CN113164607A - Rig-i激动剂及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了RIG‑I激动剂。在某些实施方式中，本发明的激动剂可用于在细胞中诱导I型干扰素应答。

Description

RIG-I激动剂及其使用方法
相关申请的交叉引用
根据35 U.S.C.§119(e)，本申请要求2018年10月9日提交的美国临时申请号62/743,387的优先权，其公开内容通过引用以其整体并入本文。
背景技术
视黄酸诱导基因1(RIG-I)、黑素瘤分化相关基因5(MDA5)和遗传与生理学实验室2(LGP2)包括细胞内模式识别受体(PRR)的RIG-I样受体(RLR)类。受体通过识别细胞质中的外源RNA并通过产生促炎性细胞因子和I型干扰素来引发先天性免疫应答来抵御细菌和病毒感染。
RIG-I识别自身和非自身的RNA，包括正链和负链RNA病毒，由RNA聚合酶III从DNA病毒比如埃-巴二氏病毒或富含AT的双链DNA模板产生的RNA片段，抗病毒内切核糖核酸酶RNA酶L的RNA裂解产物，合成的聚I：C，以及甚至是缺少5'-三磷酸酯的RNA适体。RIG-I独特的病原体相关分子模式(PAMP)被定义为包含5'-三磷酸酯部分的双链体RNA，尽管RIG-I识别绝对只需要双链体RNA。
在本领域中仍然需要新型的RIG-I激动剂。在某些实施方式中，这类化合物可用于在细胞中诱导I型干扰素应答。在其他实施方式中，此类化合物可用于治疗疾病或障碍，比如但不限于细菌、病毒或寄生虫感染、癌症、自身免疫疾病、炎性障碍和/或呼吸障碍。本发明满足了本领域的这种需求。
发明内容
本发明提供了能够诱导干扰素应答的聚核糖核酸(RNA)分子。在某些实施方式中，RNA分子是单链的并且包括第一核苷酸序列，该第一核酸序列的5’-端与接头的一端缀合。在某些实施方式中，接头的另一端与第二核苷酸序列的3’-端缀合。在某些实施方式中，接头不含核苷、核苷酸、脱氧核苷或脱氧核苷酸或其任何替代或修饰。在某些实施方式中，第一核苷酸序列与第二核苷酸序列基本上互补。在某些实施方式中，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列可以杂交以形成双链区段。在某些实施方式中，双链区段中的碱基对的数目为范围从8至20的整数。在某些实施方式中，RNA分子形成发夹结构。
本发明进一步提供了能够诱导干扰素应答的聚核糖核酸(RNA)分子。在某些实施方式中，RNA分子是单链的并且包括第一核苷酸序列，该第一核酸序列的5’-端与选自环和接头的元件的一端缀合。在某些实施方式中，元件的另一端与第二核苷酸序列的3’-端缀合。在某些实施方式中，第一核苷酸序列与第二核苷酸序列基本上互补。在某些实施方式中，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列可以杂交以形成双链区段。在某些实施方式中，双链区段中的碱基对的数目为范围从8至20的整数。在某些实施方式中，RNA分子形成具有3’-突出端的发夹结构。
本发明进一步提供了药物组合物，其包括至少一种本发明中考虑的分子。
本发明进一步提供了在细胞中诱导I型干扰素应答的方法。在某些实施方式中，该方法包括使细胞与至少一种本发明中考虑的分子接触。
本发明进一步提供了一种通过在受试者的细胞中诱导I型干扰素应答在需要其的受试者中治疗疾病或障碍的方法。在某些实施方式中，该方法包括使细胞与至少一种本发明中考虑的分子接触。
附图说明
当结合附图阅读时，将更好地理解本发明的示例性实施方式的以下详细描述。为了说明本发明，在附图中显示了非限制性实施方式。然而，应当理解，本发明不限于附图中所示实施方式的精确布置和工具。
图1包括图解人细胞系(显示为293T)中荧光素酶报道系统中的干扰素诱导的条形图。
图2包括图解某些合成的SLR在整个动物中诱导大规模IFN应答并伴随诱导RIG-1特异性细胞因子的图。X-轴代表用图例中所示的不同RNA激动剂治疗的不同组的小鼠。
图3是图解与本发明选择的SLR接触的HEK-293T细胞中的干扰素应答的图。
图4A-4B是图解底链上的3’-突出端对RIG-1的结合和信号传导的影响的一组曲线图。图4A：FL RIG-I与底链上的5’-ppp/OH钝性末端和3’-突出端的RNA的电泳迁移率分析(EMSA)的拟合曲线。图4B：使用SLR-10及其在底链上带有3’突出端的变体的IFN-β诱导分析。在两幅图中显示的RNA序列中，N＝0、1、2、3或5。
图5A-5D是图解顶链上的5’-突出端对RIG-I的结合和信号传导的影响的一组图和方案。图5A：用于EMSA分析的具有5’突出端的RNA双链体的插图。N＝0、1、2、3和5。图5B：FLRIG-I与顶链上的5’-ppp钝性末端和5’-突出端的RNA的EMSA分析的拟合曲线。图5C：RIG-I-ΔCARD与顶链上的5’-ppp钝性末端和5’-突出端的RNA的EMSA分析的拟合曲线。图5D：使用SLR-10和其在顶链上具有5’-突出端的变体的IFN-β诱导分析。OH-SLR-10是没有5’-ppp基团的发夹RNA。
具体实施方式
本发明提供了用于在细胞中诱导I型干扰素应答的组合物和方法。在一方面中，本发明提供了某些RIG-1激动剂，比如但不限于茎环RNA(SLR)。在某些实施方式中，此类化合物可用于治疗疾病或障碍，比如但不限于细菌、病毒或寄生虫感染、癌症、自身免疫疾病、炎性障碍和/或呼吸障碍。
在某些实施方式中，本发明的RIG-I激动剂选择性地激活RIG-I先天免疫传感器。在其他实施方式中，本发明的RIG-I激动剂为茎环RNA。国际专利申请公开号WO/2014/159990和美国专利申请公开号US 2016/0046942中的公开内容通过引用以它们的整体并入本文。
本文所述的组合物和方法可以激活任何PRR，包括但不限于，PRR的RIG-I样受体(RLR)类，其包括RIG-I、MDA5和LGP2；NOD-样受体(NLR)、C-型凝集素受体(CLR)和toll-样受体(TLR)。
在某些实施方式中，本发明提供了核酸分子。用于本公开内容的示例性核酸包括核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、肽核酸(PNA)、苏糖核酸(TNA)、二醇核酸(GNA)、锁定核酸(LNA)或其杂合体。如本文描述的，本发明的核酸分子不依赖于特定的核苷酸序列。相反，可以使用任何核苷酸序列，只要该序列具有形成本文所述的核酸分子结构的能力。
在某些实施方式中，本发明的核酸分子包括双链区域。例如，在某些实施方式中，核酸分子为双链的双链体。在其他实施方式中，本发明的核酸分子是单链，其中分子的第一区域与分子的第二区域杂交以形成双链体。在又其他实施方式中，核酸分子的发夹结构改善了双链体的稳定性。
在某些实施方式中，核酸分子包括钝性末端。
在某些实施方式中，核酸分子具有至少一个3’-突出端。在其他实施方式中，3’-突出端包括非碱基配对核苷酸。在又其他实施方式中，3’-突出端包括两个非碱基配对核苷酸。在又其他实施方式中，3’-突出端包括三个非碱基配对核苷酸。在又其他实施方式中，3’-突出端包括四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或多于十个非碱基配对核苷酸。
在某些实施方式中，核酸分子具有至少一个5’-突出端。在其他实施方式中，分子内结构产生5’-突出端。在又其他实施方式中，5’-突出端包括非碱基配对核苷酸。在又其他实施方式中，5’-突出端包括两个非碱基配对核苷酸。在又其他实施方式中，5’-突出端包括三个非碱基配对核苷酸。在又其他实施方式中，5’-突出端包括四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或多于十个非碱基配对核苷酸
在其他实施方式中，核酸分子包括5’-三磷酸酯或5’-二磷酸酯基团。在又其他实施方式中，一个或多个5’-三磷酸酯或5’-二磷酸酯基团的存在改善了核酸分子与RIG-I的结合亲和力。
在某些实施方式中，可以通过主链修饰(例如硫代磷酸酯)和5’-末端修饰和/或3’-末端修饰来增强SLR的核酸酶抗性。在其他实施方式中，SLR可以用示踪剂标记，比如荧光团、同位素等，它们很容易通过固相合成并入到末端环中。
在某些实施方式中，可以使用改善其稳定性和/或靶向性的递送媒介物在体内递送SLR。在其他实施方式中，SLR被瘤内递送。在又其他实施方式中，SLR被全身递送。
本发明的SLR强烈激活RIG-1并刺激细胞中强烈的IFN应答。在非限制性实例中，图1图解了人细胞系(显示的293T)中荧光素酶报道系统的干扰素诱导。
此外，合成的SLR在整个动物中诱导大规模的IFN应答，同时伴随着RIG-1特异性细胞因子的诱导(参见图2)。敲除和敲低实验表明RIG-I特异性。重要地是，SLR不会引起广泛的炎性作用或毒性，这表明低的TNF激活。
体内研究显示SLR14(SEQ ID NO:7)作为单一药剂具有强大的抗肿瘤作用(参见图3)。
Figure BDA0003091904760000041
技术人员将理解，本发明不限于本文讨论的示例性疗法。此外，技术人员将理解一种或多种疗法可单独或以任何组合形式施用。此外，技术人员将理解一种或多种疗法可以与包括化疗的任何其他类型的疗法组合施用。
定义
除非另有定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管与本文描述的那些方法或材料相似或等同的任何方法和材料都可以用于本发明的实践或测试中，但是描述了选择的方法和材料。
如本文所使用的以下每个术语在本节中具有与其相关的含义。
冠词“一(a)”和“一(an)”在本文中用于指代一个或多个(即，至少一个)该冠词的语法对象。举例来说，“元素(an element)”意思是一种元素或多于一种元素。
当提及可测量值比如量、持续时间等时，本文所使用的“约”意指包括与规定值相差±20％或±10％，更优选地±5％，甚至更优选地±1％，和仍更优选地±0.1％的变量，因为这样的变量适合于执行所公开的方法。
如本文所使用的，术语“癌症”定义为特征在于异常细胞的快速且不受控制的生长的疾病。癌细胞可以局部扩散，或通过血流和淋巴系统扩散到身体的其他部位。各种癌症的实例包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。
“互补的(complementary)”是指两个核酸链的区域之间或同一核酸链的两个区域之间的序列互补性的广义概念。已知第一核酸区域的腺嘌呤残基能够与第二核酸区域的残基形成特异性氢键(“碱基配对”)，如果该残基是胸腺嘧啶或尿嘧啶，则该残基与第一区域反平行。类似地，已知第一核酸链的胞嘧啶残基能够与第二核酸链的残基碱基配对，如果该残基是鸟嘌呤，则该残基与第一链反平行。如果当两个区域以反平行方式排列时，第一区域的至少一种核苷酸残基能够与第二区域的残基碱基配对，则核酸的第一区域与相同或不同核酸的第二区域互补。在某些实施方式中，第一区域包括第一部分，和第二区域包括第二部分，由此，当第一和第二部分以反平行方式排列时，第一部分的至少约50％，和优选至少约75％，至少约90％或至少约95％的核苷酸残基能够与第二部分的核苷酸残基碱基配对。在某些实施方式中，第一部分的所有核苷酸残基能够与第二部分中的核苷酸残基碱基配对。
“编码(encoding)”是指多核苷酸中的特定核苷酸序列比如基因、cDNA或mRNA用作合成具有确定的核苷酸序列(即，rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列的生物过程中的其他聚合物和大分子的模板的的固有特性，以及由此产生的生物学特性。因此，如果对应于该基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生该蛋白质，则该基因编码蛋白质。编码链和非编码链二者都可以称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其他产物，编码链的核苷酸序列与mRNA序列相同且通常在序列表中提供，非编码链用作基因或cDNA的转录模板。除非另有说明，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此为简并形式并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可以包括内含子。
如本文所使用的，当应用于核酸时，术语“片段(fragment)”是指较大核酸的子序列。核酸的“片段”的长度可以为至少约5个核苷酸；例如，至少约10个核苷酸至约100个核苷酸；至少约100个至约500个核苷酸，至少约500个至约1000个核苷酸，至少约1000个核苷酸至约1500个核苷酸；或约1500个核苷酸至约2500个核苷酸；或约2500个核苷酸(及其之间的任何整数值)。
如本文所使用的“同源的(homologous)、同源性(homology)”或“相同的(identical)、同一性(identity)”是指氨基酸和核酸序列之间的比较。当提及核酸分子时，“同源性”、“同一性”或“同一性百分比”是指已经通过序列分析程序与相同核苷酸匹配的主题核酸序列的核苷酸的百分比。同源性可以通过已知方法容易地计算。可以使用计算机程序比较核酸序列和氨基酸序列，该计算机程序比对核酸或氨基酸的相似序列，并且因此确定差异。在优选的方法中，采用了BLAST程序(NCBI)和其中使用的参数，并且使用ExPaSy来比对基因组DNA序列的序列片段。然而，可以通过使用任何标准的比对软件来获得等效的比对评估。
如本文所使用的“同源的”是指两个聚合物分子之间，例如两个核酸分子，例如两个DNA分子或两个RNA分子之间，或两个多肽分子之间的亚基序列相似性。当两个分子中的亚基位置都被同一个亚基占据时，例如，如果两个DNA分子中的每个分子中的位置都被腺嘌呤占据，那么它们在那个位置上是同源的。两个序列之间的同源性是匹配或同源位置数目的直接函数，例如，如果两个化合物序列中一半的位置(例如，长度为十个亚基的聚合物中的五个位置)是同源的，则两个序列为50同源的，如果90％的位置，例如10个中的9个是匹配的或同源的，则两个序列具有90％的同源性。举例来说，DNA序列5’-ΑTTG-3’和5’-AATC-3’具有50％的同源性。
“杂交探针”是能够以碱基特异性的方式与核酸的互补链结合的寡核苷酸。这种探针包括如Nielsen等人，1991，Science 254：1497-1500中所描述的肽核酸，以及其他核酸类似物和核酸模拟物(参见美国专利号6,156,501)。
