CN113171354A - 一种海藻酸钠修饰的盐酸罗哌卡因多囊脂质体微球及其制备方法与应用 - Google Patents

一种海藻酸钠修饰的盐酸罗哌卡因多囊脂质体微球及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种海藻酸钠修饰的盐酸罗哌卡因多囊脂质体微球及其制备方法与应用。该制备方法首先是将纳米碳酸钙凝胶引发剂混匀分散于液体石蜡中，搅拌均匀状况下加入多囊脂质体，再加入海藻酸钠溶液，混匀；接着调节pH至3.0‑5.8，游离的钙离子快速引发凝胶化反应，形成均匀的网状交联结构凝胶包覆的多囊脂质体微球。该多囊脂质体微球的结构清晰，粒径均匀，状态稳定，缓释时间长等特点。相比于现有的制备方法，本发明不仅保障最终多囊脂质体的成囊效果，均匀覆盖在多囊脂质体表面，解决了海藻酸钠联结成片的问题，增强了多囊脂质体的稳定性，从而提升了缓释效果等优势。同时，本发明还可以减少了有机溶剂中氯仿的使用量。

Description

一种海藻酸钠修饰的盐酸罗哌卡因多囊脂质体微球及其制备 方法与应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种海藻酸钠修饰的盐酸罗哌卡因多囊脂质体微球及其制备方法与应用。
背景技术
罗哌卡因(Ropivacaine，RPV)是一种新型的长效酰胺类局麻药，具有心脏和中枢神经系统毒性低，作用时间长，运动神经与感觉神经阻滞分离等优势和特点。在疼痛预防和治疗中，罗哌卡因可用于分娩镇痛，上腹部、下腹部外科手术及全膝关节置换术等术后镇痛。目前临床应用的罗哌卡因制剂均为注射剂，单次硬膜外注射后止痛通常只能持续5h左右，连续给药则需要通过手术内置导管或输液泵等特殊装置,输液泵必须随身携带给患者带来不便，渗透导管置于体内增加局部刺激性并存在感染、神经损伤等并发症，并且容易发生诸如脊椎血肿等并发症。术后疼痛通常可持续48～72h，且在此时间内最难控制。因此，开发罗哌卡因长效缓释镇痛制剂十分必要。
多囊脂质体(Multivescular liposomes，MVL)是采用贮库泡沫技术制备的一种新型脂质体。作为输送药物的新剂型，其特点是能在注射部位或给药腔室中大量并长时间留存，MVL的内部是由众多的含水腔室以非同心圆的形式构成的，各含水腔室之间又以类脂双分子层磷脂膜相隔，因此具有良好的缓释作用和储库效应，可有效减少患者的用药次数，提高其治疗的依从性。
但是现有的方法制备罗哌卡因多囊脂质体稳定性不佳，在储藏运输过程中容易发生团聚、破碎等现象；而且缓释效果也不理想，出现比较严重的突释现象。海藻酸钠是一种天然多糖，其具有的稳定性、溶解性和安全性使其成为一种较好的药物制剂辅料，能够有效提高多囊脂质体的稳定性。但是现阶段关于海藻酸钠-盐酸罗哌卡因多囊脂质体的制备方法所制得的Rpv-MVLs-Alg仍有诸多问题，例如，徐伟等人使用钙离子引发海藻酸钠过度凝胶化，导致联结成片的问题(徐伟，于洋，陈逸鹏，等.两性霉素B脂质体-微球的制备及工艺优化[J].中国抗生素杂志,2018,43(07):893-900.)。再如，戴传云等直接将碳酸钙加入到多囊脂质体与海藻酸钠的混合物中，会出现包覆不均匀的问题，甚至出现颗粒过大，不适合注射给药(戴传云，刘火安，傅亚，等.多囊脂质体-海藻酸钠微球的理化性质及初步稳定性研究[J].中国药房,2008,(28):2203-2205.)。
发明内容
为了克服现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种海藻酸钠修饰的盐酸罗哌卡因多囊脂质体微球及其制备方法与应用。
