CN113151139A - 一种提高酵母利用果糖能力的培养方法 - Google Patents

一种提高酵母利用果糖能力的培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高酵母利用果糖能力的培养方法，属于发酵技术领域。本发明所述的方法不涉及任何改造酵母基因的物理、化学方法，而是通过逐步改变酵母培养基的成分及增加外部条件的干预，提高酵母的果糖利用能力。本发明所述的培养方法获得的酵母菌群在果糖利用率和转化率上都有显著的提升，表面蛋白受体的表达量也明显增加。本发明所述培养方法能够充分提升酵母的果糖利用效率，降低发酵过程的残糖率，解决了酵母培养应用过程中果糖利用率低这一长期存在的难题，为实现能源的高效利用扩展了一条新途径。

Description

一种提高酵母利用果糖能力的培养方法
技术领域
本发明属于发酵技术领域，具体涉及一种提高酵母利用果糖能力的培养方法。
背景技术
甘蔗和甜菜其内含有大量的蔗糖和还原性糖，一般经常用来作为产糖原料。而以其作为酵母发酵原料也在许多国家开展。甘蔗汁营养成分丰富，其中的蔗糖、果糖及葡萄糖含量达12％～16％。甘蔗汁主要含糖为蔗糖，发酵过程中，蔗糖水解为等摩尔的果糖和葡萄糖。果糖和葡萄糖共用一套膜运输和酶催化体系，但葡萄糖对膜运输和酶的亲和力均大于果糖,因而酵母在发酵过程中往往优先利用葡萄糖，进而使得果糖成为发酵后期主要残糖。此时发酵液中营养物质缺乏和乙醇含量高使得果糖代谢缓慢甚至停滞，导致发酵时间延长，不仅造成了原料的浪费，还使得发酵得到产物不易存储，甚至不可用于工业生产。
有研究表明，影响葡萄糖和果糖利用差异性的因素主要有可同化氮、糖浓度、温度、葡萄糖与果糖比例、菌种性能等。其中，温度、葡萄糖与果糖的比例对酵母利用果糖的利用率影响的研究较少，通过低温锻炼培养酵母细胞增强其果糖的利用能力的研究更少；通过果糖浓度锻炼培养酵母，获得一种果糖利用能力显著增强的酵母菌的相关研究也未见报道。
发明内容
鉴于此，本发明的目的是提供了一种提高酵母利用果糖能力的培养方法。
本方法通过采用对培养基成分的逐步改变与外部条件的干预相结合的手段，使酵母菌的果糖消耗速率和利用能力显著增强，该方法未采用任何改造酵母基因的物理、化学方法。培养所得的酵母可安全用于工业酿酒、核苷酸提取等。此项技术极大的提高了原料果糖的利用效率，实现了能源的高效利用。
本发明目的是通过以下方式实现：
本发明提供一种提高酵母利用果糖能力的培养方法，具体包括如下步骤：
(1)以2～5％的接种量(v/v)，将初始培养获得的酵母菌接种至1号果糖锻炼培养基中，初始培养温度28～32℃，每隔1～2h培养温度下降1℃,培养温度降至18～22℃后，停止降温，继续培养至24～48h；
(2)以2～5％的接种量(v/v)，将步骤(1)获得的酵母菌接种至2号果糖锻炼培养基中，初始培养温度28～32℃，每隔1～2h培养温度下降1℃，培养温度降至10～14℃后，停止降温，继续培养至24～48h；以此类推，依次在3、4、5号果糖锻炼培养基中培养；
(3)以2～5％的接种量(v/v)，将步骤(2)中5号果糖锻炼培养基得到的酵母菌接种至6号果糖锻炼培养基中，初始培养温度为22～27℃，每隔0.5～1h温度下降1℃，培养温度降至8～12℃后，停止降温，续培养至24～48h；以此类推，依次在7、8、9、10号果糖锻炼培养基中培养；
(4)以2～5％的接种量(v/v)，将步骤(3)中10号果糖锻炼培养基得到的酵母菌接种至11号果糖锻炼培养基内，培养温度为15～20℃，培养时间为24～48h，培养结束后收集所得酵母；