术语“杂交”是指两个单链核酸非共价结合形成双链核酸的过程；三链杂交在理论上也是可能的。核酸中的互补序列彼此配对以形成双螺旋。所得的双链核酸是“杂合体”。杂交可以在例如两个互补或部分互补的序列之间。杂交可以具有双链区和单链区。杂合体可以是例如DNA：DNA，RNA：DNA或DNA：RNA。杂合体也可以在修饰的核酸之间形成。可以将一种或两种核酸固定在固体载体上。杂交技术可用于检测和分离特定序列，测量同源性或定义一条或两条链的其他特征。
杂合体的稳定性取决于多种因素，包括互补性的长度，互补区域内错配的存在，反应中盐的温度和浓度。杂交通常在严格的条件下进行，例如，盐浓度不超过1M，和温度至少为25℃。例如，5X SSPE(750mMNaCl，50mM磷酸钠，5mM EDTA，pH 7.4)或100mM MES，1M NaCl，20mM EDTA，0.01％Tween-20和温度25-50℃的条件适合于等位基因特异性探针杂交。在特别优选的实施方式中，杂交在40-50℃下进行。乙酰化的BSA和鲱鱼精子DNA可以添加到杂交反应中。适用于微阵列的杂交条件描述于可获得自Affymetrix(Santa Clara，CA)的基因表达技术手册(Gene Expression Technical Manual)和基因芯片作图分析手册(GeneChipMapping Assay Manual)。
如果两个寡核苷酸仅在寡核苷酸彼此互补退火至少约75％，优选至少约90％或至少约95％的条件下退火，则第一寡核苷酸与第二寡核苷酸以“高严格性”退火。用于使两个寡核苷酸退火的条件的严格性是温度、退火介质的离子强度、温育时间段、寡核苷酸的长度、寡核苷酸的GC含量以及预期的两个寡核苷酸之间的非同源性程度等因素的函数，如果这些因素已知的话。调节退火条件的严格性的方法是已知的(参见例如Sambrook等人，2012,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.)。
如本文所使用的，“说明材料”包括可用于传达试剂盒中的本发明的化合物、组合物、载体、或递送系统用于实现本文阐述的各种疾病或障碍的缓解的有用性的出版物、录音、图表或任何其他表达介质。任选地或替代地，说明材料可以描述一种或多种减轻哺乳动物的细胞或组织中的疾病或障碍的方法。例如，本发明的试剂盒的说明材料可以粘附(affix)在装有本发明的鉴别的化合物、组合物、载体或递送系统的容器上，或者与包含本发明的化合物、组合物、载体或递送系统的容器一起运输。可替代地，说明材料可以与容器分开运输，以使说明材料和化合物由接受者协同使用。
如本文所使用的“分离物(isolate)”是指从个体获得或从来自个体的样品获得的核酸。可以在获得核酸后的任何时间(例如，实验室培养之前或之后，扩增之前或之后)分析核酸。
如本文所使用的，术语“标记”是指发光标记、光散射标记或放射性标记。荧光标记包括但不限于商购的荧光素亚磷酰胺，比如Fluoreprime(Pharmacia)、Fluoredite(Millipore)和FAM(ABI)。参见美国专利号6,287,778。
术语“错配(mismatch)”、“错配对照(mismatch control)”或“错配探针(mismatchprobe)”是指其序列与特定靶序列不完全互补的核酸。错配可以包括一个或多个碱基。如本文所使用的，术语“核酸”既指天然存在的分子，比如DNA和RNA，也指各种衍生物和类似物。通常，本教导的探针、发夹接头和靶多核苷酸是核酸，并且通常包含DNA。如本领域普通技术人员将理解的，可以采用其他衍生物和类似物。
如本文所使用的，术语“核苷酸碱基(nucleotide base)”是指一个或多个取代或未取代的芳族环。在某些实施方式中，一个或多个芳族环包含至少一个氮原子。在某些实施方式中，核苷酸碱基能够与适当互补的核苷酸碱基形成沃森-克里克(Watson-Crick)和/或Hoogsteen氢键。示例性核苷酸碱基和其类似物包括但不限于天然存在的核苷酸碱基腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、6-甲基-胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶和天然存在的核苷酸碱基的类似物，例如，7-脱氮腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮-8-氮杂鸟嘌呤、7-脱氮-8-氮杂腺嘌呤、N6-δ2-异戊烯基腺嘌呤(6iA)、N6-δ2-异戊烯基-2-甲基硫代腺嘌呤(2ms6iA)、N2-二甲基鸟嘌呤(dmG)、7-甲基鸟嘌呤(7mG)、肌苷、水粉蕈素(nebularine)、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、次黄嘌呤、假尿苷、假胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、2-硫代嘧啶、6-硫代鸟嘌呤、4-硫代胸腺嘧啶、4-硫尿嘧啶、O6-甲基鸟嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、O4-甲基胸腺嘧啶、5,6-二氢胸腺嘧啶、5,6-二氢尿嘧啶、吡唑并[3,4-D]嘧啶(参见例如，美国专利号6,143,877和6,127,121和PCT申请公开WO 01/38584)、亚乙烯基腺嘌呤、吲哚比如硝基吲哚和4-甲基吲哚，以及吡咯比如硝基吡咯。某些示例性核苷酸碱基可以在例如Fasman,1989,Practical Handbook of Biochemistry and MolecularBiology,pp.385-394,CRC Press,Boca Raton,Fla.和其中引用的参考文献中找到。
如本文使用的，术语“核苷酸(nucleotide)”是指包括连接至糖比如核糖、阿拉伯糖、木糖和吡喃糖及其糖类似物的C-1’碳的核苷酸碱基的化合物。术语核苷酸还包括核苷酸类似物。糖可以是取代的或未取代的。取代的核糖包括但不限于其中一个或多个碳原子，例如2’-碳原子被一个或多个相同或不同的Cl、F、-R、-OR、-NR2或卤素基团取代的那些核糖，其中每个R独立地是H、C1-C6烷基或C5-C14芳基。示例性核糖包括但不限于2’-(C1-C6)烷氧基核糖、2’-(C5-C14)芳氧基核糖、2’,3’-二脱氢核糖、2’-脱氧基-3’-卤代核糖、2’-脱氧基-3’-氟核糖、2’-脱氧基-3’-氯核糖、2’-脱氧基-3’-氨基核糖、2’-脱氧基-3’-(C1-C6)烷基核糖、2’-脱氧基-3’-(C1-C6)烷氧基核糖和2’-脱氧基-3’-(C5-C14)芳氧基核糖、核糖、2’-脱氧核糖、2’,3’-二脱氧核糖、2’-卤代核糖、2’-氟核糖、2’-氯核糖和2’-烷基核糖，例如2’-O-甲基、4’-端基异构体核苷酸、1’-端基异构体核苷酸、2’-4’-和3’-4’-链接和其他“锁定的”或“LNA”、双环糖修饰(参见例如，PCT申请公开号WO 98/22489、WO 98/39352；和WO99/14226)。术语“核酸”通常指大的多核苷酸。
术语“寡核苷酸(oligonucleotide)”通常是指短的多核苷酸，通常不大于约50个核苷酸。将理解的是，当核苷酸序列由DNA序列(即，A、T、G、C)表示时，其还包括其中“U”替代“T”的RNA序列(即，A、U、G、C)。
如本文所使用的，术语“突出端(overhang)”是指由延伸超过互补链的末端的一条链或区域产生的末端非碱基配对核苷酸(一个或多个)，互补链的末端与第一链或区域形成双链体。能够通过氢键形成双链体的一种或多种多核苷酸可以具有突出端。延伸超出双链体的3’末端的单链区域称为突出端。
如本文所使用的，术语“模式识别受体(pattern recognition receptor)”，缩写为PRR，是指通常识别与病原体相关的分子模式的蛋白质家族。PRR可以包括RIG-I样受体(RLR)家族、NOD-样受体(NLR)家族、C-型凝集素受体(CLR)家族或toll-样受体(TLR)家族的成员。在某些实施方式中，本文所述的核酸分子与PRR结合，从而产生干扰素应答。应当理解，PRR包括任何PRR片段、变体、剪接变体、突变体等。在某些实施方式中，PRR是RIG-1。
如本文所使用的，术语“多核苷酸(polynucleotide)”被定义为核苷酸链。此外，核酸是核苷酸的聚合物。因此，本文所用的核酸和多核苷酸是可互换的。本领域技术人员具有核酸是可以被水解成单体“核苷酸”的多核苷酸的一般知识。单体核苷酸可以被水解成核苷。如本文所使用的多核苷酸包括但不限于通过本领域可用的任何手段获得的所有核酸序列，包括但不限于重组手段，即使用普通的克隆和扩增技术等，并通过合成方式从重组文库或细胞基因组克隆核酸序列。如本文所使用的“寡核苷酸”是指长度通常小于100个碱基的短的多核苷酸。
本文使用常规符号来描述多核苷酸序列：单链多核苷酸序列的左手端是5’端。与mRNA具有相同序列的DNA链被称为“编码链”；位于DNA上参考点5’处的DNA链上的序列称为“上游序列(upstream sequence)”；为DNA上参考点3’的在DNA链上的序列称为“下游序列(downstream sequence)”。
技术人员将理解，本文以其全部正向表示的所有核酸序列，以其反向以及它们的正向和反向互补方向也可用于本发明的组合物和方法中，并在本文中进行了描述，如同它们在此明确陈述。
“引物(primer)”是指能够与指定的多核苷酸模板特异性杂交并提供用于合成互补多核苷酸的起始点的多核苷酸。当将多核苷酸引物置于诱导合成的条件下，例如在核苷酸，互补的多核苷酸模板和用于聚合的试剂比如DNA聚合酶的存在下，发生这种合成。引物通常是单链的，但是可以是双链的。引物通常是脱氧核糖核酸，但各种各样的合成引物和天然存在的引物可用于许多应用中。引物与被设计与之杂交的模板互补，可作为起始合成的位点，但不必反映模板的确切序列。在这种情况下，引物与模板的特异性杂交取决于杂交条件的严格性。引物可以用可检测的标记物标记，例如发色、放射性或荧光部分，并用作可检测部分。荧光部分的实例包括但不限于稀土螯合物(铕螯合物)、德克萨斯红、若丹明、荧光素、丹磺酰氯、藻红蛋白、藻青蛋白、光谱橙、光谱绿和/或上述的任一种或多种的衍生物。其他可检测的部分包括洋地黄毒苷和生物素。
如本文所使用的“探针(probe)”定义为能够通过一种或多种类型的化学键，通常通过互补的碱基配对，通常通过氢键形成与互补序列的靶核酸结合的核酸。如本文所使用的，探针可以包括天然的(即，A、G、U、C或T)或修饰的碱基(7-脱氮鸟苷、肌苷等)。另外，除磷酸二酯键以外的连接可以连接探针中的碱基，只要它不干扰杂交。因此，探针可以是肽核酸，其中组成碱基通过肽键而不是磷酸二酯键连接。术语“匹配”、“完美匹配”、“完美匹配探针”或“完美匹配对照”是指具有与特定靶序列完全互补的序列的核酸。核酸通常与靶序列的一部分(子序列)完全互补。完美匹配(PM)探针可以是“测试探针”、“标准化对照”探针、表达水平对照探针等。然而，完美匹配对照或完美匹配与“错配”或“错配探针”不同。
如本文所使用的，术语“核糖核苷酸(ribonucleotide)”和短语“核糖核酸(ribonucleic acid)”(RNA)是指包含至少一种核糖核苷酸单元的修饰的或未修饰的核苷酸或多核苷酸。核糖核苷酸单元包括连接至核糖基部分的2’-位置的氧，该核糖基部分具有在核糖基部分的1’-位置的N-糖苷键连接的含氮碱基，以及允许与另一个核苷酸连接或阻止连接的部分。
如本文所使用的，术语“靶标(target)”是指对给定分子具有亲和力的分子。靶标可以是天然存在的分子或人造分子。而且，它们可以以未改变的状态或与其他物质的聚集体形式使用。靶标可以直接地或经由特异性结合物质共价或非共价地连接到结合成员。本发明可使用的靶标的实例包括但不限于蛋白质、肽、寡核苷酸和核酸。
如本文所使用的，术语“变体(variant)”是核酸序列或肽序列，其序列分别不同于参考核酸序列或肽序列，但是保留了参考分子的基本特性。核酸变体的序列的改变可能不会改变由参考核酸编码的肽的氨基酸序列，或者可能导致氨基酸取代、添加、缺失、融合和截短。核酸或肽的变体可以是天然存在的，比如等位基因变体，或者可以是未知的天然存在的变体。核酸和肽的非天然存在的变体可以通过诱变技术或通过直接合成来制备。
范围：在整个本公开内容中，本发明的各个方面可以以范围格式呈现。应当理解，范围格式的描述仅是为了方便和简洁，而不应被解释为对本发明范围的僵化限制。因此，应该将范围的描述视为已具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，对范围1到6的描述应被视为已明确公开了比如1到3、1到4、1到5、2到4、2到6、3到到6等，以及该范围内的单个数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。无论该范围的宽度如何，这都适用。
化合物和组合物
在某些实施方式中，本发明的核酸分子具有20个碱基对、19个碱基对、18个碱基对、17个碱基对、16个碱基对、15个碱基对、14个碱基对、13个碱基对、12个碱基对、11个碱基对、10个碱基对、9个碱基对、8个碱基对、7个碱基对或6个碱基对的双链区段。在某些实施方式中，双链区段包括一个或多个错配的碱基。即，不需要在每个核苷酸对上都具有沃森-克里克碱基配对。在某些实施方式中，双链区段包含约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碱基对。
在某些实施方式中，核酸分子可以具有任何序列，并且包含发夹结构和钝性末端，其中该发夹包括约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碱基对的双链区段。
本发明的核酸分子包括来自任何来源的核酸。在本发明的上下文中，核酸包括但不限于脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、肽核酸(PNA、苏糖核酸(TNA)、二醇核酸(GNA)、锁定核酸(LNA)或其杂合体。
LNA，通常称为无法访问的RNA，是修饰的RNA核苷酸。LNA核苷酸的核糖部分被连接2'-氧和4'-碳的额外桥修饰。桥将核糖“锁定”在3'-内(North)构象中，这种构象通常在A型双链体中发现。可以根据需要将LNA核苷酸与寡核苷酸中的DNA或RNA残基混合，并根据沃森-克里克碱基配对规则与DNA或RNA杂交。这种低聚物可以化学合成并且可商购的。锁定的核糖构象增强了碱基堆积和主链预组织。
