CN113164425A - 用于治疗囊性纤维化的氨基酸组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了可用于增加囊性纤维化跨膜电导(CFTR)蛋白从特别是在上皮细胞中的细胞质易位到质膜的氨基酸组合物。还提供了用于增加CFTR在质膜中的浓度、增加氯离子转运和增加水转运的方法。这些组合物和方法可用于治疗在所述CFTR蛋白中携带一个或多个突变的受试者的囊性纤维化。这些组合物在治疗囊性纤维化和在制备用于治疗囊性纤维化的药剂中的用途也涵盖在本文中。

Description

用于治疗囊性纤维化的氨基酸组合物和方法
相关申请
本申请要求2018年10月30日提交的美国临时申请号62/752,847的优先权，所述申请出于所有目的以引用的方式并入本文。
序列表
本申请含有序列表，所述序列表以ASCII格式以电子方式提交并且由此以引用的方式整体并入。所述ASCII副本创建于2019年10月25日，名为174821-013301PCT_SL.txt并且大小为25,987字节。
技术领域
本文描述了可用于增加囊性纤维化跨膜电导(CFTR)蛋白从细胞质易位到质膜的氨基酸组合物。还提供了用于增加CFTR在质膜中的浓度、增加氯离子转运和增加水转运的方法。本文所述的组合物和方法可用于治疗在CFTR蛋白中携带一个或多个突变的受试者的囊性纤维化。这些组合物在治疗囊性纤维化和在制备用于治疗囊性纤维化的药剂中的用途也涵盖在本文中。
背景技术
囊性纤维化(CF)是由CFTR合成减少或缺乏、蛋白质错误折叠和/或通道功能障碍引起的遗传性隐性疾病，其导致气道、肠和胰腺上皮细胞中的氯分泌减少、钠吸收(ENaC)增加和体液稳态受损。CF是最常见的限制生命的遗传性病症，其可影响肺、肝、胰腺、肾和肠。囊性纤维化以常染色体隐性方式遗传，其中每个亲本在编码囊性纤维化跨膜电导(CFTR)蛋白的基因的至少一个等位基因中携带突变，导致每四个子代中就有一个携带两个突变的CFTR基因拷贝(例如，等位基因)。因此，到2岁时，超过75％的患者被诊断出患有囊性纤维化。1近年来，虽然患有囊性纤维化的人的预期寿命有所增加，但目前的中位生存年龄为约40岁。当前疗法通常涉及繁重的支持治疗，所述支持治疗被设计来管理增加的肺部感染风险和不良的营养状况。另外，虽然最近已经批准了治疗CF潜在遗传原因的小分子疗法，但这些疗法对最常见的CFTR突变Phe508del的效果最低，并且成本高昂，每位患者每年高达30万美元。2
虽然已在患有囊性纤维化的患者中鉴定出超过2,000个CFTR突变，但绝大多数囊性纤维化诊断仅表现出少数几个突变中的一个或多个。3最常见的突变Phe508del是缺失3个核苷酸，导致氨基酸苯丙氨酸(三字母代码：Phe，单字母代码：F)的单个密码子丢失。此突变造成缺陷的CFTR蛋白加工(例如折叠和运输到质膜)，从而导致几乎没有CFTR(参与离子和水跨细胞膜转运的氯离子转运蛋白)的膜表达。另外，成功易位到质膜的少量Phe508delCFTR通常是功能上缺陷的，其特征在于氯离子转运受损。一般来讲，CFTR突变造成跨膜的离子梯度失调，从而导致水从上皮细胞流出的渗透压降低，并表现为覆盖细胞的厚粘液层。营养丰富的厚粘液充当细菌(诸如绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))捕获和生长的最佳环境，所述细菌造成通常对抗生素无反应的持续感染。另外，许多CF患者还发展了其他肺部疾病，诸如支气管肺曲霉病和支气管扩张，从而导致发病率和死亡率增加。
虽然已经开发出针对由CFTR中的特定突变引起的囊性纤维化的靶向疗法，但许多疗法仅对具有某些CFTR突变的患者有效，并且已经报道了不良副作用。2一个实例是依伐卡托(ivacaftor)(VX-770，KAYLDECOTM)(CFTR的小分子增效剂)，4如描述于美国专利申请公布US 2014/0221424和国际专利申请号PCT/US2015/036691中。然而，依伐卡托针对在CFTR基因的至少一个等位基因上有错义突变Gly551Asp(G551D)的患者的CF治疗，其涵盖约4％至5％的患有CF的患者。5对于治疗囊性纤维化的疗法存在明确的未满足的需求，特别是对于携带最普遍的CFTR突变Phe508del CFTR的患者。
附图说明
图1A示出了对照(基础林格氏)溶液和各种单独的氨基酸(AA)在无C18时的苯扎米尔不敏感电流(μA)的图(n＝4)。
图1B示出了对照(基础林格氏)溶液和各种单独的AA在有C18时的苯扎米尔不敏感电流(μA)的图(n＝4)。
图2A示出了对照(基础林格氏)溶液和各种AA组合(CF2AA、CF3AA-2、CF4AA、CF4AA-2、CF5AA-3、CF4AA-3和CF4AA-4)在无C18时的苯扎米尔不敏感电流(μA)的图(n＝4)。
图2B示出了对照(基础林格氏)溶液、含DMSO的基础林格氏和各种AA组合(CF2AA、CF3AA-2、CF4AA、CF4AA-2、CF5AA-3、CF4AA-3和CF4AA-4)在有C18时的苯扎米尔不敏感电流(μA)的图(n＝4)。
图3A示出了对照(基础林格氏)溶液和各种单独的氨基酸(AA)在无C18时的苯扎米尔敏感电流(μA)的图(n＝4)。
图3B示出了对照(基础林格氏)溶液和各种单独的氨基酸(AA)在有C18时的苯扎米尔敏感电流(μA)的图(n＝4)。
图4A示出了对照(基础林格氏)溶液和各种AA组合(CF2AA、CF3AA-2、CF4AA、CF4AA-2、CF5AA-3、CF4AA-3和CF4AA-4)在无C18时的苯扎米尔敏感电流(μA)的图(n＝4)。
图4B示出了对照(基础林格氏)溶液、含DMSO的基础林格氏和各种AA组合(CF2AA、CF3AA-2、CF4AA、CF4AA-2、CF5AA-3、CF4AA-3和CF4AA-4)在有C18时的苯扎米尔敏感电流(μA)的图(n＝4)。
图5示出了描绘基础氯通量的图。浸于媒介物中的非刺激性CF细胞不分泌氯。然而，浸于CF-5AA-3中的CF细胞中氯分泌有显著增加(P<0.05；n＝7)。
图6示出了描绘基础氯通量的图。与非刺激性正常HBEC相比，浸于媒介物和CF-5AA-3中的非刺激性CF细胞具有显著更高的钠吸收(P<0.001；n＝6)。
图7A至图7F示出了描述阴离子电流和刺激性氯通量的图。图7A示出了与正常HBEC相比，浸于媒介物中的CF细胞的苯扎米尔不敏感电流(阴离子电流)显著更低，但CF-5AA-3使阴离子电流增加了>10倍(n＝4)。图7B示出了与媒介物相比，浸于CF-5AA-3中的CF细胞中的布美他尼敏感电流(氯电流)显著更高(n＝4)，但未达到正常HBEC的值。图7C、图7D、图7E和图7F：示出了浸于CF-5AA-3中的CF细胞具有显著更高的阴离子峰电流(图7E)和总氯分泌(图7F)，并且用FSK和GLPG1837刺激对AA存在下的增加值没有贡献(图7C、图7D)。
图8A和图8B示出了描绘ENaC活性和封闭的钠通量的图。图8A示出了与正常HBEC相比，浸于媒介物或CF-5AA-3中的CF细胞具有显著更高的ENaC活性(苯扎米尔敏感电流)，但与媒介物相比，浸于CF-5AA-3中的CF细胞中的ENaC活性显著更低(n＝4)。图8B相似地示出了CF细胞中的钠吸收显著增加，而浸于CF-5AA-3中的CF细胞中的钠吸收则适度降低(n＝7)。
图9示出了描绘所示AA制剂对CF细胞中ENaC活性的影响的图。与媒介物和CF-5AA-3相比，浸于CF-4AA-3中的CF细胞可进一步降低ENaC活性(n＝4)。
图10A和图10B呈现了描绘在毛喉素(forskolin)和增效剂存在的情况下，C18(校正剂；类似于鲁玛卡托(Lumacaftor))和/或VX661(校正剂；替扎卡托(tezacaftor))对CFTRΔF508细胞的影响的图。依伐卡托：GLPG1837(可逆增效剂)；Symdeko：VX661(替扎卡托)/C18。CF5AA-3比C18或Symdeko更大程度地增加电流。
图11示出了描绘在具有CFTRΔF508的原代HBEC中的36氯通量研究显示响应于CF-5AA-3的氯分泌增加的图。
图12呈现了示出CF5AA-3经由CFTR在具有CFTRΔF508的原代HBEC中增加阴离子电流的图。当与三重组合相比时，通过CF5AA-3的阴离子电流是显著更高的且持续的。
图13呈现了示出CF5AA-3经由Ano1增加阴离子电流的图。当与三重组合观察到的电流相比时，通过CF5AA-3的Ano1介导的电流是显著更高的且持续的。
图14呈现了示出CF5AA-3将顶端阴离子分泌增加到与所示的校正剂和增效剂相似的程度的图。
发明内容
所覆盖的实施方案由权利要求书而非本发明内容限定。本发明内容是对各个方面的高级概述，并引入了一些概念，这些概念将在下面的具体实施方式部分中进一步描述。本发明内容并不旨在鉴别所要求保护的主题的关键特征或本质特征，也不旨在单独用于确定所要求保护的主题的范围。应当通过参考整个说明书的适当部分、任何或所有附图以及每个权利要求来理解主题。
本公开认识到需要为囊性纤维化患者提供更具成本效益且更有效的治疗选择。本文所述的氨基酸组合物可特别可用于治疗在CFTR基因的等位基因上携带至少一个Phe508del突变的CF患者。当CFTR基因对于Phe508del突变是纯合的时，几乎没有CFTR被运输到质膜，这使得用CFTR增效剂(例如依伐卡托)的处理(其增强存在于质膜中的CFTR的功能)几乎无效。本公开提供了显示出增强野生型和Phe508del CFTR蛋白两者从细胞质易位到质膜的组合物。具体来说，本文所述的组合物在增加质膜上的突变CFTR蛋白的数量方面特别有效。此外，本文还提供了用于治疗存在CFTR功能障碍的疾病(例如囊性纤维化)的方法。
制剂–氨基酸
在第一方面，本发明提供了一种制剂，所述制剂包含：呈游离氨基酸的半胱氨酸和脯氨酸以及至少一种选自由甘氨酸、酪氨酸和赖氨酸组成的组的另外的游离氨基酸，前提条件是游离氨基酸中的至少一种为L-氨基酸。
在一个实施方案中，游离氨基酸为L-氨基酸。
在一个实施方案中，制剂不包含除半胱氨酸、脯氨酸以及至少一种选自由甘氨酸、酪氨酸和赖氨酸组成的组的另外的氨基酸以外的游离氨基酸。
在一个实施方案中，制剂基本上由以下组成：呈游离氨基酸的半胱氨酸和脯氨酸以及一种或多种选自由甘氨酸、酪氨酸和赖氨酸组成的组的另外的游离氨基酸，前提条件是游离氨基酸中的至少一种为L-氨基酸。
在一个实施方案中，制剂由以下组成：呈游离氨基酸的半胱氨酸和脯氨酸以及一种或多种选自由甘氨酸、酪氨酸和赖氨酸组成的组的另外的游离氨基酸，前提条件是游离氨基酸中的至少一种为L-氨基酸。
在一个实施方案中，制剂包含呈游离氨基酸的半胱氨酸、脯氨酸和甘氨酸以及任选的一种或多种选自由酪氨酸和赖氨酸组成的组的另外的游离氨基酸、由其组成或基本上由其组成，前提条件是游离氨基酸中的至少一种为L-氨基酸。
在一个实施方案中，制剂包含呈游离氨基酸的半胱氨酸、脯氨酸和甘氨酸、由其组成或基本上由其组成，前提条件是游离氨基酸中的至少一种为L-氨基酸，并且不含其他游离氨基酸。
在一个实施方案中，制剂包含呈游离氨基酸的半胱氨酸、脯氨酸和酪氨酸以及任选的一种或多种选自由甘氨酸和赖氨酸组成的组的另外的游离氨基酸、由其组成或基本上由其组成，前提条件是游离氨基酸中的至少一种为L-氨基酸。
在一个实施方案中，制剂包含呈游离氨基酸的半胱氨酸、脯氨酸和酪氨酸、由其组成或基本上由其组成，前提条件是游离氨基酸中的至少一种为L-氨基酸，并且不含其他游离氨基酸。
在一个实施方案中，制剂包含呈游离氨基酸的半胱氨酸、脯氨酸和赖氨酸以及任选的一种或多种选自由甘氨酸和酪氨酸组成的组的另外的游离氨基酸、由其组成或基本上由其组成，前提条件是游离氨基酸中的至少一种为L-氨基酸。
在一个实施方案中，制剂包含呈游离氨基酸的半胱氨酸、脯氨酸和赖氨酸、由其组成或基本上由其组成，前提条件是游离氨基酸中的至少一种为L-氨基酸，并且不含其他游离氨基酸。
在一个实施方案中，制剂包含呈游离氨基酸的半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸和酪氨酸、由其组成或基本上由其组成，并且任选地另外包含呈游离氨基酸的赖氨酸，前提条件是游离氨基酸中的至少一种为L-氨基酸。
在一个实施方案中，制剂包含呈游离氨基酸的半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸和酪氨酸、由其组成或基本上由其组成，前提条件是游离氨基酸中的至少一种为L-氨基酸，并且不含其他游离氨基酸。
在一个实施方案中，制剂包含呈游离氨基酸的半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸和赖氨酸、由其组成或基本上由其组成，并且任选地另外包含呈游离氨基酸的酪氨酸，前提条件是游离氨基酸中的至少一种为L-氨基酸。
在一个实施方案中，制剂包含呈游离氨基酸的半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸和赖氨酸、由其组成或基本上由其组成，前提条件是游离氨基酸中的至少一种为L-氨基酸，并且不含其他游离氨基酸。
在一个实施方案中，制剂包含呈游离氨基酸的半胱氨酸、脯氨酸、赖氨酸和酪氨酸、由其组成或基本上由其组成，并且任选地另外包含呈游离氨基酸的甘氨酸，前提条件是游离氨基酸中的至少一种为L-氨基酸。
在一个实施方案中，制剂包含呈游离氨基酸的半胱氨酸、脯氨酸、赖氨酸和酪氨酸、由其组成或基本上由其组成，前提条件是游离氨基酸中的至少一种为L-氨基酸，并且不含其他游离氨基酸。
在一个实施方案中，制剂包含呈游离氨基酸的半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸、酪氨酸和赖氨酸、由其组成或基本上由其组成，前提条件是游离氨基酸中的至少一种为L-氨基酸。
在一个实施方案中，制剂不包含其他游离氨基酸。
在第二方面，本发明提供了一种制剂，所述制剂包含：呈游离氨基酸的半胱氨酸和脯氨酸以及至少一种选自由甘氨酸、酪氨酸、赖氨酸和缬氨酸组成的组的另外的游离氨基酸，前提条件是游离氨基酸中的至少一种为L-氨基酸。
在第二方面的一个实施方案中，游离氨基酸为L-氨基酸。
在第二方面的一个实施方案中，制剂不包含除半胱氨酸、脯氨酸以及至少一种选自由甘氨酸、酪氨酸、赖氨酸和缬氨酸组成的组的另外的氨基酸以外的游离氨基酸。
在第二方面的一个实施方案中，制剂包含呈游离氨基酸的半胱氨酸、脯氨酸和缬氨酸、由其组成或基本上由其组成，前提条件是游离氨基酸中的至少一种为L-氨基酸。
在第二方面的一个实施方案中，制剂包含呈游离氨基酸的半胱氨酸、脯氨酸、缬氨酸和甘氨酸、由其组成或基本上由其组成，前提条件是游离氨基酸中的至少一种为L-氨基酸。
在第二方面的一个实施方案中，制剂包含呈游离氨基酸的半胱氨酸、脯氨酸、缬氨酸和酪氨酸、由其组成或基本上由其组成，前提条件是游离氨基酸中的至少一种为L-氨基酸。
在一个实施方案中，第二方面的制剂中的任一种不包含其他游离氨基酸。
制剂–赋形剂等
在一个实施方案中，制剂还包含水。
在一个实施方案中，制剂为药物制剂。
在一个实施方案中，制剂还包含药学上可接受的载剂、缓冲剂、电解质、佐剂或赋形剂。
在一个实施方案中，制剂为无菌的。
在一个实施方案中，制剂被配制用于通过肠、肺、吸入、鼻内或舌下途径施用。
在一个实施方案中，每种游离氨基酸以治疗有效量存在。
治疗方法
在另一方面，本发明提供了一种如上文所述的制剂，其用作药剂。
在本发明的一个实施方案中，如上文所述的制剂用于治疗囊性纤维化。
本发明还提供了如上文所述的制剂在制造用于治疗囊性纤维化的药剂中的用途。
在另一方面，本发明提供了一种用于治疗患有囊性纤维化的受试者的方法，所述方法包括向患有囊性纤维化的受试者施用如上文所述的制剂，其中所述施用减轻囊性纤维化的至少一种症状。
在一个实施方案中，患有囊性纤维化的受试者表达野生型CFTR。在一个实施方案中，受试者在CFTR基因中具有突变。在一个实施方案中，受试者表达野生型CFTR和突变型CFTR。在一个实施方案中，受试者患有囊性纤维化，其中存在与野生型CFTR的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一的CFTR蛋白，其中野生型CFTR序列包含SEQ ID NO:1。在一个实施方案中，CFTR中的突变包含Gly542X、Gly551Asp、Arg553X、Arg117His、120del23、Phe508del或其组合，其中X为任何氨基酸。在一个实施方案中，CFTR为Phe508del CFTR突变体。
在一个实施方案中，如上文所述的制剂与另外的治疗剂组合使用。
在一个实施方案中，另外的治疗剂包括小分子药物、蛋白质药物、核酸药物或其组合中的至少一种。在一个实施方案中，另外的治疗剂为CFTR增效剂、CFTR校正剂、CFTR通读剂或其组合中的至少一种。在一个实施方案中，另外的治疗剂为CFTR增效剂。在一个实施方案中，CFTR增效剂为依伐卡托。
本发明的其他方面
在本发明的另一方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含：如上文所述的药物制剂；以及用于向受试者施用或使生物样品与制剂接触的说明书。
在本发明的另一方面，提供了一种用于增加存在于至少一个细胞的质膜上的囊性纤维化跨膜电导调节因子(CFTR)蛋白的数量的方法，所述方法包括：使所述至少一个细胞与有效量的如上文所述的药物制剂接触，其中所述接触促进CFTR的折叠或CFTR向质膜的转运中的至少一项，从而增加存在于细胞质膜上的CFTR蛋白的数量。
在一个实施方案中，质膜上的野生型CFTR蛋白的数量增加。在一个实施方案中，质膜上的突变型CFTR蛋白的数量增加。在一个实施方案中，与质膜上的野生型CFTR氨基酸序列至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一的CFTR蛋白的数量增加，其中野生型CFTR包含SEQ ID NO:1。在一个实施方案中，CFTR蛋白中的一个或多个包含Gly542X、Gly551Asp、Arg553X、Arg117His、120del23、Phe508del或其组合，其中X为任何氨基酸。在一个实施方案中，CFTR蛋白中的一个或多个包含Phe508del突变。在一个实施方案中，通过从细胞排出的氯离子的增加来检测存在于细胞质膜上的CFTR蛋白数量的增加。在一个实施方案中，存在于细胞质膜上的CFTR蛋白数量的增加与从细胞排出的水的增加有关。在一个实施方案中，细胞为上皮细胞。在一个实施方案中，上皮细胞为肺上皮细胞。在一个实施方案中，肺上皮细胞为支气管上皮细胞。在一个实施方案中，从患有囊性纤维化的受试者中分离出支气管上皮细胞。
在一个特定的方面，提供了一种药物制剂，所述药物制剂包含：治疗有效量的呈游离氨基酸的半胱氨酸和脯氨酸以及治疗有效量的至少一种由甘氨酸、酪氨酸或赖氨酸组成的组的另外的游离氨基酸，前提条件是游离氨基酸中的至少一种为L-氨基酸，其中药物制剂基本上由半胱氨酸、脯氨酸和至少一种另外的游离氨基酸组成。
在药物制剂的特定实施方案中，游离氨基酸为L-氨基酸。在另一个特定的实施方案中，药物制剂还包含水。在另一个特定的实施方案中，药物制剂还包含药学上可接受的载剂、缓冲剂、电解质、佐剂或赋形剂。在另一个特定的实施方案中，药物制剂为无菌的。在另一个特定的实施方案中，药物制剂被配制用于通过肠、肺、吸入、鼻内或舌下途径施用。
在药物制剂的一个特定实施方案中，药物制剂包含治疗有效量的呈游离氨基酸的半胱氨酸和脯氨酸以及治疗有效量的至少一种由甘氨酸、酪氨酸或赖氨酸组成的组的另外的游离氨基酸、基本上由其组成或由其组成，并且不含其他游离氨基酸。所述氨基酸的组合包括例如：半胱氨酸、脯氨酸和甘氨酸；半胱氨酸、脯氨酸和酪氨酸；半胱氨酸、脯氨酸和赖氨酸；半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸和酪氨酸；半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸和赖氨酸；半胱氨酸、脯氨酸、酪氨酸和赖氨酸；以及半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸、酪氨酸和赖氨酸。
在药物制剂的另一个特定实施方案中，药物制剂包含治疗有效量的呈游离氨基酸的半胱氨酸和脯氨酸以及治疗有效量的至少一种由甘氨酸、酪氨酸、赖氨酸或缬氨酸组成的组的另外的游离氨基酸、基本上由其组成或由其组成，并且不含其他游离氨基酸。所述氨基酸的组合包括例如：半胱氨酸、脯氨酸和缬氨酸；半胱氨酸、脯氨酸、缬氨酸和甘氨酸；以及半胱氨酸、脯氨酸、缬氨酸和酪氨酸。
在药物制剂的另一个特定实施方案中，药物制剂包含治疗有效量的呈游离氨基酸的半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸、酪氨酸和赖氨酸中的每个，并且不含其他游离氨基酸。在药物制剂的另一个特定实施方案中，药物制剂基本上由治疗有效量的呈游离氨基酸的半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸、酪氨酸和赖氨酸中的每个组成或由其组成。
