CN113163799A - 玉米蛋白质水解产物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了制备玉米蛋白质水解产物的组合物和方法，该方法包括获得具有至少约75重量％的玉米蛋白质浓度的玉米蛋白质组合物，将酶以酶与玉米蛋白质按重量计约1:100至约1:20的比率添加到包含玉米蛋白质组合物的玉米蛋白质悬浮液中，控制玉米蛋白质悬浮液的pH和温度以水解玉米蛋白质，以及终止玉米蛋白质的水解以提供玉米蛋白质水解产物，该玉米蛋白质水解产物在选自pH 7.0、pH 3.4、pH 5的pH下以及pH 7.0、pH5和pH 3.4中的全部pH下具有约7％至约37％的溶解度。该玉米蛋白质水解产物可用于各种食品、饲料、饮料和其他应用。
Description
优先权声明
本申请要求2018年11月2日提交的美国临时专利申请号62/755,175的优先权及权益，该文献的全部内容全文以引用方式并入本文。
技术领域
本专利申请涉及在食品和饮料产品中使用的玉米蛋白质的领域。更具体地讲，本专利申请涉及具有高溶解度的玉米蛋白质水解产物及其制备方法。
背景技术
无论蛋白质是食物中固有的还是添加到食物中的，其均可对加工和进食体验具有显著影响。蛋白质是饮食的重要营养组分，并且制造商和消费者经常寻找蛋白质成分以提供附加的有益效果。有益效果可能是感官上的或经济上的。最近，人们一直关注用较便宜的植物来源蛋白质替代相对昂贵的动物来源蛋白质。然而，植物来源蛋白质成分的功能特性组合可能与动物来源蛋白质的功能特性组合不匹配。这需要对植物蛋白质的行为进行改性以更好地匹配被替代的动物蛋白质。
对成分进行改性的方法包括纯化、物理加工和酶改性。用酶对植物蛋白质进行改性在本领域中是熟知的，但是将酶应用于蛋白质以实现特定行为并不简单。不同的酶表现出不同的特异性范围和强度。这意味着当应用于相同的蛋白质时，两种酶可能导致非常不同的结果。反应条件(例如pH、温度、时间和底物-酶比率)可改变单种酶对单种蛋白质底物的效果。处理蛋白质的方式(暴露于不同水合、剪切、温度、pH等的组合和顺序)可影响酶与蛋白质反应的能力，从而导致不同的结果。
发明内容
玉米蛋白质作为潜在的食品成分在食品工业中几乎没有受到关注。例如，目前市场上没有适于食物用途且具有大于65重量％的蛋白质含量的商业玉米蛋白质浓缩物或分离物。玉米蛋白质不含过敏原，这使得其适于广泛使用并降低与混合的过敏原/非过敏原产生相关联的清洁成本。然而，玉米蛋白质具有较差的溶解度，这限制了其在一些食品应用中的应用。在食品工业中仍然需要提供用于一系列产品类别的可溶性玉米蛋白质。具体地讲，如本文所述的玉米蛋白质水解产物具有改善的溶解度以用于各种食品和饮料应用。
此外，已发现通过选择玉米蛋白质原料并控制蛋白质的水解度，在一个方面所得玉米蛋白质水解产物表现出优异的风味特性。在一个方面，所得玉米蛋白质水解产物表现出低程度的可感知苦味风味，如通过测试小组分析所评估的那样。在一个方面，所得玉米蛋白质水解产物具有小于0.25g/L的咖啡因当量值。在一个方面，所得玉米蛋白质水解产物具有小于0.23g/L的咖啡因当量值。在一个方面，所得玉米蛋白质水解产物具有小于0.21g/L的咖啡因当量值。在一个方面，所得玉米蛋白质水解产物具有0.1g/L至0.25g/L的咖啡因当量值。在一个方面，所得玉米蛋白质水解产物具有0.1g/L至0.23g/L的咖啡因当量值。在一个方面，所得玉米蛋白质水解产物具有0.1g/L至0.21g/L的咖啡因当量值。在一个方面，所得玉米蛋白质水解产物具有0.15g/L至0.25g/L的咖啡因当量值。在一个方面，所得玉米蛋白质水解产物具有0.15g/L至0.23g/L的咖啡因当量值。在一个方面，所得玉米蛋白质水解产物具有0.15g/L至0.21g/L的咖啡因当量值。
在一个方面，提供了在选自pH 7.0、pH 3.4、pH 5的pH下以及pH 7.0、pH 5和pH3.4中的全部pH下具有至少约75重量％的玉米蛋白质浓度和约7％至约37％的溶解度的玉米蛋白质水解产物。在一个方面，玉米蛋白质水解产物在选自pH 7.0、pH 3.4、pH 5的pH下以及pH 7.0、pH 5和pH 3.4中的全部pH下具有约7％至约20％的溶解度。在一个方面，玉米蛋白质水解产物在选自pH 7.0、pH 3.4、pH 5的pH下以及pH 7.0、pH 5和pH 3.4中的全部pH下具有约15％至约28％的溶解度。在一个方面，玉米蛋白质水解产物在选自pH 7.0、pH3.4、pH 5的pH下以及pH 7.0、pH 5和pH 3.4中的全部pH下具有约24％至约35％的溶解度。
在一个方面，玉米蛋白质水解产物具有约1％至约17％的水解度(基于总蛋白质计)。在一个方面，玉米蛋白质水解产物具有约1％至约7％的水解度。在一个方面，玉米蛋白质水解产物具有约1％至约5％的水解度。在一个方面，玉米蛋白质水解产物具有约8％至约14％的水解度。在一个方面，玉米蛋白质水解产物具有约10％至约17％的水解度。在一个方面，玉米蛋白质水解产物具有约3％至8％的水解度。在一个方面，玉米蛋白质水解产物具有约4％至约6％的水解度。
在一个方面，制备玉米蛋白质水解产物的方法包括获得玉米蛋白质组合物(即，原料)，将酶以酶与玉米蛋白质按重量计约1:100至约1:20的比率添加到包含玉米蛋白质组合物的玉米蛋白质悬浮液中，控制玉米蛋白质悬浮液的pH和温度以水解玉米蛋白质，以及终止玉米蛋白质的水解以提供玉米蛋白质水解产物，该玉米蛋白质水解产物在选自pH 7.0、pH 3.4、pH 5的pH下以及pH 7.0、pH 5和pH 3.4中的全部pH下具有约1％至约17％的水解度和约7％至约37％的溶解度。在一个方面，随后干燥由此提供的玉米蛋白质水解产物。
在一个方面，制备玉米蛋白质水解产物的方法包括获得具有至少约75重量％的玉米蛋白质浓度的玉米蛋白质组合物(即，原料)，在约40℃至约55℃的温度下将玉米蛋白质组合物添加到水中以获得5％(w/v)玉米蛋白质悬浮液，将玉米蛋白质悬浮液的pH调节至约5.0至约6.0的pH水平，将酶以酶与玉米蛋白质按重量计约1:100至约1:20的比率添加到玉米蛋白质组合物中，以及水解玉米蛋白质悬浮液，同时保持温度和pH，以及终止玉米蛋白质的水解以提供玉米蛋白质水解产物，该玉米蛋白质水解产物在选自pH 7.0、pH 3.4、pH 5的pH下以及pH 7.0、pH 5和pH 3.4中的全部pH下具有约1％至约17％的水解度和约7％至约37％的溶解度。在一个方面，随后干燥由此提供的玉米蛋白质水解产物。
本文所述的玉米蛋白质水解产物的增强的溶解度可有利于玉米蛋白质水解产物在多种产品类别诸如食品、饮料和饲料中的使用。在一个方面，玉米蛋白质水解产物可作为蛋白质源添加剂包括在各种非液体食物产品中。本发明的玉米蛋白质水解产物可有利地提高食物产品的蛋白质含量，而不引入令人反感的风味。此外，本文所述的玉米蛋白质水解产物表现出优异的质地特性，并且向食物提供提高的蛋白质含量，同时不会不利地影响感官特性诸如口感。例如，未水解的玉米蛋白质可具有粒状或砂质感，而本发明的玉米蛋白质水解产物可表现出优异、更光滑的口感。增强的溶解度可增加在食物中重要的其他功能，并且蛋白质改性可改变那些功能而不改变溶解度。
玉米蛋白质是有价值的蛋白质营养来源。营养有益效果可以多种方式描述，并且蛋白质消耗对生理机能具有充分描述的影响。亮氨酸是存在于玉米蛋白质中的氨基酸中的一种，而玉米蛋白质是蛋白质中更丰富的亮氨酸来源中的一种。亮氨酸对于刺激肌肉蛋白质合成尤其重要。这是所有年龄的消费者所关注的，尤其是对于中老年人而言。对增加肌肉量感兴趣的年轻消费者通常消耗包含充足亮氨酸的蛋白质。这些蛋白质中的一些是昂贵的或仅可得自动物来源。玉米蛋白质比大多数动物蛋白质便宜并且具有基于植物的可持续性有益效果。寻求肌肉蛋白质合成有益效果的人消耗蛋白质的常见方式之一是以饮料形式消耗。未改性的玉米蛋白质在水中的溶解度和分散性较差，但本发明的产品更适于制备饮料。具有改善的溶解度和低苦味，玉米蛋白质可单独配制或与其他蛋白质组合配制以产生具有所需感官特性的营养饮料。经改性的蛋白质也可更适于在其他应用中使用。
该发明内容旨在提供对本专利申请主题的概述。不旨在提供对本发明的排他的或详尽列举的解释。包括详细描述以提供关于本专利申请的另外信息。
附图说明
在未必按比例绘制的附图中，类似的数字可在不同的视图中描述类似的部分。具有不同字母后缀的类似数字可表示类似部分的不同实例。附图通常以举例的方式而非限制的方式示出本文档中讨论的各种实施方案。
图1是在pH 3.4和pH 7.0下蛋白质溶解度之间的关系图。
图2是蛋白质溶解度和水解度之间的关系图。
图3是示出在各种水解条件下产生的玉米蛋白质水解产物的溶解度的曲线。
图4是水解期间pH和温度对玉米蛋白质水解产物在pH 3.4下的溶解度的影响的图。