LNA包括具有碳或杂脂环的核酸单元，该环具有4至6个环成员，例如呋喃糖环(firanose ring)或其他脂环结构，比如环戊基、环庚基、四氢吡喃基、氧杂环庚烷基、四氢噻吩基、吡咯烷基、噻烷基(thianyl)、硫代环庚烷基、哌啶基等。在某些实施方式中，采用碳或杂脂环基团的至少一个环原子形成另外的环状键，从而提供多环基团。环状键可以包括一个或多个，通常为两个原子的碳或杂脂环基团。环状键也可以包括一个或多个原子，该原子是碳或杂脂环基团的取代基而不是环成员。示例性LNA单元包括含有呋喃糖基型环和下述键中的一个或多个的那些：C-1’、C-2’；C-2’、C-3’；C-2’、C-4’；或C-2’、C-5’链接。C-2’、C-4’是特别期望的。在其他实施方式中，LNA单元是在中心糖部分(例如核糖或木糖)的2’-位具有取代基的化合物，或其衍生物，其有利于C3’-内构象，通常被称为North(或简称为N)构象。示例性LNA单元包括2’-O-甲基、2’-氟、2’-烯丙基和2’-O-甲氧基乙氧基衍生物。在国际专利公开WO 99/14226、WO 00/56746和WO 00/66604中进一步讨论了其他期望的LNA单元，其全部以其整体包括在本文中。
DNA和RNA天然存在于生物体中，但是它们也可能存在于活生物体外部或添加到生物体中。核酸可以是任何来源，例如病毒、细菌、古细菌、真菌、核糖体、真核或原核。它可以是来自任何生物样品以及任何生物体、组织、细胞或亚细胞区室的核酸。它可以是来自任何生物体的核酸。核酸可以在定量之前进行预处理，例如通过分离、纯化或修饰。还可以使用人工或合成核酸。核酸的长度可以变化。核酸可以被修饰，例如可以包括一个或多个修饰的核酸碱基或修饰的糖部分(例如，包括甲氧基)。核酸的主链可以如肽核酸(PNA)中那样包括一个或多个肽键。核酸可包含碱基类似物，比如非嘌呤或非嘧啶类似物或核苷酸类似物。它还可以包括其他附件，比如蛋白质、肽和/或氨基酸。
在某些实施方式中，本发明的核酸分子是形成分子内结构，即发夹结构的单链寡核苷酸。
在某些实施方式中，发夹核酸分子形成钝性末端。在某些实施方式中，钝性末端是指例如RNA双链体，其中双链体的至少一个末端没有任何突出端，例如3’-二核苷酸突出端，使得5’-和3’-链端在一起，即齐平的或如本文所指是钝性的。本发明的分子可以具有至少一个钝性末端。在其他实施方式中，分子内结构产生3’-突出端。在某些情况中，3’-突出端包括非碱基配对核苷酸。在其他实施方式中，3’-突出端包括两个非碱基配对核苷酸。在又其他实施方式中，3’-突出端包括三个非碱基配对核苷酸。在又其他实施方式中，3’-突出端包括四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或多于十个非碱基配对核苷酸。在某些情况中，分子内结构产生5’-突出端。在某些实施方式中，5’-突出端包括非碱基配对核苷酸。在其他实施方式中，5’-突出端包括两个非碱基配对核苷酸。在又其他实施方式中，5’-突出端包括三个非碱基配对核苷酸。在又其他实施方式中，5’-突出端包括四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或多于十个非碱基配对核苷酸。
在某些情况下，本发明的短发夹核酸分子是理想的刺激物，因为在解链(unwound)后具有重新退火的能力，而不是发夹的较短回文双链体则一旦双链体解链(melt)就可能很快失去刺激IFN产生的能力。然而，本发明不限于发夹结构，如本文所证明的，短的双链双链体表现出结合PRR和刺激干扰素应答的能力。
在一些情况下，本发明的短的发夹核酸分子设计为使得在某些条件下，分子内茎结构在茎结构未折叠的情况下具有降低的稳定性。以这种方式，茎结构可以设计为使得可以解除茎结构的分子内碱基配对并且类似于线性分子。
根据本发明，提供了预定的茎寡核苷酸序列，其包含形成茎结构的互补序列的片段(stretch)。在某些实施方式中，茎包括双链区段，该双链区段包括20个碱基对、19个碱基对、18个碱基对、17个碱基对、16个碱基对、15个碱基对、14个碱基对、13个碱基对、12个碱基对、11个碱基对、10个碱基对、9个碱基对、8个碱基对、7个碱基对或6个碱基对，使得这些互补的片段退火以提供发夹结构。在某些实施方式中，双链区段包含一个或多个碱基错配。即，双链区段不必在各个和每个碱基对上都包括沃森-克里克碱基配对以便产生发夹结构。
在某些实施方式中，本发明的短发夹核酸分子包含：反义序列和有义序列，其中所述有义序列与反义序列基本上互补；和连接反义序列和有义序列的环区域或接头。
在某些方面中，本发明包括包含单分子RNA，比如短的发夹RNA的多核苷酸。短发夹RNA可以是单分子RNA，其包括一起形成发夹环结构的有义序列、环区域或接头和反义序列。优选地，反义序列和正义序列彼此基本互补(约80％互补或更多)，其中在某些实施方式中，反义序列和正义序列彼此100％互补。在某些实施方式中，反义序列和有义序列各自包括20个碱基对、19个碱基对、18个碱基对、17个碱基对、16个碱基对、15个碱基对、14个碱基对、13个碱基对、12个碱基对、11个碱基对、10个碱基对、9个碱基对、8个碱基对、7个碱基对或6个碱基对。另外，本发明的单分子RNA内的反义序列和有义序列可以具有相同的长度或不同的长度。环可以是任何长度，例如长度为0、1个或更多、2个或更多、4个或更多、5个或更多、8个或更多、10个或更多、15个或更多、20个或更多、40个或更多、或100个或更多的核苷酸。
在某些方面中，接头不含核苷、核苷酸、脱氧核苷或脱氧核苷酸或其任何替代或修饰。在某些实施方式中，接头不含磷酸酯主链或其任何替代或修饰。
本文考虑了本领域已知的任何接头。接头的非限制性实例包括乙二醇(-CH2CH2O)、肽、肽核酸(PNA)、亚烷基链(基于二价烷烃的基团)、酰胺、酯、醚等，以及任何其组合。
在某些实施方式中，接头包括至少一个乙二醇基团。在其他实施方式中，接头包括一个乙二醇基团。在又其他实施方式中，接头包括两个乙二醇基团。在又其他实施方式中，接头包括三个乙二醇基团。在又其他实施方式中，接头包括四个乙二醇基团。在又其他实施方式中，接头包括五个乙二醇基团。在又其他实施方式中，接头包括六个乙二醇基团。在又其他实施方式中，接头包括七个乙二醇基团。在又其他实施方式中，接头包括八个乙二醇基团。在又其他实施方式中，接头包括九个乙二醇基团。在又其他实施方式中，接头包括十个乙二醇基团。在又其他实施方式中，接头包括多于十个乙二醇基团。在又其他实施方式中，接头包括(OCH2CH2)n，其中n为范围从1至10的整数。在又其他实施方式中，n是1。在又其他实施方式中，n是2。在又其他实施方式中，n是3。在又其他实施方式中，n是4。在又其他实施方式中，n是5。在又其他实施方式中，n是6。在又其他实施方式中，n是7。在又其他实施方式中，n是8。在又其他实施方式中，n是9。在又其他实施方式中，n是10。
在某些实施方式中，接头包含至少一个氨基酸、至少两个氨基酸、至少三个氨基酸、至少四个氨基酸、至少五个氨基酸、至少六个氨基酸、至少七个氨基酸、至少八个氨基酸、至少九个氨基酸、至少十个氨基酸或多于十个氨基酸。
在某些实施方式中，接头包括亚烷基链，比如但不限于C1-C50亚烷基链，其被选自下列的至少一种取代基任选地取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷基、C3-C8环烷基、C1-C6烷氧基、-OH、卤素、-NH2、-NH(C1-C6烷基)、-N(C1-C6烷基)(C1-C6烷基)、-C(＝O)OH、-C(＝O)O(C1-C6烷基)和-C(＝O)O(C3-C8环烷基)，其中烷基或环烷基被选自下列的至少一种任选地取代：C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷基、C3-C8环烷基、C1-C6烷氧基、-OH、卤素、-NH2、-NH(C1-C6烷基)、-N(C1-C6烷基)(C1-C6烷基)、-C(＝O)OH、-C(＝O)O(C1-C6烷基)和-C(＝O)O(C3-C8环烷基)。在其他实施方式中，接头选自-(CH2)-、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)2-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)6-、-(CH2)7-、-(CH2)8-、-(CH2)9-、-(CH2)10-、-(CH2)11-、-(CH2)12-、-(CH2)13-、-(CH2)14-、-(CH2)15-、-(CH2)16-、-(CH2)17-、-(CH2)18-、-(CH2)19-、和-(CH2)20-，各自独立地任选地被取代，如本文其他地方所描述。
核酸修饰
可以修饰本发明的核酸分子以改善在血清中或在用于细胞培养的生长培养基中的稳定性。为了增强稳定性，可以稳定3’-残基以防止降解，例如，可以选择3’-残基使得它们由嘌呤核苷酸，特别是腺苷或鸟苷核苷酸组成。可替代地，容许嘧啶核苷酸被修饰的类似物取代，例如，尿苷被2’-脱氧基胸苷取代，并且不影响分子的功能。
在某些实施方式中，核酸分子可包含至少一种修饰的核苷酸类似物。例如，可以通过并入修饰的核苷酸类似物来稳定末端。
核苷酸类似物的非限制性实例包括糖和/或主链修饰的核糖核苷酸(即，包括对磷酸酯-糖主链的修饰)。例如，天然RNA的磷酸二酯键可以被修饰为包括氮或硫杂原子中的至少一种。在某些主链修饰的核糖核苷酸中，与相邻核糖核苷酸连接的磷酸酯基团被例如硫代磷酸酯基团的修饰基团替换。在某些糖修饰的核糖核苷酸中，2’OH-基团被选自H、OR、R、卤素、SH、SR、NH2、NHR、NR2和ON的基团替换，其中R为C1-C6烷基、烯基或炔基，并且卤素是F、Cl、Br或I。
修饰的其他实例是核苷碱基修饰的核糖核苷酸，即，包含至少一种非天然存在的核苷碱基而不是天然存在的核苷碱基的核糖核苷酸。可以修饰碱基以阻断腺苷脱氨酶的活性。示例性的修饰的核苷碱基包括但不限于在5-位修饰的尿苷和/或胞苷，例如5-(2-氨基)丙基尿苷，5-溴尿苷；在8位修饰的腺苷和/或鸟苷，例如8-溴鸟苷；脱氮核苷酸，例如7-脱氮腺苷；O-和N-烷基化的核苷酸，例如N6-甲基腺苷是合适的。应当注意，以上修改可以组合。
可以添加修饰以增强稳定性、官能度和/或特异性，并使本发明的短发夹核酸分子的免疫刺激特性最小化。例如，突出端可以是未修饰的，或可以包含一个或多个特异性或稳定化的修饰，比如2’-位的卤素或O-烷基修饰，或核苷酸间的修饰，例如硫代磷酸酯修饰。突出端可以是核糖核酸、脱氧核糖核酸或核糖核酸和脱氧核糖核酸的组合。
在一些情况下，核酸分子包括下述化学修饰中的至少一种：一个或多个核苷酸的2’-H、2’-O-甲基或2’-OH修饰；主链的一种或多种硫代磷酸酯修饰；和非核苷酸部分；其中，与相应的不具有化学修饰的短发夹核酸分子相比，至少一种化学修饰赋予降低的免疫刺激活性、增加的血清稳定性或二者。
在某些实施方式中，嘧啶核苷酸包括2’-O-甲基嘧啶核苷酸和/或2’-脱氧基-嘧啶核苷酸。
在某些实施方式中，一些或全部嘌呤核苷酸可以包括2’-O-甲基嘌呤核苷酸和/或2’-脱氧基-嘌呤核苷酸。
在某些实施方式中，化学修饰存在于本发明的核酸分子的3’-和/或5’-端的核苷酸附近。
在某些实施方式中，本发明的核酸分子可以具有增强的对核酸酶的抗性。为了提高核酸酶的抗性，核酸分子可以包括例如2’-修饰的核糖单元和/或硫代磷酸酯键。例如，2’-羟基(OH)可以被修饰或被许多不同的“氧”或“脱氧”取代基替换。
为了增加核酸酶抗性，本发明的核酸分子可以包括2’-O-甲基、2’-氟、2’-O-甲氧基乙基、2’-O-氨基丙基、2’-氨基和/或硫代磷酸酯键。包括锁定核酸(LNA)、乙烯核酸(ENA)，例如，2’-4’-乙烯-桥核酸，和某些核苷碱基修饰，比如2-氨基-A，2-硫代(例如，2-硫-U)，G-钳修饰，还可以增加与靶标的结合亲和力。
在某些实施方式中，核酸分子包括2’-修饰的核苷酸，例如，2’-脱氧基、2’-脱氧基-2’-氟、2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、2’-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)或2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)。在某些实施方式中，核酸分子包括至少一种2’-O-甲基-修饰的核苷酸，和在一些实施方式中，核酸分子的所有核苷酸均包括2’-O-甲基修饰。
“氧”-2’-羟基修饰的实例包括烷氧基或芳氧基(OR，例如R＝H，烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)；和聚乙二醇(PEG)，O(CH2CH2O)nCH2CH2OR；“锁定”核酸(LNA)，其中2’-羟基例如通过亚甲基桥连接到同一核糖的4’碳上；胺、O-AMINE和氨基烷氧基，O(CH2)nAMINE(例如AMINE＝NH2；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基、乙二胺、聚氨基)。仅包含甲氧基乙基(MOE)的寡核苷酸(OCH2CH2OCH3，一种PEG衍生物)，其核酸酶稳定性与经强力硫代磷酸酯修饰后的核酸酶稳定性相当。
“脱氧”修饰包括氢(即脱氧核糖)；卤素(例如，氟)；氨基(例如NH2；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基、二杂芳基氨基或氨基酸)；NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-AMINE(AMINE＝NH2；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基)、-NHC(O)R(R＝烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)、氰基；巯基；烷基-硫代-烷基；硫代烷氧基；和烷基、环烷基、芳基、烯基和炔基，其可以被例如氨基官能度任选地取代。
优选的取代基是2’-甲氧基乙基、2’-OCH3、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基和2’-氟。
增加抗性的一种方法是鉴定裂解位点并修饰这些位点以抑制裂解。例如，二核苷酸5’-UA-3’、5’-UG-3’、5’-CA-3’、5’-UU-3’或5’-CC-3’可以用作裂解位点。因此可以通过修饰5’-核苷酸实现增强的核酸酶抗性，产生例如，至少一种5’-尿苷-腺嘌呤-3’(5’-UA-3’)二核苷酸，其中尿苷为2’-修饰的核苷酸；至少一种5’-尿苷-鸟嘌呤-3’(5’-UG-3’)二核苷酸，其中5’-尿苷为2’-修饰的核苷酸；至少一种5’-胞苷-腺嘌呤-3’(5’-CA-3’)二核苷酸，其中5’-胞苷为2’-修饰的核苷酸；至少一种5’-尿苷-尿苷-3’(5’-UU-3’)二核苷酸，其中5’-尿苷为2’-修饰的核苷酸；或至少一种5’-胞苷-胞苷-3’(5’-CC-3’)二核苷酸，其中5’-胞苷为2’-修饰的核苷酸。寡核苷酸分子可以包括至少2个、至少3个、至少4或至少5个这样的二核苷酸。在某些实施方式中，核酸分子的所有嘧啶均带有2’-修饰，并且因此该核酸分子具有对内切核酸酶的增强的抗性。