在特定的实施方案中，药物制剂用于疗法中。在更特定的实施方案中，药物制剂用于治疗囊性纤维化。在另一个特定的实施方案中，药物制剂用于制造用于治疗囊性纤维化的药剂。
在另一方面，提供了一种用于治疗患有囊性纤维化的受试者的方法，所述方法包括向患有囊性纤维化的受试者施用本文所述的药物制剂，其中所述施用减轻囊性纤维化的至少一种症状。在方法的一个特定实施方案中，受试者表达野生型CFTR。在另一个特定的实施方案中，受试者在CFTR基因中具有突变。在另一个特定的实施方案中，受试者表达野生型CFTR和突变型CFTR。在另一个特定的实施方案中，受试者患有囊性纤维化，其中存在与野生型CFTR的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一的CFTR蛋白，其中野生型CFTR序列包含SEQ ID NO:1。在另一个特定的实施方案中，CFTR中的突变包含Gly542X、Gly551Asp、Arg553X、Arg117His、120del23、Phe508del或其组合，其中X为任何氨基酸。在另一个特定的实施方案中，CFTR为Phe508del CFTR突变体。在方法的另一个特定实施方案中，所述方法还包括施用另外的治疗剂。在方法的另一个特定实施方案中，另外的治疗剂包括小分子药物、蛋白质药物、核酸药物或其组合中的至少一种。在方法的另一个特定实施方案中，另外的治疗剂为CFTR增效剂、CFTR校正剂、CFTR通读剂或其组合中的至少一种。在方法的另一个特定实施方案中，另外的治疗剂为CFTR增效剂。在方法的另一个特定实施方案中，CFTR增效剂为依伐卡托。
在方法的一个特定实施方案中，药物制剂包含治疗有效量的呈游离氨基酸的半胱氨酸和脯氨酸以及治疗有效量的至少一种由甘氨酸、酪氨酸或赖氨酸组成的组的另外的游离氨基酸、基本上由其组成或由其组成，并且不含其他游离氨基酸。所述氨基酸的组合包括例如：半胱氨酸、脯氨酸和甘氨酸；半胱氨酸、脯氨酸和酪氨酸；半胱氨酸、脯氨酸和赖氨酸；半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸和酪氨酸；半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸和赖氨酸；半胱氨酸、脯氨酸、酪氨酸和赖氨酸；以及半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸、酪氨酸和赖氨酸。
在方法的另一个特定实施方案中，药物制剂包含治疗有效量的呈游离氨基酸的半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸、酪氨酸和赖氨酸中的每个，并且不含其他游离氨基酸。在方法的另一个特定实施方案中，药物制剂基本上由治疗有效量的呈游离氨基酸的半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸、酪氨酸和赖氨酸中的每个组成或由其组成。
在另一方面，提供了一种用于增加存在于至少一个细胞的质膜上的囊性纤维化跨膜电导调节因子(CFTR)蛋白的数量的方法，所述方法包括：使所述至少一个细胞与有效量的本文所述的药物制剂接触，其中所述接触促进CFTR的折叠或CFTR向质膜的转运中的至少一项，从而增加存在于细胞质膜上的CFTR蛋白的数量。在方法的一个特定实施方案中，质膜上的野生型CFTR蛋白的数量增加。在方法的另一个特定实施方案中，质膜上的突变型CFTR蛋白的数量增加。在方法的另一个特定实施方案中，与质膜上的野生型CFTR氨基酸序列至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一的CFTR蛋白的数量增加，其中野生型CFTR包含SEQ ID NO:1。在方法的另一个特定实施方案中，CFTR蛋白中的一个或多个包含Gly542X、Gly551Asp、Arg553X、Arg117His、120del23、Phe508del或其组合，其中X为任何氨基酸。在方法的另一个特定实施方案中，CFTR蛋白中的一个或多个包含Phe508del突变。在方法的另一个特定实施方案中，通过从细胞排出的氯离子的增加来检测存在于细胞质膜上的CFTR蛋白数量的增加。在方法的另一个特定实施方案中，存在于细胞质膜上的CFTR蛋白数量的增加与从细胞排出的水的增加有关。在方法的另一个特定实施方案中，细胞为上皮细胞。在方法的一个更特定的实施方案中，上皮细胞为肺上皮细胞。在方法的仍更特定的实施方案中，肺上皮细胞为支气管上皮细胞。在方法的另一个特定实施方案中，从患有囊性纤维化的受试者中分离出支气管上皮细胞，并且对此类细胞进行的体外测定的结果提供了关于哪些治疗剂和/或其组合将赋予分离出细胞的受试者以治疗功效的指导。在方法的另一个特定实施方案中，所述方法还包括施用另外的治疗剂。在方法的另一个特定实施方案中，另外的治疗剂包括小分子药物、蛋白质药物、核酸药物或其组合中的至少一种。在方法的另一个特定实施方案中，另外的治疗剂为CFTR增效剂、CFTR校正剂、CFTR通读剂或其组合中的至少一种。在方法的另一个特定实施方案中，另外的治疗剂为CFTR增效剂。在方法的另一个特定实施方案中，CFTR增效剂为依伐卡托。
在方法的一个特定实施方案中，药物制剂包含治疗有效量的呈游离氨基酸的半胱氨酸和脯氨酸以及治疗有效量的至少一种由甘氨酸、酪氨酸或赖氨酸组成的组的另外的游离氨基酸、基本上由其组成或由其组成，并且不含其他游离氨基酸。所述氨基酸的组合包括例如：半胱氨酸、脯氨酸和甘氨酸；半胱氨酸、脯氨酸和酪氨酸；半胱氨酸、脯氨酸和赖氨酸；半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸和酪氨酸；半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸和赖氨酸；半胱氨酸、脯氨酸、酪氨酸和赖氨酸；以及半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸、酪氨酸和赖氨酸。
在方法的另一个特定实施方案中，药物制剂包含治疗有效量的呈游离氨基酸的半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸、酪氨酸和赖氨酸中的每个，并且不含其他游离氨基酸。在方法的另一个特定实施方案中，药物制剂基本上由治疗有效量的呈游离氨基酸的半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸、酪氨酸和赖氨酸中的每个组成或由其组成。
在另一个特定的实施方案中，提供了一种试剂盒，其包含：药物制剂，所述药物制剂包含呈游离氨基酸的半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸、酪氨酸和赖氨酸、基本上由其组成或由其组成；以及用于向受试者施用或使生物样品与组合物接触的说明书。
在另一方面，本公开提供了用于治疗囊性纤维化的组合物，所述组合物包含半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸、酪氨酸和赖氨酸、基本上由其组成或由其组成。在另一方面，本发明提供了氨基酸组合物在治疗有此需要的受试者的囊性纤维化中的用途。在另一方面，本发明提供了氨基酸组合物在制备用于治疗有此需要的受试者的囊性纤维化的药剂中的用途。
在一个方面，本公开提供了组合物，所述组合物包含半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸、酪氨酸和赖氨酸、基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，氨基酸为L-氨基酸。在某些实施方案中，组合物还包含水。在另一方面，组合物还包含药学上可接受的载剂、缓冲剂、电解质、佐剂或赋形剂。在某些实施方案中，组合物为无菌的。在另一方面，组合物被配制用于通过肠、肺、吸入、鼻内或舌下途径施用。
在某些实施方案中，受试者患有囊性纤维化，其中存在野生型CFTR。在一个方面，受试者在CFTR基因中具有突变。在另一方面，受试者患有囊性纤维化，其中野生型和突变型CFTR同时存在。在又另一方面，受试者患有囊性纤维化，其中存在与由SEQ ID NO:1提供的野生型CFTR的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一的CFTR蛋白。在仍其他方面，CFTR为Gly542X、Gly551Asp、Arg553X、Arg117His、120del23或Phe508del CFTR突变体，其中X为任何氨基酸。在某些实施方案中，CFTR为Phe508del CFTR突变体。
本文还提供了用于增加存在于细胞质膜上的囊性纤维化跨膜电导调节因子(CFTR)蛋白的数量的方法，所述方法包括使细胞与有效量的组合物接触，所述组合物包含半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸、酪氨酸和赖氨酸、基本上由其组成或由其组成。在某些方面，有效量增加存在于细胞质膜上的CFTR蛋白的数量。在其他方面，质膜上的野生型CFTR蛋白的数量增加。在仍其他方面，质膜上的突变型CFTR蛋白的数量增加。在某些方面，质膜上与由SEQ ID NO:1提供的野生型CFTR氨基酸序列至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一的CFTR蛋白的数量增加。在一些实施方案中，CFTR蛋白中的一个或多个为Gly542X、Gly551Asp、Arg553X、Arg117His、120del23或Phe508del突变体，其中X为任何氨基酸。在其他实施方案中，CFTR蛋白中的一个或多个为Phe508del CFTR突变体。在某些实施方案中，从细胞排出的氯离子增加。在其他实施方案中，从细胞排出的水增加。在其他实施方案中，细胞为上皮细胞。在某些实施方案中，上皮细胞为肺上皮细胞。在一些实施方案中，肺上皮细胞为支气管上皮细胞。在其他实施方案中，从患有囊性纤维化的受试者获得支气管上皮细胞。细胞可为体外、体内或离体的。
在某些方面，本文提供的方法还包括施用另外的治疗剂。在某些实施方案中，另外的治疗剂为小分子药物、蛋白质药物或核酸药物。在某些实施方案中，另外的治疗剂为小分子药物。在其他实施方案中，另外的治疗剂为CFTR增效剂、校正剂或通读剂。在其他实施方案中，另外的治疗剂为CFTR增效剂。在一些方面，CFTR增效剂为依伐卡托。在某些实施方案中，另外的治疗剂为CFTR校正剂。在某些实施方案中，CFTR校正剂为鲁玛卡托。另外的治疗剂可包括在本文所述的任何组合物中(例如，所述组合物还包含另外的治疗剂)。可在施用本文所述的任何组合物(例如，组合疗法)的同时、之前或之后施用另外的治疗剂。
在另一方面，本公开提供了一种用于治疗囊性纤维化的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用本文所述的组合物，其中组合物被配制用于通过肠、
肺、吸入、鼻内或舌下途径施用。在某些实施方案中，组合物被配制用于经肺施用于受试者。在某些实施方案中，组合物被配制用于肠施用于受试者。在某些实施方案中，组合物被配制用于经口施用于受试者。
在另一方面，本公开提供了一种用于治疗囊性纤维化的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用本文所述的组合物。在某些实施方案中，受试者患有囊性纤维化，其中受试者在CFTR基因中具有突变。在某些实施方案中，受试者患有囊性纤维化，其中受试者对于野生型CFTR和突变型CFTR为杂合的。在某些实施方案中，受试者患有囊性纤维化，其中受试者对于第一突变型CFTR和第二突变型CFTR为杂合的(例如，其中突变是不同的)。在某些实施方案中，受试者患有囊性纤维化，其中受试者对于突变型CFTR为纯合的(例如，两个等位基因具有相同的突变)。在某些实施方案中，受试者患有囊性纤维化，其中受试者对于野生型CFTR为纯合的(例如，两个等位基因均未突变)。在某些实施方案中，突变型CFTR为Gly542X、Gly551Asp、Arg553X、Arg117His、120del23或Phe508del CFTR突变体，其中X为任何氨基酸。在某些实施方案中，突变型CFTR为Phe508del CFTR突变体。在某些实施方案中，存在于受试者中的CFTR蛋白与由SEQ ID NO:1提供的野生型CFTR的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一。在某些实施方案中，存在于受试者中的CFTR蛋白与由SEQ ID NO:2提供的Phe508del CFTR的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一。
关于各种疾病(包括囊性纤维化和相关肺部疾病)的诊断和治疗信息见于Longo,D.等人(编),Harrison's Principles of Internal Medicine,第18版；McGraw-HillProfessional,2011中。关于各种治疗剂和人疾病(包括肺部疾病)的信息见于Brunton,L.等人(编)Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics,第12版,McGraw Hill,2010和/或Katzung,B.(编)Basic and Clinical Pharmacology,McGraw-Hill/Appleton&Lange；第11版(2009年7月)中。本文提及的所有专利、专利申请、书籍、论文、文件、数据库、网站、出版物、参考文献等以引用的方式整体并入。在本说明书与任何并入的参考文献之间存在冲突的情况下，以本说明书(包括其任何修改)为准。申请人保留基于例如任何并入的材料修改本说明书和/或纠正明显错误的权利。所并入的材料的任何内容均不限制本发明。除非另外指出，否则本文使用术语标准的本领域公认的意义。本文使用各种术语的标准缩写。
在某些方面，本文提供的组合物包含选自半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸、酪氨酸和赖氨酸中的一种或多种游离氨基酸、基本上由其组成或由其组成，并且不含其他游离氨基酸。
本文还提供了组合物在治疗有此需要的受试者的囊性纤维化中的用途，其中所述组合物包含半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸、酪氨酸和赖氨酸。
本文还提供了试剂盒，其包含组合物，所述组合物包含半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸、酪氨酸和赖氨酸、基本上由其组成或由其组成；以及用于向受试者施用或使生物样品与组合物接触的说明书。
设想了单独描述的实施方案的所有组合。
如下所述，在某些实施方案的详细描述中阐述了本发明的某些实施方案的细节。从定义、实施例、附图和权利要求中，本发明的其他特征、目的以及优点将会显而易见。
定义
为方便起见，本文收集了与本公开中使用的各种术语有关的描述和某些信息。
本文所用的术语“剂”是指任何物质、化合物(例如分子)、超分子复合物、材料或其组合或混合物。化合物可为可以由化学式、化学结构或序列表示的任何剂。剂的实例包括例如小分子、多肽、核酸(例如，RNAi剂、反义寡核苷酸、适体)、脂质、多糖等。一般来讲，可使用本领域已知的任何合适的方法来获得剂。普通技术人员将基于例如剂的性质来选择适当的方法。剂可至少部分纯化。在一些实施方案中，剂可作为组合物的一部分提供，除了所述剂外，组合物还可包含例如抗衡离子、水性或非水性稀释剂或载剂、缓冲剂、防腐剂或其他成分。在一些实施方案中，剂可作为盐、酯、水合物或溶剂化物提供。在一些实施方案中，剂在例如细胞吸收的典型剂的范围内为细胞可渗透的，并且在细胞内(例如在哺乳动物细胞内)起作用以产生生物效应。某些化合物可以特定的几何或立体异构形式存在。除非另外指出，否则本公开将此类化合物(包括顺式和反式异构体、E-和Z-异构体、R-和S-对映异构体、非对映异构体、(D)-异构体、(L)-异构体、(-)-和(+)-异构体、其外消旋混合物及其其他混合物)涵盖在各种实施方案中。
某些化合物可以多种或质子化状态存在、可具有多种构型、可作为溶剂化物[例如，与水(即水合物)或常见溶剂]存在且/或可具有不同的结晶形式(例如，多晶型物)或不同的互变异构形式。在适用的情况下，本公开涵盖表现出此类替代的质子化状态、构型、溶剂化物和形式的实施方案。术语“剂”还可涵盖“治疗剂”。术语“化合物”与“剂”可互换使用。
例如，当根据选定的施用形式、途径和/或方案递送到细胞或生物体时，剂(或含有此种剂的组合物)的“有效量”或“有效剂量”是指足以实现所需生物和/或药理作用的量。短语“有效量”与“治疗有效量”可互换使用。如本领域普通技术人员将理解的，有效的特定剂或组合物的绝对量可根据诸如所需的生物或药理终点、要递送的剂、靶组织等因素而变化。本领域普通技术人员将进一步理解，在各种实施方案中，“有效量”可与细胞接触或以单个剂量或通过使用多个剂量施用于受试者。在某些实施方案中，有效量为增加CFTR运输到细胞质膜的量。在某些实施方案中，有效量为增加CFTR从细胞质易位到细胞质膜的量。在某些实施方案中，有效量为增加氯离子从细胞中的排出的量。在某些实施方案中，有效量为增加水从细胞中的排出的量。在某些实施方案中，有效量为减轻肺部疾病的症状和/或治疗肺部疾病的量。在某些实施方案中，有效量为减轻囊性纤维化的症状和/或治疗囊性纤维化的量。
如本文所用，术语“基本上由...组成”将成分和步骤的范围限制为指定材料或步骤以及不会实质性地影响本发明的一个或多个基本且新颖的特征的那些材料或步骤，例如，用于治疗囊性纤维化的组合物及其用途以及用于治疗囊性纤维化的方法。例如，通过使用“基本上由...组成”，治疗组合物不含任何未指定的成分，包括但不限于游离氨基酸、二肽、寡肽或多肽或蛋白质；以及对囊性纤维化的治疗具有直接的有利或不利治疗作用的单糖、双糖、寡糖、多糖和碳水化合物。此外，通过使用术语“基本上由...组成”，组合物可包含对囊性纤维化的治疗没有治疗作用的物质；此类成分包括不影响肺上皮的健康或功能的载剂、赋形剂、佐剂、调味剂等。
本文中使用关于一个或多个要素的诸如“包含”、“具有”、“包括”或“含有”的术语的任何方面或实施方案的描述旨在为类似方面或实施方案“由一个或多个特定要素组成”、“基本上由一个或多个特定要素组成”或“大体上包含”一个或多个特定要素提供支持，除非另外说明或与上下文明显矛盾(例如，本文中描述为包含特定要素的组合物应理解为也描述由该要素组成的组合物，除非另外说明或与上下文明显矛盾)。
术语“基因”是指包含核苷酸的DNA的基因座(例如，区域)。通常，基因含有多个区域，包括启动转录通常所需的一个或多个上游或下游调控序列(例如，增强子/沉默子、启动子、5'非编码序列、3'非编码序列)、包含一个或多个外显子和一个或多个内含子的开放阅读框。“外显子”是将编码最终成熟RNA的一部分的基因的任何部分，所述最终成熟RNA的一部分将被翻译成蛋白质序列。“内含子”是在最终成熟RNA的成熟期间通过RNA剪接去除的基因的任何部分。“隐匿外显子”是可将翻译提前终止密码子引入到成熟RNA中或导致非典型剪接模式的外显子。术语“基因”可指表达蛋白质的核酸片段，包括在编码序列之前(5'非编码序列)和之后(3'非编码序列)的调控序列。“天然基因”是指见于自然界中的具有其自身调控序列的基因。因此，嵌合基因或嵌合构建体可包含衍生自不同来源的调控序列和编码序列、或衍生自同一来源但以与自然界中所见不同的方式排列的调控序列和编码序列。“内源基因”是指在生物体基因组中其天然位置的天然基因。“外来”基因是指通常不见于宿主生物体中，但通过基因转移被引入到宿主生物体中的基因。外来基因可包括插入非天然生物体中的天然基因或嵌合基因。
术语“基因产物”(在本文中也称为“基因表达产物”或“表达产物”)包括由基因表达产生的产物，诸如从基因中转录的RNA和由这种RNA的翻译产生的多肽。应当理解，某些基因产物可例如在细胞中进行加工或修饰。例如，可将RNA转录物在mRNA翻译之前剪接、聚腺苷酸化等，且/或多肽可经历共翻译或翻译后加工，诸如去除分泌信号序列、去除细胞器靶向序列、或诸如磷酸化、脂肪酰化等的修饰。术语“基因产物”涵盖此类加工或修饰的形式。来自包括人的多种物种的基因组、mRNA、多肽序列是本领域已知的，并且可在公众可访问的数据库中获得，所述数据库诸如国家生物技术信息中心(www.ncbi.nih.gov)或通用蛋白质资源(www.uniprot.org)。
