CN113172880B - 一种基于气动精准控制活性软骨支架的连续梯度化仿生制造方法 - Google Patents

一种基于气动精准控制活性软骨支架的连续梯度化仿生制造方法 Download PDF

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Abstract

本发明提出一种基于气动精准控制活性软骨支架的连续梯度化仿生制造方法，基于海藻酸钠SA离子交联与明胶Gel低温凝固成形机理，以SA、Gel、羟基磷灰石HA和软骨细胞悬浮液为支架基体材料，根据天然软体组织形态特征，采用基于高压可控气体的挤压沉积3D打印技术实现内嵌活细胞三维软体支架的制备；制备过程中通过对不同料筒所施压力的实时动态精准调控，实现组分含量的精准可控，而后经动态混合喷头实现不同组分材料的实时动态混合及连续梯度铺放，并在CaCl2溶液及低温平台的共同作用下使支架交联成。解决了现有软骨支架材料浓度单一，分层结构中各层材料成分单一等与天然软骨连续梯度的解剖学特性不符的问题。

Description

一种基于气动精准控制活性软骨支架的连续梯度化仿生制造 方法
技术领域
本发明属于软骨组织工程领域，具体涉及一种基于气动精准控制活性软骨支架的连续梯度化仿生制造方法。
背景技术
关节软骨缺损是骨关节临床常见病之一，由于软骨细胞增殖能力差，损伤后无法通过自身软骨细胞增殖修复创面，致使各种损伤、炎症和退行性病变均可引起不可逆性软骨缺损。传统的治疗方案主要有两种，一种是自体骨移植，但会造成新的创伤，容易引发供体组织并发症；另一种是异体骨移植，但容易引起免疫排斥反应，存在从供体传染疾病的危险。近年来，3D打印组织工程软骨支架的出现为临床关节软骨的缺损修复带了曙光。
当前3D打印技术已经实现了软骨支架外形的可控制造，在工艺原理上满足了制备软骨支架的要求。但是天然关节软骨具有复杂的连续梯度化层状结构，目前的制造技术还只是停留在单一浓度的水凝胶软骨支架研究上，已有的层状多级结构软骨支架也仅仅只是简单分几个梯度来制造，每一层的成分含量是单一的，层与层之间存在明显的界线。这与天然软骨结构、成分、性能的连续梯度解剖学特性还存在一定差距。
海藻酸钠(SA)是从海藻中分离的多糖聚合物，有较好的细胞相容性和生物降解性并且交联方式简单，当其与钙离子(Ca2+)接触时，可瞬时凝胶化形成不可逆的海藻酸钙水凝胶，但是单一的海藻酸钠水凝胶存在很多缺点，比如力学强度低，细胞的附着点相对较少，打印一段时间后海藻酸钠凝胶收缩严重，不能很好地成型，所以需要其他高分子生物材料对海藻酸钠进行改性。
明胶(Gel)是通过胶原蛋白的三重螺旋结构水解形成的单链分子，是一种来源丰富的天然高分子材料。明胶具有很多优点，其表面活性强，温度敏感性高，且有良好的亲水性能和生物相容性，易于降解吸收，并可以促进软骨细胞增殖及维持其表型表达，具有诱导间充质干细胞向成骨细胞分化的作用。此外明胶不会与氯化钙发生反应，和海藻酸钠共混后会产生分子间作用力，进而提高材料机械强度，是构建软骨的理想材料。
羟基磷灰石(HA)是脊椎动物骨骼和牙齿矿物质的主要无机成分，具有良好的生物相容性、生物降解性与生物活性。大量的科学研究表明，羟基磷灰石材料对骨缺损区有较好的修复效果，因此HA作为人工骨材料在骨缺损修复上得到广泛应用。将HA引入到水凝胶基质中，不仅可以提升水凝胶的拉伸与压缩性能，更有助于改善水凝胶表面光滑与粘附性差等不足。
近年来，通过传统组织工程和生物3D打印方法来制备仿生软骨支架的论文和专利屡见不鲜，但在成分、结构、细胞浓度及力学性能方面实现梯度化软骨支架仿生制造的研究未见报道。