图5是水解期间pH和温度对玉米蛋白质水解产物在pH 7.0下的溶解度的影响的图。
图6A是pH对未经过热处理的玉米蛋白质水解产物的溶解度的影响的图。
图6B是pH对经过热处理的玉米蛋白质水解产物的溶解度的影响的图。
图7A是水解期间蛋白质浓度对ph 3.4下的溶解度的影响的图。
图7B是水解期间蛋白质浓度对ph 7下的溶解度的影响的图。
图8是示出CP1、DH5、DH10、DH16和DH30**的蛋白质二级结构的图。
图9是示出酶处理之前和之后玉米蛋白质的表面疏水性的图。
具体实施方式
“玉米蛋白质组合物”是指包含未经历水解的玉米蛋白质的组合物；换句话讲，它是水解反应中使用的原料。此类组合物中的玉米蛋白质含量可小于100％蛋白质。此类组合物中的玉米蛋白质含量在至少75重量％和至少79重量％蛋白质的范围内。通过AACCI 46-30.01(粗蛋白–燃烧法)使用氮分析仪(LECO TruSpecNTM,St.Joseph,Michigan USA)和6.25的转换因子测定蛋白质含量。
“玉米蛋白质水解产物”或“水解产物”是指在受控条件下经历有限水解的玉米蛋白质组合物。
“水解度(DH)”是指水解产物中裂解肽键的比例。DH通过邻苯二甲醛(OPA)方法测定。
“蛋白质溶解度”是指存在于液相中的蛋白质的浓度相对于平衡时存在于液相和固相中的蛋白质的量。蛋白质溶解度可以百分比报告，并且通过测量在向以特定蛋白质含量、pH和盐浓度制备的溶液施加离心力之后上清液中的蛋白质含量相对于离心之前溶液中的总蛋白质来测定。
玉米蛋白质水解产物
提供了在选自pH 7.0、pH 3.4、pH 5的pH下以及pH 7.0、pH 5和pH 3.4中的全部pH下具有至少约75重量％的玉米蛋白质浓度和约7％至约37％的溶解度的玉米蛋白质水解产物。在一个方面，玉米蛋白质水解产物在3.4至7的任何pH下具有约7％至约37％的溶解度，或者玉米蛋白质水解产物在3.4至9的任何pH下具有约7％至约37％的溶解度。
在一个方面，玉米蛋白质浓度为至少约79重量％。在一个方面，玉米蛋白质浓度为至少约82重量％。在一个方面，玉米蛋白质浓度为至少约85重量％。在一个方面，玉米蛋白质浓度为至少约89重量％。在一个方面，玉米蛋白质浓度为至少约92重量％。在一个方面，玉米蛋白质浓度为至少约98重量％。
在一个方面，玉米蛋白质浓度为约79重量％至约89重量％。在一个方面，玉米蛋白质浓度为约82重量％至约89重量％。在一个方面，玉米蛋白质浓度为约85重量％至约89重量％。在一个方面，玉米蛋白质浓度为约85重量％至约98重量％。在一个方面，玉米蛋白质浓度为约89重量％至约98重量％。在一个方面，玉米蛋白质浓度为约92重量％至约98重量％。在一个方面，玉米蛋白质浓度为约95重量％至约100重量％。在一个方面，玉米蛋白质浓度为约98重量％至约100重量％。
在一个方面，玉米蛋白质水解产物在pH 7.0下具有约7％至约37％的溶解度。在一个方面，玉米蛋白质水解产物在pH 7.0下具有约7％至约20％的溶解度。在一个方面，玉米蛋白质水解产物在pH 7.0下具有约15％至约28％的溶解度。在一个方面，玉米蛋白质水解产物在pH 7.0下具有约24％至约35％的溶解度；或者其中在pH 7.0下溶解度为约16％至约24％。
在一个方面，玉米蛋白质水解产物在pH 3.4下具有约7％至约37％的溶解度。在一个方面，玉米蛋白质水解产物在pH 3.4下具有约7％至约20％的溶解度。在一个方面，玉米蛋白质水解产物在pH 3.4下具有约15％至约28％的溶解度。在一个方面，玉米蛋白质水解产物在pH 3.4下具有约24％至约35％的溶解度；或者其中在pH 3.4下溶解度为约16％至约24％。
已经发现，如本文所述的玉米蛋白质水解产物可有利地表现出期望的溶解度特性而对pH不敏感。换句话讲，当测量溶解度时，无论组合物的pH是否处于3.4至9的任何pH下，给定的玉米蛋白质水解产物组合物将具有基本上相同的溶解度特性。为了方便起见，测试玉米蛋白质水解产物组合物在pH 3.4、5和7下的溶解度是组合物在相关pH值下溶解度特性的敏感性的指示。如本文所述的组合物在介于3.4和7之间的pH值下，例如在pH 5下，表现出优异的溶解度特性。
在一个方面，玉米蛋白质水解产物在pH 7.0和pH 3.4两者的pH下具有约7％至约37％的溶解度。在一个方面，玉米蛋白质水解产物在pH 7.0和pH 3.4两者的pH下具有约7％至约20％的溶解度。在一个方面，玉米蛋白质水解产物在pH 7.0和pH 3.4两者的pH下具有约15％至约28％的溶解度。在一个方面，玉米蛋白质水解产物在pH 7.0和pH 3.4两者的pH下具有约24％至约35％的溶解度。在一个方面，玉米蛋白质水解产物在pH 7.0和pH 3.4两者的pH下具有约30％至约37％的溶解度。
一般来讲，当玉米蛋白质水解产物具有约1％至约17％的水解度时，实现玉米蛋白质水解产物的期望特性。某些水解度范围可提供用于某些食物产品的特定有益效果。在一个方面，玉米蛋白质水解产物可在约1％至约7％的范围内。在一个方面，水解度可在约8％至约14％的范围内。在一个方面，水解度可在约10％至约17％的范围内。在一个方面，水解度可为约3％至8％。在一个方面，水解度可为约4％至约6％。
在一个方面，玉米蛋白质水解产物可以溶液或浆液的形式提供。在一个方面，玉米蛋白质水解产物可以浓缩溶液、糊剂或浆液的形式提供，例如具有约40重量％至约80重量％固形物的固形物含量，或具有约40重量％至约60重量％固形物的固形物含量。提供玉米蛋白质水解产物提供了处理优点，这便于将水解产物添加和混合到液体中，并且避免了处理粉末的挑战。在一个方面，玉米蛋白质水解产物以无菌包装中的溶液、糊剂或浆液的形式提供。在一个方面，玉米蛋白质水解产物可以粉末形式获得。玉米蛋白质水解产物的粉末组合物可包含小于100％的玉米蛋白质。在一个方面，玉米蛋白质水解产物的粉末组合物可包含至少约70重量％的玉米蛋白质。在一个方面，玉米蛋白质水解产物的粉末组合物可包含至少约75重量％的玉米蛋白质。在一个方面，玉米蛋白质水解产物的粉末组合物可包含至少约80重量％的玉米蛋白质。在一个方面，玉米蛋白质水解产物的粉末组合物可包含约79重量％的玉米蛋白质。在一个方面，玉米蛋白质水解产物的粉末组合物可包含约80重量％的玉米蛋白质。在一个方面，玉米蛋白质水解产物的粉末组合物具有小于10％的含水量。
制备水解产物的方法
在本发明的方法中，进行玉米蛋白质组合物的受控且有限的水解以提供具有所指示的溶解度特性的玉米蛋白质水解产物。在一个方面，该方法包括获得玉米蛋白质组合物，将酶添加到玉米蛋白质组合物中，以及在受控条件下水解玉米蛋白质组合物以形成期望水解度的玉米蛋白质水解产物。
作为第一步，获得具有至少约75重量％的玉米蛋白质浓度的玉米蛋白质组合物。在一个方面，玉米蛋白质组合物是适于食物用途的浓缩物或分离物。在一个方面，玉米蛋白质组合物是基本上去淀粉的玉米谷蛋白材料，其已经用包含水和水混溶性有机溶剂的溶剂洗涤以获得以干重计具有期望的蛋白质重量％的玉米蛋白质组合物。“去淀粉”是指具有如通过Ewers旋光法ISO 10520:1997所测量的约0.1重量％至3.0重量％(ds)范围内的残余不溶性淀粉固形物的起始玉米谷蛋白材料。在至少某些方面，此类玉米谷蛋白原料中的残余淀粉固形物可在约0.1重量％至2.0重量％(ds)、约0.1重量％至1.0重量％(ds)或约0.1重量％至0.75重量％(ds)的范围内。方法在例如转让给Cargill Incorporated的WO2016/154441和WO 2018/058150中有所描述，这些文献以引用方式并入本文。在一个方面，洗涤玉米蛋白质组合物源以提供玉米蛋白质组合物原料可从玉米原料中去除许多不期望的非蛋白质组分(色素、霉菌毒素、碳水化合物(诸如糖)、有机酸、油等)。
在一个方面，玉米蛋白质浓度为至少约79重量％。在一个方面，玉米蛋白质浓度为至少约82重量％。在一个方面，玉米蛋白质浓度为至少约85重量％。在一个方面，玉米蛋白质浓度为至少约89重量％。在一个方面，玉米蛋白质浓度为至少约92重量％。在一个方面，玉米蛋白质浓度为至少约98重量％。
在一个方面，玉米蛋白质浓度为约79重量％至约89重量％。在一个方面，玉米蛋白质浓度为约82重量％至约89重量％。在一个方面，玉米蛋白质浓度为约85重量％至约89重量％。在一个方面，玉米蛋白质浓度为约85重量％至约98重量％。在一个方面，玉米蛋白质浓度为约89重量％至约98重量％。在一个方面，玉米蛋白质浓度为约92重量％至约98重量％。在一个方面，玉米蛋白质浓度为约95重量％至约100重量％。在一个方面，玉米蛋白质浓度为约98重量％至约100重量％。