数据库包括例如，GenBank、RefSeq、Gene、UniProtKB/SwissProt、UniProtKB/Trembl等。一般来讲，NCBI参考序列数据库中的序列(例如，mRNA和多肽序列)可用作感兴趣的基因的基因产物序列。应当理解，基因的多个等位基因可存在于相同物种的个体之间。例如，编码特定蛋白质的核酸的一个或多个核苷酸中的差异(例如，多至约1％、2％、3％至5％的核苷酸)可能存在于给定物种的个体之间。由于遗传密码的简并性，尽管可能存在导致编码蛋白质的序列改变的DNA多态性，但此类变异通常不会改变所编码的氨基酸序列。多态变体的实例可见于例如单核苷酸多态性数据库(dbSNP)中，所述数据库可获自NCBI网站www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/[Sherry,S.T.等人(2001)dbSNP:The NCBIdatabase of genetic variation.Nucl Acids Res,29:308–311；Kitts,
A.和Sherry,S.(2009)The single nucleotide polymorphism database(dbSNP)of nucleotide sequence variation。于：The NCBI Handbook(Internet)；McEntyre,J.,Ostell,J.,编者Bethesda(MD):National Center for Biotechnology Information(US)；2002(www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi？book＝handbook&part＝ch5)]中。某些蛋白质的多个同种型可能例如由于替代的RNA剪接或编辑而存在。一般来讲，在本公开的方面涉及基因或基因产物的情况下，除非另外指出，否则如果适用，涵盖涉及等位基因变体或同种型的实施方案。某些实施方案可针对一个或多个特定序列，例如一个或多个特定等位基因或一个或多个同种型。
术语“氨基酸”涵盖所有已知的氨基酸，其包含胺(-NH2)官能团、羧基(-COOH)官能团和每个氨基酸所特有的侧链(“R”)基团。“氨基酸”涵盖由人基因组编码的21种氨基酸(即蛋白原性氨基酸)、由细菌或单细胞生物体编码或产生的氨基酸以及天然来源的氨基酸。为了本公开的目的，除非另外说明，否则具有碱性侧链的氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)的共轭酸形式或具有酸性侧链的氨基酸(天冬氨酸和谷氨酸)的共轭碱形式基本相同。“氨基酸”还涵盖就增强本发明组合物的效果(例如，增加质膜中CFTR蛋白的数量、增加氯离子从细胞的排出、治疗囊性纤维化)而言保持大体相同或更好的活性的其衍生物。衍生物可为例如对映异构体，并且包括氨基酸的D-形式和L-形式。衍生物可为“天然”或“非天然”氨基酸(例如，硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸、碘化酪氨酸、正亮氨酸或正缬氨酸)的衍生物(例如，β-氨基酸、高氨基酸、脯氨酸衍生物、丙酮酸衍生物、3-取代的丙氨酸衍生物、甘氨酸衍生物、环取代的酪氨酸衍生物、环取代的苯丙氨酸衍生物、线性核心氨基酸和N-甲基氨基酸)。其他氨基酸衍生物包括但不限于通过例如氨基酸的酰化、甲基化、糖基化和/或卤化来合成的那些。这些包括例如β-甲基氨基酸、C-甲基氨基酸和N-甲基氨基酸。本文所述的氨基酸可以游离氨基酸的形式存在。术语“游离氨基酸”是指并非肽或多肽的一部分的氨基酸(例如，不通过肽键与另一个氨基酸连接)。游离氨基酸在溶液中呈游离的，但可与溶液中的盐或其他组分缔合。
术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”在本文中可互换地使用，并且是指通过肽(酰胺)键连接在一起的氨基酸残基的聚合物。所述术语是指任何大小、结构或功能的蛋白质、肽或多肽。通常，蛋白质、肽或多肽的长度为至少三个氨基酸。蛋白质、肽或多肽可指单个蛋白质或蛋白质的集合。蛋白质、肽或多肽中的氨基酸中的一个或多个可例如通过添加化学实体来修饰，所述化学实体诸如碳水化合物基团、羟基、磷酸酯基团、法呢基、异法呢基、脂肪酸基团、用于缀合、官能化或其他修饰的接头等。蛋白质、肽或多肽也可为单分子或可为多分子复合物。在一些实施方案中，蛋白质包含同二聚体或异二聚体。蛋白质、肽或多肽可以仅仅是天然存在的蛋白质或肽的片段。蛋白质、肽或多肽可为天然存在的、重组的或合成的或其任何组合。蛋白质可包含不同的结构域，例如核酸结合结构域(例如，指导蛋白质与靶位点结合的Cas9的gRNA结合结构域)和核酸裂解结构域。在一些实施方案中，蛋白质包含蛋白质部分(例如构成核酸结合结构域的氨基酸序列)和有机化合物(例如可充当核酸裂解剂的化合物)。在一些实施方案中，蛋白质与核酸(例如RNA)复合或缔合。在一些实施方案中，蛋白质包含配体结合结构域。在一些实施方案中，蛋白质包含活性位点(例如，生物或酶活性的位点)。在一些实施方案中，蛋白质包含变构位点(例如，可结合可以远离活性位点的配体的蛋白质位点)。本文提供的任何蛋白质可通过本领域已知的任何方法产生。例如，本文提供的蛋白质可通过重组蛋白表达和纯化产生，这特别适合于包含肽接头的融合蛋白。用于重组蛋白表达和纯化的方法是众所周知的，并且包括由Green和Sambrook,MolecularCloning:A Laboratory Manual[第4版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.(2012)]描述的那些，其全部内容以引用的方式并入本文。
“同一性”或“同一性百分比”是两个或更多个核酸或多肽的序列相同程度的度量。感兴趣的序列A与第二序列B之间的同一性百分比可通过以下步骤来计算：比对序列，允许引入缺口来最大化同一性，确定与相同残基相对的残基(核苷酸或氨基酸)的数量，除以TGA和TGB的最小值(此处TGA和TGB是比对中序列A和B中的残基数量和内部缺口位置数量的总和)，并乘以100。当计算达到特定同一性百分比所需的相同残基数量时，小数应四舍五入至最接近的整数。序列可使用本领域已知的多种计算机程序来比对。例如，可使用诸如BLAST2、BLASTN、BLASTP、Gapped BLAST等计算机程序来生成比对和/或获得同一性百分比。如Karlin和Altschul,Proc Natl Acad Sci USA,90:5873-5877,1993中所修改的Karlin和Altschul的算法(Karlin和Altschul,Proc Natl Acad Sci USA,87:22264-2268,1990)被并入Altschul等人[Altschul等人(1990)J Mol Biol,215:403-410]的NBLAST和XBLAST程序中。在一些实施方案中，为了获得用于比较目的的缺口比对，使用Gapped BLAST，如Altschul等人[Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res,25:3389-3402]中所描述。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可使用相应程序的默认参数。参见具有URL的网站www.ncbi.nlm.nih.gov和/或McGinnis,S.和Madden,TL,W20–W25 Nucleic AcidsResearch,2004,第32卷,Web server issue。其他合适的程序包括CLUSTALW[Thompson,J.D.,Higgins,D.G.和Gibson,T.J.(1994)Nuc Acid Res,22:4673-4680]、CLUSTAL Omega[Sievers,F.,Wilm,A.,Dineen,D.等人(2011)Fast,scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega.Mol SysBiol,7:doi:10.1038/msb.2011.75]以及GAP(GCG版本9.1；其实现了Needleman&Wunsch,1970年算法[Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.(1970)J.Mol Biol,48:443-453])。可在评估窗口上评估同一性百分比。在一些实施方案中，评估窗口的长度可为所比较序列的最短序列长度的至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多，例如100％。在一些实施方案中，评估窗口为至少100；200；300；400；500；600；700；800；900；1,000；1,200；1,500；2,000；2,500；3,000；3,500；4,000；4,500或5,000个氨基酸。在一些实施方案中，评估窗口上的任一序列或两个序列中不超过20％、10％、5％或1％的位置被缺口占据。在一些实施方案中，任一序列或两个序列中不超过20％、10％、5％或1％的位置被缺口占据。
特定多肽或多核苷酸的“变体”相对于多肽或多核苷酸(其可分别称为“原始多肽”或“原始多核苷酸”)具有一个或多个添加、取代和/或缺失。添加可为插入或可在任一末端处。变体可比原始多肽或多核苷酸短或长。术语“变体”涵盖“片段”。“片段”是比原始多肽短的多肽或多核苷酸的连续部分。在一些实施方案中，变体包含片段或由片段组成。在一些实施方案中，片段或变体的长度为原始多肽或多核苷酸的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更长。片段可为N端、C端或内部片段。在一些实施方案中，变体多肽包含原始多肽的至少一个结构域或由其组成。在一些实施方案中，变体多肽或多核苷酸包含在序列上与原始多肽或多核苷酸至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一的多肽或多核苷酸或由其组成。在一些实施方案中，变体多肽或多核苷酸包含超过原始多肽或多核苷酸的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的多肽或多核苷酸或由其组成。在一些实施方案中，变体多肽的序列包含相对于原始序列具有N个氨基酸差异的序列或由其组成，其中N为原始多肽中氨基酸数量的至多1％、2％、5％或10％的任何整数，其中“氨基酸差异”是指氨基酸的取代、插入或缺失。在一些实施方案中，取代为保守取代。可例如基于所涉及残基的侧链大小、极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性进行保守取代。在一些实施方案中，可根据表A进行保守取代，其中在第二列的同一框中和在第三列的同一行中的氨基酸可在保守取代中彼此取代。某些保守取代是用第二列中同一框内的第三列另一行的氨基酸取代第三列中与第二列中的框相对应的一行中的氨基酸。
表A
Figure BDA0003084976600000261
在一些实施方案中，脯氨酸(P)、半胱氨酸(C)或这两者均被认为是在单独的组中。在特定的组内，某些取代在某些实施方案中可能是特别感兴趣的，例如，亮氨酸被异亮氨酸替换(或反之亦然)、丝氨酸被苏氨酸替换(或反之亦然)或丙氨酸被甘氨酸替换(或反之亦然)。
在一些实施方案中，变体是生物活性变体，即，所述变体至少部分地保留原始多肽或多核苷酸的至少一种活性。在一些实施方案中，变体至少部分地保留原始多肽或多核苷酸的一种以上或大体上所有已知的生物学重要活性。活性可为例如催化活性、结合活性、执行或参与生物结构或过程的能力等。在一些实施方案中，变体的活性可为原始多肽或多核苷酸活性的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多，在各种实施方案中，高达原始多肽或多核苷酸活性的大约100％、大约125％或大约150％。在一些实施方案中，变体(例如生物活性变体)包含与原始多肽至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％同一或超过原始多肽的至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或100％的多肽或由其组成。在一些实施方案中，例如在功能变体中的改变(例如取代或缺失)不改变或缺失已知或预测对于活性重要的氨基酸或核苷酸，例如已知或预测的催化残基或涉及结合底物或辅因子的残基。可在一个或多个合适的测定中测试变体以评估活性。
如本文所用，术语“小分子”为质量小于约2千道尔顿(kDa)的有机分子。在一些实施方案中，小分子小于约1.5kDa或小于约1kDa。在一些实施方案中，小分子小于约800道尔顿(Da)、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da或100Da。通常，小分子的质量为至少50Da。在一些实施方案中，小分子为非聚合的。在一些实施方案中，小分子不是氨基酸。在一些实施方案中，小分子不是核苷酸。在一些实施方案中，小分子不是糖类。在一些实施方案中，小分子含有多个碳-碳键并且可包含一个或多个杂原子和/或对于与蛋白质的结构相互作用(例如氢键结合)重要的一个或多个官能团，例如胺、羰基、羟基或羧基，并且在一些实施方案中，包含至少两个官能团。小分子通常包含一个或多个环状碳或杂环结构和/或芳族或多芳族结构，任选地被上述官能团中的一个或多个取代。在某些实施方案中，小分子为治疗活性剂，诸如药物(例如，如联邦法规(C.F.R.)中所提供的，由美国食品与药物管理局批准的分子)。小分子还可与一个或多个金属原子和/或金属离子络合。在此情况下，小分子也被称为“有机金属小分子”。优选的小分子具有生物活性，因为它们在动物(优选哺乳动物，更优选人)中产生生物作用。小分子包括但不限于放射性核素和显像剂。在某些实施方案中，小分子为药物。优选地，尽管不是必须的，药物是被适当的政府机构或监管机构认为在人或动物中安全且有效的药物。例如，批准用于人的药物由FDA列于21C.F.R.§§330.5、331至361和440至460中，其以引用的方式并入本文。根据本发明，所有列出的药物都被认为是可接受的。
术语“组合物”与“制剂”可互换使用。
术语“施用(administer、administering或administration)”是指在受试者体内或之上植入、吸收、摄取、注射、吸入或以其他方式引入本文所述的化合物或其组合物。
在各种实施方案中，“受试者”可为任何脊椎动物。受试者可为个体，向其施用例如出于实验、诊断和/或治疗目的的剂或从其获得样品或在其上执行程序。在一些实施方案中，受试者为哺乳动物，例如人、非人灵长类动物或啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、兔子)。可从所公开的治疗方法中受益的哺乳动物物种包括但不限于猿、黑猩猩、猩猩、人、猴子；家养动物，诸如狗、猫；牲畜，诸如马、牛、猪、绵羊、山羊、鸡；以及动物诸如小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠。在某些实施方案中，受试者为人。人可具有任一性别，并且可能处于发育的任何阶段。在某些实施方案中，受试者已被诊断患有囊性纤维化。在某些实施方案中，受试者已被诊断患有由CFTR突变引起的囊性纤维化。在某些实施方案中，受试者已被诊断患有由Phe508delCFTR突变引起的囊性纤维化。
人CF的动物模型是本领域已知的并且在本文中描述。参见例如实施例4。也参见Grubb等人(Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 290:L270–L277,2006)；McCarron等人(Respiratory Research 19:54,2018)；和Lavelle等人(BioMed Research International2016卷,文章编号5258727,14页)，其各自的全部内容以引用的方式并入本文。例如，Lavelle等人描述了CF的小鼠和猪模型。
如本文在治疗受试者的上下文中使用的“治疗(Treat、treatment、treating)”和类似术语是指提供受试者的医学和/或外科管理。治疗可包括但不限于向受试者施用剂或组合物(例如，药物组合物)。如本文所用，术语“治疗”或其任何语法变型(例如治疗(treat、treating和treatment)等)包括但不限于减轻疾病或病状的症状；和/或减少、压制、抑制、减轻或影响疾病或病状的进展、严重程度和/或范围。
治疗效果还可包括降低疾病发生或复发的可能性或减轻疾病的一种或多种症状或表现。可向患有疾病或相对于一般群体的成员处于发展疾病的风险提高的受试者施用治疗剂。在一些实施方案中，可将治疗剂施用于已患有疾病但不再显示出疾病证据的受试者。可施用剂以例如降低疾病复发的可能性。可预防性地，即在疾病的任何症状或表现发展之前施用治疗剂。
“预防性治疗”是指为未发展疾病或未显示疾病证据的受试者提供医学和/或外科管理，以例如降低疾病发生的可能性或降低疾病发生的严重程度。受试者可能已被鉴定为处于发展疾病的风险(例如，相对于一般群体处于提高的风险下，或具有增加发展疾病的可能性的风险因素下)中。
如本文所用，术语“改善”或其任何语法变型(例如改善(ameliorate、ameliorating和amelioration)等)包括但不限于延迟疾病或病状(例如囊性纤维化或其并发症)的发作或降低所述疾病或病状的严重程度。如本文所用，改善并不需要完全没有症状。
术语“病状”、“疾病”和“病症”可互换使用。
本文所述的化合物的“有效量”是指足以引起所需生物反应的量。在某些实施方案中，有效量为足以增加氯离子转运的量。在某些实施方案中，有效量为足以调节(例如，增强)囊性纤维化跨膜电导调节因子(CFTR)蛋白(例如，野生型CFTR或突变型CFTR)的功能的量。在某些实施方案中，有效量为足以调节(例如，增强)Phe508del CFTR的功能的量。在某些实施方案中，有效量为增加CFTR从细胞质易位到质膜的量。本文所述的化合物的有效量可根据诸如所需生物终点、化合物的药代动力学、所治疗的病状、施用方式以及受试者的年龄和健康等因素而变化。在某些实施方案中，有效量为治疗有效量。在某些实施方案中，有效量为预防性治疗。在某些实施方案中，有效量为单个剂量中本文所述化合物的量。在某些实施方案中，有效量为多剂量中本文所述化合物的组合量。
本文所述的化合物的“治疗有效量”是足以在病状的治疗中提供治疗益处或足以延迟或最小化与病状相关的一种或多种症状的量。化合物的治疗有效量意指治疗剂单独或与其他疗法组合时在病状的治疗中提供治疗益处的量。术语“治疗有效量”可包括改善整体疗法、减少或避免病状的症状、体征或病因和/或增强另一种治疗剂的治疗功效的量。在某些实施方案中，治疗有效量为足以增加氯离子转运(例如，增加氯从上皮细胞排出)的量。在某些实施方案中，治疗有效量为足以增加水转运(例如，增加水从上皮细胞排出)的量。在某些实施方案中，治疗有效量为足以调节(例如，增强)囊性纤维化跨膜电导调节因子(CFTR)蛋白(例如，野生型CFTR或突变型CFTR)的功能的量。在某些实施方案中，治疗有效量为足以调节(例如，增强)Phe508del CFTR的功能的量。在某些实施方案中，治疗有效量为增加CFTR从细胞质易位到质膜的量。在某些实施方案中，治疗有效量为足以治疗肺部疾病的量。在某些实施方案中，治疗有效量为足以治疗囊性纤维化的量。
如本文所用，术语“盐”是指任何和所有盐，并且包括药学上可接受的盐。
术语“载剂”可指与本公开组合物一起施用的任何稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。合适的药物载剂的实例描述于Remington’s Essentials of Pharmaceuticals,第21版,Felton编,2012中，其以引用的方式并入本文。
示例性稀释剂包括碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸钠乳糖、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、山梨醇、肌醇、氯化钠、干淀粉、玉米淀粉、糖粉及其混合物。