本发明的首要目的在于提供一种海藻酸钠修饰的盐酸罗哌卡因多囊脂质体微球(Rpv-MVLs-Alg)的制备工艺，大幅度地提高了盐酸罗哌卡因多囊脂质体稳定性，减少破碎、团聚等现象，并且提升其缓释效果，延长作用时间。
本发明的另一目的在于提供海藻酸钠修饰的盐酸罗哌卡因多囊脂质体(Rpv-MVLs-Alg)。
本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。
本发明提供的Rpv-MVLs-Alg微球的制备方法，首先将纳米碳酸钙凝胶引发剂均匀分散于液体石蜡中。接着，将含有盐酸罗哌卡因的第一水相和含有磷脂等各种脂类的油相通过均质形成初乳；再将初乳转移至含有L-赖氨酸的第二水相当中，通过均质形成复乳；除去有机溶剂后得到盐酸罗哌卡因多囊脂质体。最后，再将得到的多囊脂质体与海藻酸钠溶液依次加入预先混匀了纳米碳酸钙的液体石蜡中，加入酸性溶液(例如醋酸溶液)调节pH迅速产生凝胶反应，最后经离心、洗涤得到海藻酸钠-盐酸罗哌卡因多囊脂质体。
本发明提供的海藻酸钠修饰的盐酸罗哌卡因多囊脂质体微球(标记为Rpv-MVLs-Alg)的制备方法，包括如下步骤：
(1)将第一水相通过注射器或者恒流泵注入油相中，混合均匀，均质处理，得到初乳；
(2)将步骤(1)所述初乳加入第二水相中，均质处理，得到复乳；
(3)将步骤(2)所述复乳用氮气吹扫，除去复乳中的有机溶剂，离心取沉淀，得到盐酸罗哌卡因多囊脂质体；将所述盐酸罗哌卡因多囊脂质体加入生理盐水中，分散均匀，得到分散液；
(4)将乳化剂加入液体石蜡中，混合均匀，然后加入纳米碳酸钙，混合均匀，得到混合液1；将步骤(3)所述分散液、海藻酸钠溶液依次流加至所述混合液1中，进行第一次搅拌处理，得到混合液3，调节所述混合液3的pH为酸性，进行第二次搅拌处理(进行凝胶化反应)，离心取沉淀，得到所述海藻酸钠修饰的盐酸罗哌卡因多囊脂质体微球。
进一步地，步骤(1)所述第一水相的制备，包括：将添加剂加入水中，混合均匀，得到所述第一水相；所述添加剂为盐酸罗哌卡因、葡萄糖、蔗糖、氯化钠等中的一种以上；在第一水相中，盐酸罗哌卡因的浓度为2.5-50mg/mL，添加剂的总浓度为2.5-5％wt。
进一步地，步骤(1)所述油相的制备，包括：将溶质加入有机溶剂中，混合均匀，得到所述油相；所述溶质为蛋黄卵磷脂、胆固醇、三油酸甘油酯、三辛酸甘油酯、二棕榈酰磷脂酰胆碱中的一种以上；所述有机溶剂为氯仿、二氯甲烷中的一种以上；在所述油相中，溶质的浓度为蛋黄卵磷脂8-32mg/mL、胆固醇4-16mg/mL、三油酸甘油酯2-8mg/mL、二棕榈酰磷脂酰胆碱1.3-5mg/mL。
优选地，步骤(1)所述有机溶剂为氯仿与二氯甲烷的混合液；所述二氯甲烷与氯仿的体积比为9：1-0.5：1。
进一步优选地，步骤(1)所述有机溶剂为氯仿与二氯甲烷的混合液；所述二氯甲烷与氯仿的体积比为4：1-2：1。
更进一步优选地，步骤(1)所述有机溶剂为氯仿与二氯甲烷的混合液；所述二氯甲烷与氯仿的体积比为3：1。
进一步地，步骤(1)所述第一水相注入油相中的速率为0.01-3ml/s。
优选地，步骤(1)所述第一水相注入油相中的速率为0.1-0.3ml/s。
进一步地，步骤(1)所述第一水相与油相的体积比为0.25：1-2.5：1。
进一步地，步骤(1)所述均质处理的转速为5000-15000rpm，均质处理的时间为4-18min。
优选地，步骤(1)所述均质处理是在冰水浴中进行的。
优选地，步骤(1)所述均质处理的转速为7000-12000rpm。
进一步优选地，步骤(1)所述均质处理的转速为8000-10000rpm。
优选地，步骤(1)所述均质处理的时间为4-18min。
进一步优选地，步骤(1)所述均质处理的时间为8-12min。