公开号为CN105031724A的专利公开了“一种组织工程软骨支架及其制备方法”，该方法以Ⅱ型胶原蛋白、透明质酸、硫酸软骨素和羟基磷灰石为基体材料，通过3D打印机得到初级CII-HA-CS-HAP三维软骨支架，然后利用EDC/NHS系统将初级CII-HA-CS-HAP三维软骨支架进行交联，再冷冻干燥得到最终的CII-HA-CS-HAP三维软骨支架。该制备方法流程简单，所制备的软骨支架具有生物相容性好，毒性低等优点，但该方法仅以单一浓度成型材料构成软骨支架，支架的力学性能较差，且单一梯度的结构与天然软骨连续梯度的结构不符。
公开号为CN108355174A的专利公开了“一种多功能分层关节软骨支架的制备方法”，该方法首先将软骨支架分为3层：软骨层、钙化层、软骨下骨层，然后针对各层的力学性能和生物特性来制备适合于不同层成型的水凝胶材料，最后通过3D打印方式完成了支架的制造。该方法虽然从一定程度上模拟了天然软骨的分层结构，但是支架的各层材料成分含量单一，层与层之间存在明显的界限，与天然软骨结构、成分、性能的连续梯度解剖学特性还存在一定差距。
发明内容
为克服现有软骨支架材料浓度单一，分层结构中各层材料成分单一等与天然软骨连续梯度的解剖学特性不符的问题，本发明提出了一种以SA、Gel、HA、软骨细胞悬浮液为软骨支架基体材料，基于海藻酸钠离子交联与明胶低温凝固成形机理来制备连续梯度化活性软骨支架的方法：首先制备SA、Gel以及SA/HA水凝胶和软骨细胞悬浮液，采用精准可控的高压气体对装有不同打印材料的料筒施加动态变化的压力，而后经动态混合喷头实现不同组分材料的实时动态混合及连续梯度铺放，在CaCl2溶液及低温平台的共同作用下交联定型，如此层层堆叠，最终完成内嵌细胞活性软骨支架的连续梯度化仿生制造。
本发明的技术方案为：
所述一种基于气动精准控制活性软骨支架的连续梯度化仿生制造方法，基于海藻酸钠SA离子交联与明胶Gel低温凝固成形机理，以SA、Gel、羟基磷灰石HA和软骨细胞悬浮液为支架基体材料，根据天然软体组织形态特征，采用基于高压可控气体的挤压沉积3D打印技术实现内嵌活细胞三维软体支架的制备；制备过程中通过对不同料筒所施压力的实时动态精准调控，实现组分含量的精准可控，而后经动态混合喷头实现不同组分材料的实时动态混合及连续梯度铺放，并在CaCl2溶液及低温平台的共同作用下使支架交联成。
进一步的，所述一种基于气动精准控制活性软骨支架的连续梯度化仿生制造方法，包括以下步骤：
步骤1：依据天然软骨分层特征，建立软骨支架的多层组织数学模型和三维CAD模型，为关节软骨支架的梯度化仿生制造提供数据支撑；并结合水凝胶基体材料特性，确定软骨支架不同带层基体材料的组分配比及软骨细胞密度分布；
步骤2：取用原代关节软骨细胞进行培养，得到细胞悬浮液；根据水凝胶基体材料的理化特性，配制SA、Gel以及SA/HA水凝胶溶液，并于29～31℃水浴锅中保温备用；配制质量分数为2％～6％的CaCl2溶液，静置待用；
步骤3：将制备好的细胞悬浮液、SA、Gel以及SA/HA水凝胶溶液分别装入不同的料筒中，并连接好驱动气管，装配好主动混合喷头，将打印基板温度设置为4℃～6℃；
步骤4：将步骤1建立的软骨支架的三维CAD模型切片处理，得到切片处理文件，并导入3D挤压成型设备；
步骤5：启动气泵，开始打印，按照步骤1所确定的软骨支架不同带层基体材料组分配比及软骨细胞密度分布，对不同料筒施加不同大小的压力，不同组分含量的基体材料经主动混合喷头均匀混合后精准沉积于低温基板上，通过层层堆叠构建了材料成分在层间和层内梯度变化的软骨支架，在结构和功能上模拟了天然软骨的分层连续梯度变化规律；每层打印后喷洒所制备的CaCl2溶液，使其交联成型，如此层层固化堆叠，完成整个支架的打印；