用于制造所提供的药物组合物的药学上可接受的赋形剂包括惰性稀释剂、分散剂和/或成粒剂、表面活性剂和/或乳化剂、崩解剂、结合剂、防腐剂、缓冲剂、润滑剂和/或油。赋形剂诸如可可脂和栓剂蜡、着色剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂也可存在于组合物中。包含达到有效量所需的氨基酸的组合物的确切量将因受试者而异，这取决于例如受试者的物种、年龄和一般状况、副作用或病症的严重程度、特定化合物的特征、施用方式等。有效量可包括在单个剂量(例如，单次口服剂量)或多个剂量(例如，多次口服剂量)中。在某些实施方案中，当将多个剂量施用给受试者或应用于组织或细胞时，多个剂量中的任何两个剂量包括不同或大体相同量的本文所述的化合物。在某些实施方案中，当将多个剂量施用给受试者或应用于组织或细胞时，向受试者施用多个剂量或向组织或细胞应用多个剂量的频率为每天三个剂量、每天两个剂量、每天一个剂量、每隔一天一个剂量、每三天一个剂量、每周一个剂量、每两周一个剂量、每三周一个剂量或每四周一个剂量。在某些实施方案中，向受试者施用多个剂量或向组织或细胞应用多个剂量的频率为每天一个剂量。在某些实施方案中，向受试者施用多个剂量或向组织或细胞应用多个剂量的频率为每天两个剂量。在某些实施方案中，向受试者施用多个剂量或向组织或细胞应用多个剂量的频率为每天三个剂量。在某些实施方案中，当将多个剂量施用给受试者或应用于组织或细胞时，多个剂量的第一剂与最后一剂之间的持续时间为一天、两天、四天、一周、两周、三周、一个月、两个月、三个月、四个月、六个月、九个月、一年、两年、三年、四年、五年、七年、十年、十五年、二十年或受试者、组织或细胞的寿命。在某些实施方案中，多个剂量的第一剂与最后一剂之间的持续时间为三个月、六个月或一年。在某些实施方案中，多个剂量的第一剂与最后一剂之间的持续时间为受试者、组织或细胞的寿命。在某些实施方案中，本文所述的剂量(例如，单个剂量或多个剂量的任一剂量)独立地包括介于0.1μg与1μg之间、0.001mg与0.01mg之间、0.01mg与0.1mg之间、0.1mg与1mg之间、1mg与3mg之间、3mg与10mg之间、10mg与30mg之间、30mg与100mg之间、100mg与300mg之间、300mg与1,000mg之间或1g与10g之间(包括端值)的包含本文所述的氨基酸的组合物。在某些实施方案中，本文所述的剂量独立地包括介于1mg与3mg之间(包括端值)的包含本文所述的氨基酸的组合物。在某些实施方案中，本文所述的剂量独立地包括介于3mg与10mg之间(包括端值)的包含本文所述的氨基酸的组合物。在某些实施方案中，本文所述的剂量独立地包括介于10mg与30mg之间(包括端值)的包含本文所述的氨基酸的组合物。在某些实施方案中，本文所述的剂量独立地包括介于30mg与100mg之间(包括端值)的包含本文所述的氨基酸的组合物。
如本文所述的剂量范围为将所提供的药物组合物施用于成人提供指导。施用于例如儿童或青少年的量可由医学从业者或本领域技术人员确定，并且可小于或等于施用于成人的量。
组合物可在施用可用作例如组合疗法的一种或多种另外的药剂或治疗剂的同时、之前或之后施用。药剂包括治疗活性剂。
药剂还包括预防活性剂。药剂包括有机小分子，诸如药物化合物(例如，如联邦法规(CFR)中所提供的，由美国食品与药物管理局批准的用于人或兽医用途的化合物)、肽、蛋白质、碳水化合物、单糖、寡糖、多糖、核蛋白、粘蛋白、脂蛋白、合成多肽或蛋白质、连接到蛋白质的小分子、糖蛋白、类固醇、核酸、DNA、RNA、核苷酸、核苷、寡核苷酸、反义寡核苷酸、脂质、激素、维生素和细胞。在某些实施方案中，另外的药剂为可用于治疗和/或预防疾病(例如，增生性疾病、肺部疾病、胃肠道疾病、血液疾病、神经疾病、疼痛病状、精神病症或代谢病症)的药剂。在某些实施方案中，另外的治疗剂为可用于治疗肺部疾病的剂。
在某些实施方案中，另外的治疗剂为可用于治疗囊性纤维化的剂。在某些实施方案中，可用于治疗囊性纤维化的剂可为依伐卡托
Figure BDA0003084976600000331
鲁玛卡托
Figure BDA0003084976600000332
阿塔鲁伦(ataluren)或替扎卡托。在某些实施方案中，另外的治疗剂为依伐卡托。在某些实施方案中，另外的治疗剂为鲁玛卡托。在某些实施方案中，另外的治疗剂为可用于治疗囊性纤维化、管理与囊性纤维化相关的症状或用于治疗与囊性纤维化同时发生的疾病或感染(例如，细菌感染、病毒感染、细支气管炎、哮喘等)的剂。可用于本公开目的的另外的治疗剂包括但不限于全身性阿法链道酶(dornase alfa systemic)(Pulmozyme)、阿奇霉素(azithromycin)(例如，Zithromax、Zmax)、氨曲南(Aztreonam)(Cayston、Azactam)、妥布霉素(tobramycin)(例如，
Figure BDA0003084976600000333
Nebcin、Bethkis、Kitabis Pak、TOBIPodhaler)、阿米卡星(Amikin)、胰脂肪酶(Creon、Zenpep、Pancreaze、Viokase、Pertzye、Ultresa、Pangestyme EC、Panocaps)、庆大霉素(Garamycin)和胰酶。每种另外的药剂可以针对该药剂确定的剂量和/或时间表施用。另外的药剂也可彼此一起施用和/或与本文所述的化合物或组合物以单个剂量一起施用或以不同剂量单独施用。方案中采用的特定组合将考虑本文所述化合物与另外的一种或多种药剂的相容性和/或要达到的所需治疗和/或预防效果。一般来讲，期望以不超过单独使用它们时的水平的水平组合使用另外的一种或多种药剂。在一些实施方案中，组合使用的水平将低于单独使用的水平。在某些实施方案中，本文所述的化合物或药物组合物可与抗癌疗法组合施用，所述抗癌疗法包括但不限于手术、放射疗法、移植(例如，干细胞移植、骨髓移植)、免疫疗法和化学疗法。
术语“肺部疾病”或“肺病”是指肺部的疾病。肺部疾病的实例包括但不限于囊性纤维化及与其相关的病状，包括：支气管扩张、支气管炎、哮喘(例如，间歇性哮喘、轻度持续性哮喘、中度持续性哮喘、重度持续性哮喘)、慢性支气管炎和肺纤维化。
本公开还包括试剂盒(例如，药物包)。所提供的试剂盒可包括本文所述的药物组合物或化合物和容器(例如，小瓶、安瓿、瓶、注射器和/或分配器包装或其他合适的容器)。在一些实施方案中，所提供的试剂盒还可任选地包括第二容器，所述第二容器包含用于稀释或悬浮本文所述的药物组合物或化合物的药物赋形剂。在一些实施方案中，将在第一容器和第二容器中提供的本文所述的药物组合物或化合物组合以形成一个单位剂型。在某些实施方案中，本文所述的试剂盒还包括用于使用试剂盒的说明书。
具体实施方式
CF为欧洲血统的个体中最常见的致死性隐性遗传病症，每年每2500名新生儿中有1名至每3500名新生儿中有1名受到影响。CF是由囊性纤维化跨膜电导调节因子(CFTR)基因的突变引起的，导致CFTR合成减少或缺乏、蛋白质错误折叠和/或通道功能障碍，从而导致气道、肠和胰腺上皮细胞中的氯分泌减少、钠吸收(ENaC)增加和体液稳态受损。CFTR基因在多个组织中表达。CF的特征是多系统病理，包括呼吸系统、胃肠道系统、胰腺系统和肝胆系统。原发性发病率和死亡率与慢性肺感染和炎症有关。
CF突变被划分为：I类(22％)＝无CFTR表达；II类(88％)＝CFTR蛋白错误折叠；III类(6％)＝CFTR通道不开放；IV类(6％)＝CFTR通道故障；V类(5％)＝CFTR太少。突变也可能跨越一个以上类别。诸如鲁玛卡托的药物用于解决II类突变(折叠)；诸如替扎卡托或依伐卡托的药物为用于解决III类至V类突变的‘增效剂’。
使用选择性激活CFTR活性或纠正蛋白质错误折叠的小分子的CF疗法的最新进展显示，关于治疗具有CFTRΔF508突变的受试者的成功有限。本发明人已鉴定出所选氨基酸(AA)组合，其可刺激氯分泌并降低ENaC活性，从而提高顶端氯离子通道活性并减少顶端膜上的钠吸收。因此，所选AA组合及其组合物呈现为用于单独和与其他CF治疗剂(例如像鲁玛卡托、替扎卡托和/或依伐卡托)组合治疗患有CF的受试者的治疗剂。本文还涵盖所选AA组合用于治疗CF或在制备用于治疗CF的药剂中的用途，其中所述用途是单独的和/或与其他CF治疗剂(例如像鲁玛卡托、替扎卡托和/或依伐卡托)组合的。
如本文所述，本发明人已通过实验将完全分化的原代正常人支气管上皮细胞与纯合的CFTRΔF508(II类突变)人支气管上皮细胞进行了比较。简而言之，在尤斯室(Ussingchamber)中测量了跨上皮短路电流(Isc)、电阻(R)以及22Na和36Cl的单向通量(Jms&Jsm)和净通量(Jnet)。当在CF-5AA-3(用于治疗CF的氨基酸制剂)不存在(对照)或存在下，用毛喉素和GLPG1837(替代依伐卡托的增效剂)刺激CF细胞时，峰值电流(图7E)和氯分泌(图7F)在CF-5AA-3(在本文中也称为CF5AA-3)存在下得到显著改善。关于另外的研究细节，参见下面的实施例2。
在例如图5至图9中提供的结果表明，通过校正和/或修改质膜通道功能，所选氨基酸组合(例如，CF-5AA-3)改善了CFTRΔF508完全分化的原代正常人支气管上皮细胞(HBEC)(对于CFTRΔF508是纯合的)中功能障碍的氯和钠通道活性。因此，提出所选氨基酸制剂(例如，CF-5AA-3)来补充具有CFTRΔF508突变的患者的现有护理标准。
在存在校正剂(C18；VX661，替扎卡托)和增效剂(GLPG1837，替代依伐卡托)的情况下，峰值电流比基线高出一倍以上，但单独使用时仍低于CF-5AA-3基础峰值电流。相对于单独的CF-5AA-3，向CF-5AA-3中添加相同的三重混合物使电流又增加了26％(图10A和图10B)。
另外，进一步证明，由于对CFTR和ANO1通道的直接作用，与三重混合物相比，CF-5AA-3显著增加氯通量(图11)。CF-5AA-3表现出的对ENaC的影响很小。关于另外的研究细节，参见下面的实施例2。
总的来说，使用具有CFTRΔF508突变(II类)的原代人支气管上皮细胞进行的体外电生理研究表明，与常见的校正剂和增效剂[柱AA DMSO BASAL对柱C18+GLPG]类似，单独的CF-5AA-3可在F508del人支气管细胞中定量增加氯分泌(负通量)，当与单独的校正剂和增效剂相比时，CF-5AA-3与常用的校正剂(C18)和增效剂(GLPG)的组合使氯分泌(负通量)翻倍。
本文提供的结果指示，另外的氯离子通道在HBEC中也可具有活性(例如SLC26A9)。除CFTR以外的氯离子通道的激活提示，CF-5AA-3可通过CFTR非依赖性方式诱导氯分泌来缓解所有5类CF突变。关于目前没有药物治疗的具有CFTR I类突变的受试者，这特别值得注意。
包含增加CFTR易位到质膜的氨基酸的组合物
本文提供的组合物增加野生型和突变型CFTR蛋白两者从细胞质易位到质膜。具体来说，本文所述的组合物在增加质膜上的Phe508del CFTR蛋白的数量方面特别有效，导致上皮细胞分泌更多的氯离子和水，从而对抗厚粘液的形成(囊性纤维化的标志)。
在一个方面，组合物包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：选自半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸、酪氨酸和赖氨酸中的一个或多个游离氨基酸；以及任选的药学上可接受的载剂、缓冲剂、电解质、佐剂、赋形剂和/或另外的治疗剂。在某些实施方案中，组合物包含游离氨基酸半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸、酪氨酸和赖氨酸、基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，组合物基本上由指定的游离氨基酸组成或仅由其组成，并且不含其他游离氨基酸，或含有可忽略量的其他游离氨基酸。在某些实施方案中，组合物包括作为“天然”或“非天然”氨基酸衍生物的氨基酸衍生物。在某些实施方案中，组合物包括氨基酸的盐和/或前药。在某些实施方案中，组合物包含游离氨基酸半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸、酪氨酸和赖氨酸、基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，组合物还包含选自半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸、酪氨酸和赖氨酸中的一种或多种游离氨基酸、基本上由其组成或由其组成。在另一方面，组合物包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：选自半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸、酪氨酸和赖氨酸中的两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个或所有五个游离氨基酸；以及任选的药学上可接受的载剂、缓冲剂、电解质、佐剂、赋形剂和/或另外的治疗剂。在另一方面，组合物包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：游离氨基酸半胱氨酸和脯氨酸以及选自甘氨酸、酪氨酸和/或赖氨酸中的至少一个另外的游离氨基酸；以及任选的药学上可接受的载剂、缓冲剂、电解质、佐剂、赋形剂和/或另外的治疗剂。
在一个方面，组合物包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：选自苏氨酸和赖氨酸中的一个或多个游离氨基酸；以及任选的药学上可接受的载剂、缓冲剂、电解质、佐剂、赋形剂和/或另外的治疗剂。在某些实施方案中，组合物包含游离氨基酸苏氨酸和赖氨酸、基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，组合物基本上由指定的游离氨基酸组成或仅由其组成，并且不含其他游离氨基酸，或含有可忽略量的其他游离氨基酸。在某些实施方案中，组合物包括作为“天然”或“非天然”氨基酸衍生物的氨基酸衍生物。在某些实施方案中，组合物包括氨基酸的盐和/或前药。在某些实施方案中，组合物包含游离氨基酸苏氨酸和赖氨酸、基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，组合物还包含选自苏氨酸和赖氨酸中的一种或多种游离氨基酸、基本上由其组成或由其组成。
在一个方面，组合物包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：选自半胱氨酸、脯氨酸和缬氨酸中的一个或多个游离氨基酸；以及任选的药学上可接受的载剂、缓冲剂、电解质、佐剂、赋形剂和/或另外的治疗剂。在某些实施方案中，组合物包含游离氨基酸半胱氨酸、脯氨酸和缬氨酸、基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，组合物基本上由指定的游离氨基酸组成或仅由其组成，并且不含其他游离氨基酸，或含有可忽略量的其他游离氨基酸。在某些实施方案中，组合物包括作为“天然”或“非天然”氨基酸衍生物的氨基酸衍生物。在某些实施方案中，组合物包括氨基酸的盐和/或前药。在某些实施方案中，组合物包含游离氨基酸半胱氨酸、脯氨酸和缬氨酸、基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，组合物还包含选自半胱氨酸、脯氨酸和缬氨酸中的一种或多种游离氨基酸、基本上由其组成或由其组成。在另一方面，组合物包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：选自半胱氨酸、脯氨酸和缬氨酸中的两个或更多个或所有三个游离氨基酸；以及任选的药学上可接受的载剂、缓冲剂、电解质、佐剂、赋形剂和/或另外的治疗剂。
在一个方面，组合物包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：选自半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸和缬氨酸中的一个或多个游离氨基酸；以及任选的药学上可接受的载剂、缓冲剂、电解质、佐剂、赋形剂和/或另外的治疗剂。在某些实施方案中，组合物包含游离氨基酸半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸和缬氨酸、基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，组合物基本上由指定的游离氨基酸组成或仅由其组成，并且不含其他游离氨基酸，或含有可忽略量的其他游离氨基酸。在某些实施方案中，组合物包括作为“天然”或“非天然”氨基酸衍生物的氨基酸衍生物。在某些实施方案中，组合物包括氨基酸的盐和/或前药。在某些实施方案中，组合物包含游离氨基酸半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸和缬氨酸、基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，组合物还包含选自半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸和缬氨酸中的一种或多种游离氨基酸、基本上由其组成或由其组成。在另一方面，组合物包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：选自半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸和缬氨酸中的两个或更多个、三个或更多个或所有四个游离氨基酸；以及任选的药学上可接受的载剂、缓冲剂、电解质、佐剂、赋形剂和/或另外的治疗剂。
在一个方面，组合物包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：选自半胱氨酸、脯氨酸、缬氨酸和酪氨酸中的一个或多个游离氨基酸；以及任选的药学上可接受的载剂、缓冲剂、电解质、佐剂、赋形剂和/或另外的治疗剂。在某些实施方案中，组合物包含游离氨基酸半胱氨酸、脯氨酸、缬氨酸和酪氨酸、基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，组合物基本上由指定的游离氨基酸组成或仅由其组成，并且不含其他游离氨基酸，或含有可忽略量的其他游离氨基酸。在某些实施方案中，组合物包括作为“天然”或“非天然”氨基酸衍生物的氨基酸衍生物。在某些实施方案中，组合物包括氨基酸的盐和/或前药。在某些实施方案中，组合物包含游离氨基酸半胱氨酸、脯氨酸、缬氨酸和酪氨酸、基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，组合物还包含选自半胱氨酸、脯氨酸、缬氨酸和酪氨酸中的一种或多种游离氨基酸、基本上由其组成或由其组成。在另一方面，组合物包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：选自半胱氨酸、脯氨酸、缬氨酸和酪氨酸中的两个或更多个、三个或更多个或所有四个游离氨基酸；以及任选的药学上可接受的载剂、缓冲剂、电解质、佐剂、赋形剂和/或另外的治疗剂。
在一个方面，组合物包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：选自甘氨酸、亮氨酸和赖氨酸中的一个或多个游离氨基酸；以及任选的药学上可接受的载剂、缓冲剂、电解质、佐剂、赋形剂和/或另外的治疗剂。在某些实施方案中，组合物包含游离氨基酸甘氨酸、亮氨酸和赖氨酸、基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，组合物基本上由指定的游离氨基酸组成或仅由其组成，并且不含其他游离氨基酸，或含有可忽略量的其他游离氨基酸。在某些实施方案中，组合物包括作为“天然”或“非天然”氨基酸衍生物的氨基酸衍生物。在某些实施方案中，组合物包括氨基酸的盐和/或前药。在某些实施方案中，组合物包含游离氨基酸甘氨酸、亮氨酸和赖氨酸、基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，组合物还包含选自甘氨酸、亮氨酸和赖氨酸中的一种或多种游离氨基酸、基本上由其组成或由其组成。在另一方面，组合物包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：选自甘氨酸、亮氨酸和赖氨酸中的两个或更多个或所有三个游离氨基酸；以及任选的药学上可接受的载剂、缓冲剂、电解质、佐剂、赋形剂和/或另外的治疗剂。
在一个方面，组合物包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：选自甘氨酸、亮氨酸、赖氨酸、酪氨酸、精氨酸和异亮氨酸中的一个或多个游离氨基酸；以及任选的药学上可接受的载剂、缓冲剂、电解质、佐剂、赋形剂和/或另外的治疗剂。在某些实施方案中，组合物包含游离氨基酸甘氨酸、亮氨酸、赖氨酸、酪氨酸、精氨酸和异亮氨酸、基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，组合物基本上由指定的游离氨基酸组成或仅由其组成，并且不含其他游离氨基酸，或含有可忽略量的其他游离氨基酸。在某些实施方案中，组合物包括作为“天然”或“非天然”氨基酸衍生物的氨基酸衍生物。在某些实施方案中，组合物包括氨基酸的盐和/或前药。在某些实施方案中，组合物包含游离氨基酸甘氨酸、亮氨酸、赖氨酸、酪氨酸、精氨酸和异亮氨酸、基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，组合物还包含选自甘氨酸、亮氨酸、赖氨酸、酪氨酸、精氨酸和异亮氨酸中的一种或多种游离氨基酸、基本上由其组成或由其组成。在另一方面，组合物包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：选自甘氨酸、亮氨酸、赖氨酸、酪氨酸、精氨酸和异亮氨酸中的两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个或所有六个游离氨基酸；以及任选的药学上可接受的载剂、缓冲剂、电解质、佐剂、赋形剂和/或另外的治疗剂。