进一步地，步骤(2)所述第二水相的制备，包括：将L-赖氨酸、葡萄糖等加入水中，混合均匀，得到所述第二水相；在所述第二水相中，L-赖氨酸的浓度为10-100mmol/L，葡萄糖的浓度为0.5-7％wt。
进一步地，步骤(2)所述第二水相与初乳的体积比为1.5：1-10：1；
优选地，步骤(2)所述第二水相与初乳的体积比为4：1-6：1。
优选地，在所述第二水相中，L-赖氨酸的浓度为30-50mmol/L。
进一步地，步骤(2)所述均质处理的转速为1000-10000rpm。
优选地，步骤(2)所述均质处理的转速为3000-5000rpm。
进一步地，步骤(2)所述均质处理的时间为10-100s。
优选地，步骤(2)所述均质处理的时间为30-60s。
进一步地，步骤(3)在氮气吹扫的过程中，复乳的温度为15-50℃；氮气的流速为5-30L/min，氮气吹扫时间为8-20min；
优选地，步骤(3)在氮气吹扫的过程中，复乳的温度为28-33℃，氮气的流速为12-16L/min，氮气吹扫时间为12-14min。
进一步地，在步骤(3)所述分散液中，盐酸罗哌卡因多囊脂质体的浓度为浓度为5-15mg/mL。
进一步地，步骤(4)所述乳化剂为司盘-80、PEG 2000、PEG 4000等中的一种以上；
优选地，步骤(4)所述乳化剂为司盘-80。
进一步地，步骤(4)所述乳化剂与液体石蜡的质量体积比为0.5-10：1mg/mL；进一步地，步骤(4)所述纳米碳酸钙的粒径为5-500nm；
优选地，步骤(4)所述纳米碳酸钙的粒径为50-500nm。
进一步优选地，步骤(4)所述纳米碳酸钙的粒径为80-120nm。
进一步地，步骤(4)所述纳米碳酸钙与液体石蜡的质量体积比为0.25-3：1mg/mL；
进一步地，步骤(4)所述海藻酸钠溶液的质量百分比浓度为1.5-3％；
进一步地，步骤(4)所述分散液与海藻酸钠溶液的体积比为为0.5：1-2.5：1；
进一步地，步骤(4)所述所述分散液和海藻酸钠溶液流加至所述混合液1的速率均为0.05-0.3mL/s；
进一步地，步骤(4)所述分散液和海藻酸钠溶液两者的总体积与混合液1体积之比1：10-6：10。
进一步地，步骤(4)所述第一次搅拌处理的转速为100-200rpm，第一次搅拌处理的时间为5-15min；
进一步地，步骤(4)中，调节混合液3的pH为3.0-5.8；
优选地，步骤(4)中，可以往混合液3中加入酸性溶液调节其pH；所述酸性溶液为醋酸(浓度为10-100wt％)、乳酸、磷酸中的一种；
进一步优选地，步骤(4)中，往混合液3中加入醋酸溶液调节其pH；所述醋酸溶液的质量百分比浓度为20-40％。
优选地，步骤(4)中，调节混合液3的pH为4.0-5.6。
进一步地，步骤(4)所述第二次搅拌处理的转速为300-500rpm，第二次搅拌处理的时间为10-20min。
优选地，在本发明提供的制备方法中，各物质混合均匀的方式可以是磁力搅拌均匀。搅拌的转速为250-500rpm。
本发明提供一种由上述的制备方法制得的海藻酸钠修饰的盐酸罗哌卡因多囊脂质体微球。
本发明提供的海藻酸钠修饰的盐酸罗哌卡因多囊脂质体微球在输送药物中的应用。
本发明提供的制备方法，先将纳米碳酸钙凝胶引发剂均匀分散于液体石蜡中，再在搅拌状况下依次加入多囊脂质体、海藻酸钠溶液，混匀；接着调节pH至5左右，游离出来的钙离子快速引发凝胶化反应包覆多囊脂质体微球。该方法制备的微球表面可以形成均匀的网状交联的凝胶结构，获得多囊结构清晰，粒径均匀，状态稳定，缓释时间长的盐酸罗哌卡因多囊脂质体微球制剂。
本发明提供的制备方法，所加入的物料是有先后顺序的要求，即预先将纳米碳酸钙于液体石蜡中，再加入依次加入多囊脂质体、海藻酸钠溶液。