在一个方面，玉米蛋白质组合物是基本上去淀粉的玉米谷蛋白材料，其已经用氧化剂处理以提供具有按原样小于150ppm的游离亚硫酸盐浓度的玉米蛋白质组合物原料。在一个方面，氧化剂可为例如但不限于过氧化氢、臭氧气体、空气、次氯酸钠、溴酸钾和乙醇的组合、过氧化氢酶、过氧化物酶或它们的组合。在优选的方面，氧化剂为过氧化氢。用于此类处理的方法在转让给Cargill Incorporated的WO 2017/165748中有所描述，该文献以引用方式并入本文。
在适于提供玉米蛋白质悬浮液的温度和量下，将玉米蛋白质组合物添加到包含水的溶剂体系中。在一个方面，溶剂体系为水。在一个方面，溶剂体系包含水和合适的食品级共溶剂。在一个方面，在约40℃至约70℃的温度下，将玉米蛋白质组合物添加到溶剂体系中。在一个方面，在约45℃至约55℃的温度下，将玉米蛋白质组合物添加到溶剂体系中。在一个方面，将玉米蛋白质组合物以一定量添加到溶剂体系中，以获得约具有约1％(w/v)至约25％(w/v)的固形物含量的玉米蛋白质悬浮液。在一个方面，将玉米蛋白质组合物以一定量添加到溶剂体系中，以获得约1％至约15％(w/v)玉米蛋白质悬浮液。在一个方面，将玉米蛋白质组合物以一定量添加到溶剂体系中，以获得约3％至约8％(w/v)玉米蛋白质悬浮液。在一个方面，将玉米蛋白质组合物以一定量添加到溶剂体系中，以获得约5％(w/v)玉米蛋白质悬浮液。
将酶以酶与玉米蛋白质按重量计约1:100至约1:20的比率添加到包含玉米蛋白质组合物的玉米蛋白质悬浮液中。在一个方面，在添加酶之前，将玉米蛋白质悬浮液的pH调节和/或保持在期望的水平。在一个方面，在添加酶之前，将玉米蛋白质悬浮液的pH调节和/或保持在约5.0至约6.0。
在一个方面，可以酶与玉米蛋白质按重量计约1:55至约1:20的比率添加酶。在一个方面，可以酶与玉米蛋白质按重量计约1:55至约1:45的比率添加酶。在一个方面，可以酶与玉米蛋白质按重量计约1:30至约1:20的比率添加酶。在一个方面，可以酶与玉米蛋白质按重量计约1:50至约1:25的比率添加酶。在一个方面，酶与玉米蛋白质的比率为约1:50。在一个方面，酶与玉米蛋白质的比率为约1:37.5。在一个方面，酶与玉米蛋白质的比率为约1:25。在一个方面，酶与玉米蛋白质的比率为约1:100。
术语“酶”是指具有活性酶产物的组合物。本领域的技术人员将会知道在酶产物中酶活性和包含水平可变化。在一个方面，酶为蛋白酶。在一个方面，蛋白酶得自真菌。在一个方面，蛋白酶得自真菌米曲霉(Aspergillus oryzae)。在一个示例中，真菌酶可为得自Amano Enzyme Inc.的蛋白酶M“Amano”SD。不受理论的约束，据信真菌酶尤其是当用于如本文所述的水解方法时，以蛋白质上的特定位点为目标，从而导致不被感知为苦味的亲水性肽的释放，并且当在如本文所述的条件下使用时，真菌酶可使蛋白质异味最小化。
在一个方面，将包含酶的玉米蛋白质悬浮液的pH和温度控制足以将玉米蛋白质水解至期望的水解度的时间。在一个方面，玉米蛋白质悬浮液在水解期间的pH为约5.0至约6.0。在一个方面，玉米蛋白质悬浮液在水解期间的pH为约5.5。在一个方面，玉米蛋白质悬浮液在水解期间的温度为约40℃至约70℃。在一个方面，玉米蛋白质悬浮液在水解期间的温度为约45℃至约55℃。在一个方面，玉米蛋白质悬浮液在水解期间的温度为约50℃。在一个方面，玉米蛋白质悬浮液的水解进行约15分钟至约180分钟的时间。在一个方面，玉米蛋白质悬浮液的水解进行约30分钟至约120分钟的时间。在一个方面，玉米蛋白质悬浮液的水解进行约45分钟至约90分钟的时间。
在一个方面，当玉米蛋白质水解产物具有约1％至约17％的水解度时，玉米蛋白质悬浮液的水解终止。在一个方面，当玉米蛋白质水解产物具有约1％至约7％的水解度时，玉米蛋白质悬浮液的水解终止。在一个方面，当玉米蛋白质水解产物具有约8％至约14％的水解度时，玉米蛋白质悬浮液的水解终止。在一个方面，当玉米蛋白质水解产物具有约10％至约17％的水解度时，玉米蛋白质悬浮液的水解终止。在一个方面，当玉米蛋白质水解产物具有约3％至8％的水解度时，玉米蛋白质悬浮液的水解终止。在一个方面，当玉米蛋白质水解产物具有约4％至约6％的水解度时，玉米蛋白质悬浮液的水解终止。
在一个方面，将包含酶的玉米蛋白质悬浮液的pH和温度控制足以水解玉米蛋白质的时间，使得玉米蛋白质水解产物在选自pH 7.0、pH 3.4、pH 5的pH下以及pH 7.0、pH 5和pH 3.4中的全部pH下具有约7％至约37％的溶解度。在一个方面，将包含酶的玉米蛋白质悬浮液的pH和温度控制足以水解玉米蛋白质的时间，使得玉米蛋白质水解产物在选自pH7.0、pH 3.4、pH 5的pH下以及pH 7.0、pH 5和pH 3.4中的全部pH下具有约7％至约20％的溶解度。在一个方面，将包含酶的玉米蛋白质悬浮液的pH 和温度控制足以水解玉米蛋白质的时间，使得玉米蛋白质水解产物在选自pH 7.0、pH 3.4、pH 5的pH下以及pH 7.0、pH 5和pH3.4中的全部pH下具有约15％至约28％的溶解度。在一个方面，将包含酶的玉米蛋白质悬浮液的pH和温度控制足以水解玉米蛋白质的时间，使得玉米蛋白质水解产物在选自pH 7.0、pH 3.4、pH 5的pH下以及pH 7.0、pH 5和pH 3.4中的全部pH下具有约24％至约35％的溶解度。在一个方面，将包含酶的玉米蛋白质悬浮液的pH和温度控制足以水解玉米蛋白质的时间，使得玉米蛋白质水解产物在选自pH 7.0、pH 3.4、pH 5的pH下以及pH 7.0、pH 5和pH3.4中的全部pH下具有约16％至约24％的溶解度。在一个方面，将包含酶的玉米蛋白质悬浮液的pH和温度控制足以水解玉米蛋白质的时间，使得玉米蛋白质水解产物在选自pH 7.0、pH 3.4、pH 5的pH下以及pH 7.0、pH 5和pH 3.4中的全部pH下具有约24％至约35％的溶解度。在一个方面，将包含酶的玉米蛋白质悬浮液的pH和温度控制足以水解玉米蛋白质的时间，使得玉米蛋白质水解产物在选自pH 7.0、pH 3.4、pH 5的pH下以及pH 7.0、pH 5和pH3.4中的全部pH下具有约30％至约37％的溶解度。
在本发明方法的一个方面，在完成期望的水解之后干燥玉米蛋白质水解产物。在一个方面，干燥通过冷冻干燥或喷雾干燥进行。在一个方面，玉米蛋白质水解产物的粉末组合物具有小于10％的含水量。
在一个方面，玉米蛋白质水解产物以粉末形式提供。在一个方面，玉米蛋白质水解产物的粉末组合物包含至少约75重量％的玉米蛋白质。在一个方面，玉米蛋白质水解产物的粉末组合物包含至少约79重量％的玉米蛋白质。在一个方面，玉米蛋白质水解产物的粉末组合物包含至少约80重量％的玉米蛋白质。在一个方面，玉米蛋白质水解产物的粉末组合物包含至少约85重量％的玉米蛋白质。在一个方面，玉米蛋白质水解产物的粉末组合物包含至少约90重量％的玉米蛋白质。
在一个方面，制备玉米蛋白质水解产物的方法可包括获得具有至少约75重量％的玉米蛋白质浓度的玉米蛋白质组合物，在约45℃至约55℃的温度下与水混合以获得5％(w/v)玉米蛋白质悬浮液，将玉米蛋白质悬浮液的pH调节至约5.0至约6.0，将酶以酶与玉米蛋白质按重量计约1:100至约1:25的比率添加到玉米蛋白质悬浮液中，以及水解玉米蛋白质悬浮液，同时保持温度和pH，以及终止玉米蛋白质的水解以提供玉米蛋白质水解产物，该玉米蛋白质水解产物在选自pH 7.0、pH 3.4、pH 5的pH下以及pH7.0、pH 5和pH 3.4中的全部pH下具有约7％至约37％的溶解度。在一个方面，水解玉米蛋白质悬浮液的步骤进行约30分钟至约120分钟的时间，同时保持温度和pH以获得玉米蛋白质水解产物。
在一个方面，水解玉米蛋白质组合物可在介于约50℃和约60℃之间、优选50℃的温度下进行。在一个方面，水解玉米蛋白质组合物可在介于约5.0和约6.0之间的pH范围、优选5.5的pH下进行。在一个方面，用于水解玉米蛋白质组合物的时间介于约30分钟和约120分钟之间，优选60分钟。
在一个方面，制备玉米蛋白质水解产物的方法可包括获得玉米蛋白质组合物，在约50℃的温度下与水混合以获得5％(w/v)玉米蛋白质悬浮液，将酶以酶与玉米蛋白质按重量计约1:50的比率添加到玉米蛋白质悬浮液中，将玉米蛋白质悬浮液的pH调节至约5.5，以及水解玉米蛋白质悬浮液约60分钟，同时保持温度和pH，以获得玉米蛋白质水解产物。在如本文所述的受控且有限的水解下产生的玉米蛋白质水解产物在pH 7.0下可具有约1.5％至约3％或约2.4％的总蛋白质水解度和至少约16％至约20％或约17％的溶解度。
在一个方面，制备玉米蛋白质水解产物的方法可包括获得玉米蛋白质组合物，在约48℃的温度下与水混合以获得5％(w/v)玉米蛋白质悬浮液，将酶以酶与玉米蛋白质按重量计约1:50的比率添加到玉米蛋白质悬浮液中，将玉米蛋白质悬浮液的pH调节至约5.5，以及水解玉米蛋白质悬浮液约120分钟，同时保持温度和pH，以获得玉米蛋白质水解产物。在如本文所述的受控且有限的水解下产生的玉米蛋白质水解产物在pH 7.0下可具有约4％至约6％或约5％的总蛋白质水解度和至少约21％至约24％或约21％的溶解度。