下表B提供了包含增加CFTR易位到质膜的氨基酸的组合物的非限制性实例。
表B：包含氨基酸的组合物
Figure BDA0003084976600000401
Figure BDA0003084976600000411
如果存在于组合物中，则每种游离氨基酸可以例如以下浓度存在：脯氨酸为约0.4至约1.5克/升、约0.7至约1.3克/升、约0.9至约1.1克/升或约1.5至约1.7克/升；谷氨酸为约0.7至约1.7克/升、约0.9至约1.5克/升、约1.1至约1.3克/升或约1.5
至约1.7克/升；谷氨酰胺为约0.6至约1.6克/升、约0.8至约1.4克/升、约1.0至约1.2克/升或约1.5至约1.7克/升；亮氨酸为约0.05至约0.4克/升、约0.1至约0.3克/升或约1.5至约1.7克/升；丙氨酸为约0.4至约1.5克/升、约0.7至约1.3克/升、约1.1至约2.1克/升、约1.3至约1.9克/升或约1.5至约1.7克/升；天冬氨酸为约0.4至约1.5克/升、约0.7至约1.3克/升、约1.1至约2.1克/升、约1.3至约1.9克/升或约1.5至约1.7克/升；苯丙氨酸为0.4至约1.5克/升、约0.7至约1.3克/升、约1.1至约2.1克/升、约1.3至约1.9克/升或约1.5至约1.7克/升；组氨酸为0.4至约1.5克/升、约0.7至约1.3克/升、约1.1至约2.1克/升、约1.3至约1.9克/升或约1.5至约1.7克/升；苏氨酸为0.4至约1.5克/升、约0.7至约1.3克/升、约0.9至约1.1克/升或约1.5至约1.7克/升；异亮氨酸为0.4至约1.5克/升、约0.7至约1.3克/升、约1.1至约2.1克/升、约1.3至约1.9克/升或约1.5至约1.7克/升；天冬酰胺为0.4至约1.5克/升、约0.7至约1.3克/升、约1.1至约2.1克/升、约1.3至约1.9克/升或约1.5至约1.7克/升；色氨酸为0.4至约1.5克/升、约0.7至约1.3克/升、约1.1至约2.1克/升、约1.3至约1.9克/升或约1.5至约1.7克/升。
在某些实施方案中，组合物的氨基酸为游离氨基酸。在某些实施方案中，组合物的氨基酸为L-氨基酸。在某些实施方案中，组合物的氨基酸为D-氨基酸。在某些实施方案中，组合物的氨基酸为D-氨基酸与L-氨基酸的组合。
在某些实施方案中，本文所述的组合物的氨基酸可为游离氨基酸的前药。术语“前药”是指具有可裂解基团并且通过溶剂分解或在生理条件下变为本文所述的化合物(其在体内具有药物活性)的化合物。
在某些实施方案中，本文所述的组合物的氨基酸可为氨基酸的盐(即氨基酸盐)。氨基酸可与以下呈盐形式：阳离子(例如，溶液中具有带负电侧链的氨基酸盐(例如，谷氨酸和天冬氨酸))、阴离子(溶液中具有带正电侧链的氨基酸盐(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸))和无机化合物。示例性氨基酸盐列于Fleck M和Petrosyan AM,Salts of AminoAcids,第1版；Springer International Publishing,2014中，其以引用的方式并入本文。
在某些实施方案中，组合物还包含水。
在某些实施方案中，组合物还包含缓冲剂。示例性缓冲剂包括柠檬酸盐缓冲剂溶液、醋酸盐缓冲剂溶液、磷酸盐缓冲剂溶液、氯化铵、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、葡乳醛酸钙、葡庚糖酸钙、葡萄糖酸钙、D-葡萄糖酸、甘油磷酸钙、乳酸钙、丙酸、乙酰丙酸钙、戊酸、磷酸氢二钙、磷酸、磷酸三钙、磷酸氢钙、醋酸钾、氯化钾、葡萄糖酸钾、钾混合物、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸钾混合物、乙酸钠、碳酸氢钠、氯化钠，柠檬酸钠、乳酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钠混合物、氨丁三醇、氢氧化镁、氢氧化铝、海藻酸、无热原水、等渗盐水、林格氏溶液、乙醇及其混合物。
在某些实施方案中，磷酸根离子(诸如H2PO4-、HPO42-和PO43-)用于缓冲本发明的组合物。在某些实施方案中，治疗组合物使用HCO3-或CO32-作为缓冲剂。在其他实施方案中，治疗组合物不使用HCO3-或CO32-作为缓冲剂。
在某些实施方案中，组合物包含选自例如以下的一种或多种电解质：Na+；K+；HCO3-；CO32-；Ca2+；Mg2+；Fe2+；Cl-；磷酸根离子，诸如H2PO4-、HPO42-和PO43-；锌；碘；铜；铁；硒；铬；和钼。在一个替代实施方案中，组合物不含HCO3-或CO32-。在另一个替代实施方案中，组合物包含总浓度小于5mg/1或浓度低于5mg/1的HCO3-和CO32-。在某些实施方案中，组合物不含电解质。在某些实施方案中，组合物不含碳水化合物(例如，双糖、寡糖或多糖)。在某些替代实施方案中，组合物不包含以下中的一种或多种或任一种：Na+；K+；HCO3-；CO32-；Ca2+；Mg2+；Fe2；Cl-；磷酸根离子，诸如H2PO4-、HPO42-和PO43-；锌；碘；铜；铁；硒；铬；和钼。
在某些实施方案中，组合物还包含糖、维生素、电解质、矿物质、蛋白质或脂质。在某些实施方案中，组合物还包含糖。在某些实施方案中，组合物还包含维生素。在某些实施方案中，组合物还包含电解质。在某些实施方案中，组合物还包含矿物质。在某些实施方案中，组合物还包含蛋白质。在某些实施方案中，组合物还包含脂质。
在某些实施方案中，组合物不含选自以下的成分中的一种或多种：寡糖、多糖和碳水化合物；寡肽或多肽或蛋白质；脂质；小链脂肪酸、中链脂肪酸和/或长链脂肪酸；和/或含有一种或多种上述营养素的食物。
组合物可具有在约2.5至约8.5范围内的pH。在某些实施方案中，组合物的pH范围在约2.5至约6.5、约3.0至约6.0、约3.5至约5.5、约3.9至约5.0或约4.2至约4.6内。在其他实施方案中，组合物的pH范围在约6.5至约8.5、约7.0至约8.0或约7.2至约7.8内。在某些实施方案中，组合物具有例如约2.5至约8.5的pH。在某些实施方案中，组合物的pH为约2.5至约6.5、约2.5至约6.0、约3.0至约6.0、约3.5至约6.0、约3.9至约6.0、约4.2至约6.0、约3.5至约5.5、约3.9至约5.0或约4.2至约4.6。在其他实施方案中，pH为约6.5至约8.5、约7.0至约8.5、约7.0至约8.0、约7.2至约8.0或约7.2至约7.8。在某些实施方案中，pH为约7.3至约7.5。在某些实施方案中，pH为约7.3至约7.4。在某些实施方案中，pH为约7.4至约7.5。在某些实施方案中，pH为约7.4。
在某些实施方案中，组合物的总渗透压为约100mosm至280mosm或介于其间的任何值。在某些实施方案中，总渗透压为约150msom至260mosm。在另一个实施方案中，组合物的总渗透压为低于280mosm的任何值。
在某些实施方案中，组合物为无菌的。
本文所述的组合物可通过药理学领域中已知的任何方法来制备。一般来讲，此类制备方法包括使本文所述组合物的化合物(即一个或多个游离氨基酸)与载剂或赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分缔合，然后，如有必要和/或期望，使产物成型和/或包装到所需的单剂量或多剂量单位中。
本文所述药物组合物中的一种或多种活性成分、药学上可接受的赋形剂和/或任何另外的成分的相对量将根据所治疗受试者的身份、体型和/或状况并且进一步根据施用组合物的途径而变化。组合物可包含介于0.1％与100％(重量/重量)之间的活性成分。
如本文所述，化合物或组合物可与一种或多种另外的药剂(例如，治疗活性剂和/或预防活性剂)组合施用。化合物或组合物可与改善其在治疗有此需要的受试者的疾病、预防有此需要的受试者的疾病、降低有此需要的受试者发展疾病的风险和/或提高受试者或细胞中的CFTR活性方面的活性(例如，活性(例如效力和/或功效)、提高生物利用度、提高安全性、降低耐药性、降低和/或调节新陈代谢、抑制排泄和/或改变在受试者或细胞中的分布的另外的药剂组合施用。还应理解，所采用的疗法对于相同的病症可实现所需效果，和/或其可实现不同的效果。在某些实施方案中，本文所述的包含本文所述的化合物和另外的药剂的药物组合物显示出协同作用，所述协同作用在包含化合物和另外的药剂中的一个而不是两个的药物组合物中不存在。
本文所述的组合物可在施用与化合物或组合物不同且可适用作例如组合疗法的一种或多种另外的药剂或治疗剂的同时、之前或之后施用。药剂包括治疗活性剂。药剂还包括预防活性剂。药剂包括有机小分子，诸如药物化合物(例如，如联邦法规(CFR)中所提供的，由美国食品与药物管理局批准的用于人或兽医用途的化合物)、肽、蛋白质、碳水化合物、单糖、寡糖、多糖、核蛋白、粘蛋白、脂蛋白、合成多肽或蛋白质、连接到蛋白质的小分子、糖蛋白、类固醇、核酸、DNA、RNA、核苷酸、核苷、寡核苷酸、反义寡核苷酸、脂质、激素、维生素和细胞。在某些实施方案中，另外的药剂为可用于治疗和/或预防疾病(例如，增生性疾病、血液疾病、神经疾病、痛苦病状、精神病症、肺部疾病或代谢病症)的药剂。在某些实施方案中，另外的药剂可用于治疗肺部疾病。在某些实施方案中，另外的药剂可用于治疗囊性纤维化。每种另外的药剂可以针对该药剂确定的剂量和/或时间表施用。另外的药剂也可彼此一起施用和/或与本文所述的化合物或组合物以单个剂量一起施用或以不同剂量单独施用。方案中采用的特定组合将考虑本文所述化合物与另外的一种或多种药剂的相容性和/或要达到的所需治疗和/或预防效果。一般来讲，期望以不超过单独使用它们时的水平的水平组合使用另外的一种或多种药剂。在一些实施方案中，组合使用的水平将低于单独使用的水平。
在某些实施方案中，组合物在施用一种或多种另外的治疗剂的同时、之前或之后施用，其中另外的治疗剂为CFTR增效剂、校正剂或通读剂。“CFTR增效剂”为增强CFTR在细胞质膜上的功能的化合物。这些化合物可用于治疗导致CFTR蛋白正确运输到质膜但功能不恰当的囊性纤维化突变(例如，通道门控缺陷、ATP结合减少或消失和/或氯转运减少)。在某些实施方案中，CFTR增效剂为依伐卡托(VX-770，
Figure BDA0003084976600000451
)。“CFTR校正剂”为改善突变型CFTR的细胞内加工和易位，从而允许更多的蛋白质到达质膜的化合物。在某些实施方案中，CFTR校正剂为鲁玛卡托(VX-809，
Figure BDA0003084976600000452
)。在某些实施方案中，CFTR校正剂为替扎卡托(VX-661)。“CFTR读通剂”是在存在由CFTR基因序列中的点突变引起的提前终止密码子(PTC)突变的情况下促进转录的化合物。
通常，PTC会导致CFTR蛋白被截短，所述蛋白不能恰当加工且/或出现故障(例如，通道门控缺陷、ATP结合减少或消失和/或氯转运减少)。在某些实施方案中，CFTR通读剂为阿塔鲁伦(TRANSLARNATM)。在某些实施方案中，将包含如本文所述的氨基酸的组合物与依伐卡托组合施用。在某些实施方案中，将包含如本文所述的氨基酸的组合物与鲁玛卡托组合施用。在某些实施方案中，将包含如本文所述的氨基酸的组合物与阿塔鲁伦组合施用。在某些实施方案中，将包含如本文所述的氨基酸的组合物与依伐卡托和鲁玛卡托组合施用。在某些实施方案中，将包含如本文所述的氨基酸的组合物与依伐卡托和阿塔鲁伦组合施用。在某些实施方案中，将包含如本文所述的氨基酸的组合物与鲁玛卡托和阿塔鲁伦组合施用。在某些实施方案中，组合物是单独施用的，即，不在施用一种或多种另外的药剂或治疗剂的同时、之前或之后施用。在某些实施方案中，在不存在CFTR增效剂、校正剂或通读剂的情况下施用组合物。
用于经口施用的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、粉剂和颗粒剂。在此类固体剂型中，活性成分与至少一种惰性的药学上可接受的赋形剂或载剂(诸如柠檬酸钠或磷酸二钙)和/或以下物质混合：(a)填充剂或增量剂，诸如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，诸如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)湿润剂，诸如甘油；(d)崩解剂，诸如琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；(e)缓溶剂，诸如石蜡；(f)吸收促进剂，诸如季铵化合物；(g)润湿剂，诸如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，诸如高岭土和膨润土；以及(i)润滑剂，诸如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠及其混合物。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型可包括缓冲剂。
在某些实施方案中，可以粉末形式提供包含本文所述的氨基酸的组合物，并重构以供施用于受试者。本文所述的药物组合物可以适合于经由颊腔的肺施用的制剂形式制备、包装和/或出售。这种制剂可包含干燥颗粒，所述干燥颗粒包含活性成分并且直径在约0.5纳米至约7纳米或约1纳米至约6纳米的范围内。此类组合物方便地呈干粉形式，供使用包括干粉贮存器的装置(其中推进剂流可被引导至所述装置中以分散粉末)和/或使用自推式溶剂/粉末分配容器(诸如包含溶解和/或悬浮在密封容器中的低沸点推进剂中的活性成分的装置)施用。此类粉末包括这样的颗粒，其中按重量计至少98％的颗粒具有大于0.5纳米的直径，并且按数量计至少95％的颗粒具有小于7纳米的直径。或者，按重量计至少95％的颗粒具有大于1纳米的直径，并且按数量计至少90％的颗粒具有小于6纳米的直径。干粉组合物可包括固体细粉稀释剂，诸如糖，并且以单位剂型方便地提供。
用于经口和肠胃外施用的液体剂型包括药学上可接受的乳液、微乳液、溶液、混悬液、糖浆和酏剂。除活性成分外，液体剂型还可包含本领域中常用的惰性稀释剂，诸如水或其他溶剂；增溶剂和乳化剂，诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(例如，棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇以及脱水山梨糖醇的脂肪酸酯及其混合物。除惰性稀释剂外，口服组合物可包含佐剂，诸如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂以及芳香剂。在用于肠胃外施用的某些实施方案中，本文所述的缀合物与增溶剂(诸如
Figure BDA0003084976600000471
醇、油、改性油、二醇、聚山梨醇酯、环糊精、聚合物及其混合物)混合。
为了肺递送而配制的本文所述的药物组合物可以溶液和/或混悬液液滴的形式提供活性成分。此类制剂可作为包含活性成分的任选无菌的水性和/或稀醇溶液和/或混悬液制备、包装和/或出售，并且可使用任何喷雾和/或雾化装置方便地施用。此类制剂还可包含一种或多种另外的成分，包括但不限于调味剂(诸如糖精钠)、挥发油、缓冲剂、表面活性剂和/或防腐剂(诸如羟基苯甲酸甲酯)。通过此施用途径提供的液滴的平均直径可在约0.1纳米至约200纳米的范围内。
可用于肺递送的本文所述的制剂可用于鼻内递送本文所述的药物组合物。适用于鼻内施用的另一种制剂为包含活性成分且平均颗粒为约0.2微米至500微米的粗粉。此种制剂是通过从保持在鼻孔附近的粉末容器经由鼻道快速吸入来施用的。
用于鼻施用的制剂可例如包含约低至0.1％(重量/重量)至高达100％(重量/重量)的活性成分，并且可包含一种或多种本文所述的另外的成分。本文所述的药物组合物可以用于颊施用的制剂形式制备、包装和/或出售。此类制剂可呈例如使用常规方法制成的片剂和/或锭剂的形式，并且可含有例如0.1％至20％(重量/重量)的活性成分，其余则包含口服可溶解和/或可降解的组合物以及任选的一种或多种本文所述的另外的成分。或者，用于颊施用的制剂可包含含有活性成分的粉状和/或气溶胶状和/或雾化溶液和/或混悬液。当分散时，此类粉状、气溶胶状和/或雾化制剂的平均粒径和/或液滴大小可在约0.1纳米至约200纳米范围内，并且还可包含一种或多种本文所述的另外的成分。
用于增加CFTR易位到质膜的的方法
本公开提供了用于增加囊性纤维化跨膜电导调节因子(CFTR)蛋白从细胞质易位到质膜的组合物。一般来讲，不希望受到任何特定理论的束缚，CFTR蛋白(例如Phe508del)中的突变可破坏正确的加工、折叠和/或向质膜的运输，从而导致质膜上CFTR蛋白数量的减少以及表达突变型CFTR蛋白的细胞中的氯离子转运功能的受损。氯离子转运受损导致渗透分布失衡，使得由于细胞内氯离子浓度异常高，水无法通过渗透作用从表达突变型CFTR蛋白的细胞中抽出。由此导致形成覆盖细胞的厚粘液层，这是囊性纤维化的标志。
因此，在一个方面，本公开提供了一种用于增加细胞质膜上CFTR蛋白的数量的方法，所述方法包括使细胞与有效量的包含本公开氨基酸的组合物接触。在某些实施方案中，细胞为上皮细胞。在某些实施方案中，上皮细胞为小肠上皮细胞或肺上皮细胞。在某些实施方案中，上皮细胞为肺上皮细胞。在某些实施方案中，肺上皮细胞为支气管上皮细胞。支气管上皮细胞可为正常人的支气管上皮细胞(NHBE)或患病人的支气管上皮细胞(DHBE)。患病人的支气管上皮细胞可获自被诊断患有肺部疾病(例如，哮喘、COPD、囊性纤维化)的人供体。在某些实施方案中，支气管上皮细胞表达野生型CFTR。在某些实施方案中，支气管上皮细胞表达突变型CFTR。在某些实施方案中，支气管上皮细胞表达野生型和突变型CFTR(即，CFTR基因中的一个等位基因编码野生型CFTR，而第二等位基因含有突变(例如，Phe508delCFTR))。在某些实施方案中，支气管上皮细胞仅表达Phe508del突变型CFTR。细胞可在体外、体内或离体存在。
在某些实施方案中，质膜上的野生型CFTR蛋白的数量增加。在某些实施方案中，质膜上的突变型CFTR蛋白的数量增加。在某些实施方案中，质膜上的Gly542X突变型CFTR蛋白的数量增加，其中X为任何氨基酸。在某些实施方案中，质膜上的Gly551Asp突变型CFTR蛋白的数量增加。在某些实施方案中，质膜上的Arg553X突变型CFTR蛋白的数量增加，其中X为任何氨基酸。在某些实施方案中，质膜上的Arg117His突变型CFTR蛋白的数量增加。在某些实施方案中，质膜上的120del23突变型CFTR蛋白的数量增加。在某些实施方案中，质膜上的Phe508del突变型CFTR蛋白的数量增加。在某些实施方案中，质膜上与由SEQ ID NO:1提供的野生型CFTR的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一的CFTR蛋白的数量增加。在某些实施方案中，质膜上与由SEQ ID NO:2提供的Phe508del CFTR的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一的CFTR蛋白的数量增加。
在某些实施方案中，本公开提供了一种用于增加细胞质膜上CFTR蛋白的数量的方法，所述方法包括使细胞与有效量的本文所述的组合物接触。在某些实施方案中，组合物包含一种或多种选自苏氨酸和赖氨酸的游离氨基酸、基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，组合物包含一种或多种选自半胱氨酸、脯氨酸和缬氨酸的游离氨基酸、基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，组合物包含一种或多种选自半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸和缬氨酸的游离氨基酸、基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，组合物包含一种或多种选自半胱氨酸、脯氨酸、缬氨酸和酪氨酸的游离氨基酸、基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，组合物包含一种或多种选自半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸、酪氨酸和赖氨酸的游离氨基酸、基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，组合物包含一种或多种选自甘氨酸、亮氨酸和赖氨酸的游离氨基酸、基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，组合物包含一种或多种选自甘氨酸、亮氨酸、赖氨酸、酪氨酸、精氨酸和异亮氨酸的游离氨基酸、基本上由其组成或由其组成。在另一方面，组合物包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：游离氨基酸半胱氨酸和脯氨酸及至少一种选自甘氨酸、酪氨酸和/或赖氨酸的另外的游离氨基酸；以及任选的缓冲剂、电解质、佐剂和/或赋形剂。