发明人发现，操作步骤对实验结果影响显著。如果先将纳米碳酸钙加入盐酸罗哌卡因多囊脂质体与海藻酸钠溶液的混合液后，再加入到液体石蜡中，由于水的张力较大，纳米碳酸钙漂浮在溶液的表面，很难均匀地分散在体系中，而且有的颗粒会聚集，导致后续凝胶化反应不完全、不均匀。而本发明将纳米碳酸钙先分散于液体石蜡中，能够使纳米碳酸钙均匀悬浮在液体石蜡中，后续凝胶化反应修饰脂质体时更加均匀。
发明人还发现，如果将多囊脂质体与海藻酸钠溶液混合后再加入到液体石蜡中，会导致多囊脂质体表面覆盖很厚的海藻酸钠凝胶，且联结成片；而本发明将多囊脂质体先分散到含有纳米碳酸钙的液体石蜡中，再逐步加入海藻酸钠溶液，最终就能够使海藻酸钠凝胶均匀适量地包覆在多囊脂质体的表面。
进一步地，在本发明制备多囊脂质体的一些实施方案中，将含有盐酸罗哌卡因的第一水相和含有磷脂等各种脂类的油相通过均质形成初乳，其油相中的脂类包括：14.8-17mg/mL蛋黄卵磷脂(PC)、7.6-8.3mg/mL胆固醇(CH)、2-3mg/mL二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、3.5-4.5mg/mL三油酸甘油三脂(TO)。
进一步地，在本发明中的一些实施方案中，所述油相溶剂为氯仿、二氯甲烷、以及二氯甲烷-氯仿的混合溶液，优选二氯甲烷-氯仿9：1-0.5：1，更优选4：1-2：1。
发明人发现，若是采用常用的纯氯仿或含氯仿较多的溶剂作为有机溶剂，难以除尽，且由于其对人体毒性较大，有机溶剂除去时残余量级须非常的低，增加了除气成本；若是采用纯二氯甲烷作为有机溶剂，上述的各种脂类不能够完全的溶解。当采用二氯甲烷-氯仿(4：1-2：1)时，不仅可以降低了氯仿使用量，也能够使各种脂类完全地溶解。
进一步地，在本发明中的一些实施方案中，第一水相含有36-39mg/mL盐酸罗哌卡因、28-33mg/mL葡萄糖。
上述第一水相和油相混合方法是将第一水相缓慢滴入油相中并充分震荡。混速过快会影响初乳(油包水)的形成效果，最终导致多囊脂质体成囊效果不好。
进一步地，第一水相和油相混合后还包括初乳的形成步骤，即将上述混合好的油水混合液在冰水浴条件下(0-5℃)进行高速均质，转速优选为5000-15000，更优选为7000-12000rpm；时间优选为4-18min，更优选为8-12min。冰水浴可以有效降低高速均质产生的热量，降低均质温度，减少油相中有机溶剂的挥发。
本发明中还包括复乳的形成步骤；即将上述初乳加入第二水相中，然后用均质仪进行分散。第二水相和初乳的体积比优选为1.5：1-10：1，更优选为4：1-6：1。发明人发现，当第二水相和初乳按照体积比1：1混合时，初乳中的小囊泡很难在第二水相中分散开，而且团聚现象明显。增加第二水相的体积，使初乳中的囊泡在复乳制备过程中分散更好，而且所得多囊脂质体形貌更好。
第二水相含有L-赖氨酸的葡萄糖水溶液。其中L-赖氨酸浓度为优选为10-100mmol/L，更优选为30-50mmol/L。发明人发现，L-赖氨酸浓度过低会导致多囊脂质体在复乳形成过程中发生团聚现象；L-赖氨酸浓度过高会导致最终形成的多囊脂质体发生大面积破碎的情况。而葡萄糖则是用于调节内外水相渗透压平衡，过高和过低都会导致囊泡破裂，使得药物流出并在第二水相析出。
将初乳和第二水相进行均质得到复乳，转速优选为1000-10000rpm，更优选为3000-5000rpm；时间优选为10-100s，更优选为30-60s。
本发明还包括除去有机溶剂，即将上述复乳在预设温度的水浴中用氮气在液面吹扫，预设温度优选为15-50℃，更优选为28-33℃；氮气吹扫流速优选为5-30L/min，更优选为12-16L/min；吹扫时间优选为8-20min，更优选为12-14min。
发明人发现，预设温度过低会导致有机溶剂除不干净，不仅会导致最终制剂在储存过程中物理稳定性降低，而且制剂中残留的有机溶剂对人体有害；预设温度过高会导致在氮气吹扫时，囊泡直接破碎甚至破裂，影响最终的成囊效果。