在一个方面，制备玉米蛋白质水解产物的方法可包括获得玉米蛋白质组合物，在约50℃的温度下与水混合以获得5％(w/v)玉米蛋白质悬浮液，将酶以酶与玉米蛋白质按重量计约1:25的比率添加到玉米蛋白质悬浮液中，将玉米蛋白质悬浮液的pH调节至约5.5，以及水解玉米蛋白质悬浮液约90分钟，同时保持温度和pH，以获得玉米蛋白质水解产物。在如本文所述的受控且有限的水解下产生的玉米蛋白质水解产物在pH 7下可具有约6％至约10％或约8％至约9％的水解度和至少约15％至约25％的溶解度。
一般来讲，水解蛋白质通常具有苦味或涩味。令人惊讶的是，本专利申请的玉米蛋白质水解产物没有苦味。
在一个方面，制备玉米蛋白质水解产物的方法包括：
获得玉米蛋白质组合物；
在约45℃至约55℃的温度下将玉米蛋白质组合物添加到水中以获得5％(w/v)玉米蛋白质悬浮液；
将玉米蛋白质悬浮液的pH调节至约5.0至约6.0；
将酶以酶与玉米蛋白质按重量计约1:100至约1:25的比率添加到玉米蛋白质悬浮液中；
水解玉米蛋白质悬浮液约30分钟至约120分钟，同时保持温度和pH，以获得玉米蛋白质水解产物，其中玉米蛋白质水解产物在pH 7.0下具有约1％至约32％的水解度和至少约7％至约47％的溶解度；以及
干燥玉米蛋白质水解产物。
在一个方面，制备玉米蛋白质水解产物的方法包括：
获得玉米蛋白质组合物；
将酶以酶与玉米蛋白质按重量计约1:100至约1:25的比率添加到玉米蛋白质组合物中；以及
在约5.0至约6.0的pH范围内以及在约30分钟至约120分钟的时间范围内水解玉米蛋白质组合物以获得玉米蛋白质水解产物，其中玉米蛋白质水解产物在pH 7.0下具有约1％至约20％的水解度和至少约7％至约36％的溶解度。
在一个方面，玉米蛋白质水解产物作为食物产品诸如饮料或非液体食物中的成分提供。在一个方面，玉米蛋白质水解产物以饮料的约1重量％至约10重量％存在。在一个方面，玉米蛋白质水解产物以饮料的约2重量％至约10重量％存在。在一个方面，玉米蛋白质水解产物以饮料的约3重量％至约10重量％存在。在一个方面，玉米蛋白质水解产物以饮料的约2重量％至约8重量％存在。在一个方面，玉米蛋白质水解产物以饮料的约2重量％至约6重量％存在。在一个方面，玉米蛋白质水解产物以饮料的约2重量％至约5重量％存在。在一个方面，包含本段所述的玉米蛋白质水解产物的饮料表现出低程度的可感知苦味风味，如通过测试小组分析所评估的那样。在一个方面，包含玉米蛋白质水解产物的饮料具有小于0.25g/L的咖啡因当量值。在一个方面，包含玉米蛋白质水解产物的饮料具有小于0.23g/L的咖啡因当量值。在一个方面，包含玉米蛋白质水解产物的饮料具有小于0.21g/L的咖啡因当量值。在一个方面，包含玉米蛋白质水解产物的饮料具有0.1g/L至0.25g/L的咖啡因当量值。在一个方面，包含玉米蛋白质水解产物的饮料具有0.1g/L至0.23g/L的咖啡因当量值。在一个方面，包含玉米蛋白质水解产物的饮料具有0.1g/L至0.21g/L的咖啡因当量值。在一个方面，包含玉米蛋白质水解产物的饮料具有0.15g/L至0.25g/L的咖啡因当量值。在一个方面，包含玉米蛋白质水解产物的饮料具有0.15g/L至0.23g/L的咖啡因当量值。在一个方面，包含玉米蛋白质水解产物的饮料具有0.15g/L至0.21g/L的咖啡因当量值。
实施例
本专利申请将在以下实施例中进一步描述，这些实施例不限制权利要求书中的本发明的范围。
实施例1
根据转让给Cargill Incorporated的WO2016/154441、WO 2017/165748和WO2018/058150，对玉米蛋白质组合物的两个样品进行纯化，这些文献以引用方式并入本文。每个样品的蛋白质浓度示于表1中。样品CP1组合物包含82.88重量％的蛋白质，并且样品CP-RTE组合物包含79.44重量％的蛋白质。
表1：玉米蛋白质组合物
| 样品 | 蛋白质(％) |
| CP1 | 82.88 |
| CP-RTE | 79.44 |
使用真菌酶蛋白酶M(Amano Enzyme Inc.)，以约1:100、1:50、1:37.5和1:25的酶与蛋白质的比率(E:P)由样品CP1制备玉米蛋白质水解产物。在水解期间监测时间(30分钟、60分钟、90分钟、100分钟和120分钟)、温度(40℃、45℃、50℃和55℃)和pH(5.0、5.5和6.0)。在不同水解条件下制备的CP1水解产物的DH和溶解度特性分别示于表2和表3中。
在表2中列出的条件下，在将5％蛋白质溶液在水中以小规模(水解产物的体积为150ml)混合1小时后，进行样品CP1的水解。然后添加酶(蛋白酶M)，每隔10分钟(30分钟温育)或15分钟(60分钟或更长时间温育)调节pH以保持期望的pH。在水解之后，用1M NaOH中和至pH 7.0并且通过加热到75℃持续5分钟使酶失活。水解之后，将样品冷冻干燥。
表2：CP1水解产物的制备条件和DH
1.在该表中标识了样品“DH5”、“DH10”、“DH16”、“DH30**”，这些样品在后续实施例中报告并在附图中示出。使用该样品标识符中的DH数字是为了便于标识被测试的样品。该DH数字通常对应于所测量的样品可溶性级分(即上清液)的水解度。
使用Nielsen、Petersen和Dambmann，“Improved Method for Determining FoodProtein Degree of Hydrolysis”，2001年，Journal of Food Science，第642-646页中所述的OPA方法测定上清液的水解度。将玉米蛋白质(0.01g)与1ml的1％十二烷基硫酸钠(SDS)混合，并且在室温下搅拌过夜。以13000rpm将样品离心10分钟，并且用重蒸馏水将100μL上清液稀释10倍。OPA试剂、丝氨酸标准物和样品测试如Nielsen等人文章所述进行。遵循Pierce BCA蛋白质测定试剂盒(Thermo Scientific，#23227)的说明进行BCA测定以测定上清液的蛋白质浓度。通过AACCI 46-30.01(粗蛋白-燃烧法)，使用氮分析仪(美国密歇根州圣约瑟夫的力可公司的LECO TruSpecNTM(St.Joseph,Michigan,USA))和6.25的转换因子测定样品总蛋白质含量。在pH 3.4和7下，在经过热处理和未经过热处理的情况下，测定未处理的CP1(使用除酶添加之外的所有条件处理的CP1)和CP1水解产物的溶解度。基于粉末的蛋白质含量(AACCI 46-30.01)和pH 3.4和7.0下6.25的转化因子制备蛋白质溶液(10mL，5％蛋白质)，同时连续搅拌1小时。还测定了200μL等分试样的蛋白质含量。为了评估溶解度的热稳定性，将样品在85℃下加热30分钟。将样品(经过热处理或未经过热处理)在13,000rpm下离心10分钟，并且分析200μL上清液的蛋白质含量。基于以下公式计算蛋白质的溶解度百分比：
溶解度(％)＝上清液中的蛋白质含量/离心前蛋白质含量*100
表3示出了各种CP1水解产物的溶解度结果。
表3：各种CPI水解产物的溶解度
对于加热样品和未加热样品两者，CP1水解产物在pH 3.4和pH 7下测定的溶解度之间显示出强的正相关性(图1)。此外，水解产物的溶解度(无论测定的pH如何)显示出与DH的正线性相关性(图2)。
一般来讲，溶解度随着时间和酶剂量的自变量而增大并且随着pH的增大而降低。图3是在不同pH(5.0、5.5和6.0)和固定的酶剂量(1:25、1:37.5和1:50)下，加热(Z轴)一定时间范围(X轴)和温度范围(Y轴)之后，pH 7下溶解度的可视化。图上的线表示具有相同溶解度的条件。例如，在pH＝5.0并且酶固定在1:25(左下图块)的情况下，最右侧的轮廓线为35％溶解度线。与该线相关联的每组时间和温度产生35％可溶性材料。这些线不是直的，因为自变量之间存在相互作用。低溶解度为浅色阴影，并且高溶解度为深色阴影。溶解度随时间和温度而增加，并且当较长时间与较高温度组合时，溶解度降低。
在一个方面，在5.5的pH、50℃的温度、60分钟的水解时间以及1:50的E:P浓度比率下，CP1水解产物产生约2.4％的DH，具有比在5.0和45℃、5.5和40℃、5.5和45℃、5.5和55℃、6.0和50℃以及6.0和55℃的pH和温度组合下产生的CP1水解产物更高的溶解度(17％至20％)，并且具有约2.4％或更低％的类似DH(图4和图5)。
通过激光衍射测定所制备的水解产物的粒度，激光衍射测量随着激光束穿过分散的颗粒样品由散射光强度的角变化确定的粒度分布。该分散的颗粒样品作为矿物油中的浆液生成。使用Malvern Mastersizer 3000激光衍射粒度分析仪执行这些测量。观察到的所选样品的粒度分布示于下表4中，其中D10是样品质量的10％由直径小于该值的颗粒构成时的直径，D50是样品质量的50％由直径小于该值的颗粒构成时的直径(即，中值粒度)，D90是样品质量的50％由直径小于该值的颗粒构成时的直径，并且D[4,3](μm)是平均粒度。