所述果糖锻炼培养基包括编号为1—11号的果糖锻炼培养基，其中，1号－11号果糖锻炼培养基中的葡萄糖浓度由10g/100mL逐渐降低，每次降低1～2g/100mL，果糖浓度由10g/100mL逐渐升高，每次升高1～2g/100mL；1号－11号果糖锻炼培养基还包括蛋白胨4g/100mL，酵母浸粉2g/100mL，pH为5.0。
进一步地，步骤(1)-(4)中，所述培养的摇床转速为100～300r/min。
进一步地，步骤(1)中所述初始培养包括如下步骤：将活化的酵母菌接种到初始培养基中，接种量为2～5％(v/v)，30℃，摇床转速为180r/min，培养12～24h；所述初始培养基包括蛋白胨4g/100mL，酵母浸粉2g/100mL，葡萄糖10g/100mL，果糖10g/100mL，pH为5.0。
进一步地，所述活化的酵母菌的培养过程包括如下步骤：将保藏的酵母菌株接种至基础培养基中，30℃，摇床转速为180r/min，培养12～24h；所述基础培养基包括蛋白胨2g/100mL，酵母浸粉1g/100mL，葡萄糖4g/100mL，pH为5.0。
进一步地，所述1号－11号果糖锻炼培养基中的葡萄糖浓度由10g/100mL逐渐降至0，2号与3号果糖锻炼培养基完全相同，设置为一组，以此类推，每组每次降低2g/100mL，果糖浓度由10g/100mL逐渐升至20g/100mL，每组每次升高2g/100mL。
进一步地，步骤(1)-(4)的培养过程中，每间隔4h，使用20～40kHZ的超声波进行辅助处理，功率密度为50～200W/L，每次处理1～10min。
进一步地，所述酵母菌包括面包酵母、酿酒酵母、热带假丝酵母或高核酸酵母NY-1。
进一步地，所述培养基均为无菌培养基。
本发明相对于现有技术具有的有益效果如下：
1.与未经过本发明所述的培养方法培养的酵母菌相比，通过本发明所述的培养方法培养后酵母菌在正常发酵过程中果糖利用速率与葡萄糖利用速率差别相对较小，果糖利用能力获得极大提升。
2.经过本发明所述的培养方法培养后的酵母发酵速率明显加快，使得前期葡萄糖利用速率加快，使得果糖不受葡萄糖浓度的抑制，果糖利用速度明显加快，从而提高果糖的利用性。
3.低温可以使酵母细胞中控制葡萄糖代谢的相关酶类活性下降，让原本受抑制的控制果糖代谢的部分酶基因得以表达，通过不断重复的低温锻炼适应配合外界果糖浓度的逐渐增加，逐渐提升了果糖的代谢能力，使得酵母菌可以在果糖培养基内快速生长。
4.通过低温胁迫与逐渐升高的果糖浓度协同作用，使得酵母菌内果糖亲和力较高的运载蛋白基因被激活，辅以超声波，让果糖运载通路增加，果糖转运效率越发高效，使得果糖的利用速率显著提高，残糖率明显下降。在发酵过程中不仅实现了能量的高度利用，极大的加快发酵速率，而且所得发酵产物低糖、健康更利于储藏、食用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例，下面将对实施例涉及的附图进行简单地介绍。
图1为实施例1中酵母菌对葡萄糖与果糖的利用效率图。
图2为对比例1中酵母菌对葡萄糖与果糖的利用效率图。
图3为实施例1和对比例1中酵母菌对果糖的利用效率对比图。
图4为实施例1和对比例1中酵母菌利用果糖发酵过程中总菌体浓度对比图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但本发明的实施方式不限于此，显而易见地，下面描述中的实施例仅是本发明的部分实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，获得其他的类似的实施例均落入本发明的保护范围。
