CN113149981A - 一种降解雄激素受体的蛋白降解靶向嵌合体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新的基于VHL配体诱导的双功能分子化合物，以及在合成这些化合物和其药物组合物中的应用。本发明所涉及化合物如式I所示，该化合物能够选择性诱导AR蛋白降解，可用于治疗前列腺癌、乳腺癌等癌症。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体的涉及一种靶向降解的双功能分子化合物，以及在合成这些化合物和其药用组合物中的应用。
背景技术
雄激素受体(AR)是一种配体依赖性的反式转录调节蛋白，广泛分布于机体组织，参与雄激素的各种生理调节功能；除脾脏外，AR几乎在人类所有组织中都有不同水平的表达。AR既可以在胞质中调控信号通路，也可以在胞核内直接调控相关靶基因。AR信号在肿瘤(如前列腺癌、乳腺癌、肾癌等)发生发展和转移中具有重要作用。
前列腺癌是指发生在前列腺上皮的恶性肿瘤，是男性常见的恶性肿瘤之一。目前关于前列腺癌的治疗方案主要有两种：一种依赖于雄激素的减少，另一种是有效抑制AR功能；当前开发的一种替代方案包括消除AR蛋白。由于AR在泌尿系统肿瘤中的重要作用，AR蛋白的消除在治疗上将得到有益的应答。因此，开发更为有效降解AR蛋白的药物是非常必要的。
蛋白降解靶向嵌合技术，是指将靶向蛋白小分子药物和E3泛素连接酶配体通过接头连接起来，同时结合靶蛋白与E3泛素连接酶。此类化合物可通过将靶蛋白泛素化以实现该蛋白的降解或抑制，其与传统小分子药物相比降解效力更强。本发明所涉及的双功能分子化合物即采用了此种作用机制，且本发明的双功能分子化合物可与VHL E3泛素连接酶结合，其中VHL配体的结构如式V所示：
发明内容
本发明提供了一种基于VHL(Von Hippel-Lindau)配体诱导的双功能分子化合物、包括含有所述化合物的组合物，以及制备和使用它们的方法，所述化合物可用作雄激素受体(AR)的靶向泛素化和降解的调节剂；此外，本发明还提供了该类化合物在治疗或预防肿瘤等疾病中的应用。
本发明的一个目的在于提供一种如式I所示的双功能分子化合物，
其中：
所述R1为氯或者三氟甲基；R2为H或者CH3；X1、X2、X3、X4分别独立的表示CH或者N，且X1、X2、X3、X4中的0-2个可同时为N；所述L为接头，且L为结构
优选地，所述L的结构为
进一步的，本发明的优选化合物包括但不限于以下结构：
本发明的另一个目的在于，提供一种双功能分子化合物的合成方法，方法如下所示：
其中，化合物5可通过步骤d一步反应合成得到，也可通过步骤d1和步骤d2两步反应合成得到。
步骤a为化合物1与Boc酸酐反应得到化合物2；步骤b为化合物2与化合物10反应得到化合物3；步骤c为化合物3进行水解反应得到化合物4；步骤d为化合物4和化合物11反应得到化合物5(步骤d1为化合物4与化合物13反应得到化合物14，步骤d2为化合物14与N-Boc哌嗪反应得到化合物5)；步骤e为化合物5进行水解反应得到化合物6；步骤f为化合物6与化合物12反应得到化合物7；步骤g为化合物7进行水解反应得到化合物8；步骤h为化合物8与化合物V反应得到目标化合物式I；
上述方法中，所述R1为氯或者三氟甲基；R2为H或者CH3；X1、X2、X3、X4分别独立的表示CH或者N，且X1、X2、X3、X4中的0-2个可同时为N；所述X为离去基团，具体地，所述X为TsO或者MsO；所述L为结构
具体地，上述合成方法的步骤如下所示：
步骤a：向化合物1中加入适量Boc酸酐和四氢呋喃，搅拌下反应一段时间，待反应完全后，减压蒸除溶剂，残余物经纯化可得化合物2；
步骤b：容器中加入化合物2和四氢呋喃，室温搅拌下加入钠氢，搅拌反应一段时间后，加入化合物10，室温搅拌一段时间，待反应完全后，减压蒸除溶剂，并向残余物中加入适量水、二氯甲烷萃取多次，收集有机相，有机相合并后干燥、过滤，滤液减压蒸除溶剂，残余物经纯化得化合物3；
