CN113181151A - 短链脂肪酸在预防或/和治疗肝损伤中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了短链脂肪酸在预防或/和治疗肝损伤中的应用。短链脂肪酸是肠道菌群酵解膳食纤维的产物，属于内源性物质，毒副作用小，结构简单，易于代谢，获取方便，价格低廉，可以抑制肝脏脂肪变性和肝脏炎症发生，改善肝脏功能，预防或/和治疗肝损伤。

Description

短链脂肪酸在预防或/和治疗肝损伤中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及短链脂肪酸在预防或/和治疗肝损伤中的应用。

背景技术

肝损伤是临床常见的疾病，主要分为开放性肝损伤、病理性肝损伤、闭合性肝损伤和化学性肝损伤。随着社会发展，化学性肝损伤的发病人数日益增多，其中由长期或大量饮酒导致的酒精性肝损伤尤为高发，已经成为严重危害人类身体健康的常见疾病之一，主要包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎和肝硬化。在我国，酒精性肝损伤的发病率及与其相关的死亡率正在逐年上升，寻找有效预防和治疗酒精性肝损伤的方法至关重要。目前，酒精性肝损伤的发病机制较为复杂，是多种因素相互作用的结果。而肠道屏障功能受损引起的肠源性内毒素血症在酒精性肝损伤发生发展中发挥十分重要的作用，酒精改变肠道菌群组成，增加肠道通透性，造成细菌易位及其有害代谢产物，如内毒素，进入门静脉，激活肝脏内Kupffer细胞膜受体TLR4，进一步活化NF-κB促进促炎因子的释放，最终导致肝脏炎症。因此，基于肠肝轴调控肠道屏障-炎症通路已成为防治酒精性肝损伤的有效措施。

当前，酒精性肝损伤防治药物多以中草药提取物、药物复合物、肠道益生菌为主。如专利CN111481588A公开了一种防治酒精性肝损伤的组合物及其制备方法与应用，防治酒精性肝损伤的组合物包括绞股蓝提取物和荷叶提取物。该技术方案通过绞股蓝和荷叶的提取物进行配伍制得防治酒精性肝损伤的组合物，对酒精性肝损伤具有一定的缓解、预防及治疗作用。但上述各组成成分提取方式繁琐，成本高，且成分复杂，效应分子不明确，保存条件要求高。

发明内容

为解决以上技术问题，本发明提出短链脂肪酸在预防或/和治疗酒精性肝损伤中的应用。短链脂肪酸，包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异丁酸和异戊酸，是由肠道菌群发酵膳食纤维产生，能有效改善肠道屏障功能，维持肠道稳态，并调控机体炎症状态。虽然乙酸、丁酸在治疗溃疡性结肠炎、预防Ⅰ型糖尿病和结肠癌等方面研究广泛，但到目前为止，还未有报道指出直接补充丙酸和丁酸能够改善慢性酒精性肝损伤。

本发明提供的技术方案如下：

短链脂肪酸在预防或/和治疗肝损伤中的应用。

优选地，所述肝损伤为化学性肝损伤。

更优选地，所述化学性肝损伤为酒精性肝损伤。

优选地，所述短链脂肪酸为乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异丁酸或异戊酸中的一种或多种。

更优选地，所述短链脂肪酸为丙酸或/和丁酸。

优选地，短链脂肪酸给药形式包括前体药物、盐、酯或靶向释放制剂。

更优选地，前体药物为可以在生物代谢或者化学分解后释放特定短链脂肪酸的药物。

更优选地，靶向释放制剂包含与至少一种短链脂肪酸共价键合的载体分子。

更优选地，载体包括淀粉、树胶、寡糖或果胶类等碳水化合物或其他大分子材料。优选地，短链脂肪酸给药方式为口服、舌下含服、口腔含服、皮下注射、肌肉注射、静脉内注射或动脉内注射。