关于起到增强对核糖核酸酶活性的保护作用的硫代磷酸酯键，该核酸分子可以在核苷酸序列的5’-或3’-端的至少第一、第二或第三核苷酸间键中包括硫代磷酸酯。为了使核酸酶抗性最大化，可以将2'-修饰与一种或多种磷酸酯接头修饰(例如，硫代磷酸酯)组合使用。
在某些实施方式中，在核酸主链中包含吡喃糖还可以减少核酸内切裂解。在某些实施方式中，在核酸主链中包含呋喃糖还可以减少核酸内切裂解。
在某些实施方式中，可以用氨基烷基例如5’-O-烷基氨基取代基封闭5’-末端。其他5’-缀合物可以抑制5’至3’的核酸外切裂解。尽管不受理论的束缚，但是5’-缀合物可通过在空间上阻断核酸外切酶与寡核苷酸的5’-端结合而抑制核酸外切裂解。即使是小的烷基链、芳基、杂环缀合物或修饰的糖(D-核糖、脱氧核糖、葡萄糖等)也可以阻断5’-3-核酸外切酶。
因此，核酸分子可以包括修饰以抑制例如通过在受试者体内发现的核酸酶例如核酸内切酶或核酸外切酶的降解。这些单体在本文中称为NRM或促进核酸酶抗性单体，相应的修饰称为NRM修饰。在许多情况下，这些修饰也将调节寡核苷酸分子的其他性质，例如与蛋白质相互作用的能力，例如与运输蛋白，例如与血清白蛋白。
可以将一种或多种不同的NRM修饰引入核酸分子或核酸分子的序列中。可以在序列或核酸分子中多次使用NRM修饰。
NRM修饰包括一些只放在末端的修饰和可以放在任何位置的其他修饰。可以抑制杂交的一些NRM修饰优选仅用于末端区域，并且更优选地不用于核酸分子的裂解位点或裂解区域。
可以将这样的修饰引入末端区域中，例如在靶向受试者的序列或不靶向受试者的序列的末端位置或末端的2-、3-、4-或5-位处。
在某些实施方式中，核酸分子包括改善靶向的修饰，例如，本文所述的靶向修饰。将核酸分子靶向特定细胞类型的修饰的实例包括碳水化合物糖类，比如半乳糖、N-乙酰基半乳糖胺、甘露糖；维生素，比如叶酸；其他配体，比如RGD和RGD模拟物；和包括萘普生、布洛芬或其他已知的蛋白质结合分子的小分子。
可以使用本领域已知的方法，使用化学合成和/或酶促连接反应来构建核酸分子。例如，可以使用天然存在的核苷酸或各种修饰的核苷酸化学地合成核酸分子，该修饰的核苷酸设计成增加分子的生物学稳定性或增加核酸分子与靶标之间的结合的物理稳定性，例如可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。本文描述了其他合适的核酸修饰。可替代地，可以使用表达载体生物学地产生核酸分子。
为了易于说明，术语核苷酸或核糖核苷酸有时在本文中用于指寡核苷酸试剂的一个或多个单体亚基。在本文中应当理解，在修饰的RNA或核苷酸替代物的情况下，本文中术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”的使用还可指在一个或多个位置处的修饰的核苷酸或替代物置换部分。
在某些实施方式中，本发明的核酸分子优选地具有下述特性中的一种或多种：
(1)5’-修饰，其包括一个或多个磷酸酯基团或一种或多种磷酸酯基团的类似物；
(2)尽管进行了修饰，即使特别是大量的碱基，但仍具有碱基对并形成具有双链区域的双链体结构。
(3)尽管进行了修饰，即使是很大数目的核苷或所有核苷，但仍然具有“RNA-样”的特性，即，尽管不是排他性地，或甚至部分是基于核糖核苷酸的含量，它仍具有RNA分子的整体结构、化学和物理特性。例如，所有核苷酸糖可以包含例如2’-OMe、2’-氟替换2’-羟基。仍可预期该含脱氧核糖核苷酸的试剂表现出RNA-样的特性。尽管不希望受到理论的束缚，但负电性的氟在连接到核糖的C2’位置时更倾向于轴向取向。氟的这种空间偏好反过来会迫使糖类采用C3’-内折叠。这与在RNA分子中观察到的折叠方式相同，并产生了具有RNA特征的A族类型螺旋。此外，由于氟是良好的氢键受体，因此它可以与已知稳定RNA结构的水分子参与相同的氢键相互作用。通常，优选的是，在2’-糖位置上的修饰的部分将能够进入氢键，其比脱氧核糖核苷酸的2’-H部分更能够表征核糖核苷酸的2’-OH部分。在某些实施方式中，寡核苷酸分子将：在全部或其糖的至少50％、75％、80％、85％、90％或95％中表现出C3’-内折叠；展现出足够量的糖中的C3’-内折叠，产生表征RNA的A族类型螺旋；将具有不超过20、10、5、4、3、2或1个糖——其不是C3’-内折叠结构。
用C3’-内糖折叠的2’-修饰包括2’-OH、2’-O-Me、2’-O-甲氧基乙基、2’-O-氨基丙基、2’-F、2’-O-CH2-CO-NHMe、2’-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-N(Me)2和LNA。用C2’-内糖折叠的2’-修饰包括2’-H、2’-Me、2’-S-Me、2’-乙炔基和2’-ara-F。糖修饰也可以包括L-糖和2’-5’-连接的糖。
本文讨论的核酸试剂包括未修饰的RNA和DNA以及已被修饰例如以提高功效的RNA和DNA，以及核苷替代物的聚合物。未修饰的RNA是指这样一种分子，其中核酸的成分，即糖、碱基和磷酸酯部分，与天然存在的相同或基本相同，优选与人体天然存在的相同或基本相同。本领域已将稀有的或不寻常的但天然存在的RNA称为修饰的RNA，参见例如Limbach等人，Nucleic Acids Res.1994,22:2183-2196。这种稀有的或不寻常的RNA，通常称为修饰的RNA，通常是转录后修饰的结果，并且在本文所用的术语未修饰的RNA的范围内。如本文所使用的修饰的RNA是指这样一种分子，其中核酸的一种或多种组分，即糖、碱基和磷酸酯部分，与天然存在的不同，优选地与人体中天然存在的不同。尽管它们被称为“修饰的RNA”，但由于修饰的原因，它们当然会包含严格说来不是RNA的分子。核苷替代物是这样的分子，其中核糖磷酸酯主链被非核糖磷酸酯构建体替代，该结构允许碱基以正确的空间关系出现，从而杂交与核糖磷酸酯主链，例如磷酸核糖主链的不带电模拟物所见的基本相似。本文讨论了所有上述实例。
由于核酸是亚基或单体的聚合物，因此以下描述的许多修饰发生在核酸内重复的位置处，例如碱基或磷酸酯部分、或磷酸酯部分的非连接O的修饰。在某些情况下，修饰将发生在核酸的所有受试位置处，但是在许多情况下，实际上，在大多数情况下，修饰不会发生。举例来说，修饰可以仅发生在3’-或5’-末端位置，在末端区域中，例如在末端核苷酸上的位置，或在链的最后2、3、4、5或10个核苷酸。配体可以在3’-端、5’-端或内部位置或这些位置的组合处连接。例如，配体可以在3’-端和5’-端；在3’-端和一个或多个内部位置处；在5’-端和一个或多个内部位置处；或在3’-端、5’-端和一个或多个内部位置处。例如，非连接O位置的硫代磷酸酯修饰可能仅在一个或两个末端处发生，或者可能仅在一个末端区域发生，例如在末端核苷酸的位置处或核酸的最后2、3、4、5或10个核苷酸中。5’-端可以被磷酸酯化。
在下面讨论了修饰和核苷酸替代物。
Figure BDA0003091904760000161
上述式1所呈现的支架(scaffold)代表核糖核酸的一部分。基本成分是核糖、碱基、末端磷酸酯和磷酸核苷酸间接头。当碱基是天然存在的碱基，例如腺嘌呤、尿嘧啶、鸟嘌呤或胞嘧啶时，糖是未修饰的2’羟基核糖(如所描绘的)，并且W、X、Y和Z均为O时，式1表示天然存在的未修饰的寡核糖核苷酸。
在某些应用中，未修饰的寡核糖核苷酸可能不是最佳的，例如，未修饰的寡核糖核苷酸可能易于被例如细胞核酸酶降解。核酸酶可以水解核酸磷酸二酯键。然而，对一种或多种上述RNA组分的化学修饰可以赋予改进的性质，并且例如可以使寡核糖核苷酸对核酸酶更稳定。就提供用于将配体或其他部分连接至核酸试剂的束缚点而言，未修饰的寡核糖核苷酸也可能不是最佳的。
修饰的核酸和核苷酸替代物可以包括以下一种或多种：
(i)改变，例如替换非连接的(X和Y)磷酸酯氧中的一个或两个和/或连接的(W和Z)磷酸酯氧中的一个或多个。当磷酸酯处于末端位置时，W或Z位置中的一个将不会将磷酸酯连接至天然存在的核糖核酸中的其他元素。然而，为了简化术语，除非另有说明，否则核酸的5’端的W位置和核酸的3’端的Z末端位置均在术语“连接的磷酸酯氧”的范围内；
(ii)改变，例如，用例如核糖上的2’羟基替代核糖的成分，或用本文所描述的核糖以外的结构大规模替代核糖；
(iii)用“脱磷”接头大规模替代磷酸酯部分(括号I)；
(iv)修饰或替换天然存在的碱基；
(v)替换或修饰核糖-磷酸酯主链(括号II)；
(vi)RNA的3’-端或5’-端的修饰，例如末端磷酸酯基团的去除、修饰或替换，或部分比如荧光标记部分与RNA的3’-或5’-端的缀合。
在本文中使用的术语替换、修饰、改变等并不意味着任何工艺限制，例如，修饰并不意味着必须以参比或天然存在的核糖核酸开始，并对其进行修饰以产生修饰的核糖核酸，而是修饰仅表明与天然存在的分子存在差异。
应当理解，某些化学实体的实际电子结构不能仅用一种规范形式(即路易斯结构)来充分表示。尽管不希望受到理论的束缚，但实际结构可以是统称为共振形式或结构的两种或两种以上规范形式的某种混合或加权平均值。共振结构不是离散的化学实体，仅存在于纸上。它们之间的区别仅在于特定化学实体的键合和非键合电子的位置或“定位”。一个共振结构可能比其他共振结构更大程度地有助于杂合。因此，根据本领域公认的特定物质的主要共振形式，对本发明的实施方式进行了书面和图形描述。例如，任何氨基磷酸酯(用氮取代非连接的氧)将由上图中的X＝O和Y＝N代表。
磷酸酯基团
磷酸酯基团是带负电的物质。电荷均匀地分布在两个非连接的氧原子(即，上式1中的X和Y)上。然而，可以通过用不同的取代基取代至少一个氧来修饰磷酸酯基团。对RNA磷酸酯主链的这种修饰的一个结果可以使寡核糖核苷酸对核分解的抗性增加。因此，尽管不希望受到理论的束缚，但在某些实施方式中可能希望引入产生具有不对称电荷分布的不带电荷的接头或带电荷的接头的改变。
修饰的磷酸酯基团的实例包括硫代磷酸酯、磷酸硒酸酯、硼烷磷酸酯、硼烷磷酸酯、膦酸氢酯、氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯。二硫代磷酸酯的两个非键合氧均被硫替换。与X或Y中只有一个被改变的情况不同，二硫代磷酸酯中的磷中心是非手性的，从而阻止了寡核糖核苷酸非对映体的形成。非对映体的形成可以导致其中单个非对映体表现出对核酸酶变化的抗性的制剂。此外，相对于相应的未修饰的RNA种类，包含手性磷酸酯基团的RNA的杂交亲和力可以较低。因此，尽管不希望受到理论的束缚，但对于消除手性中心的X和Y的修饰，例如二硫代磷酸酯的形成，可能是合乎需要的，因为它们不能产生非对映体混合物。因此，X可以是S、Se、B、C、H、N或OR中的任何一个(R是烷基或芳基)。因此，Y可以是S、Se、B、C、H、N或OR中的任何一个(R是烷基或芳基)。优选用硫替换X和/或Y。
磷酸酯接头也可以通过用氮(桥连的磷酸酰胺化物)、硫(桥连的硫代磷酸酯)和碳(桥连的亚甲基膦酸酯)替代连接的氧(即式1中的W或Z)来修饰。替代可以在末端氧(位置W(3’)或位置Z(5’))处发生。优选用碳替换W或用氮替换Z。
糖基
修饰的RNA可以包括核糖核酸的全部或一些糖基的修饰。例如，2’-羟基(OH)可以被许多不同的“氧”或“脱氧”取代基取代修饰。尽管不受理论的束缚，由于羟基不再能去质子化以形成2’-醇盐离子，因此有望提高稳定性。2’醇盐可以通过分子内亲核攻击接头磷原子来催化降解。尽管不希望受到理论的束缚，但对于一些实施方式，可能希望引入其中不可能在2’-位形成醇盐的改变。
“氧”-2’-羟基修饰的实例包括烷氧基或芳氧基(OR，例如，R＝H、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)；聚乙二醇(PEG)，O(CH2CH2O)nCH2CH2OR；“锁定”核酸(LNA)，其中2’-羟基通过例如亚甲基桥或亚乙基桥(例如，2’-4’-亚乙基桥核酸(ENA))与相同核糖的4’碳连接；氨基，O-AMINE(AMINE＝NH2；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基、二杂芳基氨基、乙二胺、聚氨基)和氨基烷氧基、O(CH2)nAMINE、(例如，AMINE＝NH2；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基、乙二胺、聚氨基)。值得注意的是，仅含有甲氧基乙基(MOE)的寡核苷酸(OCH2CH2OCH3，PEG衍生物)展现与经强力硫代磷酸酯修饰的那些相当的核酸酶稳定性。
“脱氧”修饰包括氢(即脱氧核糖)；卤素(例如，氟)；氨基(例如NH2；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基、二杂芳基氨基或氨基酸)；NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-AMINE(AMINE＝NH2；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基)、-NHC(O)R(R＝烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基、或糖)、氰基；巯基；烷基-硫代-烷基；硫代烷氧基；和烷基、环烷基、芳基、烯基和炔基，其可以被例如氨基官能度任选地取代。优选的取代基是2’-甲氧基乙基、2’-OCH3、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基和2’-氟。
糖基还可以包含一个或多个碳，该碳的立体化学构型与核糖中相应碳的立体化学构型相反。因此，修饰的RNA可以包括含有例如阿拉伯糖作为糖的核苷酸。
修饰的RNA也可以包括在C-1’处缺少核苷碱基的“无碱基(abasic)”糖。这些无碱基糖还可以包含在一个或多个组成糖原子上的修饰。
为了使核酸酶的抗性最大化，可以将2’修饰与一种或多种磷酸酯接头修饰(例如，硫代磷酸酯)组合使用。所谓的“嵌合”寡核苷酸是包含两个或更多个不同修饰的寡核苷酸。
修饰还可以引起在核酸剂的一个或多个位点处用另一种实体(SRMS)完全取代核糖结构。
磷酸酯基团的替代
磷酸酯基团可以被不含磷的连接基替换(参见上式1中的括号I)。尽管不希望受到理论的束缚，但是相信由于带电荷的磷酸二酯基团是核分解降解中的反应中心，因此用中性结构模拟物替换其应赋予增强的核酸酶稳定性。同样，尽管不希望受到理论的束缚，但在一些实施方式中，可能希望引入其中带电荷的磷酸酯基团被中性部分替换的改变。