步骤c：容器中加入化合物3、三氟乙酸和二氯甲烷，搅拌溶清后室温反应一段时间，待反应完全后，减压蒸除溶剂，向残余物中加入适量水和碳酸钠调节pH至9-10，用二氯甲烷萃取多次，收集有机相，有机相合并后干燥、过滤，滤液减压蒸除溶剂得化合物4；
步骤d：容器中加入化合物4、化合物11、DIPEA和二氯甲烷，室温搅拌下加入HATU，搅拌反应一段时间，待反应完全后加入二氯甲烷，分别用水和氢氧化钠水溶液洗涤，有机相经干燥、过滤，滤液减压蒸除溶剂得化合物5；
[步骤d1：容器中加入化合物13、化合物4、DIPEA和DMF，室温搅拌下加入HATU，室温搅拌反应一段时间，待反应完全后加入乙酸乙酯，然后依次用水和饱和氯化钠水溶液洗涤，有机层干燥、过滤，滤液减压蒸除溶剂，经纯化得化合物14；
步骤d2：容器中加入化合物14、N-Boc哌嗪、碳酸钾和DMSO，搅拌下升温反应一段时间，待反应完全后，体系降至室温，加入乙酸乙酯，然后依次用水和饱和氯化钠水溶液洗涤，有机层干燥、过滤，滤液减压蒸除溶剂，经纯化得化合物5。]
步骤e：容器中加入化合物5、三氟乙酸和二氯甲烷，搅拌溶清后室温反应一段时间，待反应完全后，减压蒸除溶剂，向残余物中加入适量水和碳酸钠调节pH至9-10，用二氯甲烷萃取多次，收集有机相，有机相合并后干燥、过滤，滤液减压蒸除溶剂得化合物6；
步骤f：将化合物6、化合物12、碳酸钾和DMF混合后进行微波反应，反应一段时间，降至室温，加入乙酸乙酯，用水、饱和氯化钠水溶液分别洗涤，收集有机相，有机相合并后干燥、过滤，滤液减压蒸除溶剂，残余物经纯化得化合物7；
步骤g：将化合物7、三氟乙酸和二氯甲烷混合后搅拌溶清，室温反应一段时间，待反应完全后，减压蒸除溶剂得化合物8；
步骤h：向化合物8中加入适量DIPEA、VHL三氟乙酸盐和二氯甲烷，搅拌下加入HATU，待反应完全后，加入适量二氯甲烷，然后用水洗涤，收集有机相，有机相干燥、过滤，滤液减压蒸除溶剂，残余物经纯化得目标化合物I。
所述R1、R2、X1、X2、X3、X4、X、L均如上文所定义；
本发明还提供一种合成上述双功能分子化合物所需的中间体，化合物6，其结构式如下所示：
其中，所述R1为氯或者三氟甲基；X1、X2、X3、X4分别独立的表示CH或者N，且X1、X2、X3、X4中的0-2个可同时为N。
本发明的又一个目的在于提供一种药物组合物，其中含有有效治疗量的上述化合物I及其他非活性成分，所述非活性成分包括药学上可接受的载体、稀释剂、辅料、媒介物或它们的组合物。所述药物组合物还可进一步加工成制剂，所述制剂的剂型可以为片剂或胶囊中的一种。
本发明的再一个目的是提供上述化合物I及其药物组合物在制备治疗或预防肿瘤的药物中的应用。其中，所述肿瘤可以但不限于是癌症、前列腺癌、乳腺癌等。
附图说明
图1是VCap细胞加化合物I-2(100nM)处理24小时后所得蛋白样品通过酶联免疫印迹分析得到AR蛋白的水平(对照组所加为实验组同等体积的DMSO)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，应理解，以下实施例仅用于说明本发明，而不意味着对本发明的任何限制。
本发明涉及的原料可从商业途径获得，或者通过本领域已知的方法合成，或根据本文所述方法合成。
本发明所用到的英文缩写解释如下：
Corning：康宁公司
TICO：TICO Europe(一家荷兰胎牛血清生产商)
Beyotime：碧云天生物技术
Sigma：Sigma Aldrich(西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司)
DOJINDO：东仁化学科技(上海)有限公司
VHL：Von Hippel-Lindau(冯·希佩尔·林道)
DIPEA：N，N-二异丙基乙胺
HATU：2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯
TsO：对甲苯磺酰氧基
DMF：N，N-二甲基甲酰胺
DMSO：二甲基亚砜