本发明提供了丙酸和丁酸在预防或/和治疗酒精性肝损伤中的应用，且防治效果显著。通过直接补充丙酸和丁酸防治酒精性肝损伤的发明还未有报道。丙酸和丁酸为结构明确的小分子，是正常人群肠道菌群发酵膳食纤维产生的短链脂肪酸，无毒性，安全性高，获取方便，成本低廉，能够满足公众对安全、有效且简单的防治酒精性肝损伤手段的需求。

本发明具有以下技术优势：

(1)丙酸和丁酸在体外促进酒精暴露下的肝细胞的增殖作用。

(2)降低肝脏指数的作用。

(3)改善肝脏功能，抑制ALT和AST水平升高。

(4)抑制肝脏脂肪变性，降低肝脏TC和TG含量。

(5)减少肝脏中淋巴细胞浸润，减轻炎症发生。

(6)增加肠道内容物中丙酸和丁酸的含量并改善肠道损伤，维持肠道屏障功能。

附图说明

图1为丙酸对酒精暴露下的肝细胞生存活力的影响图

图2为丁酸对酒精暴露下的肝细胞生存活力的影响图

图3为丙酸和丁酸对酒精性肝损伤小鼠体重的影响图

图4为丙酸和丁酸对酒精性肝损伤小鼠肝脏指数的影响图

图5为丙酸和丁酸对酒精性肝损伤小鼠血清中ALT水平的影响图

图6为丙酸和丁酸对酒精性肝损伤小鼠血清中AST水平的影响图

图7为丙酸和丁酸对酒精性肝损伤小鼠肝脏脂肪变性的改善作用图

图8为丙酸和丁酸对酒精性肝损伤小鼠肝脏TC含量的影响图

图9为丙酸和丁酸对酒精性肝损伤小鼠肝脏TG含量的影响图

图10为丙酸和丁酸对酒精性肝损伤小鼠肝脏炎症发生的缓解作用图

图11为丙酸和丁酸对酒精性肝损伤小鼠肠道内容物中丙酸含量的影响图

图12为丙酸和丁酸对酒精性肝损伤小鼠肠道内容物中丁酸含量的影响图

图13为丙酸和丁酸对酒精性肝损伤小鼠肝脏中丙酸含量的影响图

图14为丙酸和丁酸对酒精性肝损伤小鼠肝脏中丁酸含量的影响图

图15为丙酸和丁酸对酒精性肝损伤小鼠肠道屏障功能的影响图。

具体实施方式

现结合具体实施例和附图对本发明做进一步说明。

实施例1

一、测定丙酸或丁酸对酒精暴露下的肝细胞存活率的影响

需要说明的是，在本发明中，实验细胞为人肝癌细胞HepG2，细胞培养所用的培养基为含10％胎牛血清和1％双抗(青霉素100U/mL、链霉素100μg/mL)的Hyclone高糖DMEM培养基。

具体测定方法如下：

HepG2细胞复苏后，传代一次后，取对数生长期的细胞，以每孔5000个细胞的浓度接种于96孔板中，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养过夜。实验设空白组，阴性对照组和给药组，每组5个复孔，吸弃原有培养基，空白对照组更换为新鲜的无血清DMEM，阴性对照组更换为酒精浓度为800mM的无血清培养基，给药组更换为酒精浓度为800mM且丙酸钠或丁酸钠浓度为0.2、0.4和0.8mM的无血清培养基。处理24h后，弃掉培养基，并用PBS缓冲液洗涤一遍后，每孔加入0.5mg/mL的MTT与培养基混合液100μl，孵育4h，吸弃培养基，每孔加入150μlDMSO，放到摇床上快速摇晃，充分溶解紫色晶体，用酶标仪测定490nm下的吸光值。

二、测定丙酸或丁酸对酒精性肝损伤模型小鼠的影响

2.1小鼠酒精性肝损伤模型构建(NIAAA法)