“可忽略的量”意指存在的氨基酸对CFTR蛋白没有影响。或者，在某些实施方案中，即使氨基酸存在于组合物中，其存在量也不会影响CFTR向质膜的易位、氯离子转运或治疗有此需要的受试者的治疗效果。在某些实施方案中，可忽略的量是其中氨基酸的总浓度小于100mg/l、50mg/l、10mg/l、5mg/l、1mg/l、0.5mg/l、0.1mg/l或0.01mg/l的量。在某些实施方案中，可忽略的量是其中氨基酸的总浓度小于100mg/l的量。在某些实施方案中，可忽略的量是其中氨基酸的总浓度小于50mg/l的量。在某些实施方案中，可忽略的量是其中氨基酸的总浓度小于10mg/l的量。在某些实施方案中，可忽略的量是其中氨基酸的总浓度小于5mg/l的量。在某些实施方案中，可忽略的量是其中氨基酸的总浓度小于1mg/l的量。在某些实施方案中，可忽略的量是其中氨基酸的总浓度小于0.5mg/l的量。在某些实施方案中，可忽略的量是其中氨基酸的总浓度小于0.1mg/l的量。在某些实施方案中，可忽略的量是其中氨基酸的总浓度小于0.01mg/l的量。应当理解，可忽略的量是大于零的量。
在某些实施方案中，本公开的组合物包含一种或多种游离氨基酸，所述一种或多种游离氨基酸对于增加CFTR向质膜的易位是必要的(例如，必需的)。在某些实施方案中，本公开的组合物可包含一种或多种游离氨基酸，所述一种或多种游离氨基酸对于增加CFTR向质膜的易位不是必要的(即，不直接使CFTR稳定)，而是可提供组合物的替代有益性质(例如，保持特定的pH或渗透压)。
在一个方面，增加细胞质膜上CFTR蛋白的数量的方法涉及增加CFTR从细胞的细胞质向细胞膜的易位，所述方法包括使细胞与有效量的包含本公开的氨基酸的组合物接触。在一个实施方案中，所述方法造成处理过的细胞的质膜上CFTR蛋白数量的增加。通过将与包含本文所述的氨基酸的组合物接触的细胞与未处理的细胞(例如，对照细胞)进行比较，可确定质膜上CFTR蛋白数量的增加。例如，蛋白质印迹可用于将从与包含如本文所述的氨基酸的组合物接触的上皮细胞分离的膜囊泡中CFTR的存在和量与从未处理的上皮细胞(例如，对照细胞)分离的膜囊泡中CFTR的量进行比较。进行如本文所述的蛋白质印迹分析在本领域普通技术人员的能力范围内。可用于确定样品中CFTR蛋白表达水平的另外的相关技术包括斑点印迹分析、免疫组织化学、免疫细胞化学和酶联免疫吸附测定(ELISA)等。
CFTR蛋白是ABC转运蛋白，其作为ATP门控离子通道起作用。当被激活时，CFTR允许氯离子(Cl-)和其他带负电的离子(诸如硫氰酸根([SCN]-))沿其电化学梯度向下流动(例如，被动扩散或被动转运)。CFTR中的突变(例如像Gly551X，其中X表示任何氨基酸，例如Gly551Asp)导致CFTR蛋白的特征是离子通道门控功能的缺陷。最常见的CFTR突变Phe508del导致CFTR蛋白缺少苯丙氨酸508的密码子，并且不能正确折叠或运输到质膜上。因此，在一个方面，本公开提供了一种用于增加细胞质膜上CFTR蛋白的数量并增加氯离子穿过细胞膜的转运(例如，氯离子从细胞排出)的方法，所述法包括使细胞与包含如本文所述的氨基酸的组合物接触。
因此，在一个方面，本公开提供了一种用于增加氯离子从细胞排出的方法，所述方法包括使细胞与有效量的本文所述的组合物接触。在某些实施方案中，组合物包含一种或多种选自苏氨酸和赖氨酸的游离氨基酸、基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，组合物包含一种或多种选自半胱氨酸、脯氨酸和缬氨酸的游离氨基酸、基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，组合物包含一种或多种选自半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸和缬氨酸的游离氨基酸、基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，组合物包含一种或多种选自半胱氨酸、脯氨酸、缬氨酸和酪氨酸的游离氨基酸、基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，组合物包含一种或多种选自半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸、酪氨酸和赖氨酸的游离氨基酸、基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，组合物包含一种或多种选自甘氨酸、亮氨酸和赖氨酸的游离氨基酸、基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，组合物包含一种或多种选自甘氨酸、亮氨酸、赖氨酸、酪氨酸、精氨酸和异亮氨酸的游离氨基酸、基本上由其组成或由其组成。在另一方面，组合物包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：游离氨基酸半胱氨酸和脯氨酸及至少一种选自甘氨酸、酪氨酸和/或赖氨酸的另外的游离氨基酸；以及任选的缓冲剂、电解质、佐剂和/或赋形剂。
在某些实施方案中，通过使细胞与CFTR增效剂、校正剂或通读剂接触来进一步增强氯从细胞的排出。在某些实施方案中，通过使细胞与包含本文所述的组合物和CFTR增效剂的组合疗法接触来增加氯从细胞的排出。在某些实施方案中，通过使细胞与包含本文所述的组合物和CFTR校正剂的组合疗法接触来增加氯从细胞的排出。在某些实施方案中，通过使细胞与包含本文所述的组合物和CFTR通读剂的组合疗法接触来增加氯从细胞的排出。在某些实施方案中，通过使细胞与包含本文所述的组合物和依伐卡托的组合疗法接触来增加氯从细胞的排出。
穿过膜的离子(诸如氯离子)的流动是用于调节水穿过半透膜(例如细胞膜)的流动的一种生物学机制。渗透描述了溶剂(例如水)分子从低溶质浓度区域流到较高溶质浓度区域，以平衡半透膜每侧的浓度(例如水的被动扩散)的过程。当细胞中的氯离子浓度由于CFTR的故障而增加时，水分子不会从细胞中流出并进入周围的粘液膜，导致形成厚粘液。因此，在另一方面，本公开提供了用于增加水从细胞的流出(例如渗透)的方法和组合物，所述方法包括使细胞与包含如本文所述的氨基酸的组合物接触。
因此，在一个方面，本公开提供了一种用于增加水从细胞的排出的方法，所述方法包括使细胞与本文所述的组合物接触。在某些实施方案中，组合物包含一种或多种选自苏氨酸和赖氨酸的游离氨基酸、基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，组合物包含一种或多种选自半胱氨酸、脯氨酸和缬氨酸的游离氨基酸、基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，组合物包含一种或多种选自半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸和缬氨酸的游离氨基酸、基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，组合物包含一种或多种选自半胱氨酸、脯氨酸、缬氨酸和酪氨酸的游离氨基酸、基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，组合物包含一种或多种选自半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸、酪氨酸和赖氨酸的游离氨基酸、基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，组合物包含一种或多种选自甘氨酸、亮氨酸和赖氨酸的游离氨基酸、基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，组合物包含一种或多种选自甘氨酸、亮氨酸、赖氨酸、酪氨酸、精氨酸和异亮氨酸的游离氨基酸、基本上由其组成或由其组成。在另一方面，组合物包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：游离氨基酸半胱氨酸和脯氨酸及至少一种选自甘氨酸、酪氨酸和/或赖氨酸的另外的游离氨基酸；以及任选的缓冲剂、电解质、佐剂和/或赋形剂。
在某些实施方案中，通过使细胞与CFTR增效剂、校正剂或通读剂接触来进一步增强水从细胞的排出。在某些实施方案中，通过使细胞与包含本文所述的组合物和CFTR增效剂的组合疗法接触来增加水从细胞的排出。在某些实施方案中，通过使细胞与包含本文所述的组合物和CFTR校正剂的组合疗法接触来增加水从细胞的排出。在某些实施方案中，通过使细胞与包含本文所述的组合物和CFTR通读剂的组合疗法接触来增加水从细胞的排出。在某些实施方案中，通过使细胞与包含本文所述的组合物和依伐卡托的组合疗法接触来增加水从细胞的排出。
用于治疗囊性纤维化的方法
如上所述，氯离子通过囊性纤维化跨膜电导调节因子(CFTR)蛋白的流动对于维持细胞和周围粘膜(特别是肺和小肠)中的体液水平至关重要。破坏CFTR加工、折叠和向质膜运输的CFTR蛋白中的突变(例如Phe508del)使得质膜上功能性CFTR蛋白的数量减少。生物学结果是覆盖上皮细胞层的厚粘液层的形成，从而促进细菌生长并阻止上皮细胞从周围体液中获取营养。最终，携带一个或多个CFTR基因突变的患者可能发展呼吸和肺部疾病，诸如囊性纤维化。
受试者可为例如患有肺部疾病的人。在某些实施方案中，受试者患有囊性纤维化。在某些实施方案中，囊性纤维化的潜在遗传原因可为CFTR基因的一个或多个等位基因中的Phe508del突变。人还可能患有常常与囊性纤维化同时发生的另外的并发症，诸如细菌感染、病毒感染、哮喘和慢性呼吸衰竭等。因此，包含本文公开的氨基酸的组合物还可适用于管理患有囊性纤维化的受试者的症状和其他并发症。
在某些实施方案中，本文所述的方法使得患有肺部疾病(例如，囊性纤维化)的患者的生存增加。本文所述的方法和组合物还可用于改善患有囊性纤维化的患者的治疗结果。
因此，在一个方面，本公开提供了用于治疗囊性纤维化的组合物，其中将所述组合物施用于有此需要的受试者(例如，患有囊性纤维化的受试者)。在某些实施方案中，受试者患有囊性纤维化，其中存在SEQ ID NO:1的野生型CFTR。在某些实施方案中，受试者患有囊性纤维化，其中存在与由SEQ ID NO:1提供的野生型CFTR的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一的CFTR蛋白。在某些实施方案中，受试者患有囊性纤维化，其中存在突变型CFTR。在某些实施方案中，受试者患有囊性纤维化，其中突变型CFTR为Gly542X、Gly551Asp、Arg553X、Arg117His、120del23或Phe508del突变体，其中X表示任何氨基酸。在某些实施方案中，受试者患有囊性纤维化，其中同时存在野生型CFTR和突变型CFTR。在某些实施方案中，受试者患有囊性纤维化，其中存在与由SEQ ID NO:2提供的Phe508del CFTR的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一的CFTR蛋白。在某些实施方案中，受试者患有囊性纤维化，其中突变型CFTR为SEQ ID NO:2的Phe508del CFTR。在某些实施方案中，受试者患有囊性纤维化，其中同时存在SEQ ID NO:1的野生型CFTR和SEQ ID NO:2的突变型Phe508del CFTR。本文所述的组合物可与一种或多种另外的治疗剂例如组合疗法一起施用，以进一步增加本文所述的组合物的治疗益处。
在另一方面，本公开提供了一种用于治疗囊性纤维化的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用本文所述的组合物。在某些实施方案中，组合物包含一种或多种选自苏氨酸和赖氨酸的游离氨基酸、基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，组合物包含一种或多种选自半胱氨酸、脯氨酸和缬氨酸的游离氨基酸、基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，组合物包含一种或多种选自半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸和缬氨酸的游离氨基酸、基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，组合物包含一种或多种选自半胱氨酸、脯氨酸、缬氨酸和酪氨酸的游离氨基酸、基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，组合物包含一种或多种选自半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸、酪氨酸和赖氨酸的游离氨基酸、基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，组合物包含一种或多种选自甘氨酸、亮氨酸和赖氨酸的游离氨基酸、基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，组合物包含一种或多种选自甘氨酸、亮氨酸、赖氨酸、酪氨酸、精氨酸和异亮氨酸的游离氨基酸、基本上由其组成或由其组成。在另一方面，组合物包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：游离氨基酸半胱氨酸和脯氨酸及至少一种选自甘氨酸、酪氨酸和/或赖氨酸的另外的游离氨基酸；以及任选的缓冲剂、电解质、佐剂和/或赋形剂。
在某些实施方案中，组合物还包含CFTR增效剂、校正剂或通读剂。在某些实施方案中，组合物还包含CFTR增效剂。在某些实施方案中，组合物还包含CFTR校正剂。在某些实施方案中，组合物还包含CFTR通读剂。在某些实施方案中，组合物还包含依伐卡托。在某些实施方案中，组合物不进一步包含CFTR增效剂、校正剂或通读剂。
Figure BDA0003084976600000561
(替扎卡托/依伐卡托和依伐卡托)被指示用于治疗6岁及以上的患有囊性纤维化(CF)的患者，他们对于F508del突变呈纯合的或者他们在基于体外数据和/或临床证据对替扎卡托/依伐卡托有反应的囊性纤维化跨膜电导调节因子(CFTR)基因中具有至少一个突变。对于6-11岁、称重<30kg的患者，典型剂量为50mg替扎卡托+早晨75mg依伐卡托和12小时后75mg依伐卡托。对于6-11岁、称重≥30kg的患者或12岁及以上的患者，典型剂量为100mg替扎卡托+早晨150mg依伐卡托和12小时后150mg依伐卡托。
Figure BDA0003084976600000562
(鲁玛卡托/依伐卡托)被指示用于在对CFTR基因中的F508del突变呈纯合的患者的囊性纤维化(CF)。对于6至11岁的患者：每12小时2片(每片含有鲁玛卡托100mg/依伐卡托125mg)。对于12岁及以上的患者：每12小时2片(每片含有鲁玛卡托200mg/依伐卡托125mg)。
Figure BDA0003084976600000563
(依伐卡托)是被指示用于治疗6个月及以上患者的CF的囊性纤维化跨膜电导调节因子(CFTR)增效剂，所述患者在基于临床和/或体外测定数据对依伐卡托增效有反应的CFTR基因中具有一个突变。对于6个月至<6岁的患者，推荐剂量是基于体重的，5kg至<7kg：每12小时一包25mg；7kg至<14kg：每12小时一包50mg；≥14kg：每12小时1包75mg。
可以40mg/kg/天的剂量使用阿塔鲁伦。
应当理解，当与本文所述的药物制剂组合使用时，典型剂量可变化。在这种组合疗法的一个特定实施方案中，当与本文所述的药物制剂联合施用时，例如
Figure BDA0003084976600000571
或阿塔鲁伦中任一个的剂量可相对于施用剂量和/或施用频率而减小。
CFTR基因及基因产物和CFTR突变体
如上所述，包含如本文所述的氨基酸的组合物有效地增加CFTR向质膜的易位。具体来说，包含如本文所述的氨基酸的组合物可有效地增加突变型(例如Phe508del)CFTR向质膜的易位。组合物致使质膜上CFTR蛋白的数量增加，由此提供一种用于增加氯离子跨上皮细胞膜转运以维持膜超极化和跨膜水转运的方法。这些组合物可用于治疗肺部疾病(诸如囊性纤维化)或由其他上皮细胞(诸如胰腺和小肠中的那些)中的体液转运失调而引起的疾病。
虽然在某些实施方案中可使用非人哺乳动物同源物的序列，但是本文中感兴趣的CFTR基因产物的序列通常包含人CFTR基因编码的序列或由其组成。一般来讲，CFTR蛋白或CFTR RNA的序列通常包含人CFTR的序列或由其组成。在某些实施方案中，CFTR基因的基因产物的序列包含天然存在的序列或由其组成。应当理解，遗传基因座在个体群体中可具有一个以上序列或等位基因。在一些实施方案中，天然存在的序列为标准序列。除非另外指出，否则在参考序列(RefSeq)数据库中作为蛋白质的参考序列列出的序列(在本文中用特定的名称、缩写或符号来表示)被认为是“标准序列”。如果序列在本公开的时间之后被更新，则在某些实施方案中可使用本公开之时的当前版本或其更新版本。应当理解，遗传基因座在个体群体中可具有一个以上序列或等位基因。在一些实施方案中，天然存在的序列在一个或多个氨基酸位置不同于标准序列。序列不同于标准序列并且执行多核苷酸或多肽的一种或多种正常功能的天然存在的多核苷酸或多肽可被称为具有“正常序列”。
CFTR基因的长度为大约189kb，并且由27个外显子和26个内含子构成。在某些实施方案中，CFTR蛋白为全长野生型CFTR。CFTR可为哺乳动物(例如，人)CFTR。在某些实施方案中，在本文所述的组合物和方法中使用的CFTR或其变体的序列包括天然存在的CFTR蛋白或其生物活性变体的序列。雄激素受体蛋白的生物活性变体可相对于天然存在的CFTR蛋白序列含有一个或多个添加、取代和/或缺失。在一些实施方案中，CFTR蛋白的序列包含标准CFTR序列。全长CFTR蛋白的长度为1480个氨基酸并且具有五个结构域：两个跨膜结构域、一个与每个跨膜结构域连接的胞内核苷酸结合结构域(NBD)和一个胞内调节“R”结构域。全长野生型CFTR具有以下标准氨基酸序列(GenBank和NCBI参考序列登录号：NG_016465.4)：
Figure BDA0003084976600000581
Figure BDA0003084976600000591
在某些实施方案中，本公开提供了包含氨基酸的组合物，所述氨基酸可用于增加质膜上的CFTR蛋白的数量。在某些实施方案中，CFTR蛋白在序列上与SEQ ID NO:1的野生型CFTR至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高(例如100％)同一。在某些实施方案中，CFTR蛋白在序列上与SEQ ID NO:1的野生型CFTR至少70％同一。在某些实施方案中，CFTR蛋白在序列上与SEQ ID NO:1的野生型CFTR至少80％同一。在某些实施方案中，CFTR蛋白在序列上与SEQ ID NO:1的野生型CFTR至少90％同一。在某些实施方案中，CFTR蛋白在序列上与SEQ ID NO:1的野生型CFTR至少95％同一。在某些实施方案中，CFTR蛋白在序列上与SEQ ID NO:1的野生型CFTR至少96％同一。在某些实施方案中，CFTR蛋白在序列上与SEQ ID NO:1的野生型CFTR至少97％同一。在某些实施方案中，CFTR蛋白在序列上与SEQ ID NO:1的野生型CFTR至少98％同一。在某些实施方案中，CFTR蛋白在序列上与SEQ IDNO:1的野生型CFTR至少99％同一。在某些实施方案中，CFTR蛋白在序列上与SEQ ID NO:1的野生型CFTR至少99.5％同一。在某些实施方案中，CFTR蛋白在序列上与SEQ ID NO:1的野生型CFTR至少100％同一。
在某些实施方案中，CFTR蛋白为SEQ ID NO:1的全长CFTR的变体或片段。术语“变体”还涵盖由CFTR基因的可替代剪接产生的CFTR的剪接变体。在某些实施方案中，CFTR变体包含超过SEQ ID NO:1的全长CFTR至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％的多肽或由其组成。