表4：所选的组合物表现出如下粒度：
实施例2
悬浮液pH对最终溶解度的影响
在经过热处理和未经过热处理(85℃下30分钟)的情况下，在pH 3、pH 4、pH 5、pH6、pH 7、pH 8和pH 9下测定完整CP1和水解CP1的溶解度。基于粉末的蛋白质含量(通过Dumas方法测定)，在上述pH下制备蛋白质溶液(10mL，5％蛋白质)，同时连续搅拌1小时。通过Dumas方法测定200μL等分试样的蛋白质含量。为了评估热稳定性，将样品在85℃下加热30分钟。将样品(经过热处理或未经过热处理)在13,000rpm下离心10分钟，并且分析200μL上清液的蛋白质含量。基于以下公式计算蛋白质的溶解度百分比：
蛋白质溶解度(％)＝100*(上清液中的蛋白质浓度)/(悬浮液中的蛋白质浓度)
蛋白质是可能包含正氨基酸侧链、负氨基酸侧链和中性氨基酸侧链的异质聚合物。当蛋白质具有净电荷时，溶解度增强，并且当蛋白质上的净电荷为约零时，溶解度可最小化。在表现上，这意味着一些蛋白质在其等电点附近沉淀，等电点通常介于4和6之间。天然大豆蛋白质分离物(SPI)和酪蛋白显示出倒钟形溶解度曲线，其中观察到≤3和≥6时溶解度较高，并且在pH 4至5.5下具有最小值。
悬浮液pH对经过热处理(A)和未经过热处理(B)的CP1、DH5、DH10、DH16和DH30**(如表2中所标识)的溶解度的影响示于图6A和图6B中。对经过热处理和未经过热处理的每个样品进行单独的ANOVA。无法明显区分与相同字母相关联的条(单向ANOVA，Tukey表示比较检验，p≤0.05)。
CP1样品的表现不同。未经过热处理的所有完整CP1和水解CP1的溶解度(图6A)对悬浮液pH的变化不敏感，而CP1、DH5、DH10和DH16在pH 8和pH 9下进行热处理之后具有比≤pH 7时略高的溶解度。DH30**不具有随pH变化的溶解度变化，甚至在热处理之后也是如此(图6B)。例如，乳清蛋白分离物在加热之前表现出最小的pH敏感性，但在pH 4至pH 5下加热导致蛋白质失去溶解度。在玉米蛋白质或其水解形式中未观察到这种情况。
在发生pH改变的许多食品工艺中，在加热或不加热的温和酸性条件下希望溶解度的稳定性。制造商不需要担心pH或温度的暂时偏差将对最终产品的工艺、设备具有严重的有害影响。
实施例3
水解期间存在的蛋白质含量对最终溶解度和水解度的影响
实施例1描述了低固形物浓度(5％)下的制备，但按比例放大的工艺将有利地使用较少的水，同时实现相同的效果。更大的固形物能够实现更好的资金利用和更低的操作成本、更少的能量使用以及粉末特性管理方面可能的优点。
在针对CP1_DH5水解产物优化的条件下，在水中混合5％、10％、15％和20％蛋白质溶液1小时之时进行CP1水解，该优化条件是pH 5.5和50℃(水解产物的体积为150ml)。然后以1:100的酶/底物(E/S)比率添加酶(蛋白酶M)，并且在60分钟内每隔15分钟调节pH以保持期望的pH。在水解之后，用1M NaOH中和并且通过加热到75℃持续5分钟使酶失活。水解之后，将样品冷冻干燥。在pH 3.4和pH 7下测定溶解度。
在pH 3.4或pH 7下，经过热处理和未经过热处理时，在所测试的各种蛋白质浓度下的最终溶解度不存在显著差异。相比于5％或10％，在15％和20％中观察到的平行测定之间存在较大变化。该结果显示，在蛋白酶与底物的合适比率下，此酶促水解在5％至20％固形物范围内同等可行。来自10％、15％和20％蛋白质悬浮液的总水解产物的DH低于4。
经过热处理和未经过热处理时，水解期间蛋白质浓度对ph 3.4(A)和pH 7(B)下的溶解度的影响分别示于图7A和图7B中。在经过热处理和未经过热处理的情况下进行单独的ANOVA。与不同字母相关联的条明显不同(单向ANOVA，Tukey表示比较检验，p≤0.05)。
实施例4
通过衰减全反射-傅里叶变换红外光谱(ATR-FTIR)分析蛋白质二级结构
使用OMNIC 8软件，通过配备有水平多反射金刚石附件的Thermo ScientificNicolet iS10 FTIR光谱仪(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科学公司(Thermo FisherScientific,Waltham,MA))分析CP1和水解玉米蛋白质样品。由酰胺I区(1600cm-1至1700cm-1)的二阶导数光谱确定完整样品和水解样品的二级结构。光谱区被指定为：对于β-片层为1600cm-1至1635cm-1，对于α-螺旋为1636cm-1至1649cm-1，对于随机结构为1650cm-1至1680cm-1，以及对于β-转角结构为1681cm-1至1700cm-1。将每个二级结构区域的二阶导数面积除以酰胺I区的总面积。每个样品最少记录3个光谱。
对于所有样品(完整的和水解的)，α-螺旋包含如图8所示的优势蛋白质二级结构。随着DH增加，β-片层含量随着随机结构的增加而降低。这可反映从已结构化的蛋白质结构域释放没有二级结构的肽。α-螺旋的含量保持几乎不受高达DH16的酶促水解的影响，但其在DH30**中相比于CP1更低。我们的结果暗示蛋白酶M可能对具有β片层的氨基酸区域更具特异性。螺旋的略微减少可能意味着相邻的水解事件直接侵袭螺旋或使其不稳定。
CP1、DH5、DH10、DH16和DH30**的蛋白质二级结构示于图8中。
实施例5
用蛋白水解酶对蛋白质进行的处理通常选择用于水解的特定位点。根据酶活性和蛋白质结构的组合，可溶性级分的组成可能在氨基酸比例上不同于初始组成。在非常高的DH下，可溶性级分将更接近于原料，但在较低的DH下可能存在显著差异。
表5示出用如1中所述的蛋白酶M处理后材料的可溶性级分的氨基酸组成。为了制备样品，将经处理的蛋白质悬浮于pH 7的水中60分钟，然后以9500rpm离心15分钟。将上清液和粒料分别冷冻干燥并提交用于氨基酸分析(对色氨酸采用AOAC官方方法988.15，chp.45.4.04，2006；对其余氨基酸采用AOAC官方方法982.30E(a,b,c)，chp 45.3.05)。
以100％蛋白质基础表示，可溶性级分的推断组成(如果其完全反映原料)可通过将原料组成乘以溶解度来计算。再次调节至100％蛋白质基础后，可将实际组成与推断组成进行比较。在该实施例中(表5)，可溶性级分相对富含天冬氨酸、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸和色氨酸(粗体)。一般来讲，可溶性级分中的亮氨酸(斜体)相对较少。谷氨酸、脯氨酸和苯丙氨酸在较低的DH下相对耗尽，但随着DH增大不那么明显。
表5：蛋白酶M处理后的完整级分和可溶性级分的氨基酸组成以及观察到的计算过 量/不足。过量表示为粗体，而不足表示为斜体。
可类似地将不溶性材料与预期浓度进行比较。在较低DH下，预期不溶性级分将更类似于原料，因为相对较少的材料被分级成可溶相，并且这是所观察到的现象(表4)。不溶性级分不过多，但赖氨酸和精氨酸在整个处理中不足，并且色氨酸在较高DH下变得不足。
表6：蛋白酶M处理后的完整级分和可溶性级分的氨基酸组成以及观察到的计算过 量/不足。过量表示为粗体，而不足表示为斜体。
实施例6
表面疏水性
蛋白质构型的改变可改变极性和非极性氨基酸侧链的暴露。此类变化的相对效果可通过测量疏水性化合物与蛋白质的结合来评估，该度量称为表面疏水性。
该荧光光谱测定方法使用芳族荧光探针1-苯胺8-萘磺酸盐(ANS)，其在被适当波长的光激发时发射可检测的光(Kato和Nakai，1980年；Alizadeh-Pasdar和Li-Chan，2000年)。通过将0.03976g ANS悬浮于10mL 0.1M pH 7.4磷酸盐缓冲液中并将原液储存在暗处(稳定6个月)来制备ANS原液。通过将133μL的ANS原液稀释于3734μL柠檬酸:磷酸钠的pH 7缓冲液中，在每个工作日新鲜制备ANS的工作溶液。通过以下方式制备蛋白质溶液(0.05％w/v)：称量各自达到5mg蛋白质所需的粉末量并送入15mL离心管中，向每个管加入10mL0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，并将pH调节至7.0。使用0.05％蛋白质溶液，制备0.025、0.02、0.015、0.01和0.005w/v的浓度。将200μL的0.005％至0.050％蛋白质样品加载到白色不透明96孔板中。空白对照样仅含有柠檬酸:磷酸钠pH缓冲液。一式三份制备所有样品和空白对照样。通过将激发波长和发射波长分别设定为400/30nm(激发波长/半极大处全宽度)和460/40nm来测量相对荧光指数(RFI)。将增益设定为25。将20μL的ANS探针溶液添加到每个样品和空白对照样。将板摇动1分钟，然后在暗处静置15分钟，然后再次测量RFI。