步骤6：将步骤5所打印的支架在室温环境下浸泡在制备的CaCl2溶液中，取出后用DMEM细胞培养液对支架进行漂洗；
步骤7：将步骤6制备的软骨支架置于动态灌流系统平台进行培养，培养完成后得到符合要求的软骨支架。
进一步的，步骤2配制的CaCl2溶液质量分数为4％。这里进一步限定的主要原因是，氯化钙浓度过高会造成软骨支架脱水率增加，不利于细胞生存，氯化钙浓度过低会导致软骨支架交联反应不完全，造成支架无法交联成型。氯化钙浓度达到4.0％时，海藻酸钠水凝胶的拉压强度和吸水率最大，支架成型效果最好。
进一步的，步骤1中，依据天然软骨不同带层解剖学特征数据，分析关节软骨结构、成分、性能的梯度分布规律，确定天然软骨分层特征。
进一步的，步骤2中，细胞培养液为高糖DMEM培养液，其中添加有9％～11％胎牛血清、1～3mM谷氨酰胺和90～110μm/ml抗生素，经过多次传代达到需求数量。
进一步的，步骤2中，使用前用胰酶消化，并加入DMEM细胞培养液得到细胞密度为4.0×107～6.0×107cells/ml的细胞悬浮液。
进一步的，步骤2中，根据水凝胶基体材料的理化特性，分别配制3wt％～8wt％的SA、Gel以及SA/HA水凝胶溶液。
进一步的，步骤3中，打印基板温度设置为6℃。这里对温度做进一步的限定，主要是因为申请人在研究过程中发现，明胶在6℃的成形环境中打印出的线材凝固性能和成型效果都能达到最好。
进一步的，步骤6中，支架在制备的CaCl2溶液中浸泡30min后取出，并用DMEM细胞培养液对支架进行2～3次漂洗，去除多余的交联剂CaCl2，避免过交联现象的发生。
进一步的，步骤7中，动态灌流系统平台中的细胞培养液为高糖DMEM培养液，其中添加有9％～11％胎牛血清、1～3mM谷氨酰胺、4～6ng/ml生长因子和90～110μm/ml抗生素。
进一步的，所述3D挤压成型设备包括连续梯度打印控制系统和供料系统；
所述连续梯度打印控制系统包括上位机PC、下位机FPGA控制板、BUCK电路；
所述供料系统包括气泵、减压阀、电气比例阀、除菌过滤器、气压传感器、打印料筒、主动混合喷头；
根据软骨支架不同带层基体材料的组分配比及软骨细胞密度分布需求，在上位机PC设定驱动气压的大小，并发送给下位机FPGA控制板，在下位机FPGA控制板中转换为PWM信号来调节BUCK电路的输出电压，BUCK电路控制电气比例阀输出相应大小的气压，所述电气比例阀通过气泵和减压阀提供气源；气压传感器采集电气比例阀输出气压并反馈给下位机FPGA控制板，实现误差反馈控制；电气比例阀输出气压通过除菌过滤器后驱动打印料筒，并经过主动混合喷头实现挤压沉积打印。
所述3D挤压成型设备以FPGA控制板加BUCK电路为核心，并通过控制算法构成闭环反馈系统，改善了气动挤出的时滞、时变和非线性特征，实现对输出气压的无级连续精准控制，进而达到不同组分材料的实时动态精准控制，满足了连续梯度化仿生软骨支架基体材料组分、含量精准按需铺放的技术需求。
此外，主动混合喷头不仅实现了打印材料实时混合，而且还通过设置单向输出结构实现了打印料筒中打印材料的单向流动，防止因不同料筒驱动气压相差较大时导致的打印材料串流污染问题。
有益效果
与现有技术相比，本发明具有显著的优点：
(1)本发明以天然软骨不同带层解剖学特征为依据，采用连续梯度打印控制系统和供料系统实现了材料组分在层间和层内的梯度变化，完成了活性软骨支架的连续梯度化仿生制造，在结构和功能上模拟了天然软骨的分层连续梯度变化规律。