可以替换磷酸酯基团的部分的实例包括硅氧烷、碳酸酯、羧甲基、氨基甲酸酯、酰胺、硫醚、环氧乙烷接头、磺酸酯、磺酰胺、硫代甲缩醛(thioformacetal)、甲缩醛、肟、亚甲基亚氨基、亚甲基甲基亚氨基、亚甲基亚肼基、亚甲基二甲基亚肼基和亚甲基氧基甲基亚氨基。优选的取代基包括亚甲基羰基氨基和亚甲基甲基亚氨基。
磷酸核糖主链的替代
还可以构建模拟寡核苷酸的支架，其中磷酸酯接头和核糖被耐核酸酶的核苷或核苷酸替代物替换(参见上述式1的括号II)。尽管不希望受到理论的束缚，但认为缺乏重复性带电荷的主链减少了与识别聚阴离子的蛋白质(例如核酸酶)的结合。再次，尽管不希望受到理论的束缚，但在某些实施方式中，可能希望引入其中碱基被中性替代主链束缚(tether)的改变。
实例包括吗啉基、环丁基、吡咯烷和肽核酸(PNA)核苷替代物。优选的替代物是PNA替代物。
末端修饰
寡核苷酸的3’-和5’-端可以被修饰。这种修饰可以在分子的3’-末端、5’-末端或两端。它们可以包括整个末端磷酸酯或磷酸酯基团的一个或多个原子的修饰或替换。例如，寡核苷酸的3’-和5’-端可以与其他功能性分子实体缀合，该功能性分子实体比如标记部分，例如荧光团(例如芘、TAMRA、荧光素、Cy3或Cy5染料)或保护基团(例如基于硫、硅、硼或酯的)。功能性分子实体可以通过磷酸酯基团和/或间隔基连接到糖上。间隔基的末端原子可以连接或替换磷酸酯基团或糖的C-3’-或C-5’-O、N、S或C基团的连接原子。可替代地，间隔基可以连接到或替换核苷酸替代物(例如，PNA)的末端原子。这些间隔基或接头可以包括例如-(CH2)n-、-(CH2)nN-、-(CH2)nO-、-(CH2)nS-、O(CH2CH2O)nCH2CH2OH(例如，n＝3或6)、无碱基糖、酰胺、羧基、胺、羟基胺、氧亚胺、硫醚、二硫化物、硫脲、磺酰胺或吗啉基、或生物素和荧光素试剂。尽管不希望受到理论的束缚，但认为某些部分的缀合可以改善转运、杂交和特异性性质。尽管不希望受到理论的束缚，但可能希望引入改善核酸酶抗性的末端改变。末端修饰的其他实例包括染料、嵌入剂(例如吖啶)、交联剂(例如补骨脂素、丝裂霉素C)、卟啉(TPPC4、泰克萨菲瑞(texaphyrin)、Sapphyrin)、多环芳族烃(例如，吩嗪、二氢吩嗪)、人工核酸内切酶(例如EDTA)、亲脂性载体(例如，胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-双-O(十六基)甘油、香叶基氧基己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基、或吩
Figure BDA0003091904760000201
嗪)和肽缀合物(例如、触角足肽、Tat肽)、烷基化剂、磷酸酯、氨基、巯基、PEG(例如、PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚氨基、烷基、取代的烷基、放射性标记的标志物、酶、半抗原(例如生物素)、运输/吸收促进剂(例如，阿司匹林、维生素E、叶酸)、合成核糖核酸酶(例如，咪唑、联苯咪唑、组胺、咪唑簇、吖啶-咪唑缀合物、四氮杂大环的Eu3+络合物)。
可以出于多种原因添加末端修饰，包括如本文其他地方所讨论的，以调节活性或调节抗降解性。优选的修饰包括在最3’-最末端的键上添加甲基膦酸酯；3’-C5-氨基烷基-dT；3’-阳离子基团；或其他3'-缀合物来抑制3’-5’-核酸外切降解。
可用于调节活性的末端修饰包括用磷酸酯或磷酸酯类似物修饰5’-末端。例如，在某些实施方式中，寡核苷酸试剂被5’-磷酸酯化或在5’-末端包括磷酰基类似物。合适的修饰包括：5’-单磷酸酯((HO)2(O)P-O-5’)；5’-二磷酸酯((HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)；5’-三磷酸酯((HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)；5’-鸟苷帽(7-甲基化的或非甲基化的)(7m-G-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)；5’-腺苷帽(Appp)，和任何修饰的或未修饰的核苷酸帽结构(N-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)；5’-单硫代磷酸酯(硫代磷酸酯；(HO)2(S)P-O-5’)；5’-单二硫代磷酸酯(二硫代磷酸酯；(HO)(HS)(S)P-O-5’)，5’-硫代磷酸酯((HO)2(O)P-S-5’)；氧/硫替代的单磷酸酯、二磷酸酯和三磷酸酯的任何其他组合(例如5’-α-硫代三磷酸酯、5’-γ-硫代三磷酸酯等)、5’-氨基磷酸酯((HO)2(O)P-NH-5’、(HO)(NH2)(O)P-O-5’)、5’-烷基膦酸酯(R＝烷基＝甲基、乙基、异丙基、丙基等，例如RP(OH)(O)-O-5’-、(OH)2(O)P-5’-CH2-)、5’-烷基醚膦酸酯(R＝烷基醚，比如甲氧基甲基(MeOCH2-)、乙氧基甲基等，例如RP(OH)(O)-O-5’-)。
末端修饰也可用于监测分布，在这种情况下，要添加的优选基团包括荧光团(例如荧光素)或Alexa染料(例如Alexa 488)。末端修饰还可用于增强摄取，对此有用的修饰包括胆固醇。末端修饰对于将拮抗剂与另一部分交联也是有用的；对此有用的修饰包括丝裂霉素C。
碱基
腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶是RNA中最常见的碱基。这些碱基可以被修饰或替换以提供具有改进特性的RNA。例如，可以用这些碱基或合成的和天然的核酸碱基(例如肌苷、胸腺嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、核苷、异鸟嘌呤或杀结核菌素(tubercidine))和上述任一种修饰制备抗核酸酶的寡核糖核苷酸。可替代地，可以采用任何上述碱基中的任一种的取代的或修饰的类似物，例如，本文所述的“非常规碱基”和“通用碱基”。实例包括但不限于2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、5-卤代尿嘧啶、5-(2-氨基丙基)尿嘧啶、5-氨基烯丙基尿嘧啶、8-卤代、氨基、巯基、硫代烷基、羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤、5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶、二氢尿嘧啶、3-脱氮-5-氮杂胞嘧啶、2-氨基嘌呤、5-烷基尿嘧啶、7-烷基鸟嘌呤、5-烷基胞嘧啶、7-脱氮腺嘌呤、N6,N6-二甲基腺嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、5-氨基-烯丙基-尿嘧啶、N3-甲基尿嘧啶、取代的1,2,4-三唑、2-吡啶酮、5-硝基吲哚、3-硝基吡咯、5-甲氧基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸、5-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、5-甲氧基羰基甲基-2-硫尿嘧啶、5-甲基氨甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-羧丙基)尿嘧啶、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N4-乙酰基胞嘧啶、2-硫代胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、N6-异戊基腺嘌呤、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、N-甲基鸟嘌呤或O-烷基化的碱基。其他嘌呤和嘧啶包括在美国专利号3,687,808中公开的那些、在Concise Encyclopedia Of Polymer Science AndEngineering，第858-859页，Kroschwitz,J.I.,ed.John Wiley&Sons,1990中公开的那些和Englisch等人，AngewandteChemie，国际版本，1991,30,613中公开的那些。
方法
本发明提供了用于在细胞中诱导I型干扰素应答的组合物和方法。本发明进一步提供了用于治疗疾病或障碍的组合物和方法，该疾病或障碍比如但不限于细菌、病毒或寄生虫感染、癌症、自身免疫疾病、炎性障碍和/或呼吸障碍。
在某些实施方式中，该方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的RIG-I激动剂。
本发明包括将核酸、载体和宿主细胞引入受试者的方法。引入核酸的物理方法包括注射含有核酸分子的溶液，轰击被核酸分子覆盖的粒子，将细胞或生物体浸入核酸分子的溶液中，或在存在核酸分子的情况下对细胞膜进行电穿孔。包装到病毒颗粒中的病毒构建体将完成表达构建体向细胞的有效引入和由表达构建体编码的RNA的转录。可以使用本领域已知的用于将核酸引入细胞的其他方法，比如脂质介导的载体转运，化学介导的转运例如磷酸钙等。因此，可以将核酸与执行以下一种或多种活性的组分一起引入：增强细胞对核酸的吸收、稳定双链体或以其他方式增加核酸分子的活性。
将核酸引入细胞的方法是本领域已知的。可以通过本领域的任何方法容易地将本发明的核酸分子引入宿主细胞中，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，可以通过物理、化学或生物学手段将核酸分子转移到宿主细胞中。
将核酸引入宿主细胞中的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包括载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域众所周知的。参见，例如，Sambrook等人，(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory,New York)。
用于将核酸引入宿主细胞中的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已成为将基因插入哺乳动物例如人细胞中的最广泛使用的方法。其他病毒载体可衍生自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等。参见，例如，美国专利号5,350,674和5,585,362。
用于将核酸引入宿主细胞的化学方法包括胶体分散系统，例如大分子络合物、纳米胶囊、微球、珠子和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。在体外和体内用作递送媒介物的示例性胶体系统是脂质体(例如人工膜囊泡)。
在某些情况下，核酸是经由聚合物递送媒介物递送的。例如，核酸分子可以与基于聚合物的胶束、胶囊、微颗粒、纳米颗粒等络合。然后可以将络合物体内、体外或离体与细胞接触，从而将核酸分子引入细胞。示例性的聚合物递送系统在本领域中是众所周知的(参见例如美国专利号6,013,240)。聚合物递送试剂是可商购的，包括可从Polyplus-transfection Inc(纽约，NY)获得的示例性试剂。
在使用非病毒递送系统的情况下，示例性的递送媒介物是脂质体。考虑使用脂质制剂将核酸引入宿主细胞(体外、离体或体内)。在另一方面中，核酸可以与脂质缔合。可以将与脂质缔合的核酸封装在脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂质双层中，并通过与脂质体和寡核苷酸都缔合的连接分子与脂质体连接，并包裹在脂质体中，与脂质体络合，分散在含有脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质组合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束络合，或以其他方式与脂质缔合。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体缔合的组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以双层结构、胶束或“塌陷(collapse)”结构存在。它们也可以简单地散布在溶液中，可能形成大小或形状不均匀的聚集体。脂质是可以是天然存在的或合成的脂质的脂肪物质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴以及包含长链脂族烃及其衍生物的一类化合物，比如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛。
适合使用的脂质可以从商业来源获得。例如，二肉豆蔻基磷脂酰胆碱(“DMPC”)可以获得自Sigma,St.Louis,MO；磷酸二鲸蜡酯(“DCP”)可以获得自K&K Laboratories(Plainview,NY)；胆固醇(“Chol”)可以获得自Calbiochem-Behring；二肉豆蔻基磷脂酰甘油(“DMPG”)和其他脂质可以获得自Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham,AL)。脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的储备溶液可在约-20℃下保存。氯仿用作唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是通用术语，其包含通过产生封闭的脂质双层或聚集体而形成的各种单层和多层脂质媒介物。脂质体的特征是具有带有磷脂质双层膜和内部水介质的囊泡结构。多层脂质体具有被水介质隔开的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中时，它们会自发形成。脂质组分在形成封闭结构之前经历了自我重排，并在脂质双层之间夹带水和溶解的溶质(Ghosh等人，1991Glycobiology 5:505-10)。然而，也包括在溶液中具有与正常囊泡结构不同的结构的组合物。例如，脂质可以采取胶束结构或仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。还考虑了脂质转染胺-核酸络合物。