计算净RFI：单独对每个板中的空白对照样(仅含有柠檬酸:磷酸钠缓冲液或含有添加了ANS的柠檬酸:磷酸钠缓冲液的孔)求平均值。对于每个板，从每个样品中减去适当的空白对照样平均值。通过从具有ANS的对应样品的RFI中减去未添加ANS探针的样品的RFI来计算净RFI。将净RFI相对于蛋白质浓度(％)绘制为线性回归趋势线。线性回归的初始斜率为蛋白质表面疏水性。
在CP1水解时，疏水区域更易接近，导致DH5、DH10、DH16具有增大的表面疏水性(图B1)；DH30**与CP1不可区分。
图9示出了酶处理之前和之后玉米蛋白质的表面疏水性。在α＝0.05的情况下，无法区分具有相同字母的条。
实施例7
感官评估
方法
通过将玉米蛋白质(5％w/v)和苦味参考标准咖啡因(#1＝0.107g/L，#2＝0.153g/L，#3＝0.2g/L，#4＝0.246g/L和#5＝0.293g/L)分散于去离子水中来制备用于感官评估的样品。在评估蛋白质样品之前，总共21个人自身熟悉了咖啡因参考溶液系列。为了品尝样品，评估员通过移液管将约2mL的各样品分配到自己的口中并通过移动其舌部进行分散。专门小组成员品尝每种蛋白质溶液并与他们对咖啡因参考溶液的感知相比较来指定苦味评分。在样品之间，专门小组成员随意获取水和米饼进行口感清洁。
结果表7
汇总
所有样品显示出等于或小于3.67的苦味评分，该评分对应于等于或小于0.23(g/L)的咖啡因当量。
与完整CP1相比，给定条件下的水解不引入苦味的显著差异。
具有最低水解度的DH5具有2.42的最低苦味评分，其中咖啡因当量为0.17(g/L)，而具有最高水解度的DH30**得到2.97的评分，其中咖啡因当量为0.20(g/L)。
实施例8
酶的表征
商业蛋白酶通常是来源于多特异性单种酶的催化能力的混合物和具有不同特异性的酶的混合物。功能的存在和不存在均影响酶改性的结果。为了理解蛋白质的酶改性的影响，理解关于酶产物中特异性水解活性的混合和强度是有益的。可能存在多种表征酶产物的方式，因此一组有限的活动提供实用的描述，而不会因为太耗时而无法执行。以下方法用于评估本发明方法中的活性。如本实施例中所用，对“酶”的任何引用是对包含另外的非酶组分的“酶产物”的引用。
a)偶氮酪蛋白在pH 7下的一般水解
将偶氮酪蛋白(Sigma A2765)用作底物以检测非特异性蛋白酶活性。在50mMKH2PO4-NaOH中制备偶氮酪蛋白的2重量％溶液。通过向2mL离心管中加入0.5mL相同的缓冲液来构成反应混合物。针对0分钟、10分钟、20分钟和30分钟的时间点设置管。在加入50μL的100重量％三氯乙酸水溶液后，立即将时间零点管置于冰上。将经稀释的酶的50μL等分试样加入每个管中，并将管在50℃水浴中加热。在时间间隔处，加入0.4mL偶氮酪蛋白溶液并开始计时。制备空白对照样，但用50μL缓冲液代替酶。在指定的时间点，加入50μL的100重量％TCA以停止反应并立即将停止的反应物转移到冰浴中。
将酶稀释(或溶解并稀释)到上述反应缓冲液中。测试了一系列稀释度以证实对于酶浓度的测定线性度。在后续分析中仅包括其中颜料释放速率为线性的稀释液。
当所有样品停止时，将样品以16,000xg离心7.5分钟以沉淀未反应的蛋白质。
将上清液的100μL等分试样置于96位微板读数器的孔中。向每个孔中加入100μL的缓冲液和100μL的1M NaOH。使用Gen 5.1.11软件，用BioTek Synergy HT在440nm下读取板。使用无酶的空白对照样产生平均空白对照值，该值将从所有“活性”单元中减去；对于时间点0，将任何负值设定为零。计算吸收率变化的斜率。
将一个活性单位定义为以ΔA440/分钟表示的一单位变化。为了推导商业酶产物的单位/g，将每种稀释液的活性对测定中的酶质量作图，并计算活性相对于酶的回归线。斜率表示活性/mg酶产物，其转化为ΔA440/分钟/g酶产物。检查各个酶测定线性度，然后将其包括在分析中。
b)牛血清白蛋白在pH 7下的一般水解
将牛血清白蛋白BSA(Sigma A2153-50G)用作底物以测量非特异性蛋白酶活性。在pH 7下制备10mg/mL BSA在25mM磷酸钠缓冲液中的溶液。通过在pH 7下对25mM磷酸钠缓冲液进行连续稀释来制备酶。通过酶浓度和时间点(0分钟、10分钟、20分钟和30分钟)标记并布置微量离心管。使用自动吸移管，将950μL BSA溶液添加到每个管中。将时间零点管立即置于冰浴中，并将所有其他管置于设定为50℃的水浴中进行平衡。为了抑制酶活性并沉淀蛋白质，将水中的50μL 100重量％三氯乙酸(TCA)添加到时间零点管中。将50μL适当的酶溶液添加到每个时间零点管中。一旦10分钟、20分钟和30分钟的时间点管达到平衡，在时间间隔处将50μL合适的酶溶液添加到对应的管中。在第一次添加酶时启动定时器。用50μL缓冲液代替酶溶液来制备空白对照样。在适当的时间点，添加50μL 100重量％TCA以终止反应，将管从水浴中取出，摇动，并置于冰浴中至少30分钟。然后将样品以9100×g离心10分钟。
为了获得280nm处的准确读数，将上清液的pH调节至约9.0。将氢氧化钠(120μL0.5M)添加到UV透明的96孔微板的每个孔中。将190μL上清液添加到孔中，并轻轻搅拌板以混合。使用具有Gen5软件的微板读数器在280nm处对板进行读数。
还使用TNBS(2,4,6-三硝基苯磺酸)分析上清液的游离氨基酸。在分析之前，制备TNBS在超纯水中的0.5％溶液并保存在冰箱中直至使用。使用微量移液管，将50μL的每种标准溶液(在0.01N HCl中的0mM至6mM亮氨酸)一式两份移取到96深孔板中。将每个样品(上清液)的40μL等分试样连同10μL pH9.5的2.5％硼酸盐试剂转移到深孔板。使用多通道移液管，将1mL 2.5％硼酸酯试剂添加到每个标准孔和样品孔中。为了开始反应，将20μL 0.5％TNBS添加到每个孔中，并将有机硅覆盖件置于板上以密封各个孔。摇动板以混合，并在室温下将其置于暗处以发生反应。30分钟后，移除覆盖件，并将500μL新鲜制备的1M磷酸二氢钠添加到每个孔中以停止反应。再次用有机硅覆盖件摇动板，并将每种标准溶液和样品溶液的300μL等分试样转移至96孔微板。测量420nm处的吸收率，并使用平均标准曲线计算亮氨酸当量浓度。将一个活性单位定义为1μmol亮氨酸当量/分钟的释放。为了推导商业酶产物的单位/g，将每种稀释液的活性对测定中的酶质量作图，并计算活性相对于酶的回归线。斜率表示活性/g酶产物。
c)血红蛋白的一般水解
使用两种不同的度量来测量血红蛋白的酶分解。在25mM HEPES-HCl(pH 6.5)中制备20mg/mL的牛血红蛋白(Sigma H2625)溶液。通过在冰冷的25mM HEPES缓冲液中连续稀释来制备酶。将缓冲液(0.45mL 25mM HEPES-HCl(pH 6.5))吸移到2mL微量离心管中。对于时间零点样品，添加50μL 100％TCA。向每个管中添加酶稀释液(50μL)并将管置于50℃水浴中进行平衡。通过添加500μL血红蛋白溶液来引发反应。在10分钟、20分钟和30分钟时，添加50μL 100％TCA，并将管转移到冰浴中。将样品以16,000g离心7.5分钟。如上所述计算A280的变化。
如上所述，使用TNBS测量α氨基基团的释放。
对于280nm处吸收率所指示的肽释放的测量，将120μL 0.5M NaOH添加到平底96孔UV相容板中。将190μL上清液样品等分试样添加到每个板并轻轻混合。记录280nm处的吸收率。
d)甘氨酸特异性水解
使用合成的发色底物测试对甘氨酸处的裂解具有特异性的酶活性。通过以下方式制备甘氨酸4-硝基苯胺-HCl(Sigma G4254)的1mM溶液：将5mg溶解于0.25mL DMSO中，然后用25mM Na-HEPES-HCl(pH6.75)稀释至25mL。通过在冰冷的25mM HEPES缓冲液中连续稀释来制备酶。将100μL酶等分试样添加到96位微量滴定板的孔中。通过添加100μL底物溶液来引发反应。将板置于运行Gen 5.1.11软件的50℃(预热)BioTek Synergy HT装置中。在摇动后0分钟、10分钟和20分钟时测量405nm处的吸收率。
将一个活性单位定义为以ΔA405/分钟表示的一单位变化。为了推导商业酶产物的单位/g，将每种稀释液的活性对测定中的酶质量作图，并计算活性相对于酶的回归线。斜率表示活性/mg酶产物，其转化为ΔA405/分钟/g酶产物。检查各个酶测定线性度，然后将其包括在分析中。
e)亮氨酸特异性水解