(2)本发明制备的活性软骨支架，以可降解的水凝胶为基体材料，其中内嵌的软骨细胞来源于患者，经过动态灌流系统平台的培养后，可直接用于病患软骨移植手术。各种营养物质和生长因子混合在水凝胶支架中，还可以起到缓释的作用，实现对活性软骨支架生长发育的调控。
(3)本发明制备的软骨支架以SA、Gel、SA/HA为基体材料，可以根据需求对不同材料进行组合和比例搭配，弥补了单一材料力学性能较差、吸水性差、降解过快等不足，最大限度地满足支架的需要，使最终成型的支架具有良好的生物相容性和生物、机械性能，有利于细胞的粘附和繁殖，并能够满足软骨向软骨下骨传递载荷，缓冲减震的作用。
(4)本发明设计并搭建了梯度打印控制系统，该控制系统以FPGA控制板加BUCK电路为核心，结合模糊PID算法构成一个闭环反馈系统，改善了气动挤出的时滞、时变和非线性特征，实现了输出气压大小的精准控制，保障了支架基体材料组分、含量的按需挤压。
(5)本发明以SA离子交联和Gel低温凝固为支架成型机理，可以保证支架内嵌细胞的活性。通过调控气压可以实现同一分层截面不同位置以及不同分层中细胞密度的梯度分布，相比于“先成型支架后植入细胞”的方法具有更好的生物性能，更加符合天然软骨成分、结构的连续梯度的解剖学特性。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为连续梯度关节软骨支架的制备原理图；
图2为连续梯度打印控制系统工作原理图。
具体实施方式
本发明针对现有软骨支架材料浓度单一，分层结构中各层材料成分单一等与天然软骨连续梯度的解剖学特性不符的问题，基于海藻酸钠(SA)离子交联与明胶(Gel)低温凝固成形机理，以SA、Gel、羟基磷灰石(HA)和软骨细胞悬浮液为支架基体材料，根据天然软体组织形态特征，采用基于高压可控气体的挤压沉积3D打印技术实现内嵌活细胞三维软体支架的制备。制备过程中通过对不同料筒所施压力的实时动态精准调控，实现组分含量的精准可控，而后经动态混合喷头实现不同组分材料的实时动态混合及连续梯度铺放，并在CaCl2溶液及低温平台的共同作用下使支架交联成。
该方法以自主设计、搭建的连续梯度打印控制系统和供料系统为硬件基础，根据软骨支架不同带层基体材料的组分配比及软骨细胞密度分布需求，在上位机PC设定驱动气压的大小，通过串口及时发送给下位机FPGA控制板，经过FPGA处理后转换为PWM信号来调节BUCK电路的输出电压，通过电气比例阀的控制来输出相应大小的气压，气压传感器采集输出气压经AD转换反馈给FPGA，并利用模糊PID控制算法进行误差调整。整个控制系统是一个闭环反馈系统，可以实现对气压的无级连续精准控制，进而达到不同组分材料的实时动态精准控制，满足了连续梯度化仿生软骨支架基体材料精准铺放的技术需求。
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本实施例以人体膝关节处的半月板软骨支架制备为例，来详述该方法的制备过程。
步骤1：依据半月板不同带层解剖学特征数据，分析半月板结构、成分、性能的梯度分布规律，建立相应基于统计学规律的多层组织数学模型和三维CAD模型，为关节软骨支架的梯度化仿生制造提供数据支撑；并结合水凝胶基体材料的理化特性，确定半月板软骨支架不同层次基体材料的组分配比及软骨细胞密度分布；
步骤2：取用病患个体的原代半月板关节软骨细胞进行培养，细胞培养液为高糖DMEM培养液，其中添加有10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺和100μm/ml青霉素/链霉素，经过多次传代已达到需求数量，使用前用胰酶消化，并加入DMEM细胞培养液从而制备出细胞密度为5.0×107cells/ml的细胞悬浮液；