不管使用哪种方法将核酸分子引入宿主细胞中或以其他方式使细胞暴露于本发明的分子，为了确认核酸在宿主细胞中的存在，可以进行多种测定。这样的测定包括例如本领域技术人员众所周知的“分子生物学”测定，例如DNA印记法和RNA印记法，RT-PCR和PCR。
可将本发明的核酸分子直接引入细胞中(即，细胞内)；或细胞外引入腔、胞间隙、生物体循环中、口服引入或可以通过将细胞或生物体浸入含有核酸分子的溶液中来引入。血管或血管外循环、血液或淋巴系统以及脑脊髓液是可以引入核酸分子的部位。
可替代地，可以使用本领域公认的技术将载体，例如编码本发明的核酸分子的转基因，工程化到宿主细胞或转基因动物中。
本发明提供了在细胞中诱导IFN应答的方法。例如，在某些实施方式中，该方法诱导I型IFN应答。I型IFN包括例如IFN-α、IFN-β、IFN-κ、IFN-δ、IFN-ε、IFN-τ、IFN-ω和IFN-ζ。本申请还提供了至少一种核酸分子用于在体外诱导肿瘤细胞凋亡的用途。
本发明提供了一种在细胞中刺激IFN应答，包括例如I型IFN应答的体外方法，该方法包括使细胞与至少一种本发明的核酸分子接触。
细胞可以从外源核酸(RNA或DNA)内源地和/或外源地表达PRR。外源DNA可以是质粒DNA、病毒载体或其部分。外源DNA可以整合到细胞的基因组中，或者可以在染色体外存在。细胞包括但不限于原代免疫细胞、原代非免疫细胞和细胞系。免疫细胞包括但不限于外周血单核细胞(PBMC)、浆细胞样树突细胞(PDC)、髓样树突细胞(MDC)、巨噬细胞、单核细胞、B细胞、天然杀伤细胞、粒细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞和NKT细胞。非免疫细胞包括但不限于成纤维细胞、内皮细胞、上皮细胞和肿瘤细胞。细胞系可源自免疫细胞或非免疫细胞。
本发明提供了诱导肿瘤细胞凋亡和/或死亡的体外方法，包括使肿瘤细胞与至少一种本发明的核酸分子接触。肿瘤细胞可以是从具有肿瘤或肿瘤细胞系的脊椎动物中新鲜分离的原代肿瘤细胞。
在某些实施方式中，本发明提供了诱导患者的IFN应答的预防和治疗方法。应当理解，如本文所使用的“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”定义为将治疗剂(例如，核酸分子)施加或施用到患者，或将治疗剂施加或施用到来自患者的离体组织或细胞系，该患者患有疾病或障碍、具有疾病或障碍的症状或对疾病或障碍具有易感性，目的是治疗、治愈、缓解、缓解、改变、补救、改良、改善或影响疾病或障碍、疾病或障碍的症状或对疾病的易感性。
在某些实施方式中，本申请提供了本发明的核酸分子的体内用途。在某些实施方式中，本申请提供了用于在脊椎动物，特别是哺乳动物中诱导IFN应答，包括例如I型IFN应答的至少一种本发明的核酸分子。本申请进一步提供了用于诱导脊椎动物，特别是哺乳动物中的肿瘤细胞凋亡的至少一种本发明的核酸分子。本申请另外提供了用于在医学和/或兽医实践中预防和/或治疗脊椎动物，特别是哺乳动物中的疾病和/或障碍的至少一种本发明的核酸分子。本发明还提供了用作疫苗佐剂的至少一种本发明的核酸分子。
此外，本申请提供了至少一种本发明的核酸分子用于制备在脊椎动物，特别是哺乳动物中诱导IFN应答，包括例如I型IFN应答的药物组合物的用途。本申请进一步提供了至少一种本发明的核酸分子用于制备在脊椎动物，特别是哺乳动物中诱导肿瘤细胞的凋亡和/或死亡的药物组合物的用途。本申请另外提供了在医学和/或兽医实践中至少一种本发明的核酸分子用于制备用于在脊椎动物，特别是哺乳动物中预防和/或治疗疾病和/或障碍的药物组合物的用途。
本发明包括使用核酸分子来预防和/或治疗任何疾病、障碍或病症，其中诱导IFN产生将是有益的。例如，通过本发明的核酸分子增加的IFN产生可能有益于预防或治疗各种障碍，包括但不限于癌症等。
肿瘤包括良性和恶性肿瘤(即，癌症)。癌症包括但不限于胆道癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠癌、子宫内膜癌、食管癌、胃癌、上皮内瘤、白血病、淋巴瘤、肝癌、肺癌、黑素瘤、骨髓瘤、成神经细胞瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、肉瘤、皮肤癌、睾丸癌、甲状腺癌和肾癌。
在某些实施方式中，癌症选自毛细胞白血病、慢性骨髓性白血病、皮肤T细胞白血病、慢性髓性白血病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、滤泡性淋巴瘤、恶性的黑素瘤、鳞状细胞癌、肾细胞癌、前列腺癌、膀胱细胞癌、乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肝细胞癌、基底细胞癌、结肠癌、宫颈异型增生和卡波西氏肉瘤(AIDS-相关的和AIDS无关的)。
在某些实施方式中，本发明的核酸分子与一种或多种药物活性剂组合使用，比如免疫刺激剂、抗病毒剂、抗生素、抗真菌剂、抗寄生虫剂、抗肿瘤剂、细胞因子、趋化因子、生长因子、抗血管生成因子、化疗剂、抗体和基因沉默剂。优选地，药学上活性剂选自免疫刺激剂、抗菌剂、抗病毒剂、消炎药和抗肿瘤剂。多于一种的药物活性剂可以属于相同或不同的类别。
在某些实施方式中，本发明的核酸分子与抗原和/或抗肿瘤疫苗组合使用，其中疫苗可以是预防性和/或治疗性的。核酸分子可以用作佐剂。
在另一个实施方式中，核酸与视黄酸(retinoic acid)和/或I型IFN(IFN-α和/或IFN-β)组合使用。不受任何理论束缚，视黄酸(retinoid acid)、IFN-α和/或IFN-β能够使细胞敏化，用于IFN-β产生，可能通过上调PRR表达进行。
在某些实施方式中，本发明的核酸分子与疾病和/或障碍比如肿瘤的一种或多种预防和/或治疗方法组合使用。治疗可以是药理的和/或物理的(例如，手术、放射)。
脊椎动物包括但不限于鱼、两栖动物、鸟和哺乳动物。哺乳动物包括但不限于大鼠、小鼠、猫、狗、马、绵羊、牛、母牛、猪、兔子、非人灵长类和人。在优选的实施方式中，哺乳动物是人。
施用/给药
施用方案可能会影响有效量的组成。可以在诊断疾病之前或之后将治疗制剂施用于受试者。此外，可以每天或相继施用数个分开的剂量以及交错剂量，或者该剂量可以连续输注，或者可以是推注。此外，治疗制剂的剂量可以根据治疗或预防情况的紧急程度成比例地增加或减少。
可以使用已知的方法，以有效预防或治疗疾病的剂量和时间段，将本发明的组合物施用至受试者，优选哺乳动物，更优选人。实现治疗效果所必需的治疗化合物的有效量可以根据以下因素变化，比如所采用的特定化合物的活性；施用时间；化合物的排泄速率；治疗的持续时间；与该化合物组合使用的其他药物、化合物或材料；所治疗的受试者的疾病或障碍的状态、年龄、性别、体重、病症、一般健康状况以及既往病史，以及医学领域众所周知的类似因素。可以调整剂量方案以提供最佳的治疗反应。例如，可以每天施用几次分开的剂量，或者可以根据治疗情况的紧急程度按比例减少剂量。本发明的治疗化合物的有效剂量范围的非限制性实例是每天约1至5,000mg/kg体重。本领域普通技术人员将能够研究相关因素并做出关于治疗化合物的有效量的决定，而无需过多实验。
该化合物可以每天几次被频繁地施用至受试者，或者它可以以较低频率施用，例如每天一次，每周一次，每两周一次，每月一次，或者甚至更不频繁地比如每几个月一次，或甚至每年一次或更低频率。应当理解，在非限制性实例中，每天给药的化合物的量可以每天、每隔一天、每2天、每3天、每4天或每5天施用一次。例如，每隔一天施用一次，则可以在星期一开始每天5mg剂量，随后在星期三开始每天5mg剂量，在星期五开始第二次每天5mg的第二个随后剂量，等等。剂量的频率对技术人员而言是显而易见的，并且将取决于许多因素，比如但不限于所治疗疾病的类型和严重程度、动物的类型和年龄等。
可以改变本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以便获得实现对于特定受试者、组合物和施用方式所需的治疗反应有效的，而对受试者无毒的活性成分的量。
具有本领域普通技术的医生，例如医师或兽医，可以容易地确定并开出所需的药物组合物的有效量。例如，医师或兽医可以以低于获得所需治疗效果所需的水平开始在药物组合物中使用的本发明化合物的剂量，并逐渐增加剂量直至获得所需效果。
在特定的实施方式中，以剂量单位形式配制化合物是特别有利的，以易于施用和剂量。如本文所使用的剂量单位形式是指适合作为待治疗受试者的单位剂量的物理上离散的单位；每个单位都包含预定量的治疗化合物，该化合物经计算可与所需的药物媒介物缔合以产生所需的治疗效果。本发明的剂量单位形式由以下支配并直接取决于：(a)治疗化合物的独特特征和要实现的特定治疗效果，以及(b)在复合/配制用于治疗受试者疾病的这种治疗化合物领域中固有的局限性。
用于施用的本发明的化合物可以在约1mg至约10,000mg、约20mg至约9,500mg、约40mg至约9,000mg、约75mg至约8,500mg、约150mg至约7,500mg、约200mg至约7,000mg、约3050mg至约6,000mg、约500mg至约5,000mg、约750mg至约4,000mg、约1mg至约3,000mg、约10mg至约2,500mg、约20mg至约2,000mg、约25mg至约1,500mg、约50mg至约1,000mg、约75mg至约900mg、约100mg至约800mg、约250mg至约750mg、约300mg至约600mg、约400mg至约500mg的范围内，和其间的任何和所有全部或部分增量。
在一些实施方式中，本发明的化合物的剂量为约1mg和约2,500mg。在一些实施方式中，用于本文描述的组合物中的本发明的化合物的剂量小于约10,000mg、或小于约8,000mg、或小于约6,000mg、或小于约5,000mg、或小于约3,000mg、或小于约2,000mg、或小于约1,000mg、或小于约500mg、或小于约200mg、或小于约50mg。类似地，在一些实施方式中，如本文描述的第二化合物(即，用于治疗与通过本发明的组合物治疗的相同或另一种疾病的药物)的剂量小于约1,000mg、或小于约800mg、或小于约600mg、或小于约500mg、或小于约400mg、或小于约300mg、或小于约200mg、或小于约100mg、或小于约50mg、或小于约40mg、或小于约30mg、或小于约25mg、或小于约20mg、或小于约15mg、或小于约10mg、或小于约5mg、或小于约2mg、或小于约1mg、或小于约0.5mg，和其任何和所有全部或部分增量。
在某些实施方式中，本发明涉及包装的药物组合物，其包括单独或与第二药剂组合地容纳治疗有效量的本发明的化合物或缀合物的容器；以及使用该化合物或缀合物治疗、预防或减轻受试者疾病的一种或多种症状的说明。
术语“容器(container)”包括用于容纳药物组合物的任何接受器(receptacle)。例如，在某些实施方式中，容器是包含药物组合物的包装。在其他实施方式中，容器不是包含药物组合物的包装，即，容器是接受器，例如包含包装的药物组合物或未包装的药物组合物以及药物组合物使用说明书的盒子或小瓶。此外，包装技术在本领域中是众所周知的。应当理解，药物组合物的使用说明书可以包含在含有药物组合物的包装上，并且因此这种说明与包装的产品形成增加的功能关系。然而，应该理解，说明书中可能包含有关该化合物执行其预期功能，例如治疗或预防受试者中的疾病或向受试者递送成像剂或诊断剂的能力的信息。
药物组合物
本发明提供了一种药物组合物，其包含至少一种本发明的核酸分子和药学上可接受的载体。本文描述的药物组合物的制剂可以通过药理学领域中已知的或以后开发的任何方法来制备。通常，这样的制备方法包括以下步骤：使活性成分与载体或一种或多种其他辅助成分结合，然后，如果必要或期望，将产品成型或包装成所需的单剂量或多剂量单元。
尽管本文提供的药物组合物的描述主要针对适合于对人类进行伦理施用的药物组合物，但是本领域技术人员应当理解，此类组合物通常适合于施用于各种动物。为了使组合物适合于向各种动物给药，适合于向人施用的药物组合物的修饰是众所周知的，并且如果有的话，普通技术的兽医药理师可以仅通过普通的实验来设计和执行这种修饰。考虑向其施用本发明的药物组合物的受试者包括但不限于人和其他灵长类动物，哺乳动物，包括与商业有关的哺乳动物，比如非人灵长类动物、牛、猪、马、绵羊、猫和狗。
可用于本发明方法中的药物组合物可以适于眼科、口服、直肠、阴道、肠胃外、局部、肺、鼻内、含氟或其他施用途径的制剂形式制备、包装或出售。其他考虑的制剂包括预计的纳米颗粒、脂质体制剂、含有活性成分的重新密封的红细胞和基于免疫学的制剂。
本发明的药物组合物可以作为单个单位剂量或作为多个单个单位剂量散装制备、包装或出售。如本文所使用的“单位剂量”是包括预定量的活性成分的药物组合物的离散量。活性成分的量通常等于将被施用于受试者的活性成分的剂量或该剂量的方便分数，例如该剂量的一半或三分之一。
本发明药物组合物中活性成分、药学上可接受的载体和任何其他成分的相对量将根据所治疗受试者的身份、体型和病症以及进一步根据组合物被施用的途径而变化。举例来说，组合物可以包括0.1％至100％(w/w)的活性成分。
除活性成分以外，本发明的药物组合物可进一步包括一种或多种另外的药物活性剂。可用于本发明的其他活性剂包括抗炎药，包括皮质类固醇和免疫抑制剂、化疗剂、抗生素、抗病毒剂、抗真菌剂等。
本发明药物组合物的控释或缓释制剂可以使用常规技术制备，例如使用配备有pH敏感域或蛋白酶可裂解片段的蛋白质。在某些情况下，待使用的剂型可以以缓释或控释其中使用例如羟丙基甲基纤维素、其他聚合物基质、凝胶、渗透膜、渗透系统、多层包衣、微颗粒、脂质体或微球或其组合的一种或多种活性成分提供，以提供不同比例的所需释放曲线。可以容易地选择本领域普通技术人员已知的合适的控释制剂，包括本文描述的那些，以与本发明的药物组合物一起使用。因此，本发明包括适于口服施用的单一单位剂型，比如适于控制释放的片剂、胶囊剂、凝胶胶囊和囊片。
在某些实施方式中，本发明的制剂可以是但不限于短期、快速偏移以及控制的例如缓释、延迟释放和脉动释放制剂。
术语缓释在其常规意义上是指可在延长的时间内逐渐释放药物的药物制剂，尽管不一定，但在可导致在延长的时间段内药物血液水平基本恒定。该时间段可以长达一个月或更长，并且释放时间应长于以弹丸形式施用的相同量的药剂。
为了进行缓释，可以将化合物与提供化合物缓释特性的合适的聚合物或疏水性材料一起配制。正因如此，用于本发明方法的化合物可以以微颗粒形式例如通过注射施用，或以晶片或圆盘形式通过植入施用。
在本发明的一个优选实施方式中，使用缓释制剂将本发明的化合物单独或与另一种药剂组合施用至受试者。