如上述的方法制备的一种Rpv-MVLs-Alg微球，该制剂稳定性和缓释效果都非常良好。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
(1)现有技术制备的多囊脂质体稳定差，碎片多等弊端；使用高浓度Ca离子溶液引发海藻酸钠凝胶化所修饰的盐酸罗哌卡因多囊脂质体，存在联结成片、粒度不均等问题；直接将碳酸钙加入到多囊脂质体与海藻酸钠的混合物中，会出现包覆不均的问题；相比现有的罗哌卡因多囊脂质体制备工艺，本发明提供的海藻酸钠修饰的盐酸罗哌卡因多囊脂质体微球的制备方法，其优势在于先将纳米碳酸钙在液体石蜡中分散均匀，再在后续加入酸性溶液调节体系pH以生成Ca2+引发凝胶化反应，使得海藻酸钠能够均匀覆盖在多囊脂质体的表面，从而提升制剂的稳定性和缓释效果，减少其在储藏、运输过程中药物的泄漏并且保持其多囊的结构；
(2)本发明提供的制备方法，采用二氯甲烷、氯仿作为有机溶剂，降低除去氮气的时间和成本，同时保障多囊脂质体的成囊效果和形貌；此外，由于在多囊脂质体外层修饰了一层海藻酸钠，在药物释放过程中可以减缓多囊结构的破碎，更进一步地提升了其缓释效果。
附图说明
图1为实施例1中Rpv-MVLs的形貌观察图(200×)。
图2为实施例1中Rpv-MVLs-Alg的形貌观察图(200×)。
图3为实施例1中Rpv-MVLs和Rpv-MVLs-Alg微球在体外释放的曲线。
图4为对比例1中Rpv-MVLs-Alg(CaCl2)微球的形貌观察图(200×)。
图5为对比例2中Rpv-MVLs的形貌观察图(200×)。
图6为实施例2中Rpv-MVLs的形貌观察图(200×)。
图7为对比例3中Rpv-MVLs的形貌观察图(200×)。
图8为对比例4中Rpv-MVLs的形貌观察图(200×)。
图9为对比例5中Rpv-MVLs的形貌观察图(200×)。
图10为对比例6中Rpv-MVLs的形貌观察图(200×)。
图11为对比例7中Rpv-MVLs的形貌观察图(200×)。
图12为对比例8中Rpv-MVLs的形貌观察图(200×)。
图13为实施例3中Rpv-MVLs的形貌观察图(200×)。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
实施例1
Rpv-MVLs-Alg微球的制备方法如下：
步骤1：形成油包水初乳(W/O)
将4ml第一水相用5ml注射器注入4ml油相中，第一水相注入油相中的速率为0.2mL/s，并且持续震荡，加入完毕后置于冰水浴中，以10000转每分钟高速均质9min，形成油包水初乳。其中，第一水相的溶剂为水；溶质组成如下：37.5mg/ml盐酸罗哌卡因、31mg/ml葡萄糖。油相的有机溶剂为二氯甲烷-氯仿(3：1)；溶质组成如下：16mg/ml蛋黄卵磷脂(PC)、8mg/ml胆固醇(TH)、2.5mg/mL、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、4mg/mL三油酸甘油酯(TO)。
步骤2：形成水包油包水(W/O/W)复乳
将步骤1得到的初乳加入25mL的第二水相中，以4000转每分钟均质45s形成水包油包水复乳。其中，第二水相的溶剂为水，溶质组成为52.6mg/ml葡萄糖、40mmol/L L-赖氨酸。
步骤3：得到Rpv-MVLs
3.1除去有机溶剂
将步骤2所得复乳置于30℃的恒温水浴当中，以13L/min流速的氮气吹扫14min，除去溶液中的二氯甲烷和氯仿，得到盐酸罗哌卡因多囊脂质体。
3.2离心浓缩(根据所需药物浓度选择)