取SPF级8周龄雄性C57BL/6(体重＞20g)小鼠48只，随机分为4组，分别为：空白对照组(Con)、酒精造模组(EtOH)、补充100mM丙酸钠造模组(EtOH+P)和补充100mM丁酸钠造模组(EtOH+B)，每组12只。小鼠在温度为25±2℃、相对湿度为50±5％、12h光照/12h黑暗的标准化动物房中完成1周的环境适应期。使用Lieber Decarli对照液体饲料适应性喂养5天后，空白对照组小鼠给予Lieber Decarli对照液体饲料配对喂养直至实验结束。造模组小鼠的饲料由Lieber Decarli液体对照饲料和Lieber Decarli酒精液体饲料按比例混合，使酒精浓度以每天增加1％的幅度递增，喂养过渡5天。过渡期结束后，进入造模期，酒精造模组、丙酸钠补充组和丁酸钠补充组给予酒精浓度为5％，热量为28％的Lieber Decarli酒精液体饲料，连续配对喂养30天。实验进行过程中，每周固定时间称重小鼠一次。造模期的最后一天早上7-9点，空白对照组小鼠灌胃糊精，造模组三组小鼠灌胃酒精，9h后收集小鼠肠道内容物，于-80℃超低温保存。麻醉小鼠，摘眼球取血后解剖小鼠收集完整肝脏组织和部分结肠组织，用PBS缓冲液冲洗干净，一部分组织样品于-80℃保存，一部分样品放入4％多聚甲醛中固定。

2.2肝脏指数测定

解剖小鼠，取出完整肝脏，滤纸吸取表面血水后，称重，计算小鼠肝脏指数(％)＝肝脏质量(g)/体重(g)×100％。

2.3肠道内容物中短链脂肪酸的测定

利用气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术检测各组肠道内容物中SCFAs含量：取收集的粪便0.015g，加入600μl预冷的超纯水，组织研磨仪研磨均匀后，室温下超声提取15min，4℃10000rpm离心10min后取100μl上清液于玻璃管中，加入10μl 2-乙基丁酸作为内标校正，然后加入44μl PH＝7的PBS缓冲液和280μl100mM五氟溴苄，充分混匀后，置于60℃水浴加热1.5h，降温后加入200μl正己烷，涡旋3min，转移到1.5mL离心管，10000rpm，离心10min，取最上层液体进行GC-MS分析，根据标准工作液建立的线性回归方程进行定量分析。

2.4生化指标分析

血清中ALT、AST测定：选取干净的96孔板，测定孔和对照孔加入20μl 37℃预温的基质液，之后在测定孔加入5μl待测样本，置于37℃恒温培养箱孵育30min，各孔加入20μl2,4-二硝基苯肼液，对照孔加入5μl蒸馏水，37℃孵育20min，最后各孔加入200μl 0.4mol/L氢氧化钠液，水平摇晃均匀后室温放置15min，酶标仪波长510nm下测定各孔吸光值。

肝脏中TC、TG测定：称取0.01-0.015g肝脏组织，按体重(g)：体积(mL)＝1:9的比例，加入9倍体积的生理盐水，冰上研磨成匀浆，2500rpm离心10min，取上清液2.5μL加入96孔板中作为样本孔，空白孔加入2.5μL蒸馏水，校准孔加入2.5μL标准品，之后所有孔加入250μL工作液，37℃孵育10min，波长510nm，酶标仪测定各孔吸光值。同时，取组织上清液测定总蛋白浓度，按照说明书上的计算公式计算各样本TC、TG含量。

2.5组织切片染色

油红O染色：肝脏组织冷冻切片，厚度为10-15μm，干燥后浸入50％乙醇稍洗，油红O染色稀释液浸染8-10min，50％乙醇分色，清水洗涤，Harris苏木精染核30s，清水冲洗至变蓝，用甘油明胶固封，显微镜下观察并拍照。

HE染色：肝脏和结肠组织石蜡包埋后进行切片，厚度在2-3μm左右，将切好的组织样本放入二甲苯中充分浸泡，重复一次，随后，将组织样本放入无水乙醇浸泡5min，最后用95％、85％、70％的酒精依次浸泡组织样本，充分水化。PBS清洗组织后，滴加苏木素染色液于样本组织中，染色10min，蒸馏水洗去多余染液后，使用1％的盐酸乙醇将过度染色的细胞核上多余的染液去除，随后使用促蓝液对细胞核复染，用蒸馏水冲洗干净。将伊红染液滴加到组织上，染色3min，之后使用80％、95％和100％乙醇进行梯度脱水，最后使用二甲苯浸泡组织样本，风干后使用中性树胶封片，显微镜观察并拍照留存。