根据水凝胶基体材料的理化特性，配制质量分数为3％wt SA、5％wt Gel的水凝胶以及3％wt SA和8％wt HA的复合水凝胶，并于30℃水浴锅中保温备用；配制质量分数为4％的CaCl2溶液，静置待用；
步骤3：将制备好的细胞悬浮液、SA、Gel以及SA/HA水凝胶溶液分别装入不同的料筒中，并连接好驱动气管，装配好主动混合喷头，将打印基板温度设置为6℃；
步骤4：将步骤1所建软骨支架的三维CAD模型切片处理后的STL文件导入3D挤压成型机；
步骤5：启动气泵，开始打印，按照步骤1所确定的软骨支架不同带层基体材料组分配比及软骨细胞密度分布，对不同料筒施加不同大小的压力，不同组分含量的基体材料经主动混合喷头均匀混合后精准沉积于低温基板上，通过层层堆叠构建了材料成分在层间和层内梯度变化的软骨支架，在结构和功能上模拟了天然软骨的分层连续梯度变化规律；每层打印后及时喷洒所制备的CaCl2溶液，使其交联成型，如此层层固化堆叠，完成整个支架的打印；
步骤6：将步骤5所打印的支架在室温环境下浸泡在制备的CaCl2溶液中30min后取出，取出后用DMEM细胞培养液对支架进行3次漂洗，去除多余的交联剂CaCl2，避免过交联现象的发生；
步骤7：将步骤6制备的软骨支架置于动态灌流系统平台进行培养，细胞培养液为高糖DMEM培养液，其中添加有10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、5ng/ml CDGF生长因子和100μm/ml青霉素/链霉素。3周后培养完成，得到符合要求的软骨支架，便可用于病患半月板移植手术。
本发明步骤1基于天然软骨不同带层解剖学特征，分析关节软骨结构、成分、性能的梯度分布规律，建立相应基于统计学规律的多层组织数学模型和三维CAD模型，为关节软骨支架的梯度化仿生制造提供数据支撑。
本发明步骤5按照步骤1所确定的软骨支架不同带层基体材料组分配比及软骨细胞密度分布，对不同料筒施加不同大小的压力，不同组分含量的基体材料经主动混合喷头均匀混合后精准沉积于低温基板上，通过层层堆叠构建了材料成分在层间和层内梯度变化的软骨支架，在结构和功能上模拟了天然软骨的分层连续梯度变化规律。
本发明步骤5对不同料筒施加不同大小的实时气压是基于自主设计并搭建的梯度打印控制系统，该控制系统以FPGA控制板加BUCK电路为核心，结合模糊PID控制算法构成一个闭环反馈系统，改善了气动挤出的时滞、时变和非线性特征，实现了输出气压大小的精准控制，保障了支架基体材料组分、含量的按需挤压。
本发明步骤5的主动混合喷头不仅需要实现打印材料实时混合，而且还要保证料筒中打印材料的单向流动性，防止因不同料筒驱动气压相差较大时导致的打印材料串流污染问题。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (8)

1.一种基于气动精准控制活性软骨支架的连续梯度化仿生制造方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1：依据天然软骨分层特征，建立软骨支架的多层组织数学模型和三维CAD模型；并结合水凝胶基体材料特性，确定软骨支架不同带层基体材料的组分配比及软骨细胞密度分布；
步骤2：取用原代关节软骨细胞进行培养，得到细胞悬浮液；根据水凝胶基体材料的理化特性，配制SA、Gel以及SA/HA水凝胶溶液，并于29~31℃水浴锅中保温备用；配制质量分数为2%~6%的CaCl2溶液，静置待用；