实施例1
1.培养基成分：
基础培养基：包括蛋白胨2g/100mL，酵母浸粉1g/100mL，葡萄糖4g/100mL，pH为5.0。
初始培养基：包括蛋白胨4g/100mL，酵母浸粉2g/100mL，葡萄糖10g/100mL，果糖10g/100mL，pH为5.0。
果糖锻炼培养基：包括编号为1—11号的果糖锻炼培养基，其中，1号－11号果糖锻炼培养基中的葡萄糖浓度由10g/100mL逐渐降至0，每个编号降低1g/100mL，果糖浓度由10g/100mL逐渐升至20g/100mL，每个编号升高1g/100mL；1号－11号果糖锻炼培养基还包括蛋白胨4g/100mL，酵母浸粉2g/100mL，pH为5.0。
以上所有培养基都已做无菌处理。
2.酵母培养
2.1将斜面保藏的面包酵母菌株接一环至准备好的液体摇甁基础培养基中活化，30℃，摇床转速180r/min培养24h，复苏菌种。
2.2将上述摇瓶液体菌液接种到初始培养基内，接种量为2％(v/v)，发酵温度30℃，摇床转速180r/min，培养12h。
2.3以2％(v/v)的接种量，将初始培养基培养的酵母菌接种至编号1的培养基中，培养24h，溶氧充足，初始培养基温度30℃，期间每隔2h温度下降1℃,20h后温度降至20℃。
2.4以2％(v/v)的接种量将从1号培养基得到的酵母菌接种至2号培养基内，培养时间24h，溶氧充足，初始培养基温度30℃，期间每隔1h温度下降1℃,20h后温度降至10℃。以此方法按顺序在3、4、5号培养基中培养。
2.5以2％(v/v)的接种量将从5号培养基得到的酵母菌接种至6号培养基内，培养时间为24h，溶氧量充足，培养基初始温度为25℃，每隔30min温度下降1℃，直至10℃为止，以此方法按顺序在7、8、9、10号培养基中培养。
2.6以2％(v/v)的接种量将从10号培养基得到的酵母菌接种至11号培养基内，培养时间为24h，溶氧量充足，培养温度为20℃，发酵结束后收集所得酵母。
3.对上述培养方法培养后的酵母进行发酵实验
3.1发酵培养基：蛋白胨4g/100mL、酵母浸膏2g/100mL、葡萄糖10g/100mL、果糖10g/100mL。
3.2发酵条件：发酵温度控制在30±0.5℃，pH为5±0.2范围内，溶氧控制在10-20％范围内。
以经过上述培养方法培养后的酵母为发酵种子，进行发酵，绘制两种单糖消耗曲线。具体操作如下：选择2.6步骤后所得培养后的酵母，以2％的接种量接种至发酵培养基内，发酵时间为36h，每隔3h测定培养基内剩余葡萄糖及果糖浓度，当葡萄糖和果糖剩余浓度处于平稳后终止实验。检测发酵过程是否有乙醇产生。实验结束后，利用测定到的葡萄糖及果糖浓度，绘制两种单糖发酵过程的消耗曲线。
3.3检测方法：果糖和葡萄糖的浓度测定采用高效液相色谱法，其色谱参数为：流动相为V(色谱纯乙腈)：V(二次蒸馏水)＝80：20，体积流量1mL/min，柱温30℃。蒸发光散射检测器参数为：漂移管温度95℃，空气体积流量2.0L/min。
3.4按照上述实验方法，进行3组平行实验，记录每组实验所得数据。
经过检测，发酵过程中无乙醇产生。根据3组实验所得的数据的平均值绘制得单糖消耗曲线如图1所示。
由图1分析可知：经过培养后的酵母，在发酵过程0-12h葡萄糖消耗速度要略快于果糖，24h后葡萄糖接近消耗完全，发酵结束后残留葡萄糖浓度为0.2g/L，果糖浓度约为2g/L，两种单糖利用率均很高。与图2数据对比，葡萄糖和果糖的利用速率都明显加快，经过培养后的酵母葡萄糖残糖率下降约30％，果糖残糖率下降约50％。可以看出经过本发明所述培养后的酵母，在果糖利用速率上已显著增强。