三、结果分析

结果用均数±离均差表示。用SPSS 17.0单因素方差分析比较多组间差异性，p＜0.05被认为差异显著。

3.1丁酸或丙酸对酒精暴露下的肝细胞生存活力的影响

由图1和图2可知，丙酸钠和丁酸钠均能够减少酒精导致的肝细胞死亡，对酒精暴露下的肝细胞产生保护作用，呈剂量依赖性，且丙酸钠的护肝效果优于丁酸钠，这一结果表明丙酸和丁酸均具有预防或/和治疗酒精性肝损伤的潜力。*代表与单纯酒精暴露组相比差异显著(p<0.05)；**代表与单纯酒精暴露组相比差异极显著(p<0.01)。

3.2丙酸或丁酸对慢性酒精性肝损伤小鼠体重和肝脏指数的影响

由附图3可知，由于喂养过程中一直遵循等热量喂养(配对喂养)，因此各组小鼠在实验过程中摄入热量相等，实验各组间无显著性差异(p＞0.05)，说明补充丙酸和丁酸不影响小鼠体重变化。而各组小鼠的肝脏指数(如图4)显示，相比空白对照组(Con)，单纯的酒精喂养组(EtOH)肝脏指数显著升高，而在酒精喂养过程中添加丙酸组(EtOH+P)的小鼠肝脏指数有明显的改善，丁酸补充组(EtOH+B)小鼠的肝脏指数虽有轻微改善，但效果不显著，说明丙酸可有效改善酒精对小鼠肝脏重量的影响，且效果优于丁酸。*代表与酒精组小鼠相比差异显著(p<0.05)；**代表与酒精组小鼠相比差异极显著(p<0.01)。

3.3丙酸或丁酸对慢性酒精性肝损伤小鼠肝脏功能的影响

小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)含量检测结果如图5和图6所示，EtOH组的ALT和AST含量较Con组显著上升，肝脏功能受损严重，但在EtOH+P和EtOH+B组，ALT和AST水平显著低于EtOH组，肝脏损伤减轻。说明饮食中添加丙酸或丁酸可以大幅度减轻酒精长期暴露对肝脏细胞造成的损伤，改善肝脏功能。*代表与酒精组小鼠相比差异显著(p<0.05)；**代表与酒精组小鼠相比差异极显著(p<0.01)。

3.4丙酸或丁酸对慢性酒精性肝损伤小鼠肝脏脂肪变性的影响

酒精性肝损伤早期常见的症状之一便是肝脏脂肪变性。由附图7所示的肝脏油红O染色和HE染色结果可见，与Con组相比，EtOH组肝脏形成了大量的脂滴，数量多且形态大，脂肪堆积严重，而EtOH+P组和EtOH+B组脂滴数量减少，形态变小。由此可见，丙酸或丁酸干预可以显著减轻酒精诱导的肝脏脂肪变性程度。

3.5丙酸或丁酸对慢性酒精性肝损伤小鼠肝脏脂质水平的影响

为了进一步探究丙酸和丁酸对酒精性肝损伤小鼠肝脏中脂质水平的影响，对肝脏中的总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)含量进行了测定，如附图8和图9所示，慢性酒精暴露的小鼠(EtOH组)肝脏中TG和TC的水平均明显升高(p＜0.01)，为对照组的4.3倍和3.2倍。相比于EtOH组，在酒精暴露过程中给予丙酸和丁酸则会显著降低小鼠肝脏中的TC和TG水平(p＜0.01)，抑制肝脏中脂质的形成。此结果进一步表明，补充丙酸或丁酸能够显著降低酒精性肝损伤小鼠肝脏内的脂质堆积。*代表与酒精组小鼠相比差异显著(p<0.05)；**代表与酒精组小鼠相比差异极显著(p<0.01)。