步骤3：将制备好的细胞悬浮液、SA、Gel以及SA/HA水凝胶溶液分别装入不同的料筒中，并连接好驱动气管，装配好主动混合喷头，将打印基板温度设置为4℃~6℃；
步骤4：将步骤1建立的软骨支架的三维CAD模型切片处理，得到切片处理文件，并导入3D挤压成型设备；
所述3D挤压成型设备包括连续梯度打印控制系统和供料系统；
所述连续梯度打印控制系统包括上位机PC、下位机FPGA控制板、BUCK电路；
所述供料系统包括气泵、减压阀、电气比例阀、除菌过滤器、气压传感器、打印料筒、主动混合喷头；
根据软骨支架不同带层基体材料的组分配比及软骨细胞密度分布需求，在上位机PC设定驱动气压的大小，并发送给下位机FPGA控制板，在下位机FPGA控制板中转换为PWM信号来调节BUCK电路的输出电压，BUCK电路控制电气比例阀输出相应大小的气压，所述电气比例阀通过气泵和减压阀提供气源；气压传感器采集电气比例阀输出气压并反馈给下位机FPGA控制板，实现误差反馈控制；电气比例阀输出气压通过除菌过滤器后驱动打印料筒，并经过主动混合喷头实现挤压沉积打印；
步骤5：启动气泵，开始打印，按照步骤1所确定的软骨支架不同带层基体材料组分配比及软骨细胞密度分布，对不同料筒施加不同大小的压力，不同组分含量的基体材料经主动混合喷头均匀混合后精准沉积于低温基板上，通过层层堆叠构建了材料成分在层间和层内梯度变化的软骨支架；每层打印后喷洒所制备的CaCl2溶液，使其交联成型，如此层层固化堆叠，完成整个支架的打印；
步骤6：将步骤5所打印的支架在室温环境下浸泡在制备的CaCl2溶液中，取出后用DMEM细胞培养液对支架进行漂洗；
步骤7：将步骤6制备的软骨支架置于动态灌流系统平台进行培养，培养完成后得到符合要求的软骨支架。
2.根据权利要求1所述一种基于气动精准控制活性软骨支架的连续梯度化仿生制造方法，其特征在于：步骤2配制的CaCl2溶液质量分数为4%。
3.根据权利要求1所述一种基于气动精准控制活性软骨支架的连续梯度化仿生制造方法，其特征在于：步骤1中，依据天然软骨不同带层解剖学特征数据，分析关节软骨结构、成分、性能的梯度分布规律，确定天然软骨分层特征。
4.根据权利要求1所述一种基于气动精准控制活性软骨支架的连续梯度化仿生制造方法，其特征在于：步骤2中，细胞培养液为高糖DMEM培养液，其中添加有9%~11%胎牛血清、1~3mM谷氨酰胺和90~110μm/ml抗生素，经过多次传代达到需求数量；步骤7中，动态灌流系统平台中的细胞培养液为高糖DMEM培养液，其中添加有9%~11%胎牛血清、1~3mM谷氨酰胺、4~6ng/ml生长因子和90~110μm/ml抗生素。
5.根据权利要求4所述一种基于气动精准控制活性软骨支架的连续梯度化仿生制造方法，其特征在于：步骤2中，使用前用胰酶消化，并加入DMEM细胞培养液得到细胞密度为4.0×107 ~6.0×107 cells/ml的细胞悬浮液。
6.根据权利要求1所述一种基于气动精准控制活性软骨支架的连续梯度化仿生制造方法，其特征在于：步骤2中，根据水凝胶基体材料的理化特性，分别配制3wt%~8wt%的SA、Gel以及SA/HA水凝胶溶液。
7.根据权利要求1所述一种基于气动精准控制活性软骨支架的连续梯度化仿生制造方法，其特征在于：步骤3中，打印基板温度设置为6℃。
8.根据权利要求1所述一种基于气动精准控制活性软骨支架的连续梯度化仿生制造方法，其特征在于：步骤6中，支架在制备的CaCl2溶液中浸泡30min后取出，并用DMEM细胞培养液对支架进行2~3次漂洗，去除多余的交联剂CaCl2，避免过交联现象的发生。
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