将步骤3.1得到的盐酸罗哌卡因多囊脂质体在3000转每分钟条件下离心4min，将下层多囊脂质体沉淀用0.9wt％生理盐水重新溶解分散均匀得到分散液(标记为Rpv-MVLs)；所述多囊脂质体沉淀与生理盐水的质量体积比为50：1mg/mL。
步骤4：形成Rpv-MVLs-Alg微球
4.1分散纳米碳酸钙颗粒
将10mL步骤3得到的Rpv-MVLs及10mL浓度为2.5wt％海藻酸钠溶液依次以0.2mL/s的流速加入含有50mg纳米碳酸钙和1g司班80的50mL液体石蜡中，以300rpm的转速磁力搅拌15min，得到混合液2。
4.2凝胶化反应
往4.1反应体系(所述混合液2)中滴加30wt％醋酸溶液，直至体系的PH降为5.0，持续磁力搅拌反应10分钟(搅拌转速为350rpm)。然后离心收集沉淀，并用生理盐水洗涤，得到所述海藻酸钠修饰的盐酸罗哌卡因多囊脂质体微球(标记为Rpv-MVLs-Alg)。
按照实施例1的制备方法所得的Rpv-MVLs和Rpv-MVLs-Alg在4℃避光条件下储存一个月的性能表征见表1，没有海藻酸钠修饰的盐酸罗哌卡因多囊脂质体(Rpv-MVLs)在一个月的储存时间内，平均粒径变化明显，泄漏率也非常高(大于20％)；而海藻酸钠修饰的盐酸罗哌卡因多囊脂质体(Rpv-MVLs-Alg)微球粒径范围适中，且未发生明显变化，泄漏率也相对较小，稳定性更好。
表1实施例1中微球样品表征
Figure BDA0003018561000000111
Figure BDA0003018561000000121
所得脂质体微球形貌结果如图1、图2所示，可见Rpv-MVLs-Alg微球边缘更加完整光滑，也更加厚实，粒径更大。两者的体外释放曲线如图3所示，从图3可以看出，Rpv-MVLs-Alg微球相比Rpv-MVLs具有更好的缓释效果，而且缓解了后者较为明显的突释现象。
对比例1
本对比例提供脂质体微球(标记为Rpv-MVLs-Alg(CaCl2)微球)的制备方法与实施例1基本相同，其操作步骤与实施例1不同之处在于：本对比例中先制得Rpv-MVLs后，与海藻酸钠溶液混合均匀后，直接加入CaCl2溶液(30％wt)，所述CaCl2溶液与Rpv-MVLs的体积比为1：3，引发凝胶化反应，得到Rpv-MVLs-Alg(CaCl2)微球。
本对比例制备的Rpv-MVLs-Alg(CaCl2)微球形貌见4。将图4与图2进行对比可以看出，对比例1的制备方法得到的Rpv-MVLs-Alg(CaCl2)微球粒径偏小，而且大都存在于联结成片的海藻酸钠凝胶中。
对比例2
本对比例提供的Rpv-MVLs-Alg微球制备方法与实施例1不同的地方在于，本对比例是直接先将纳米碳酸钙加入到所述混合液1中，再加入液体石蜡中混匀，所制备出的Rpv-MVLs-Alg微球与实施例1、对比例1对比，结果如表2，结果显示，对比例2的结果与对比例1类似，平均粒径、zeta电位数值以及包封率都偏低。
表2实施例1、2、3中微球样品微观数据
Figure BDA0003018561000000131
形貌见图5，结果显示，本对比例制备的Rpv-MVLs-Alg微球边界模糊，微球周围不规整的凝胶较多，并没有均匀地修饰在多囊脂质体表面。
实施例2
本实施例提供的Rpv-MVLs-Alg微球制备方法与实施例1不同的是，本实施例在步骤4.2的凝胶化反应过程中，是将体系的pH调整为6.0，所制备出的Rpv-MVLs-Alg微球的形貌如图6所示，可见本实施例制备的Rpv-MVLs-Alg微球中海藻酸钠凝胶化不完全，导致其不均匀地覆盖在多囊脂质体的周围。
对比例3
本对比例中的Rpv-MVLs制备方法与实施例1不同的是，步骤1的油相所采用的有机溶剂为二氯甲烷-氯仿(体积比10：1)，所制备出的Rpv-MVLs的形貌如图7所示，结果显示本对比例没有制备出成型的多囊脂质体，所得全部是破碎的磷脂。