3.6丙酸或丁酸对慢性酒精性肝损伤小鼠肝脏炎症的影响

肝脏HE染色结果如10所示，相较与Con组，EtOH组小鼠肝脏组织有明显的淋巴细胞浸润，提示肝脏有炎症发生，而EtOH+P组和EtOH+B组无明显的大面积的炎性浸润，说明丙酸或丁酸干预可减少酒精性肝损伤小鼠肝脏炎症发生的可能性。

3.7丙酸或丁酸对慢性酒精性肝损伤小鼠肠道内容物和肝脏中短链脂肪酸含量的影响

通过对小鼠肠道内容物中短链脂肪酸含量的分析发现(如图11和图12所示)，长期酒精暴露(EtOH)会造成小鼠肠道中的丙酸和丁酸含量显著降低(p＜0.05)，因此，相比于酒精组，直接补充丙酸或丁酸会同时显著提升丙酸和丁酸的含量。而对肝脏中的短链脂肪酸含量检测发现(如图13和图14所示)，酒精暴露不会降低肝脏中的丙酸和丁酸水平，补充丙酸或丁酸也并不会增加酒精性肝损伤小鼠肝脏中的丙酸和丁酸含量，因此我们推测肠道中丙酸和丁酸含量的恢复是丙酸或丁酸发挥改善酒精性肝损伤的主要机制。*代表与酒精组小鼠相比差异显著(p<0.05)；**代表与酒精组小鼠相比差异极显著(p<0.01)。

3.8丙酸或丁酸对慢性酒精性肝损伤小鼠肠道屏障的影响

肠道屏障功能受损引起的肠源性内毒素血症是酒精性肝损伤的主要发病机制，因此对各组的小鼠的结肠病理状态进行了分析。由附图15可见，与Con组相比，EtOH组小鼠结肠肠粘膜变薄、坏死脱落，杯状细胞减少且有严重的炎性细胞浸润，证明肠道屏障功能受损，补充丙酸或丁酸后，肠粘膜厚度增加，杯状细胞数量增多，且炎性状态有一定程度的缓解。这一结果表明，丙酸或丁酸干预可一定程度改善酒精性肝损伤小鼠的肠道通透性，维持肠道屏障功能。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.短链脂肪酸在预防或/和治疗肝损伤中的应用。

2.根据权利要求1所述的短链脂肪酸在预防或/和治疗肝损伤中的应用，其特征在于：所述肝损伤为化学性肝损伤。

3.根据权利要求2所述的短链脂肪酸在预防或/和治疗肝损伤中的应用，其特征在于：所述化学性肝损伤为酒精性肝损伤。

4.根据权利要求1所述的短链脂肪酸在预防或/和治疗肝损伤中的应用，其特征在于：所述短链脂肪酸为乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异丁酸或异戊酸中的一种或多种组合。

5.根据权利要求4所述的短链脂肪酸在预防或/和治疗肝损伤中的应用，其特征在于：所述短链脂肪酸优选为丙酸或/和丁酸。

6.根据权利要求1所述的短链脂肪酸在预防或/和治疗肝损伤中的应用，其特征在于：短链脂肪酸给药形式包括前体药物、盐、酯或靶向释放制剂。

7.根据权利要求6所述的短链脂肪酸在预防或/和治疗肝损伤中的应用，其特征在于：前体药物为可以在生物代谢或者化学分解后释放特定短链脂肪酸的药物。

8.根据权利要求6所述的短链脂肪酸在预防或/和治疗肝损伤中的应用，其特征在于：靶向释放制剂包含与至少一种短链脂肪酸共价键合的载体分子。

9.根据权利要求8所述的短链脂肪酸在预防或/和治疗肝损伤中的应用，其特征在于：载体包括淀粉、树胶、寡糖或果胶类等碳水化合物或其他大分子材料。

10.根据权利要求1所述的短链脂肪酸在预防或/和治疗肝损伤中的应用，其特征在于：短链脂肪酸给药方式为口服、舌下含服、口腔含服、皮下注射、肌肉注射、静脉内注射或动脉内注射。

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