆皱叶症抗性鉴定的KASP分子标记引物在大豆皱叶症抗性鉴定中的应用。
6.根据权利要求5所述的KASP分子标记在大豆皱叶症抗性鉴定中的应用，其特征在于，所述鉴定方法如下：
(1)获得待测样品基因组DNA；
(2)以基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的KASP分子标记引物进行竞争性等位基因特异性PCR反应扩增；
(3)PCR反应结束后，收集每个反应孔产生的荧光信号，根据荧光信号的类型判断分子标记的基因型，进而鉴定出待鉴定个体的皱叶症抗性。
7.一种大豆皱叶症抗性检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的大豆皱叶症抗性鉴定的KASP分子标记引物。
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