V/V：表示体积比
PBS缓冲溶液：磷酸盐缓冲溶液，pH＝7.4
RIPA裂解液：放射免疫沉淀测定裂解液
BCA蛋白定量试剂盒：二辛可宁酸蛋白定量试剂盒
SDS-PAGE胶：聚丙烯酰胺凝胶
PVDF膜：聚偏二氟乙烯膜
TBST溶液：含2％吐温的三羟甲基氨基甲烷-盐酸的缓冲盐溶液，pH＝7.4
M：mol/L(摩尔/升)
mM：mmol/L(毫摩尔/升)
nM：nmol/L(纳摩尔/升)
μM：μmol/L(微摩尔/升)
W：瓦特(功率单位)
rpm：每分钟转速
如有未包含于上述所列缩写出现在本发明中，则代表其为本领域技术人员所普遍接受的含义。
实施例1：
合成(2S，4R)-1-((S)-2-(2-(2-(4-(4-((3-内型)-(3-氯-4-氰基苯氧基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-羰基)苯基)哌嗪-1-基)乙氧基)乙酰氨基)-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺(化合物I-1)，其结构式如下：
步骤1：合成(3-内型)-羟基-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-羧酸叔丁酯(化合物2)
向烧瓶中加入2.033gα-去甲基托品醇(即化合物1)、4.201g Boc酸酐、10ml四氢呋喃，搅拌下40℃反应2小时，反应完成后，减压蒸除溶剂，残余物经硅胶柱色谱层析(按石油醚∶乙酸乙酯(V/V)＝3∶1洗脱)纯化，得3.099g化合物2。
步骤2：合成(3-内型)-(3-氯-4氰基苯氧基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-羧酸叔丁酯(化合物3a)
向烧瓶中加入1.499g化合物2、15ml四氢呋喃，室温搅拌下加入0.320g钠氢(60％含量)，搅拌10分钟后加入1.534g 2-氯-4-氟苯甲腈(即化合物10a)，室温搅拌反应18小时，反应完成后，减压蒸除溶剂，向残余物中加入15ml水，用二氯甲烷萃取三次，每次10ml，收集并合并有机相，有机相用无水硫酸钠干燥、过滤，滤液减压蒸除溶剂，残余物经硅胶柱色谱层析(按石油醚∶乙酸乙酯(V/V)＝5∶1洗脱)纯化，得2.101g化合物3a。
化合物3a的质谱数据为：MS(ESI)：m/z：361.8M+。
步骤3：合成4-(8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-(3-内型)-氧基)-2-氯苯甲腈(化合物4a)
向烧瓶中加入2.101g化合物3a、3ml三氟乙酸、1ml二氯甲烷，搅拌溶清后室温反应30分钟，反应完全后，减压蒸除溶剂，向残余物中加入20ml水，用碳酸钠调节pH至9-10，用二氯甲烷萃取三次，每次15ml，收集有机相后合并，有机相用无水硫酸钠干燥并过滤，滤液减压蒸除溶剂得1.206g化合物4a。
化合物4a的质谱数据为：MS(ESI)：m/z：262.8(M+H)+。
步骤4：合成4-(4-((3-内型)-(3-氯-4氰基苯基氧)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-羰基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(化合物5a)
向烧瓶中加入0.681g化合物4a、0.827g化合物11a、DIPEA 0.672g、10ml二氯甲烷，室温搅拌下加入HATU 1.293g，继续室温搅拌反应1小时，反应完全后加入10ml二氯甲烷，依次用10ml水洗一次，10ml氢氧化钠水溶液(1M)洗涤一次，10ml水洗一次，有机相用无水硫酸钠干燥后过滤，滤液减压蒸除溶剂得1.210g化合物5a。
化合物5a的质谱数据为：MS(ESI)：m/z：550.7(M+H)+。