在某些实施方案中，CFTR变体包含超过SEQ ID NO:1的全长CFTR至少50％的多肽或由其组成。在某些实施方案中，CFTR变体包含超过SEQ ID NO:1的全长CFTR至少60％的多肽或由其组成。在某些实施方案中，CFTR变体包含超过SEQ ID NO:1的全长CFTR至少70％的多肽或由其组成。在某些实施方案中，CFTR变体包含超过SEQ ID NO:1的全长CFTR至少80％的多肽或由其组成。在某些实施方案中，CFTR变体包含超过SEQ ID NO:1的全长CFTR至少90％的多肽或由其组成。在某些实施方案中，CFTR变体包含超过SEQ ID NO:1的全长CFTR至少95％的多肽或由其组成。在某些实施方案中，CFTR变体包含超过SEQ ID NO:1的全长CFTR至少96％的多肽或由其组成。在某些实施方案中，CFTR变体包含超过SEQ ID NO:1的全长CFTR至少97％的多肽或由其组成。在某些实施方案中，CFTR变体包含超过SEQ ID NO:1的全长CFTR至少98％的多肽或由其组成。在某些实施方案中，CFTR变体包含超过SEQ ID NO:1的全长CFTR至少99％的多肽或由其组成。在某些实施方案中，CFTR变体包含超过SEQ ID NO:1的全长CFTR至少99.5％的多肽或由其组成。在某些实施方案中，CFTR变体包含超过SEQ IDNO:1的全长CFTR至少100％的多肽或由其组成。这些变体可为野生型CFTR的生物活性变体，使得CFTR的离子通道门控功能和/或氯转运功能保留在变体中。这些变体可为野生型CFTR的无生物活性变体，使得CFTR的离子通道门控功能和/或氯转运功能在变体中被消除(例如，不起作用)。
在某些实施方案中，CFTR蛋白为突变型CFTR蛋白，例如，蛋白质的序列包括天然存在的CFTR突变体形式的序列。突变型CFTR可为哺乳动物(例如人)CFTR突变体。突变型CFTR可由无义的移码或mRNA剪接突变造成。已发现CFTR基因中的2,000多个突变，其中许多是临床相关的且/或导致疾病(例如囊性纤维化)表型。参见Bobadilla JL等人,2002,HumanMutation,19；第575-606页，其以引用的方式并入本文，关于另外的CFTR基因突变，证明其对于本公开组合物的施用可为有用的。在某些实施方案中，突变型CFTR为Gly542X、Gly551Asp、Arg553X、Arg117His、120del23或Phe508del突变体，其中X表示任何氨基酸。在某些实施方案中，突变型CFTR为Gly542X突变体，其中X表示任何氨基酸。在某些实施方案中，突变型CFTR为Gly551Asp突变体。在某些实施方案中，突变型CFTR为Arg553X突变体，其中X表示任何氨基酸。在某些实施方案中，突变型CFTR为Arg117His突变体。在某些实施方案中，突变型CFTR为120del23突变体。在某些实施方案中，突变型CFTR为Phe508del突变体。在某些实施方案中，人受试者在编码CFTR蛋白的基因的至少一个等位基因中具有CFTR突变(例如，一个等位基因编码野生型CFTR，且一个等位基因编码Phe508del CFTR)。在某些实施方案中，人受试者在编码CFTR蛋白的基因的至少两个等位基因中具有CFTR突变。在某些实施方案中，人受试者在编码CFTR蛋白的基因的至少两个等位基因中具有相同的突变(例如，两个等位基因均编码Phe508del突变体，即纯合的)。在某些实施方案中，人受试者在编码CFTR蛋白的基因的至少两个等位基因中具有不同的突变(例如，一个等位基因编码Phe508del突变体，且一个等位基因编码Gly551Asp突变体，即杂合的)。在某些实施方案中，细胞在编码CFTR蛋白的基因的至少一个等位基因中具有CFTR突变(例如，一个等位基因编码野生型CFTR，且一个等位基因编码Phe508del CFTR)。在某些实施方案中，细胞在编码CFTR蛋白的基因的至少两个等位基因中具有CFTR突变。在某些实施方案中，细胞在编码CFTR蛋白的基因的至少两个等位基因中具有相同的突变(例如，两个等位基因均编码Phe508del突变体，即纯合的)。在某些实施方案中，细胞在编码CFTR蛋白的基因的至少两个等位基因中具有不同的突变(例如，一个等位基因编码Phe508del突变体，且一个等位基因编码Gly551Asp突变体，即杂合的)。在某些实施方案中，细胞为上皮细胞。在某些实施方案中，上皮细胞为肺上皮细胞。在某些实施方案中，肺上皮细胞为支气管上皮细胞。在某些实施方案中，支气管上皮细胞来源于患有囊性纤维化的患者。
Phe508del突变体为患有囊性纤维化的患者中最常见的突变体。Phe508del突变体由缺失突变产生，其中缺失氨基酸位置508处的苯丙氨酸的密码子，导致CFTR蛋白缺少残基508(例如，长度为1479个氨基酸)。Phe508del CFTR具有以下标准氨基酸序列(GenBank和NCBI参考序列登录号：(NM_000492.3(CFTR):c.1521_1523delCTT)：
Figure BDA0003084976600000631
在某些实施方案中，CFTR蛋白为突变型CFTR蛋白，例如，蛋白质的序列包括天然存在的CFTR突变体形式的序列。在某些实施方案中，突变型CFTR蛋白在序列上与SEQ ID NO:2的Phe508del CFTR至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高(例如100％)同一。在某些实施方案中，突变型CFTR蛋白在序列上与SEQ ID NO:2的Phe508delCFTR至少70％同一。在某些实施方案中，突变型CFTR蛋白在序列上与SEQ ID NO:2的Phe508del CFTR至少80％同一。在某些实施方案中，突变型CFTR蛋白在序列上与SEQ IDNO:2的Phe508del CFTR至少90％同一。在某些实施方案中，突变型CFTR蛋白在序列上与SEQID NO:2的Phe508del CFTR至少95％同一。在某些实施方案中，突变型CFTR蛋白在序列上与SEQ ID NO:2的Phe508del CFTR至少96％同一。在某些实施方案中，突变型CFTR蛋白在序列上与SEQ ID NO:2的Phe508del CFTR至少97％同一。在某些实施方案中，突变型CFTR蛋白在序列上与SEQ ID NO:2的Phe508del CFTR至少98％同一。在某些实施方案中，突变型CFTR蛋白在序列上与SEQ ID NO:2的Phe508del CFTR至少99％同一。在某些实施方案中，突变型CFTR蛋白在序列上与SEQ ID NO:2的Phe508del CFTR至少99.5％同一。在某些实施方案中，突变型CFTR蛋白在序列上与SEQ ID NO:2的Phe508del CFTR至少100％同一。
在某些实施方案中，CFTR蛋白不能通过内质网(ER)中的传统细胞机制适当地加工。在某些实施方案中，CFTR蛋白无法正确折叠。在某些实施方案中，CFTR蛋白不能被适当地运输到质膜(例如，保留在细胞质或内质网中)。在某些实施方案中，CFTR蛋白显示受损的离子通道门控功能，即，不能适当地打开以使氯离子从细胞中转运出去。
在某些实施方案中，CFTR蛋白为SEQ ID NO:2的Phe508del CFTR的变体或片段。在某些实施方案中，CFTR变体包含超过SEQ ID NO:2的Phe508del CFTR至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％的多肽或由其组成。在某些实施方案中，CFTR变体包含超过SEQ ID NO:2的Phe508del CFTR至少50％的多肽或由其组成。在某些实施方案中，CFTR变体包含超过SEQ ID NO:2的Phe508del CFTR至少60％的多肽或由其组成。在某些实施方案中，CFTR变体包含超过SEQ ID NO:2的Phe508del CFTR至少70％的多肽或由其组成。在某些实施方案中，CFTR变体包含超过SEQ ID NO:2的Phe508del CFTR至少80％的多肽或由其组成。在某些实施方案中，CFTR变体包含超过SEQ ID NO:2的Phe508delCFTR至少90％的多肽或由其组成。在某些实施方案中，CFTR变体包含超过SEQ ID NO:2的Phe508del CFTR至少95％的多肽或由其组成。在某些实施方案中，CFTR变体包含超过SEQID NO:2的Phe508del CFTR至少96％的多肽或由其组成。在某些实施方案中，CFTR变体包含超过SEQ ID NO:2的Phe508del CFTR至少97％的多肽或由其组成。在某些实施方案中，CFTR变体包含超过SEQ ID NO:2的Phe508del CFTR至少98％的多肽或由其组成。在某些实施方案中，CFTR变体包含超过SEQ ID NO:2的Phe508del CFTR至少99％的多肽或由其组成。在某些实施方案中，CFTR变体包含超过SEQ ID NO:2的Phe508del CFTR至少99.5％的多肽或由其组成。在某些实施方案中，CFTR变体包含超过SEQ ID NO:2的Phe508del CFTR至少100％的多肽或由其组成。这些变体可为Phe508del CFTR的生物活性变体，使得CFTR的离子通道门控功能和/或氯转运功能保留在变体中。这些变体可为Phe508del CFTR的无生物活性变体，使得CFTR的离子通道门控功能和/或氯转运功能在变体中被消除(例如，不起作用)。
在一些实施方案中，可对哺乳动物核酸序列(例如人核酸序列，例如编码CFTR蛋白的人DNA序列(例如，野生型CFTR、Phe508del CFTR))进行密码子优化以增加在细胞中的表达。在某些实施方案中，可对编码CFTR蛋白的序列进行密码子优化以增加在上皮细胞中的表达。在某些实施方案中，上皮细胞为小肠上皮细胞。在某些实施方案中，上皮细胞为肺上皮细胞。在某些实施方案中，肺上皮细胞为支气管上皮细胞。支气管上皮细胞可源自患有囊性纤维化的受试者。
在一些实施方案中，以纯化形式提供CFTR蛋白。在一些实施方案中，以细胞裂解物的形式提供CFTR蛋白。在一些实施方案中，以组织匀浆的形式提供CFTR蛋白。
实施例
为了本文所述的发明可被更充分地理解，列出了以下实施例。提供本申请中描述的实施例以说明本文提供的方法、组合物和系统，并且不以任何方式解释为限制其范围。
一般实验
用于细胞培养的尤斯室设备：EM-CSYS-8尤斯室系统、P2300室、P2302滑块、VCCMC8多通道电压/电流钳、P2020电极和DM MC6单通道电极输入模块和虚拟膜(PhysiologicInstruments，San Diego，CA)。
电极：银/氯化银(Ag/AgCl)电极放置在4％含琼脂-林格氏缓冲液的电极头中
林格氏溶液：115mM NaCl、25mM NaHCO3-、2.4mM K2HPO4、0.4mM KH2PO4、1.2mMMgCl2、1.2mM CaCl2和20mM HEPES。用NaOH将pH调节至7.4。渗透压290-300mOsm。
实施例1
本文描述了制剂中的所选氨基酸(AA)或其组合，其能够通过增加CFTR和降低顶膜上的ENaC表达和活性来刺激氯分泌并降低ENaC活性。在具有突变CFTRΔF508的原代人支气管上皮细胞(HBEC)中测试了AA制剂。细胞获自CF和非CF患者。细胞在培养皿中生长至80％汇合，然后将其转移到snapwell渗透性插入物中。细胞在渗透性细胞培养支持物中生长至成熟并在空气-培养基界面中分化约30天。之后，在尤斯室中研究细胞，以测量跨上皮的电流和电阻。
在尤斯室中暴露于所选AA制剂(CF3AA、CF4AA-1/2/4、CF5AA)、CF4AA-3(阴性对照)和媒介物(对照)后，在空气-液体界面处培养28至42天的完全分化的原代纯合CFTRΔF508HBEC中测量短路电流(Isc)和电阻(R)。分别在用6μM苯扎米尔抑制ENaC，使用10μM毛喉素、1μM PG01(增效剂)激活cAMP激活的CFTR通道活性，使用20μM CFTR(inh)-172阻断CFTR通道以及使用10μMCaCCinh-A01阻断基础Ca激活的氯离子通道(CaCC)活性后，测量Isc的变化。在处理了24小时的CFTRΔF508 HBEC中重复类似的实验，之后用6μM C18(CFTR错误折叠的校正剂)进行实验。使用蛋白质印迹法分析细胞CFTR和ENaC蛋白的表达，并使用免疫荧光显微镜证实蛋白质定位。
图1A示出了对照(基础林格氏)溶液和各种单独的氨基酸(AA)在无C18时的苯扎米尔不敏感电流(μA)的图(n＝4)。图1B示出了对照(基础林格氏)溶液和各种单独的AA在无C18时的苯扎米尔不敏感电流(μA)的图(n＝4)。苯扎米尔为ENaC阻断剂，因此苯扎米尔不敏感电流代表在阻断ENaC之后剩余的电流。对于图1A和图1B，基于所选电流的Δ变化从单个氨基酸中选择最佳氨基酸。
图2A示出了对照(基础林格氏)溶液和各种AA组合(CF2AA、CF3AA-2、CF4AA、CF4AA-2、CF5AA-3、CF4AA-3和CF4AA-4)在无C18时的苯扎米尔不敏感电流(μA)的图(n＝4)。CF5AA-3产生最高的苯扎米尔不敏感电流，并且CF4AA-3为阴性对照。图2B示出了对照(基础林格氏)溶液、含DMSO的基础林格氏和各种AA组合(CF2AA、CF3AA-2、CF4AA、CF4AA-2、CF5AA-3、CF4AA-3和CF4AA-4)在无C18时的苯扎米尔不敏感电流(μA)的图(n＝4)。CF5AA-3仍产生最高的苯扎米尔不敏感电流，并且CF4AA-3为阴性对照。
图3A示出了对照(基础林格氏)溶液和各种单独的氨基酸(AA)在无C18时的苯扎米尔敏感电流(μA)的图(n＝4)。图3B示出了对照(基础林格氏)溶液和各种单独的氨基酸(AA)在有C18时的苯扎米尔敏感电流(μA)的图(n＝4)。苯扎米尔敏感电流越高，意味着保留的ENaC活性越多。可抑制ENaC活性的AA溶液显示出低的苯扎米尔敏感电流。
图4A示出了对照(基础林格氏)溶液和各种AA组合(CF2AA、CF3AA-2、CF4AA、CF4AA-2、CF5AA-3、CF4AA-3和CF4AA-4)在无C18时的苯扎米尔敏感电流(μA)的图(n＝4)。图4B示出了对照(基础林格氏)溶液、含DMSO的基础林格氏和各种AA组合(CF2AA、CF3AA-2、CF4AA、CF4AA-2、CF5AA-3、CF4AA-3和CF4AA-4)在有C18时的苯扎米尔敏感电流(μA)的图(n＝4)。CF5AA-3产生ENaC电流的最大下降。
总体上，细胞的基础电阻在350欧姆与500欧姆之间。如图4A所示，与对照相比，CF4AA-4和CF5AA-3降低了ENaC活性(苯并米尔敏感电流)。在用AA制剂(除CF4AA-3外)处理的细胞中，代表氯分泌的苯扎米尔不敏感电流更高，并且C18不导致Isc发生显著变化(图2A和图2B)。当与对照和CF4AA-3相比时，毛喉素和PG01进一步增加暴露于AA制剂的细胞中的Isc。CFTR是用AA制剂而不是CaCC处理的HBEC中氯分泌的主要因素。与相应的对照相比，用C18的预处理显示在毛喉素、PG01之后Isc的增加较小，并且在CFTR(inh)-172之后的抑制作用较小。在用AA制剂处理的HBEC中，CFTR蛋白的表达增加，并且ENaC减少，其中大部分CFTR位于细胞的顶膜中。
总之，基于一组所选的AA的制剂可通过修饰膜通道的表达和功能来改善CFTRΔF508 HBEC中功能障碍的氯离子和钠离子通道活性。这些制剂可单独使用或与现有的护理标准结合使用。
实施例2
材料和方法
细胞模型：将完全分化的原代正常人支气管上皮细胞(HBEC)和纯合CFTRΔF508HBEC(CF细胞)在空气-液体界面处的snapwell上培养28至40天。
尤斯室：当浸于媒介物或CF-5AA-3和CF-4AA-3中时，在正常的HBEC和CF细胞中测量跨上皮短路电流(Isc)、电阻(R)以及22Na和36Cl的单向通量(Jms&Jsm)和净通量(Jnet)。用毛喉素(FSK，顶端和基底外侧为10μM)和增效剂GLPG1837(顶端为3μM)刺激氯分泌，并且将苯扎米尔(顶端为6μM)和布美他尼(顶端和基底外侧为20uM)用于阻断ENaC和NKCC。
统计：使用方差分析(OriginPlus 2016)计算媒介物与AA制剂之间的统计差异。P<0.05被认为是统计学显著的。
特别是与图10和图11有关的另外的实验细节如下：
C18和/或VX661对具有CFTRΔF508的原代人支气管上皮细胞的作用通过在实验前将细胞与DMSO、含6μM C18和/或3μM VX661的DMSO一起孵育24小时来研究。在存在或不存在GLPG(N-(3-氨基甲酰基-5,5,7,7-四甲基-5,7-二氢-4H-噻吩并[2,3-c]吡喃-2-基)-1H-吡唑-5-甲酰胺)的情况下重复实验。将细胞浸于基础林格氏或氨基酸(AA)溶液中，并分别用5％CO2和95％O2鼓泡。基底外侧基础林格氏或AA溶液含有5mM葡萄糖。
处理如下：
1.30min基线电流
2.6μM苯扎米尔(1μL，M)–15min
3.有或无10uM毛喉素(1μL，M/S)+3uM GLPG1837(1μL，M)–15min
4.20uM CFTR Inh 172(2μL，M/S)–15min
5.10uM CaCC Inh AO1(1μL，M)–10min
6.20uM布美他尼(2μL，S)–15min
鲁玛卡托：C18；Symdeko：VX661(替扎卡托)/C18；依伐卡托：GLPG1837(可逆增效剂)
结果
图5至图9显示，通过校正和/或修饰质膜通道功能，所选AA组合可改善CFTRΔF508HBEC中功能障碍的氯离子和钠离子通道活性。这些制剂可以成功地补充具有CFTRΔF508突变的患者的现有护理标准。
图10A和图10B显示，CF5AA-3比校正剂更有效，并且比一种或多种校正剂加增效剂更有效。图10A和图10B还显示，CF5AA-3加一种或多种校正剂和增效剂协同起作用。
图11显示，相对于单独的C18(校正剂)，CF-5AA-3关于基础氯通量或受刺激的氯通量诱导了氯分泌的统计学显著增加。
图12示出了CF5AA-3通过CFTR增加阴离子电流的图。当与三重组合相比时，CF5AA-3的阴离子电流是显著更高且持续的。
图12显示CF5AA-3比校正剂更好地刺激CFTR通道，并且优于校正剂加增效剂。这些结果提供了CF5AA-3直接影响CFTR通道的证据。
图13显示CF5AA-3比校正剂更好地刺激CaCC通道，并且优于校正剂加增效剂。这些结果提供了CF5AA-3直接影响CaCC通道的证据。
实施例3
背景：在患有囊性纤维化的患者中，纯合F508del突变引起CFTR蛋白的错误折叠、缺陷的运输和异常的门控，造成氯分泌减少，从而导致慢性气道炎症和感染。校正CFTR错误折叠/运输(VX809和VX661)以及增强CFTR门控(VX770)的小分子组合已被批准用于治疗药物功效欠佳且具有不良反应的具有F508del的患者。本发明人将CF5AA-3与用单独VX809/VX770或VX661/VX770的处理在具有纯合F508del(HBEC-F508del)的原代人支气管上皮细胞中运输缺陷型CFTR和增加氯分泌的效率或加性效率进行比较。
方法：在尤斯室中浸于媒介物(无AA)、AA测试制剂(CF5AA-3)或AA阴性对照(NC；CF4AA-3)中的分化HBEC-F508del中测量跨上皮短路电流和36Cl净通量(Jnet)。用C18(VX809-类似物)、VX661或DMSO处理细胞24小时。用苯扎米尔阻断ENaC后，使用有或无毛喉素的GLPG1837(VX770-类似物)刺激氯分泌。分别添加CFTRinh-172、CaCCinh-A01或布美他尼以区分CFTR-、TMEM16A-和NKCC1敏感的氯电流。对HBEC-F508del膜级分进行蛋白质印迹以确定顶端CFTR表达。
结果：当与媒介物或NC相比时，浸于AA中的HBEC-F508del显示出显著更高的基础阴离子电流，无论细胞是用DMSO(10.7±0.2μA对1.4±0.1μA对2.1±0.1μA)、C18(11.1±0.2μA对1.6±0.1μA对2.1±0.1μA)或VX661(10.8±0.3μA对1.5±0.2μA对2.0±0.2μA)进行预处理。GLPG1837的刺激致使电流轻微增加，其中C18-AA中的峰值为12.7±0.4μA。在用C18和VX661预处理并用毛喉素和GLPG1837刺激的HBEC-F508del中，阴离子电流显著更高，并且相对于VX661-媒介物中的峰值7.9±0.7μA，VX661-AA中的峰值为14.8±0.4μA。在AA的存在下，CFTR对受刺激的电流的贡献最大(60％)，同时AA也激活TMEM16A(16％)和其他布美他尼敏感的氯离子通道(24％)。使用36Cl的通量研究证实，与先前无论如何处理的媒介物或NC相比，浸于AA中的HBEC-F508del中的氯分泌增加(图14)。CFTR膜表达(c带)在有或无校正剂的AA下增加：分别从6(任意单位)(DMSO-媒介物)增加到9(C18-媒介物)以及从8(DMSO-AA)增加到12(C18-AA)。参见图14。
结论：CF5AA-3增加顶端阴离子的分泌，类似于校正剂和增效剂，这表明CF5AA-3是作为CF患者的独立治疗选择、或作为在另外的临床前和临床研究后已经用于治疗CF患者的联合疗法中的添加物的有前景的药物活性成分。
实施例4
CF的动物模型