使用合成的发色底物测试对亮氨酸处的裂解具有特异性的酶活性。通过以下方式来制备L-亮氨酸-对硝基苯胺(Sigma L2158)的1mM溶液：将6.3mg溶解于0.25mL DMSO中，然后用25mM Na-HEPES-HCl(pH 6.75)稀释至25g。通过在25mM HEPES缓冲液中连续稀释来制备酶。将100μL酶等分试样添加到96位微量滴定板的孔中。通过添加100μL底物溶液来引发反应。将板置于运行Gen 5.1.11软件的50℃(预热)BioTek Synergy HT装置中。摇动后以0分钟至30分钟的间隔测量405nm处的吸收率。
将一个活性单位定义为以ΔA405/分钟表示的一单位变化。为了推导商业酶产物的单位/g，将每种稀释液的活性对测定中的酶质量作图，并计算活性相对于酶的回归线。斜率表示活性/mg酶产物，其转化为ΔA405/分钟/g酶产物。检查各个酶测定线性度，然后将其包括在分析中。
f)甲硫氨酸特异性水解
使用合成的发色底物测试对甲硫氨酸处的裂解具有特异性的酶活性。通过以下方式来制备L-甲硫氨酸对硝基苯胺(Sigma M3529)的10mM溶液：将4.8mg溶解于1.78mL丙酮中。通过在冰冷的25mM MOPS缓冲液(pH 7.5)中连续稀释来制备酶。在室温下将50μL酶等分试样与130μL缓冲液一起添加到96位微量滴定板的孔中。通过添加20μL底物溶液来引发反应。将板置于运行Gen 5.1.11软件的50℃(预热)BioTek Synergy HT装置中。在间歇摇动后以0至45分钟的间隔测量405nm处的吸收率。
将一个活性单位定义为以ΔA405/分钟表示的一单位变化。为了推导商业酶产物的单位/g，将每种稀释液的活性对测定中的酶质量作图，并计算活性相对于酶的回归线。斜率表示活性/mg酶产物，其转化为ΔA405/分钟/g酶产物。检查各个酶测定线性度，然后将其包括在分析中。
g)精氨酸特异性水解
使用合成的发色底物测试对精氨酸处的裂解具有特异性的酶活性。通过以下方式制备Nα-苯甲酰-L-精氨酸4-硝基苯胺盐酸盐(Sigma B4875)的10mM溶液：将约10mg底物溶解于0.25mL DMSO中，然后用25mM Na-HEPES(pH6.75)稀释至25g。通过在冰冷的25m MNa-HEPES(pH 6.75)中连续稀释来制备酶。将100μL酶等分试样添加到96位微量滴定板的孔中。通过添加100μL底物溶液来引发反应。将板置于运行Gen 5.1.11软件的50℃(预热)BioTekSynergy HT装置中。在间歇摇动后以0至15分钟的间隔测量405nm处的吸收率。
将一个活性单位定义为以ΔA405/分钟表示的一单位变化。为了推导商业酶产物的单位/g，将每种稀释液的活性对测定中的酶质量作图，并计算活性相对于酶的回归线。斜率表示活性/mg酶产物，其转化为ΔA405/分钟/g酶产物。检查各个酶测定线性度，然后将其包括在分析中。
h)酪氨酸特异性水解
使用合成的发色底物测试对酪氨酸处的裂解具有特异性的酶活性。通过以下方式来制备Nα-苯甲酰-L-精氨酸4-硝基苯胺盐酸盐(Sigma B4875)的10mM溶液：将11.6mg底物溶解于2.32mL丙酮中。通过在冰冷的25mM MOPS-HCl(pH 7.5)中连续稀释来制备酶。将350μL室温缓冲液的等分试样及100μL经稀释的酶添加到微量离心管中。通过添加50μL底物来引发反应。将管混合并移至50℃水浴中。通过添加50μL 100％w/w TCA在1小时、3.5小时和23小时处停止反应，并且将管冷却直至收集到所有样品。对于时间零点，在添加底物之前添加TCA。当完成时，将样品以16,000g离心7.5分钟以沉降沉淀的蛋白质和未反应的底物。将样品(200μL)加载到96孔微量滴定板上并在运行Gen5.1.11软件的BioTek Synergy HT装置上读取。记录405nm处的吸收率。该反应非常缓慢，因此用于进一步分析的唯一数据点是在23小时处的数据点。作为检查，也在相同缓冲体系中针对底物测试了胰酶，并且在第一小时内显示大于0.63的ΔA405。
将一个活性单位定义为以ΔA405/23小时表示的一单位变化。为了推导商业酶产物的单位/g，将每种稀释液的活性对测定中的酶质量作图，并计算活性相对于酶的回归线。斜率表示活性/mg酶产物，其转化为ΔA405/23小时/g酶产物。
蛋白酶M在该组测定中的活性示于下表8中。
| 底物 | 单位 | 活性(SE) |
| 偶氮酪蛋白 | ΔA<sub>440</sub>/分钟/g | 200(17) |
| 牛血清白蛋白 | ΔA<sub>280</sub>/分钟/g | 53.4(2.8) |
| 牛血清白蛋白 | μmol亮氨酸当量/分钟/g | 17.3(0.5) |
| 牛血红蛋白 | ΔA<sub>440</sub>/分钟/g | 21.9(1.0) |
| 牛血红蛋白 | ΔA<sub>280</sub>/分钟/g | 61.9(3.2) |
| 甘氨酸4-硝基苯胺-HCl | ΔA<sub>405</sub>/分钟/g | 0.535(0.023) |
| L-亮氨酸-对硝基苯胺 | ΔA<sub>405</sub>/分钟/g | 10,399(714) |
| L-赖氨酸对硝基苯胺二氢溴化物 | ΔA<sub>405</sub>/分钟/g | 1283(44.9) |
| L-甲硫氨酸4-硝基苯胺 | ΔA<sub>405</sub>/分钟/g | 90.8(4.2) |
| Nα-苯甲酰-L-精氨酸4-硝基苯胺盐酸盐 | ΔA<sub>405</sub>/分钟/g | 2.28(0.12) |
| Nα-苯甲酰-L-酪氨酸4-硝基苯胺盐酸盐 | ΔA<sub>405</sub>/23小时/g | 35.9(5.0) |
在将1g蛋白酶M施加到100g蛋白质底物的实施例中，所施加的活性也可描述为约：200个偶氮酪蛋白降解单位、53个酪蛋白衍生的A280释放单位、17个酪蛋白衍生的α胺释放单位、0.54个甘氨酸硝基苯胺水解单位、10,400个亮氨酸硝基苯胺水解单位、1280个赖氨酸硝基苯胺水解单位、91个甲硫氨酸硝基苯胺水解单位、2.3个苯甲酰基精氨酸硝基苯胺水解单位和36个苯甲酰基酪氨酸硝基苯胺水解单位。本领域的技术人员将认识到，可使用酶一般活性和特异活性的其他量度来进一步指定应用于实现本发明方法的期望果的酶活性特征。
上述具体实施方式包括对附图的参考，这些附图形成具体实施方式的一部分。附图通过举例说明的方式示出了可在其中实践本发明的具体方面。这些方面在本文中也被称为“实施例”。此类实施例可包括除所示或所述的那些之外的要素。然而，本发明人还设想了其中仅提供所示或所述的那些要素的实施例。此外，本发明人还设想了相对于特定实施例(或其一个或多个方面)或相对于本文所示或所述的其他实施例(或其一个或多个方面)使用所示或所述的那些要素(或其一个或多个方面)的任何组合或排列的实施例。
Claims (24)
1.一种玉米蛋白质水解产物，所述玉米蛋白质水解产物在选自pH 7.0、pH 3.4、pH 5的pH下以及pH 7.0、pH 5和pH 3.4中的全部pH下具有至少约75重量％的玉米蛋白质浓度和约7％至约37％的溶解度。
2.根据权利要求1所述的玉米蛋白质水解产物，其中在选自pH 7.0、pH 3.4、pH 5的pH下以及pH 7.0、pH 5和pH 3.4中的全部pH下所述溶解度为约7％至约20％。
3.根据权利要求1所述的玉米蛋白质水解产物，其中在选自pH 7.0、pH 3.4、pH 5的pH下以及pH 7.0、pH 5和pH 3.4中的全部pH下所述溶解度为约15％至约28％；或者其中在选自pH 7.0、pH 3.4、pH 5的pH下以及pH 7.0、pH 5和pH 3.4中的全部pH下所述溶解度为约24％至约35％；或者其中在选自pH 7.0、pH 3.4、pH 5的pH下以及pH 7.0、pH 5和pH 3.4中的全部pH下所述溶解度为约16％至约24％；或者其中在选自pH 7.0、pH 3.4、pH 5的pH下以及pH 7.0、pH 5和pH 3.4中的全部pH下所述溶解度为约24％至约35％；或者其中在选自pH7.0、pH 3.4、pH 5的pH下以及pH 7.0、pH 5和pH 3.4中的全部pH下所述溶解度为约30％至约37％。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的玉米蛋白质水解产物，其中所述玉米蛋白质浓度为至少约79重量％；或者其中所述玉米蛋白质浓度为至少约82重量％；或者其中所述玉米蛋白质浓度为至少约85重量％；或者其中所述玉米蛋白质浓度为至少约89重量％；或者其中所述玉米蛋白质浓度为至少约92重量％；或者其中所述玉米蛋白质浓度为至少约98重量％。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的玉米蛋白质水解产物，其中所述玉米蛋白质浓度为约79重量％至约89重量％；或者其中所述玉米蛋白质浓度为约82重量％至约89重量％；或者其中所述玉米蛋白质浓度为约85重量％至约89重量％；或者其中所述玉米蛋白质浓度为约85重量％至约98重量％；或者其中所述玉米蛋白质浓度为约89重量％至约98重量％；或者其中所述玉米蛋白质浓度为约92重量％至约98重量％；或者其中所述玉米蛋白质浓度为约95重量％至约100重量％；或者其中所述玉米蛋白质浓度为约98重量％至约100重量％。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的玉米蛋白质水解产物，其中所述玉米蛋白质水解产物具有约1％至约17％的水解度；或者其中所述玉米蛋白质水解产物具有约1％至约7％的水解度；或者其中所述玉米蛋白质水解产物具有约8％至约14％的水解度；或者其中所述玉米蛋白质水解产物具有约10％至约17％的水解度；或者其中所述玉米蛋白质水解产物具有约1.5％至3％的水解度；或者其中所述玉米蛋白质水解产物具有约4％至约6％的水解度。