对比例4
本对比例的Rpv-MVLs制备方法与实施例1不同的是，本实施例第一水相注入油相中的速度为4ml/s，所制备出的Rpv-MVLs的形貌如图8所示，结果显示，本对比例制备的Rpv-MVLs中个别囊泡极大，而且游离的单室囊泡多，粒径不均一。
对比例5
本对比例的Rpv-MVLs制备方法与实施例1不同的是，本对比例制备初乳的均质转速为4000rpm，所制备出的Rpv-MVLs的形貌如图9所示，结果显示本对比例制备的Rpv-MVLs由于制备初乳时转速过低，初乳囊泡过大，最终形成多囊脂质体囊泡破裂严重，完整的多囊极少。
对比例6
本对比例的Rpv-MVLs制备方法与实施例1不同的是，本实施例所采用第二水相中赖氨酸浓度为5mmol/L，所制备出的Rpv-MVLs的形貌如图10所示，结果显示，本对比例制备的Rpv-MVLs中囊泡非常少，且不规则，有团聚现象。
对比例7
本对比例的Rpv-MVLs制备方法与实施例不同的是，本对比例所采用第二水相与初乳的体积比为1：1，所制备出的Rpv-MVLs的形貌如图11所示，结果显示本对比例制备的Rpv-MVLs由于第二水相过少，多囊脂质体微球分散不充分，粒径小，破碎化严重。
对比例8
本对比例的Rpv-MVLs制备方法与实施例1不同的是，本对比例所采用复乳制备时均质时间为120s，所制备出的Rpv-MVLs的形貌如图12所示，结果显示本实施例制备的Rpv-MVLs没有明显的边缘，大多数都破裂了，产生了许多小囊泡的聚集体和游离的小囊泡。
实施例3
本实施例的Rpv-MVLs制备方法与实施例1不同的是，本实施例所采用氮气吹扫的温度为45℃，所制备出的Rpv-MVLs的形貌如图13所示，结果显示本实施例制备的Rpv-MVLs体粒径较小，虽有完整的边缘，但是碎片多，且形状不规则。
综上所述，本发明实施例提供的Rpv-MVLs-Alg微球的制备方法通过将纳米碳酸钙与液体石蜡混合均匀后再依次加入多囊脂质体与海藻酸钠，来提升凝胶化反应的均匀程度，使得海藻酸钠凝胶化反应后能够均匀包覆在多囊脂质体表面，并且提高了普通盐酸罗哌卡因多囊脂质体的缓释效果和稳定性。还通过改变有机溶剂的组成比例，在保证多囊脂质体形貌结果的同时，减少氯仿的使用，降低了除氮气的时间和成本。最终制备出的Rpv-MVLs-Alg微球，粒径较大且相对均一，形貌规则完整，体外释放缓释效果较好。
以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种海藻酸钠修饰的盐酸罗哌卡因多囊脂质体微球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将第一水相注入油相中，混合均匀，均质处理，得到初乳；
(2)将步骤(1)所述初乳加入第二水相中，均质处理，得到复乳；
(3)将步骤(2)所述复乳用氮气吹扫，除去复乳中的有机溶剂，离心取沉淀，得到盐酸罗哌卡因多囊脂质体；将所述盐酸罗哌卡因多囊脂质体加入生理盐水中，分散均匀，得到分散液；
(4)将乳化剂加入液体石蜡中，混合均匀，然后加入纳米碳酸钙，混合均匀，得到混合液1；将步骤(3)所述分散液、海藻酸钠溶液依次流加至所述混合液1中，进行第一次搅拌处理，得到混合液3，调节所述混合液3的pH为酸性，进行第二次搅拌处理，离心取沉淀，得到所述海藻酸钠修饰的盐酸罗哌卡因多囊脂质体微球。
2.根据权利要求1所述的海藻酸钠修饰的盐酸罗哌卡因多囊脂质体微球的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述第一水相的制备，包括：将盐酸罗哌卡因和添加剂加入水中，混合均匀，得到所述第一水相；所述添加剂为葡萄糖、蔗糖、氯化钠中的一种以上；在第一水相中，盐酸罗哌卡因的浓度为2.5-50mg/mL，添加剂的浓度为2.5-5％wt。