对比例1
对未经温度锻炼与果糖浓度锻炼的酵母进行发酵实验
1.1发酵培养基：蛋白胨4g/100mL、酵母浸膏2g/100mL、葡萄糖10g/100mL、果糖10g/100mL。
1.2发酵条件：发酵温度控制在30±0.5℃，ph为5±0.2范围内，溶氧控制在10-20％范围内。
1.3具体操作：选择实施例1中的2.2步骤中所得酵母，以2％(v/v)的接种量接种至发酵培养基内，每隔3个小时测定培养基内剩余葡萄糖及果糖浓度，当葡萄糖和果糖剩余浓度处于平稳后终止实验。检测发酵过程是否产生乙醇。检测发酵结束后酵母菌的核酸含量。
1.4.检测方法：果糖和葡萄糖的浓度测定采用高效液相色谱法，其色谱参数为：流动相为V(色谱纯乙腈)：V(二次蒸馏水)＝80：20，体积流量1mL/min，柱温30℃。蒸发光散射检测器参数为：漂移管温度95℃，空气体积流量2.0L/min。
1.5.按照上述实验方法进行3组平行实验，记录每组实验所测数据。
经检测，发酵过程中未检测到乙醇产生。根据3组实验过程中所测得葡萄糖与果糖的剩余浓度的平均值，绘制单糖消耗曲线如图2所示。根据检测到的两种单糖浓度可知在发酵的第36h，残留糖浓度处于平稳状态即终止发酵。
由图2分析可知，在发酵起始至15h，葡萄糖消耗速率较快，在24h后接近消耗完全。果糖的消耗速率在9-18h相对较快，之后逐渐降低。从发酵起始阶段开始，葡萄糖的利用速度远超果糖。反应结束后，葡萄糖残留量为0.3g/L，果糖仍然有近5g/L没被利用。
实施例2
1.培养基成分：
基础培养基：包括蛋白胨2g/100mL，酵母浸粉1g/100mL，葡萄糖4g/100mL，pH为5.0。
初始培养基：包括蛋白胨4g/100mL，酵母浸粉2g/100mL，葡萄糖10g/100mL，果糖10g/100mL，pH为5.0。
果糖锻炼培养基：包括编号为1—11号的果糖锻炼培养基，其中，1号－11号果糖锻炼培养基中的葡萄糖浓度由10g/100mL逐渐降至0，每个编号降低1g/100mL，果糖浓度由10g/100mL逐渐升至30g/100mL，每个编号升高2g/100mL；1号－11号果糖锻炼培养基还包括蛋白胨4g/100mL，酵母浸粉2g/100mL，pH为5.0。
以上所有培养基都已做无菌处理。
2.酵母培养
2.1将斜面保藏的高核酸酵母NY-1菌株接一环至准备好的液体摇甁基础培养基中活化，30℃，摇床转速180r/min培养24h复苏菌种。
2.2将上述摇瓶液体菌液接种到初始培养基内，接种量为3％(v/v)，发酵温度30℃，摇床转速180r/min，培养12h。
2.3以3％(v/v)的接种量，将初始培养基培养的酵母菌接种至编号1培养基中，培养24个小时，溶氧充足，初始培养基温度30℃，期间每隔2h温度下降1℃,20小时后温度降至20℃。
2.4以3％(v/v)的接种量将从1号培养基得到的酵母菌接种至2号培养基内，培养时间24小时，溶氧充足，初始培养基温度30℃，期间每隔1h温度下降1℃,20h后温度降至10℃。以此方法按顺序在3、4、5号培养基中培养。
2.5以3％(v/v)的接种量将从5号培养基得到的酵母菌接种至6号培养基内，培养时间为24h。溶氧量充足，培养基初始温度为25℃，每隔30min温度下降1℃，直至10℃为止，以此方法按顺序在7、8、9、10号培养基中培养。
2.6以3％(v/v)的接种量将从10号培养基得到的酵母菌接种至11号培养基内，培养时间为24h，溶氧量充足，培养温度为20℃，发酵结束后收集所得酵母。
实施例3