术语延迟释放在本文中以其常规含义使用，是指在药物施用后的一些延迟后提供药物的初始释放的药物制剂，并且尽管不是必须的，但可以包括从约10分钟直到大约12个小时的延迟。
术语脉动释放在本文中以其常规含义使用，是指以在药物施用后产生药物的脉冲血浆分布的方式提供药物释放的药物制剂。
术语立即释放以其常规含义使用，是指在药物施用后提供立即释放药物的药物制剂。
如本文使用的，短期指在药物施用后长达并且包括约8小时、约7小时、约6小时、约5小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1小时、约40分钟、约20分钟或约10分钟的任何时间段，和其任何或所有全部或部分增量。
如本文使用的，快速偏移指在药物施用后长达并且包括约8小时、约7小时、约6小时、约5小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1小时、约40分钟、约20分钟或约10分钟的任何时间段，和其任何和所有全部和部分增量。
如本文使用的，“附加成分”包括但不限于下述一种或多种：赋形剂；表面活性剂；分散剂；惰性稀释剂；制粒机和崩解剂；粘合剂；润滑剂；甜味剂；增味剂；着色剂；防腐剂；生理学上可降解的组合物比如明胶；水性媒介物和溶剂；油性媒介物和溶剂；悬浮剂；分散剂或湿润剂；乳化剂、缓和剂；缓冲液；盐；增稠剂；填充剂；乳化剂；抗氧化剂；抗生素；抗真菌剂；稳定剂；和药学上可接受的聚合或疏水的材料。可以包括在本发明的药物组合物中的其他“附加成分”在本领域是已知的，并且在例如Remington’s Pharmaceutical Sciences(1985,Genaro,ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA)中进行了描述，其通过引用并入本文。
本发明的任何组合物的施用途径包括口服、鼻、直肠、肠胃外、舌下、经皮、经粘膜(例如舌下、舌、(经)含服、(经)尿道、阴道(例如经阴道和阴道周围)、鼻(内)和(经)直肠)、膀胱内、肺内、十二指肠内、胃内、鞘内、皮下、肌内、皮内、动脉内、静脉内、支气管内、吸入和局部施用。
合适的组合物和剂型包括，例如，片剂、胶囊、囊片、丸剂、凝胶胶囊、锭剂、分散剂、悬浮剂、溶液、糖浆、颗粒剂、珠子、透皮贴剂、凝胶、散剂、丸剂、乳浆剂(magma)、糖锭、乳膏、糊剂、膏药、洗剂、盘片、栓剂、用于鼻腔或口服施用的液体喷雾剂、用于吸入的干粉或雾化制剂、用于膀胱内施用的组合物和制剂等。可用于本发明的制剂和组合物不限于本文描述的特定制剂和组合物。
如本文所使用的药物组合物的“肠胃外施用”包括特征在于受试者的组织的物理破坏和通过组织中的破坏的药物组合物的施用的任何施用途径。因此肠胃外施用包括但不限于通过注射组合物、通过手术切口施用组合物、通过穿透组织的非手术伤口施用组合物等来施用该药物组合物。特别地，肠胃外施用考虑包括但不限于眼内、玻璃体内、皮下、腹膜内、肌内、胸骨内注射、肿瘤内和肾脏透析输注技术。
适合于肠胃外施用的药物组合物的制剂包含与药学上可接受的载体例如无菌水或无菌等渗盐水组合的活性成分。这样的制剂可以适合于推注施用或连续施用的形式制备、包装或出售。可注射制剂可以单位剂型在例如含有防腐剂的安瓿或多剂量容器中制备、包装或出售。用于肠胃外施用的制剂包括但不限于混悬剂、溶液、在油性或水性媒介物中的乳剂、糊剂和可植入的缓释或可生物降解的制剂。这样的制剂可以进一步包含一种或多种附加成分，包括但不限于悬浮剂、稳定剂或分散剂。在用于肠胃外施用的制剂的某些实施方式中，以干燥(即粉末或颗粒)形式提供活性成分以用于与合适的媒介物(例如无菌无热原水)重构，然后在肠胃外施用重构的组合物。
试剂盒
如本文其他地方所描述，本发明还提供了刺激PRR活性、诱导IFN应答和/或治疗癌症的试剂盒。在某些实施方式中，试剂盒包括包含如本文其他地方所描述的核酸分子和另一种治疗剂的组合物，以及其使用说明书。说明书通常将包括关于试剂盒中组合物用于刺激PRR活性和/或治疗癌症的用途的信息。说明书可以直接印在试剂盒内的容器(如果有的话)上，或者作为施加到容器上的标签，或者作为印在容器内或与容器一起提供的单独的纸张、小册子、卡片或文件夹中。
本发明还提供了用于治疗或预防IFN产生有益的疾病、障碍或病症的试剂盒。在某些实施方式中，试剂盒包括包含如本文其他地方所描述的核酸分子和另一种治疗剂的组合物(例如药物组合物)，以及其使用说明书。说明书通常将包括关于在试剂盒中使用组合物用于治疗或预防疾病或障碍或其症状的信息。说明书可以直接印在试剂盒内的容器(如果有的话)上，或者作为施加到容器上的标签，或者作为印在容器内或与容器一起提供的单独的纸张、小册子、卡片或文件夹中。
仅使用常规实验，本领域技术人员将认识到或能够确定本文所述的具体过程、实施方式、权利要求和实施例的许多等同方案。这样的等同方案被认为在本发明的范围内，并由所附的权利要求书涵盖。例如，应该理解的是，本领域公认的替代方案并且仅使用常规实验的反应和/或治疗条件的改变在本申请的范围之内。
实验实施例
通过参考以下实验实施例进一步详细描述本发明。提供这些实施例仅出于说明的目的，除非另有说明，否则它们不意图构成限制。因此，本发明决不应解释为限于以下实施例，而是应解释为涵盖由于本文提供的教导而变得显而易见的任何和所有变型。
无需进一步描述，相信本领域普通技术人员可以使用前面的描述和下面的说明性实施例来制备和利用本发明的化合物并实践所要求保护的方法。因此，以下工作实施例具体指出了本发明的优选实施方式，并且不应解释为以任何方式限制本公开内容的其余部分。
国际专利申请公开号WO/2014/159990和美国专利申请公开号US 2016/0046942的公开内容通过引用以其整体并入本文。
实施例1：
研究了碱基序列、双链区段长度(即碱基对数)和环成分(identity)对SLR诱导干扰素应答的能力的影响。制备以下SLR并测试其抑制RIG-1活性的能力。在图3中图解了选择的SLR对HEK-293T细胞中的干扰素应答。
Figure BDA0003091904760000291
Figure BDA0003091904760000301
如图3中所证明的，与对照分子(SLR-14)相比，具有较短双链区段(8个碱基对；SLR-8)的SLR具有低的但可检测出的活性，并且当与SLR-14相比时，9个碱基对的SLR(SLR-9)具有降低的但可测量的活性。
还观察到，SLR的活性取决于双链区段中碱基的同一性和序列(例如，参见SLR-9GC与SLR-9，以及SLR-8GC与SLR-8)。
此外，实验表明，该环可以被无碱基核苷酸接头或非磷酸酯化接头(比如聚乙二醇)替代，而不会显著丧失活性(参见例如，SLR-14Ab5和SLR14S18分别与SLR-14相比)。在某些实施方式中，这种接头不是核酸酶的底物，并且因此在体外或体内更稳定。
实施例2：
研究了3’-突出端或5’-突出端的存在对SLR诱导干扰素应答能力的影响。如图4A-4B和5A-5D中所证明的，具有任何长度的5’-突出端的SLR基本上是无活性的。然而，具有单个3’-突出端核苷酸残基的SLR具有活性，而具有多个3’-突出端核苷酸残基的SLR具有降低的但是显著水平的活性。
列举的实施方式
提供了以下示例性实施方式，其编号不应解释为指定重要性等级。
实施方式1提供了能够诱导干扰素应答的聚核糖核酸(RNA)分子，其中所述RNA分子是单链的并且包括第一核苷酸序列，所述第一核酸序列的5’-端与接头的一端缀合，其中所述接头的另一端与第二核苷酸序列的3’-端缀合，其中所述接头不含核苷、核苷酸、脱氧核苷或脱氧核苷酸或其任何替代或修饰，其中所述第一核苷酸序列与所述第二核苷酸序列基本上互补，其中所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列可以杂交以形成双链区段，其中所述双链区段中的碱基对的数目为范围从8至20的整数，由此所述RNA分子形成发夹结构。
实施方式2提供了根据实施方式1所述的分子，其中所述接头不含磷酸酯主链或其任何替代或修饰。
实施方式3提供了根据实施方式1-2中任一项所述的分子，其中所述接头包括选自乙二醇基团、氨基酸和亚烷基链中的至少一种。
实施方式4提供了根据实施方式1-3中任一项所述的分子，其中所述接头包括-(OCH2CH2)n-，其中n为范围从1至10的整数。
实施方式5提供了根据实施方式1-4中任一项所述的分子，其中所述发夹具有钝性末端。
实施方式6提供了根据实施方式1-4中任一项所述的分子，其中所述发夹具有3’-突出端。
实施方式7提供了根据实施方式6所述的分子，其中所述突出端包括一个、两个或三个非碱基配对核苷酸。
实施方式8提供了根据实施方式1-7中任一项所述的分子，其中所述RNA分子包括选自5’-三磷酸酯和5’-二磷酸酯的5’-末端基团。
实施方式9提供了根据实施方式1-8中任一项所述的分子，其中所述RNA分子包括修饰的磷酸二酯主链。
实施方式10提供了根据实施方式1-9中任一项所述的分子，其中所述RNA分子包括至少一种2’-修饰的核苷酸。
实施方式11提供了根据实施方式10所述的分子，其中所述至少一种2’-修饰的核苷酸包括选自下列的修饰：2’-脱氧基、2’-脱氧基-2’-氟、2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、2’-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)和2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)。
实施方式12提供了根据实施方式1-11中任一项所述的分子，其中所述RNA分子包括至少一种修饰的磷酸酯基团。
实施方式13提供了根据实施方式1-12中任一项所述的分子，其中所述RNA分子包括至少一种修饰的碱基。
实施方式14提供了根据实施方式1-13中任一项所述的分子，其中所述双链区段包括一个或多个错配的碱基。
实施方式15提供了根据实施方式1-14中任一项所述的分子，其中所述RNA分子包括至少一种无碱基核苷酸。
实施方式16提供了能够诱导干扰素应答的聚核糖核酸(RNA)分子，其中所述RNA分子是单链的并且包括第一核苷酸序列，所述第一核酸序列的5’-端与选自环和接头的元件的一端缀合，其中所述元件的另一端与第二核苷酸序列的3’-端缀合，其中所述第一核苷酸序列与所述第二核苷酸序列基本上互补，其中所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列可以杂交以形成双链区段，其中所述双链区段中的碱基对的数目为范围从8至20的整数，由此所述RNA分子形成具有3’-突出端的发夹结构。
实施方式17提供了根据实施方式16所述的分子，其中所述突出端包括一个、两个或三个非碱基配对核苷酸。
实施方式18提供了根据实施方式16-17中任一项所述的分子，其中所述接头不含磷酸酯主链或其任何替代或修饰。
实施方式19提供了根据实施方式16-18中任一项所述的分子，其中所述接头包括选自乙二醇基团、氨基酸和亚烷基链中的至少一种。
实施方式20提供了根据实施方式16-19中任一项所述的分子，其中所述接头包括-(OCH2CH2)n-，其中n为范围从1至10的整数。
实施方式21提供了根据实施方式16-20中任一项所述的分子，其中所述RNA分子包括选自5’-三磷酸酯和5’-二磷酸酯的5’-末端基团。
实施方式22提供了根据实施方式16-21中任一项所述的分子，其中所述RNA分子包括修饰的磷酸二酯主链。
实施方式23提供了根据实施方式16-22中任一项所述的分子，其中所述RNA分子包括至少一种2’-修饰的核苷酸。
实施方式24提供了根据实施方式23所述的分子，其中所述至少一种2’-修饰的核苷酸包括选自下列的修饰：2’-脱氧基、2’-脱氧基-2’-氟、2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、2’-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)和2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)。
实施方式25提供了根据实施方式16-24中任一项所述的分子，其中所述RNA分子包括至少一种修饰的磷酸酯基团。
实施方式26提供了根据实施方式16-25中任一项所述的分子，其中所述RNA分子包括至少一种修饰的碱基。
实施方式27提供了根据实施方式16-26中任一项所述的分子，其中所述双链区段包括一个或多个错配的碱基。
实施方式28提供了根据实施方式16-27中任一项所述的分子，其中所述RNA分子包括至少一种无碱基核苷酸。
实施方式29提供了一种药物组合物，其包括至少一种根据实施方式1-28中任一项所述的分子。
实施方式30提供了根据实施方式29所述的药物组合物，进一步包括选自免疫刺激剂、抗原、抗病毒剂、抗菌剂、抗肿瘤剂、视黄酸、IFN-α和IFN-β的至少一种药剂。
实施方式31提供了在细胞中诱导I型干扰素应答的方法，所述方法包括使细胞与接触至少一种根据实施方式1-28中任一项所述的分子和/或至少一种根据实施方式29-30中任一项所述的药物组合物。
实施方式32提供了根据实施方式31所述的方法，其中所述细胞在受试者中。
实施方式33提供了一种通过在受试者的细胞中诱导I型干扰素应答在需要其的受试者中治疗疾病或障碍的方法，包括使细胞与至少一种根据实施方式1-28中任一项所述的分子和/或至少一种根据实施方式29-30中任一项所述的药物组合物接触。
实施方式34提供了根据实施方式33所述的方法，其中所述疾病或障碍选自细菌感染、病毒感染、寄生虫感染、癌症、自身免疫疾病、炎性障碍和呼吸障碍。
实施方式35提供了根据实施方式34所述的方法，其中所述癌症是选自乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病和肺癌的至少一种。
实施方式36提供了实施方式32-35中任一项所述的方法，其中所述分子被瘤内施用至受试者。
实施方式37提供了实施方式32-36中任一项所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
实施方式38提供了实施方式32-37中任一项所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
实施方式39提供了实施方式37-38中任一项所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
本文引用的每篇专利、专利申请和出版物的公开内容通过引用以其整体并入本文。尽管已经参考具体实施方式公开了本发明，但是显而易见的是，本领域的其他技术人员可以设计出本发明的其他实施方式和变型而不背离本发明的真实精神和范围。所附权利要求旨在被解释为包括所有这样的实施方式和等同变型。