步骤5：合成2-氯-4-((8-(4-(哌嗪-1-基)苯甲酰基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)-(内型)-氧基)苯甲腈(化合物6a)
向烧瓶中加入1.100g化合物5a、1.5ml三氟乙酸、0.5ml二氯甲烷，搅拌溶清后室温反应30分钟，反应完全后，减压蒸除溶剂，向残余物中加入20ml水，用碳酸钠调节pH至9-10，随后用二氯甲烷萃取三次，每次8ml，收集有机相后合并，有机相经无水硫酸钠干燥、过滤，滤液减压蒸除溶剂得0.848g化合物6a。
化合物6a的质谱数据：MS(ESI)：m/z：450.7(M+H)+。
步骤6：合成2-(2-(4-(4-((3-内型)-(3-氯-4氰基苯氧基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-羰基)苯基)哌嗪-1-基)乙氧基)乙酸叔丁酯(化合物7a)
向烧瓶中加入0.999g化合物6a、0.210g化合物12a、0.092g碳酸钾、3ml DMF，微波325W反应3分钟，降至室温，加入20ml乙酸乙酯，用水洗三次，每次10ml，随后用10ml饱和氯化钠水溶液洗涤一次，有机相经无水硫酸钠干燥、过滤，滤液减压蒸除溶剂，残余物经硅胶柱色谱层析(按二氯甲烷∶甲醇(V/V)＝20∶1洗脱)纯化，得0.064g化合物7a。
化合物7a的质谱数据：MS(ESI)：m/z：608.7(M+H)+。
步骤7：合成2-(2-(4-(4-((3-内型)-(3-氯-4氰基苯氧基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-羰基)苯基)哌嗪-1-基)乙氧基)乙酸(化合物8a)
向烧瓶中加入0.064g化合物7a、1.5ml三氟乙酸、0.5ml二氯甲烷，搅拌溶清后室温反应30分钟，反应完全后，减压蒸除溶剂得0.102g化合物8a的粗品。
化合物8a的质谱数据：MS(ESI)：m/z：552.7(M+H)+。
步骤8：合成(2S，4R)-1-((S)-2-(2-(2-(4-(4-((3-内型)-(3-氯-4-氰基苯氧基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-羰基)苯基)哌嗪-1-基)乙氧基)乙酰氨基)-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺(化合物I-1)
向步骤7所得的粗品化合物8a(0.102g，以化合物7a的量计，化合物7a为0.064g)中加入0.136g DIPEA、0.086g化合物V1、5ml二氯甲烷，室温搅拌下加入0.060g HATU，继续室温搅拌反应1小时，反应完全后，加入10ml二氯甲烷，用水洗三次，每次10ml，有机层用无水硫酸钠干燥后过滤，滤液减压蒸除溶剂，残余物经薄层色谱层析(按二氯甲烷∶甲醇(V/V)＝20∶1洗脱)纯化，得0.027g化合物I-1。
化合物I-1的核磁数据如下：
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.67(s，1H)，7.58(d，J＝8.7Hz，1H)，7.42(d，J＝8.6Hz，2H)，7.37-7.32(m，4H)，7.29(d，J＝4.8Hz，1H)，7.22(d，J＝8.9Hz，1H)，6.94(d，J＝2.2Hz，1H)，6.87(d，J＝8.7Hz，2H)，6.79(dd，J＝8.7，2.2Hz，1H)，4.85-4.66(m，3H)，4.64-4.45(m，3H)，4.36-4.22(m，2H)，4.12(d，J＝11.4Hz，1H)，4.00(dd，J＝33.7，15.4Hz，2H)，3.69(t，J＝5.4Hz，2H)，3.61(dd，J＝11.4，3.5Hz，1H)，3.29(t，J＝4.8Hz，4H)，2.72-2.64(m，6H)，2.62-2.56(m，1H)，2.51(s，3H)，2.25-1.96(m，10H)，0.94(s，9H).