1.培养基成分：
基础培养基：包括蛋白胨2g/100mL，酵母浸粉1g/100mL，葡萄糖4g/100mL，pH为5.0。
初始培养基：包括蛋白胨4g/100mL，酵母浸粉2g/100mL，葡萄糖10g/100mL，果糖10g/100mL，pH为5.0。
果糖锻炼培养基：包括编号为1—11号的果糖锻炼培养基，其中，1号－11号果糖锻炼培养基中的葡萄糖浓度由10g/100mL逐渐降至0，2号与3号果糖锻炼培养基完全相同，设置为一组，以此类推，每组每次降低2g/100mL，果糖浓度由10g/100mL逐渐升至20g/100mL，每组每次升高2g/100mL；1号－11号果糖锻炼培养基还包括蛋白胨4g/100mL，酵母浸粉2g/100mL，pH为5.0。
以上所有培养基都已做无菌处理。
2.酵母培养
2.1将斜面保藏的热带假丝酵母菌接一环至准备好的液体摇甁基础培养基中活化,30℃，摇床转速180r/min培养24h，复苏菌种。
2.2将上述摇瓶液体菌液接种到初始培养基内，接种量为4％(v/v)，发酵温度30℃，摇床转速180r/min，培养12h。
2.3以4％(v/v)的接种量，将初始培养基培养的酵母菌接种至编号1培养基中，培养24个小时，溶氧充足，初始培养基温度30℃，期间每隔2h温度下降1℃,20小时后温度降至20℃。
2.4以4％(v/v)的接种量将从1号培养基得到的酵母菌接种至2号培养基内，培养时间24小时，溶氧充足，初始培养基温度30℃，期间每隔1.5h温度下降1℃,24小时后温度降至14℃。以此方法按顺序在3、4、5号培养基中培养。
2.5以4％(v/v)的接种量将从5号培养基得到的酵母菌接种至6号培养基内，培养时间为24h。溶氧量充足，培养基初始温度为25℃，每隔1h温度下降1℃，直至10℃为止，以此方法按顺序在7、8、9、10号培养基中培养。
2.6以4％(v/v)的接种量将从10号培养基得到的酵母菌接种至11号培养基内，培养时间为24h，溶氧量充足，培养温度为20℃，发酵结束后收集所得酵母。
实施例4
1.培养基成分：
基础培养基：包括蛋白胨2g/100mL，酵母浸粉1g/100mL，葡萄糖4g/100mL，pH为5.0。
初始培养基：包括蛋白胨4g/100mL，酵母浸粉2g/100mL，葡萄糖10g/100mL，果糖10g/100mL，pH为5.0。
果糖锻炼培养基：包括编号为1—11号的果糖锻炼培养基，其中，1号－11号果糖锻炼培养基中的葡萄糖浓度由10g/100mL逐渐降至0，每个编号降低1g/100mL，果糖浓度由10g/100mL逐渐升至30g/100mL，每个编号升高2g/100mL；1号－11号果糖锻炼培养基还包括蛋白胨4g/100mL，酵母浸粉2g/100mL，pH为5.0。
以上所有培养基都已做无菌处理。
2.酵母培养
2.1将斜面保藏的面包酵母菌株接一环至准备好的液体摇甁基础培养基中活化，30℃，摇床转速180r/min，培养24h，复苏菌种。
2.2将上述的摇瓶液体菌液接种到初始培养基内，接种量为5％(v/v)，发酵温度30℃，摇床转速180r/min，培养12h。
2.3以5％(v/v)的接种量，将初始培养基培养的酵母菌接种至编号1培养基中，培养24h，溶氧充足，初始培养基温度30℃，期间每隔2h温度下降1℃，20小时后温度降至20℃，期间每4h，利用30kHZ的超声波进行辅助，功率密度为100W/L，每次超声辅助时间10min。