序列表
<110> 耶鲁大学
A·M·派尔
O·费多罗瓦
<120> RIG-I激动剂及其使用方法
<130> 047162-7196WO1(00962)
<150> US 62/743,387
<151> 2018-10-09
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成的; 5'-ppp8L
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5'-三磷酸酯
<400> 1
ggcgcggcuu cggccgcgcc 20
<210> 2
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成的; SLR-8GC
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5'-三磷酸酯
<400> 2
ggcgcggguu cgcccgcgcc 20
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成的; SLR-9GC
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5'-三磷酸酯
<400> 3
ggcgccgggu ucgcccggcg cc 22
<210> 4
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成的; SLR-10
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5'-三磷酸酯
<400> 4
ggacguacgu uucgacguac gucc 24
<210> 5
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成的; SLR-8
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5'-三磷酸酯
<400> 5
ggcgacguuu cgacgucgcc 20
<210> 6
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成的; SLR-9
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5'-三磷酸酯
<400> 6
ggcguacguu ucgacguacg cc 22
<210> 7
<211> 32
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成的; SLR-14
<220>
<221> misc
<222> (1)..(1)
<223> 5'-三磷酸酯
<400> 7
ggaucgaucg aucguucgcg aucgaucgau cc 32
<210> 8
<211> 32
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成的; SLR-14T1
<220>
<221> misc
<222> (1)..(1)
<223> 5'-三磷酸酯
<400> 8
ggaucgaucg aucggaaccg aucgaucgau cc 32
<210> 9
<211> 31
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成的; SLR-14T2
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5'-三磷酸酯
<400> 9
ggaucgaucg aucgcuugcg aucgaucgau c 31
<210> 10
<211> 33
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成的; SLR-14U5
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5'-三磷酸酯
<400> 10
ggaucgaucg aucguuuuuc gaucgaucga ucc 33
<210> 11
<211> 35
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成的; SLR-14PH
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5'-三磷酸酯
<400> 11
ggaucgaucg aucgacaaug ccgaucgauc gaucc 35
<210> 12
<211> 33
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成的; SLR-14Ab5
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5'-三磷酸酯
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> 核糖核酸无碱基核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> 核糖核酸无碱基核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> 核糖核酸无碱基核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> 核糖核酸无碱基核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> 核糖核酸无碱基核苷酸
<400> 12
ggaucgaucg aucgnnnnnc gaucgaucga ucc 33
<210> 13
<211> 15
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成的; SLR-14S18 (5'-末端)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5'-三磷酸酯
<400> 13
ggaucgaucg aucgu 15
<210> 14
<211> 15
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成的; SLR-14S18 (3'-末端)
<400> 14
gcgaucgauc gaucc 15

Claims (39)

1.一种能够诱导干扰素应答的聚核糖核酸(RNA)分子，
其中所述RNA分子是单链的并且包括第一核苷酸序列，所述第一核酸序列的5’-端与接头的一端缀合，
其中所述接头的另一端与第二核苷酸序列的3’-端缀合，
其中所述接头不含核苷、核苷酸、脱氧核苷或脱氧核苷酸或其任何替代或修饰，
其中所述第一核苷酸序列与所述第二核苷酸序列基本上互补，
其中所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列可以杂交以形成双链区段，
其中所述双链区段中的碱基对的数目为范围从8至20的整数，
由此所述RNA分子形成发夹结构。
2.根据权利要求1所述的分子，其中所述接头不含磷酸酯主链或其任何替代或修饰。
3.根据权利要求1所述的分子，其中所述接头包括选自乙二醇基团、氨基酸和亚烷基链中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的分子，其中所述接头包括-(OCH2CH2)n-，其中n为范围从1至10的整数。
5.根据权利要求1所述的分子，其中所述发夹具有钝性末端。
6.根据权利要求1所述的分子，其中所述发夹具有3’-突出端。
7.根据权利要求6所述的分子，其中所述突出端包括一个、两个或三个非碱基配对核苷酸。
8.根据权利要求1所述的分子，其中所述RNA分子包括选自5’-三磷酸酯和5’-二磷酸酯的5’-末端基团。
9.根据权利要求1所述的分子，其中所述RNA分子包括修饰的磷酸二酯主链。
10.根据权利要求1所述的分子，其中所述RNA分子包括至少一种2’-修饰的核苷酸。
11.根据权利要求10所述的分子，其中所述至少一种2’-修饰的核苷酸包括选自下列的修饰：2’-脱氧基、2’-脱氧基-2’-氟、2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、2’-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)和2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)。
12.根据权利要求1所述的分子，其中所述RNA分子包括至少一种修饰的磷酸酯基团。
13.根据权利要求1所述的分子，其中所述RNA分子包括至少一种修饰的碱基。
14.根据权利要求1所述的分子，其中所述双链区段包括一个或多个错配的碱基。
15.根据权利要求1所述的分子，其中所述RNA分子包括至少一种无碱基核苷酸。
16.一种能够诱导干扰素应答的聚核糖核酸(RNA)分子，
其中所述RNA分子是单链的并且包括第一核苷酸序列，所述第一核酸序列的5’-端与选自环和接头的元件的一端缀合，
其中所述元件的另一端与第二核苷酸序列的3’-端缀合，
其中所述第一核苷酸序列与所述第二核苷酸序列基本上互补，
其中所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列可以杂交以形成双链区段，
其中所述双链区段中的碱基对的数目为范围从8至20的整数，
由此所述RNA分子形成具有3’-突出端的发夹结构。
17.根据权利要求16所述的分子，其中所述突出端包括一个、两个或三个非碱基配对核苷酸。
18.根据权利要求16所述的分子，其中所述接头不含磷酸酯主链或其任何替代或修饰。
19.根据权利要求16所述的分子，其中所述接头包括选自乙二醇基团、氨基酸和亚烷基链中的至少一种。
20.根据权利要求16所述的分子，其中所述接头包括-(OCH2CH2)n-，其中n为范围从1至10的整数。
21.根据权利要求16所述的分子，其中所述RNA分子包括选自5’-三磷酸酯和5’-二磷酸酯的5’-末端基团。
22.根据权利要求16所述的分子，其中所述RNA分子包括修饰的磷酸二酯主链。
23.根据权利要求16所述的分子，其中所述RNA分子包括至少一种2’-修饰的核苷酸。
24.根据权利要求23所述的分子，其中所述至少一种2’-修饰的核苷酸包括选自下列的修饰：2’-脱氧基、2’-脱氧基-2’-氟、2’-O-甲基、2’-O-甲氧基乙基(2’-O-MOE)、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)、2’-O-二甲基氨基乙基(2’-O-DMAOE)、2’-O-二甲基氨基丙基(2’-O-DMAP)、2’-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)和2’-O-N-甲基乙酰胺基(2’-O-NMA)。
25.根据权利要求16所述的分子，其中所述RNA分子包括至少一种修饰的磷酸酯基团。
26.根据权利要求16所述的分子，其中所述RNA分子包括至少一种修饰的碱基。
27.根据权利要求16所述的分子，其中所述双链区段包括一个或多个错配的碱基。
28.根据权利要求16所述的分子，其中所述RNA分子包括至少一种无碱基核苷酸。
29.一种药物组合物，其包括至少一种根据权利要求1或16所述的分子。
30.根据权利要求29所述的药物组合物，进一步包括选自免疫刺激剂、抗原、抗病毒剂、抗菌剂、抗肿瘤剂、视黄酸、IFN-α和IFN-β的至少一种药剂。
31.一种在细胞中诱导I型干扰素应答的方法，所述方法包括使所述细胞与至少一种根据权利要求1或16所述的分子接触。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述细胞在受试者中。
33.一种通过在受试者的细胞中诱导I型干扰素应答在需要其的所述受试者中治疗疾病或障碍的方法，包括使所述细胞与至少一种根据权利要求1或16所述的分子接触。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述疾病或障碍选自细菌感染、病毒感染、寄生虫感染、癌症、自身免疫疾病、炎性障碍和呼吸障碍。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述癌症是选自乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病和肺癌的至少一种。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述分子被瘤内施用至所述受试者。
37.根据权利要求32所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
38.根据权利要求33所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160046943A1 (en) * 2013-03-13 2016-02-18 Yale University Interferon Production Using Short RNA Duplexes

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9181551B2 (en) * 2002-02-20 2015-11-10 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
WO2004015075A2 (en) * 2002-08-08 2004-02-19 Dharmacon, Inc. Short interfering rnas having a hairpin structure containing a non-nucleotide loop

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160046943A1 (en) * 2013-03-13 2016-02-18 Yale University Interferon Production Using Short RNA Duplexes

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