此方案中将使用基因修饰过的大鼠模型。此模型对其囊性纤维化跨膜电导调节因子(CFTR)基因有更改。大鼠模型具有人形式的CFTR基因，其中插入了常见的患者突变G551D，使得产生具有G551D突变(III类)的人源化CFTR蛋白(hCFTR)。大鼠模型在本文和本领域中称为hG551D。与其他囊性纤维化动物模型一样，到6周龄时，大约40％的hG551D大鼠表现出肠阻塞。通过用水施用Go-LYTELY以及将DietGel添加到食物中以补充水分，可预防某些肠梗阻的发生。此外，CF敲除(KO)大鼠出现牙齿异常，包括咬合不正，这可能使咀嚼更困难。因此，大鼠将每周三次接受软化的大鼠食物。还将监测受影响的大鼠是否需要修整牙齿以促进进食和预防发病或死亡。
hG551D大鼠品系被设计来模拟人疾病囊性纤维化。此疾病的特征在于缺乏通过上皮细胞层(例如鼻上皮层)的氯分泌。已经证明hG551D大鼠的大鼠气道表现出囊性纤维化肺病的特征。具体地，大鼠在气道中表达的黏膜下腺与人患者的黏膜下腺相似，且因此提供的病理与在人囊性纤维化患者中看到的一致。
为了测试hG551D大鼠中的氯分泌和对药物的反应，将进行鼻电位差程序(NPD)。关于NPD程序，轻擦大鼠尾巴，将其置于乳酸林格氏溶液中，并通过甘汞电池连接到高阻抗电压跟随器(VF 1；World Precision Instruments)。通过将Ag/AgCl电极(电线)桥连接到以180μl/h的速率泵送溶液的注射器中来建立探测探针。大约五分钟后，适当地催眠大鼠，以允许用拉至直径约0.15mm的尖端的PE 10套管插入鼻孔。灌注的溶液包括林格氏乳酸加阿米洛利(amiloride)，含有K2HPO4、KH2PO4、葡萄糖酸钠、NaHCO3、葡萄糖酸钙和毛喉素的低[Cl]溶液。每种灌注溶液将以大约2mL/min的速率施用，其中每只小鼠进入鼻腔总计小于80uL。对每种超灌注条件研究6分钟至10分钟。允许大鼠从麻醉中恢复，并施用阿替美唑(atipamazole)来逆转。
例如，本研究中的动物将用以下四种化合物中的一种进行处理：测试制剂(CF5AA-3)、阳性对照(依伐卡托)、阴性对照(CF4AA-3)或媒介物。依伐卡托将通过经口灌胃给予；其他化合物将通过气溶胶喷雾给予。每天一次对动物进行处理，持续7天，然后进行鼻电位差程序以测试药物功效。将比较最终剂量的依伐卡托或VS-009后24小时的鼻电位差。一旦完成，将对动物实施安乐死以进行组织收集及后续分析。
表C提供所示剂的示例性剂量。
程序或目的 剂 剂量 途径 频率
CFTR调节 依伐卡托 40mg/kg/天 经口灌胃 每天，持续七天
CFTR调节 CF5AA-3 3mM 喷雾 每天，持续七天
CFTR调节 CF4AA-3 3mM 喷雾 每天，持续七天
CFTR调节 媒介物 不适用 喷雾 每天，持续七天
等效方案和范围
除非相反地指出或另外从上下文中明显看出，否则在权利要求中诸如“一个/种(a/an)”和“所述”的冠词可意指一个或一个以上。除非相反地指出或另外从上下文中明显看出，否则如果在给定产物或过程中存在、使用或另外与之相关的一个、一个以上或所有组成员，则在组的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求或描述将被视为满意的。本发明包括其中给定产物或过程中存在、使用或另外与之相关的正好一个组成员的实施方案。本发明包括其中给定产物或过程中存在、使用或另外与之相关的一个以上或所有组成员的实施方案。
此外，本发明涵盖所有变型、组合和置换，其中将来自一项或多项所列权利要求的一个或多个限制、要素、条款和描述性术语引入到另一项权利要求中。例如，可将依赖于另一项权利要求的任何权利要求修改为包括在依赖于同一基本权利要求的任何其他权利要求中所见的一个或多个限制。在要素以列表形式(例如，以马库什(Markush)组形式)提供的情况下，还公开了要素的每个亚组，并且可从组中移除任一或任何要素。应当理解，一般来讲，在本发明或本发明的方面称为包括特定要素和/或特征的情况下，本发明或本发明的方面的某些实施方案由这类要素和/或特征组成或基本上由其组成。出于简化目的，这些实施方案未在本文中以同样的话具体阐述。还应注意，术语“包含”和“含有”旨在是开放的，并允许包括另外的要素或步骤。
本申请涉及各种颁布的专利、公开的专利申请、期刊文章和其他出版物，所有这些均以引用的方式整体并入本文。如果任何并入的参考文献与本说明书之间存在冲突，则以本说明书为准。另外，落入现有技术范围内的本发明的任何特定实施方案可明确地从权利要求的任何一项或多项中排除。因为这类实施方案被认为是本领域普通技术人员已知的，所以即使在本文中未明确提出排除，也可将它们排除。本发明的任何特定实施方案可出于任何原因从任何权利要求中排除，无论是否与现有技术的存在有关。
本领域技术人员将认识到或将能够确定仅使用常规实验，就能实现本文所述的具体实施方案的许多等效物。本文所述的实施方案的范围不旨在限于以上描述，而是如所附权利要求书中所述。本领域普通技术人员将理解，可在不脱离如所附权利要求书中所限定的本发明的精神或范围的情况下，对此描述进行各种改变和修改。在权利要求或说明书涉及产物(例如，物质的组成)的情况下，应当理解，根据本文公开的任何方法制造或使用产物的方法，以及将产物用于本文公开的任何一个或多个目的的方法在适用的情况下包括在本公开中，除非另外指出或除非本领域普通技术人员将明显看出会产生矛盾或不一致。在权利要求或说明书涉及一种方法的情况下，应当理解，对于执行方法的一个或多个步骤有用的一种或多种产物(例如，物质的组成)、一个或多个装置或一个或多个系统在适用的情况下包括在本公开中，除非另外指出或除非本领域普通技术人员将明显看出会产生矛盾或不一致。
在本文中给出范围的情况下，提供了其中包括端点的实施方案、其中两个端点均被排除的实施方案、以及其中包括一个端点而排除另一端点的实施方案。除非另外指出，否则应假定包括两个端点。此外，应当理解，除非另外指出或另外从上下文和本领域普通技术人员的理解中显而易见，否则在本发明的不同实施方案中，表示为范围的值可假定为所述范围内的任何特定值或子范围，除非上下文另外明确指出，否则不超过该范围下限的十分之一单位。还应理解，在本文中陈述一系列数值的情况下，提供了与该系列中任何两个值所定义的任何中间值或范围类似地相关的实施方案，并且最低值可视为最小值且最大值可视为最大值。在本文中一系列数字之前出现短语诸如“至少”、“至多”、“不超过”或类似短语的情况下，除非上下文另外明确指出，否则应理解这些短语适用于各种实施方案中的列表中的每个数字(应当理解，根据上下文，值的100％，例如，以百分比表示的值可为上限)。例如，在各种实施方案中，“至少1、2或3”应理解为意指“至少1、至少2或至少3”。还应理解，在适用的情况下，明确设想了任何和所有合理的下限和上限。例如，本领域普通技术人员可基于诸如便利性、成本、时间、精力、可用性(例如，样品、剂或试剂)、统计考虑等因素来选择或确定合理的下限或上限。在一些实施方案中，上限或下限与特定值相差2倍、3倍、5倍或10倍。如本文所用，数值包括以百分比表示的值。对于其中数值以“约”或“大约”开头的每个实施方案，提供了列举精确值的实施方案。对于其中数值不以“约”或“大约”开头的每个实施方案，提供了其中值以“约”或“大约”开头的实施方案。“大约”或“约”通常包括以任何方向(大于或小于数字)落入1％范围内的数字，或在一些实施方案中落入数字的5％范围内、或在一些实施方案中落入数字的10％范围内，除非另外说明或从上下文中明显看出(除非在此种数字不允许超过可能值的100％的情况下)。应当理解，除非明确地相反指出，否则在本文要求保护的包括一个以上动作的任何方法中，所述方法的动作的顺序不一定限于阐述所述方法的动作的顺序，但本发明包括顺序受此限制的实施方案。在一些实施方案中，方法可由个体或实体执行。在一些实施方案中，方法的步骤可由两个或更多个体或实体执行，使得方法被共同执行。在一些实施方案中，方法可至少部分地通过请求或授权另一个体或实体执行方法的一个、一个以上或所有步骤来执行。在一些实施方案中，方法包括请求两个或更多实体或个体各自执行方法的至少一个步骤。在一些实施方案中，协调两个或更多个步骤的执行，以使得方法被共同执行。执行一个或多个不同步骤的个体或实体可能互动或可能不互动。
本文使用的章节标题不以任何方式解释为限制性的。明确设想在任何章节标题下呈现的主题可适用于本文所述的任何方面或实施方案。
本文的实施方案或方面可针对本文所述的任何剂、组合物、物品、试剂盒和/或方法。设想在任何适当的情况下，任何一个或多个实施方案或方面可与任何一个或多个其他实施方案或方面自由地组合。例如，提供两种或更多种相互不矛盾的剂、组合物、物品、试剂盒和/或方法的任何组合。应当理解，除非另外指出或明确说明，否则本文中任何地方的术语的任何描述或示例都可应用于这个术语在本文中出现的任何地方(例如，在与这个术语相关的任何方面或实施方案中)。
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Val Asp Gly Gly Cys Val Leu Ser His Gly His Lys Gln Leu Met
1340 1345 1350
Cys Leu Ala Arg Ser Val Leu Ser Lys Ala Lys Ile Leu Leu Leu
1355 1360 1365
Asp Glu Pro Ser Ala His Leu Asp Pro Val Thr Tyr Gln Ile Ile
1370 1375 1380
Arg Arg Thr Leu Lys Gln Ala Phe Ala Asp Cys Thr Val Ile Leu
1385 1390 1395
Cys Glu His Arg Ile Glu Ala Met Leu Glu Cys Gln Gln Phe Leu
1400 1405 1410
Val Ile Glu Glu Asn Lys Val Arg Gln Tyr Asp Ser Ile Gln Lys
1415 1420 1425
Leu Leu Asn Glu Arg Ser Leu Phe Arg Gln Ala Ile Ser Pro Ser
1430 1435 1440
Asp Arg Val Lys Leu Phe Pro His Arg Asn Ser Ser Lys Cys Lys
1445 1450 1455
Ser Lys Pro Gln Ile Ala Ala Leu Lys Glu Glu Thr Glu Glu Glu
1460 1465 1470
Val Gln Asp Thr Arg Leu
1475

Claims (51)

1.一种药物制剂，所述药物制剂包含：
a)药物活性成分，其基本上由治疗有效量的呈游离氨基酸的半胱氨酸和脯氨酸的每种及
治疗有效量的至少一种选自由甘氨酸、酪氨酸和赖氨酸组成的组的另外的游离氨基酸组成，
前提条件是所述游离氨基酸中的至少一个为L-氨基酸；以及
任选地
b)至少一种无药物活性成分。
2.如权利要求1所述的药物制剂，其中所述游离氨基酸为L-氨基酸。
3.如权利要求1或权利要求2所述的药物制剂，其中所述药物制剂还包含水作为无药物活性成分。
4.如权利要求1至3中任一项所述的药物制剂，其中所述至少一种无药物活性成分包括药学上可接受的载剂、缓冲剂、电解质、佐剂或赋形剂。
5.如权利要求1至4中任一项所述的药物制剂，其中所述药物制剂不包含除半胱氨酸、脯氨酸以及至少一种选自由甘氨酸、酪氨酸和赖氨酸组成的组的另外的氨基酸以外的游离氨基酸。
6.如权利要求1至5中任一项所述的药物制剂，其中所述药物制剂基本上由以下组成：
呈游离氨基酸的半胱氨酸和脯氨酸及
一种或多种选自由甘氨酸、酪氨酸和赖氨酸组成的组的另外的游离氨基酸，
前提条件是所述游离氨基酸中的至少一个为L-氨基酸。
7.如权利要求1至5中任一项所述的药物制剂，其中所述药物制剂由以下组成：
呈游离氨基酸的半胱氨酸和脯氨酸及
一种或多种选自由甘氨酸、酪氨酸和赖氨酸组成的组的另外的游离氨基酸，
前提条件是所述游离氨基酸中的至少一个为L-氨基酸。
8.如权利要求1至5中任一项所述的药物制剂，其中所述药物制剂包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：呈游离氨基酸的半胱氨酸、脯氨酸和甘氨酸及
任选的一种或多种选自由酪氨酸和赖氨酸组成的组的另外的游离氨基酸，
前提条件是所述游离氨基酸中的至少一个为L-氨基酸。
9.根据权利要求8所述的药物制剂，其中所述药物制剂包含呈游离氨基酸的半胱氨酸、脯氨酸和甘氨酸、由其组成或基本上由其组成，
前提条件是所述游离氨基酸中的至少一个为L-氨基酸，
并且不含其他游离氨基酸。
10.如权利要求1至5中任一项所述的药物制剂，其中所述药物制剂包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：呈游离氨基酸的半胱氨酸、脯氨酸和酪氨酸及
任选的一种或多种选自由甘氨酸和赖氨酸组成的组的另外的游离氨基酸，
前提条件是所述游离氨基酸中的至少一个为L-氨基酸。
11.如权利要求10所述的药物制剂，其中所述药物制剂包含呈游离氨基酸的半胱氨酸、脯氨酸和酪氨酸、由其组成或基本上由其组成，
前提条件是所述游离氨基酸中的至少一个为L-氨基酸，
并且不含其他游离氨基酸。
12.如权利要求1至5中任一项所述的药物制剂，其中所述药物制剂包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：呈游离氨基酸的半胱氨酸、脯氨酸和赖氨酸及
任选的一种或多种选自由甘氨酸和酪氨酸组成的组的另外的游离氨基酸，
前提条件是所述游离氨基酸中的至少一个为L-氨基酸。
13.如权利要求12所述的药物制剂，其中所述药物制剂包含呈游离氨基酸的半胱氨酸、脯氨酸和赖氨酸、由其组成或基本上由其组成，
前提条件是所述游离氨基酸中的至少一个为L-氨基酸，
并且不含其他游离氨基酸。
14.如权利要求1至5中任一项所述的药物制剂，其中所述药物制剂包含呈游离氨基酸的半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸和酪氨酸、由其组成或基本上由其组成，并且
任选地另外包含呈游离氨基酸的赖氨酸，
前提条件是所述游离氨基酸中的至少一个为L-氨基酸。
15.如权利要求14所述的药物制剂，其中所述药物制剂包含呈游离氨基酸的半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸和酪氨酸、由其组成或基本上由其组成，
前提条件是所述游离氨基酸中的至少一个为L-氨基酸，
并且不含其他游离氨基酸。
16.如权利要求1至5中任一项所述的药物制剂，其中所述药物制剂包含呈游离氨基酸的半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸和赖氨酸、由其组成或基本上由其组成，并且
任选地另外包含呈游离氨基酸的酪氨酸，
前提条件是所述游离氨基酸中的至少一个为L-氨基酸。
17.如权利要求16所述的药物制剂，其中所述药物制剂包含呈游离氨基酸的半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸和赖氨酸、由其组成或基本上由其组成，
前提条件是所述游离氨基酸中的至少一个为L-氨基酸，
并且不含其他游离氨基酸。
18.如权利要求1至5中任一项所述的药物制剂，其中所述药物制剂包含呈游离氨基酸的半胱氨酸、脯氨酸、赖氨酸和酪氨酸、由其组成或基本上由其组成，并且
任选地另外包含作为游离氨基酸的甘氨酸，
前提条件是所述游离氨基酸中的至少一个为L-氨基酸。
19.如权利要求18所述的药物制剂，其中所述药物制剂包含呈游离氨基酸的半胱氨酸、脯氨酸、赖氨酸和酪氨酸、由其组成或基本上由其组成，
前提条件是所述游离氨基酸中的至少一个为L-氨基酸，
并且不含其他游离氨基酸。
20.如权利要求1至5中任一项所述的药物制剂，其中所述药物制剂包含呈游离氨基酸的半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸、酪氨酸和赖氨酸、由其组成或基本上由其组成，
前提条件是所述游离氨基酸中的至少一个为L-氨基酸。
21.如权利要求20所述的制剂，其中所述制剂不含其他游离氨基酸。
22.如权利要求1至21中任一项所述的药物制剂，其中所述药物制剂为无菌的。
23.如权利要求1至22中任一项所述的药物制剂，其中所述药物制剂被配制用于通过肠、肺、吸入、鼻内或舌下途径施用。
24.如权利要求1至23中任一项所述的制剂，其用作药剂。
25.如权利要求46所述的制剂，其用于治疗囊性纤维化。
26.一种根据权利要求1至23中任一项所述的制剂在制造用于治疗囊性纤维化的药剂中的用途。
27.一种用于治疗患有囊性纤维化的受试者的方法，所述方法包括
向所述患有囊性纤维化的受试者施用如权利要求1至23中任一项所述的制剂，
其中所述施用减轻囊性纤维化的至少一种症状。
28.如权利要求25至27中任一项所述所使用的制剂、用途或方法，其中所述受试者表达野生型CFTR。
29.如权利要求25至28中任一项所述所使用的制剂、用途或方法，其中所述受试者在CFTR基因中具有突变。
30.如权利要求25至29中任一项所述所使用的制剂、用途或方法，其中所述受试者表达野生型CFTR和突变型CFTR。
31.如权利要求25至30中任一项所述所使用的制剂、用途或方法，其中所述受试者患有囊性纤维化，其中存在与野生型CFTR的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一的CFTR蛋白，其中所述野生型CFTR序列包含SEQ ID NO:1。
32.如权利要求29至31中任一项所述所使用的制剂、用途或方法，其中所述CFTR中的突变包含Gly542X、Gly551Asp、Arg553X、Arg117His、120del23、Phe508del或其组合，其中X为任何氨基酸。
33.如权利要求32所述所使用的制剂、用途或方法，其中所述CFTR为Phe508del CFTR突变体。
34.如权利要求25至33中任一项所述所使用的制剂、用途或方法，其还包括施用另外的治疗剂。
35.如权利要求34所述所使用的制剂、用途或方法，其中所述另外的治疗剂包括小分子药物、蛋白质药物、核酸药物或其组合中的至少一种。
36.如权利要求34或权利要求35所述所使用的制剂、用途或方法，其中所述另外的治疗剂为CFTR增效剂、CFTR校正剂、CFTR通读剂或其组合中的至少一种。
37.如权利要求36所述所使用的制剂、用途或方法，其中所述另外的治疗剂为CFTR增效剂。
38.如权利要求37所述所使用的制剂、用途或方法，其中所述CFTR增效剂为依伐卡托。
39.一种试剂盒，所述试剂盒包括：
根据权利要求22或权利要求23所述的药物制剂；和
用于施用于受试者或使生物样品与所述制剂接触的说明书。
40.一种用于增加存在于至少一个细胞的质膜上的囊性纤维化跨膜电导调节因子(CFTR)蛋白的数量的方法，所述方法包括：
使所述至少一个细胞与有效量的如权利要求22或权利要求23所述的药物制剂接触，
其中所述接触促进CFTR的折叠或CFTR向所述质膜的转运中的至少一种，从而增加存在于所述细胞质膜上的CFTR蛋白的数量。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述质膜上的野生型CFTR蛋白的数量增加。
42.如权利要求40或权利要求41所述的方法，其中所述质膜上的突变型CFTR蛋白的数量增加。
43.如权利要求40至42中任一项所述的方法，其中与所述质膜上的野生型CFTR的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％同一的CFTR蛋白的数量增加，其中所述野生型CFTR包含SEQ ID NO:1。
44.如权利要求40至43中任一项所述的方法，其中所述CFTR蛋白中的一个或多个包含Gly542X、Gly551Asp、Arg553X、Arg117His、120del23、Phe508del或其组合，其中X为任何氨基酸。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述CFTR蛋白中的一个或多个包含Phe508del突变。
46.如权利要求40至45中任一项所述的方法，其中通过从所述细胞排出的氯离子的增加来检测存在于所述细胞质膜上的CFTR蛋白数量的增加。
47.如权利要求40至46中任一项所述的方法，其中存在于所述细胞质膜上的CFTR蛋白数量的增加与从所述细胞排出的水的增加有关。
48.如权利要求40至47中任一项所述的方法，其中所述细胞为上皮细胞。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述上皮细胞为肺上皮细胞。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述肺上皮细胞为支气管上皮细胞。
51.如权利要求50所述的方法，其中从患有囊性纤维化的受试者中分离出所述支气管上皮细胞。
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