2.4以5％(v/v)的接种量将从1号培养基得到的酵母菌接种至2号培养基内，培养时间24小时，溶氧充足，初始培养基温度30℃，期间每隔1h温度下降1℃,20小时后温度降至10℃，期间每4h，利用30kHZ的超声波进行辅助，功率密度为100W/L，每次超声辅助时间10min。以此方法按顺序在3、4、5号培养基中培养。
2.5以5％(v/v)的接种量将从5号培养基得到的酵母菌接种至6号培养基内，培养时间为24h。溶氧量充足，培养基初始温度为25℃，每隔30min温度下降1℃，直至10℃为止，期间每4h，利用30kHZ的超声波进行辅助，功率密度为100W/L，每次超声辅助时间10min。以此方法按顺序在7、8、9、10号培养基中培养。
2.6以5％(v/v)的接种量将从10号培养基得到的酵母菌接种至11号培养基内，培养时间为24h，溶氧量充足，培养温度为20℃，期间每4h，利用30kHZ的超声波进行辅助，功率密度为100W/L，每次超声辅助时间10min。发酵结束后收集所得酵母。
实施例5
为进一步研究经过本发明所述培养后的酵母与未经过本发明所述培养后的酵母在果糖培养基的生长情况。设计两组发酵实验，采用实施例1中经过培养后的酵母(2.6步骤后所得酵母)为实验组，未经过培养的酵母(2.2步骤后所得酵母)为对照组。
1.1.准备两组发酵培养基，其中成分包括：蛋白胨2g/100mL、酵母浸膏1g/100mL、果糖10g/100mL。
1.2将两组酵母都以2％(v/v)的接种量接种至各自培养基内，发酵温度控制在30±0.5℃，pH为5±0.2范围内，溶氧控制在10-20％范围内。发酵开始后每隔3h测定培养基中果糖浓度。每2h取样，稀释100倍后，测定560nm波长处的吸光度值(可对应酵母生长情况)。
1.3通过测量到的数据绘制两组实验的果糖消耗曲线如图3、酵母生长曲如线图4。
由图3分析可知，在果糖培养基中，实验组(经本发明所述培养方法培养后的酵母)果糖消耗速率明显快于对照组(未经过本发明所述培养方法培养的酵母)，在发酵结束实验组果糖残糖量在1g/L左右，而对照组仍有接近4g/L的果糖未被利用。经过对比可以看出经过培养后的酵母已获得更强的果糖亲和力，利用率和效率也显著提升。
由图4分析可知，对照组相比，实验组发酵的潜伏期时间已从原来6h缩短至3h，进入生长对数期后酵母生长更加快速，在最后平缓期所得到的酵母菌总数要远高于后者。此项实验证明经过本发明所述培养后的酵母已获得利用果糖进行快速生长的能力。
实施例6
检测酵母细胞壁蛋白含量变化
实验方法：分别取一定量实施例4中的经过本发明所述培养方法培养后的酵母(实验组)与未经过本发明所述培养方法培养的酵母菌(对照组)，采用反复冻融和超声波破碎的方法，破碎细胞壁，释放细胞质于溶液中。离心后取沉淀，用蒸馏水反复清洗离心2-3次，收集沉淀。从两种沉淀中取相同质量的酵母壁于两个烧杯中，在两个试样酵母壁中加适量蒸馏水煮沸，静置1h，用双层定量滤纸过滤，并加少量蒸馏水冲洗，于50～60℃下烘至略干，将滤纸卷成细卷放人凯氏烧瓶中，按凯氏定氮法测得蛋白质含量。重复进行3次检测，所得数据如下：
Figure BDA0003027670560000101
经试验检测，未经本发明所述培养方法培养的酵母细胞壁蛋白含量约为8.4％，经过培养后的酵母细胞壁蛋白含量约为9.2％。由此可知，经过本发明所述培养方法培养后的酵母表面蛋白质含量明显增加，而细胞壁表面蛋白多数为受体蛋白，这进一步说明通过本发明所述培养方法培养可以使得酵母细胞壁表面的受体蛋白数量增加，这其中就包含了果糖转运蛋白。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (9)