3.根据权利要求1所述的海藻酸钠修饰的盐酸罗哌卡因多囊脂质体微球的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述油相的制备，包括：将溶质加入有机溶剂中，混合均匀，得到所述油相；所述溶质包括蛋黄卵磷脂、胆固醇、三油酸甘油酯或三辛酸甘油酯、二棕榈酰磷脂酰胆碱中的一种以上；所述有机溶剂为氯仿与二氯甲烷的混合液，所述二氯甲烷与氯仿的体积比为9：1-0.5：1；在所述油相中，蛋黄卵磷脂的浓度为8-32mg/mL，胆固醇的浓度为4-16mg/mL，三油酸甘油酯或三辛酸甘油酯的浓度为2-8mg/mL，二棕榈酰磷脂酰胆碱的浓度为1.3-5mg/mL。
4.根据权利要求1所述的海藻酸钠修饰的盐酸罗哌卡因多囊脂质体微球的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述第一水相注入油相中的速率为0.01-3ml/s，所述第一水相与油相的体积比为0.25：1-2.5：1；所述均质处理的转速为5000-15000rpm，均质处理的时间为4-18min。
5.根据权利要求1所述的海藻酸钠修饰的盐酸罗哌卡因多囊脂质体微球的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述第二水相的制备，包括：将L-赖氨酸、葡萄糖加入水中，混合均匀，得到所述第二水相；在所述第二水相中，L-赖氨酸的浓度为10mmol/L-100mmol/L，葡萄糖的浓度为0.5-7％wt；步骤(2)所述第二水相与初乳的体积比为1.5：1-10：1；所述均质处理的转速为1000-10000rpm，均质处理的时间为10-100s。
6.根据权利要求1所述的海藻酸钠修饰的盐酸罗哌卡因多囊脂质体微球的制备方法，其特征在于，步骤(3)在氮气吹扫的过程中，复乳的温度为15-50℃；氮气的流速为5-30L/min，氮气吹扫时间为8-20min；在步骤(3)所述分散液中，盐酸罗哌卡因多囊脂质体的浓度为5-15mg/mL。
7.根据权利要求1所述的海藻酸钠修饰的盐酸罗哌卡因多囊脂质体微球的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述乳化剂为司盘-80、PEG 2000、PEG 4000中的一种以上；所述乳化剂与液体石蜡的质量体积比为0.5-10：1mg/mL；所述纳米碳酸钙的粒径为5-500nm，所述纳米碳酸钙与液体石蜡的质量体积比为0.25-3：1mg/mL；步骤(4)所述海藻酸钠溶液的浓度为1.5-3％wt；所述分散液与海藻酸钠溶液的体积比为0.5：1-2.5：1；所述分散液和海藻酸钠溶液流加至所述混合液1的速率均为0.05-0.3mL/s，所述分散液和海藻酸钠溶液两者的总体积与混合液1体积之比为1：10-6：10。
8.根据权利要求1所述的海藻酸钠修饰的盐酸罗哌卡因多囊脂质体微球的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述第一次搅拌处理的转速为100-300rpm，第一次搅拌处理的时间为5-15min；步骤(4)中，调节混合液3的pH为3.0-5.8；所述第二次搅拌处理的转速为300-500rpm，第二次搅拌处理的时间为10-20min。
9.一种由权利要求1-8任一项所述的制备方法制得的海藻酸钠修饰的盐酸罗哌卡因多囊脂质体微球。
10.权利要求9所述的海藻酸钠修饰的盐酸罗哌卡因多囊脂质体微球在输送药物中的应用。
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