7.一种制备玉米蛋白质水解产物的方法，所述方法包括：
a)获得具有至少约75重量％的玉米蛋白质浓度的玉米蛋白质组合物；
b)将酶以酶与玉米蛋白质按重量计约1:100至约1:20的比率添加到包含所述玉米蛋白质组合物的玉米蛋白质悬浮液中；
c)控制所述玉米蛋白质悬浮液的所述pH和温度以水解所述玉米蛋白质；以及
d)终止所述玉米蛋白质的所述水解以提供玉米蛋白质水解产物，所述玉米蛋白质水解产物在选自pH 7.0、pH 3.4、pH 5的pH下以及pH 7.0、pH 5和pH 3.4中的全部pH下具有约7％至约37％的溶解度。
8.一种制备玉米蛋白质水解产物的方法，所述方法包括：
a)获得具有至少约75重量％的玉米蛋白质浓度的玉米蛋白质组合物；
b)在约45℃至约55℃的温度下将所述玉米蛋白质组合物添加到水中以获得5％(w/v)玉米蛋白质悬浮液，所述玉米蛋白质悬浮液具有约5％(w/v)至约25％(w/v)的玉米蛋白质含量；
c)将所述玉米蛋白质悬浮液的pH调节至约5.0至约6.0的pH水平；
d)将酶以酶与玉米蛋白质按重量计约1:100至约1:20的比率添加到所述玉米蛋白质悬浮液中；以及
e)水解所述玉米蛋白质悬浮液，同时保持所述温度和所述pH，并且终止所述玉米蛋白质的所述水解以提供玉米蛋白质水解产物，所述玉米蛋白质水解产物在选自pH 7.0、pH3.4、pH 5的pH下以及pH 7.0、pH 5和pH 3.4中的全部pH下具有约7％至约37％的溶解度。
9.根据权利要求7或8中任一项所述的方法，其中所述玉米蛋白质浓度为至少约79重量％；或者其中所述玉米蛋白质浓度为至少约82重量％；或者其中所述玉米蛋白质浓度为至少约85重量％；或者其中所述玉米蛋白质浓度为至少约89重量％；或者其中所述玉米蛋白质浓度为至少约92重量％；或者其中所述玉米蛋白质浓度为至少约98重量％。
10.根据权利要求7或8中任一项所述的方法，其中所述玉米蛋白质浓度为约79重量％至约89重量％；或者其中所述玉米蛋白质浓度为约82重量％至约89重量％；或者其中所述玉米蛋白质浓度为约85重量％至约89重量％；或者其中所述玉米蛋白质浓度为约85重量％至约98重量％；或者其中所述玉米蛋白质浓度为约89重量％至约98重量％；或者其中所述玉米蛋白质浓度为约92重量％至约98重量％；或者其中所述玉米蛋白质浓度为约95重量％至约100重量％；或者其中所述玉米蛋白质浓度为约98重量％至约100重量％。
11.根据权利要求7至10中任一项所述的方法，其中所述玉米蛋白质水解产物具有约1％至约17％的水解度；或者其中所述玉米蛋白质水解产物具有约1％至约7％的水解度；或者其中所述玉米蛋白质水解产物具有约1％至约5％的水解度；或者其中所述玉米蛋白质水解产物具有约8％至约14％的水解度；或者其中所述玉米蛋白质水解产物具有约4％至约12％的水解度；或者其中所述玉米蛋白质水解产物具有约4％至约6％的水解度；或者其中所述玉米蛋白质水解产物具有约16％至约18％的水解度。
12.根据权利要求7至10中任一项所述的方法，其中所述玉米蛋白质水解产物在pH 7.0下具有约7％至约20％的溶解度；或者其中所述玉米蛋白质水解产物在pH 7.0下具有约15％至约28％的溶解度；或者其中所述玉米蛋白质水解产物在pH 7.0下具有约24％至约35％的溶解度；或者其中所述玉米蛋白质水解产物在pH 7.0下具有约16％至约24％的溶解度；或者其中所述玉米蛋白质水解产物在pH 3.4下具有约7％至约20％的溶解度；或者其中所述玉米蛋白质水解产物在pH 3.4下具有约15％至约28％的溶解度；或者其中所述玉米蛋白质水解产物在pH 3.4下具有约24％至约35％的溶解度；或者其中所述玉米蛋白质水解产物在pH 3.4下具有约16％至约24％的溶解度。
13.根据权利要求7至12中任一项所述的方法，其中所述玉米蛋白质悬浮液在水解期间的所述温度为约40℃至约60℃，或者其中所述玉米蛋白质悬浮液在水解期间的所述温度为约45℃至约55℃；或者其中所述玉米蛋白质悬浮液在水解期间的所述温度为约50℃。
14.根据权利要求7至13中任一项所述的方法，其中所述玉米蛋白质悬浮液在水解期间的所述pH为约5.0至约6.0；或者其中所述玉米蛋白质悬浮液在水解期间的所述pH为约5.5。
15.根据权利要求7至13中任一项所述的方法，其中所述玉米蛋白质悬浮液的所述水解在约5.0至约6.0的pH范围和约40℃至约60℃的温度范围下进行约30分钟至约120分钟。
16.根据权利要求7至15中任一项所述的方法，所述方法还包括在添加所述酶之前将所述玉米蛋白质悬浮液混合至少约30分钟至约60分钟。
17.根据权利要求7至16中任一项所述的方法，其中所述酶与所述玉米蛋白质悬浮液的比率按酶与玉米蛋白质的重量计为约1:40至约1:25；或者其中所述酶与所述玉米蛋白质悬浮液的比率按酶与玉米蛋白质的重量计为约1:55至约1:20；或者其中所述酶与所述玉米蛋白质悬浮液的比率按酶与玉米蛋白质的重量计为约1:55至约1:45；或者其中所述酶与所述玉米蛋白质悬浮液的比率按酶与玉米蛋白质的重量计为约1:30至约1:20；或者其中所述酶与所述玉米蛋白质悬浮液的比率按酶与玉米蛋白质的重量计为约1:50至约1:25。
18.根据权利要求7至17中任一项所述的方法，其中所述酶为蛋白酶；或者其中所述酶得自真菌；或者其中所述酶得自米曲霉。
19.根据权利要求7至18中任一项所述的方法，其中通过将所述玉米蛋白质悬浮液中和至pH 7.0，并且通过加热到至少约75℃的温度持续5分钟来使所述酶失活，所述玉米蛋白质的所述水解终止。
20.根据权利要求7至19中任一项所述的方法，所述方法还包括干燥所述玉米蛋白质水解产物的步骤。
21.包含权利要求1至6中任一项所述的玉米蛋白质水解产物的饮料。
22.根据权利要求21所述的饮料，其中所述玉米蛋白质水解产物以所述饮料的约1重量％至约10重量％存在；或者以所述饮料的约2重量％至约10重量％存在；或者以所述饮料的约3重量％至约10重量％存在；或者以所述饮料的约2重量％至约8重量％存在；或者以所述饮料的约2重量％至约6重量％存在；或者以所述饮料的约2重量％至约5重量％存在。
23.根据权利要求21至22中任一项所述的饮料，其中所述饮料具有小于0.25g/L的咖啡因当量值；或者其中所述饮料具有小于0.23g/L的咖啡因当量值；或者其中所述饮料具有小于0.21g/L的咖啡因当量值；或者其中所述饮料具有0.1g/L至0.25g/L的咖啡因当量值；或者其中所述饮料具有0.1g/L至0.23g/L的咖啡因当量值；或者其中所述饮料具有0.1g/L至0.21g/L的咖啡因当量值；或者其中所述饮料具有0.15g/L至0.25g/L的咖啡因当量值；或者其中所述饮料具有0.15g/L至0.23g/L的咖啡因当量值；或者其中所述饮料具有0.15g/L至0.21g/L的咖啡因当量值。
24.根据权利要求1至6中任一项所述的玉米蛋白质水解产物，其中所述玉米蛋白质水解产物具有小于0.25g/L的咖啡因当量值；或者其中所述玉米蛋白质水解产物具有小于0.23g/L的咖啡因当量值；或者其中所述玉米蛋白质水解产物具有小于0.21g/L的咖啡因当量值；或者其中所述玉米蛋白质水解产物具有0.1g/L至0.25g/L的咖啡因当量值；或者其中所述玉米蛋白质水解产物具有0.1g/L至0.23g/L的咖啡因当量值；或者其中所述玉米蛋白质水解产物具有0.1g/L至0.21g/L的咖啡因当量值；或者其中所述玉米蛋白质水解产物具有0.15g/L至0.25g/L的咖啡因当量值；或者其中所述玉米蛋白质水解产物具有0.15g/L至0.23g/L的咖啡因当量值；或者其中所述玉米蛋白质水解产物具有0.15g/L至0.21g/L的咖啡因当量值。
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