1.一种提高酵母利用果糖能力的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将初始培养获得的酵母菌接种至1号果糖锻炼培养基中，初始培养温度28～32℃，每隔1～2h培养温度下降1℃,培养温度降至18～22℃后，停止降温，继续培养至24～48h；
(2)将步骤(1)获得的酵母菌接种至2号果糖锻炼培养基中，初始培养温度28～32℃，每隔1～2h培养温度下降1℃，培养温度降至10～14℃后，停止降温，继续培养至24～48h；以此类推，依次在3、4、5号果糖锻炼培养基中培养；
(3)将步骤(2)中5号果糖锻炼培养基得到的酵母菌接种至6号果糖锻炼培养基中，初始培养温度为22～27℃，每隔0.5～1h培养温度下降1℃，培养温度降至8～12℃后，停止降温，续培养至24～48h；以此类推，依次在7、8、9、10号果糖锻炼培养基中培养；
(4)将步骤(3)中10号果糖锻炼培养基得到的酵母菌接种至11号果糖锻炼培养基内，培养温度为15～20℃，培养时间为24～48h，培养结束后收集所得酵母；
所述果糖锻炼培养基包括编号为1—11号的果糖锻炼培养基，其中，1号－11号果糖锻炼培养基中的葡萄糖浓度由10g/100mL逐渐降低，每次降低1～2g/100mL，果糖浓度由10g/100mL逐渐升高，每次升高1～2g/100mL；1号－11号果糖锻炼培养基还包括蛋白胨4g/100mL，酵母浸粉2g/100mL，pH为5.0。
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤(1)-(4)中，所述培养的摇床转速为100～300r/min。
3.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤(1)-(4)中，所述接种过程的接种量为培养基体积的2～5％。
4.根据权利要求1-3任一项所述的培养方法，其特征在于，步骤(1)中所述初始培养包括如下步骤：将活化的酵母菌接种到初始培养基中，接种量为培养基体积的2～5％，培养温度为30℃，摇床转速为180r/min，培养12～24h；所述初始培养基包括蛋白胨4g/100mL，酵母浸粉2g/100mL，葡萄糖10g/100mL，果糖10g/100mL，pH为5.0。
5.根据权利要求4所述的培养方法，其特征在于，所述活化的酵母菌的培养过程包括如下步骤：将保藏的酵母菌株接种至基础培养基中，培养温度为30℃，摇床转速为180r/min，培养12～24h；所述基础培养基包括蛋白胨2g/100mL，酵母浸粉1g/100mL，葡萄糖4g/100mL，pH为5.0。
6.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述1号－11号果糖锻炼培养基中的葡萄糖浓度由10g/100mL逐渐降至0，2号与3号果糖锻炼培养基完全相同，设置为一组，以此类推，每组每次降低2g/100mL，果糖浓度由10g/100mL逐渐升至20g/100mL，每组每次升高2g/100mL。
7.根据权利要求1、5或6所述的培养方法，其特征在于，步骤(1)-(4)的培养过程中，每间隔4h，使用20～40kHZ的超声波进行辅助处理，功率密度为50～200W/L，每次处理1～10min。
8.根据权利要求7所述的培养方法，其特征在于，所述酵母菌包括面包酵母、酿酒酵母、热带假丝酵母、高核酸酵母NY-1。
9.根据权利要求8所述的培养方法，其特征在于，所述培养基为无菌培养基。
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