实施例2：
合成(2S，4R)-1-((S)-2-(2-(2-(4-(4-((3-内型)-(3-氯-4-氰基苯氧基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-羰基)苯基)哌嗪-1-基)乙氧基)乙酰氨基)-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯烷-2-甲酰胺(化合物I-2)
将实施例1步骤8中的化合物V1换成化合物V2，合成方法同实施例1。
化合物I-2的核磁数据如下：
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.67(s，1H)，7.58(d，J＝8.7Hz，1H)，7.42(d，J＝8.6Hz，2H)，7.36(d，J＝8.0Hz，2H)，7.33(d，J＝8.0Hz，2H)，7.29(d，J＝4.8Hz，1H)，7.22(d，J＝8.9Hz，1H)，6.94(d，J＝2.2Hz，1H)，6.87(d，J＝8.7Hz，2H)，6.79(dd，J＝8.7，2.2Hz，1H)，5.01(p，J＝7.0Hz，1H)，4.80-4.63(m，3H)，4.55-4.43(m，2H)，4.33-4.21(m，1H)，4.12-3.97(m，3H)，3.71-3.60(m，2H)，3.58(dd，J＝11.1，3.5Hz，1H)，3.30-3.26(m，4H)，2.72-2.67(m，2H)，2.64-2.57(m，4H)，2.55-2.52(m，1H)，2.51(s，3H)，2.16-1.80(m，10H)，1.46(d，J＝6.7Hz，3H)，1.07(s，9H).
实施例3：
合成(2S，4R)-1-((S)-2-(2-(2-(4-(6-((3-内型)-(3-氯-4-氰基苯氧基)-8-氮杂双环[3.2.1]-辛烷-8-羰基)吡啶-3-基)哌嗪-1-基)乙氧基)乙酰氨基)-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯烷-2-甲酰胺(化合物I-3)
步骤1-步骤3的合成方法同实施例1。
步骤4：合成4-(6-((3-内型)-(3-氯-4-氰基苯氧基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-羰基)吡啶-3-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(化合物5c)
①合成2-氯-4-((8-(5-氟吡啶-2-甲酰基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-(3-内型)-基)氧基)苯甲腈(化合物14c)
向烧瓶中加入0.100g化合物13c、0.220g化合物4a、0.180g DIPEA、5ml DMF，室温搅拌下加入0.320g HATU，室温搅拌反应1小时，反应完全后加入25ml乙酸乙酯，然后用水洗两次，每次10ml，用10ml饱和氯化钠水溶液洗涤一次，有机层用无水硫酸钠干燥、过滤，滤液减压蒸除溶剂，残余物经硅胶柱色谱层析(按二氯甲烷∶甲醇(V/V)＝20∶1洗脱)纯化得0.239g化合物14c。
化合物14c的质谱数据：MS(ESI)：m/z：385.7(M+H)+。
②合成4-(6-((3-内型)-(3-氯-4-氰基苯氧基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-羰基)吡啶-3-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(化合物5c)
向烧瓶中加入0.192g化合物14c、0.110g N-Boc哌嗪、0.200g碳酸钾、3ml DMSO，搅拌下升温至100℃，反应18小时，反应完全后，体系降至室温，加入30ml乙酸乙酯，然后用水洗两次，每次10ml，用10ml饱和氯化钠水溶液洗涤一次，有机层用无水硫酸钠干燥、过滤，滤液减压蒸除溶剂，残余物经薄层色谱层析(按二氯甲烷∶异丙醇(V/V)＝50∶1至20∶1)得0.075g化合物5c。
化合物5c的质谱数据：MS(ESI)：m/z：573.6(M+Na)+。
将实施例1步骤8中的化合物V1换成化合物V2，步骤5-步骤8的合成方法同实施例1。
化合物I-3的核磁数据如下：
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.65(s，1H)，8.25(d，J＝2.6Hz，1H)，7.88(d，J＝8.8Hz，1H)，7.64(d，J＝8.7Hz，1H)，7.41-7.33(m，5H)，7.29(d，J＝4.7Hz，1H)，7.17(d，J＝8.9Hz，1H)，6.94(d，J＝2.2Hz，1H)，6.79(dd，J＝8.7，2.2Hz，1H)，4.96-4.87(m，1H)，4.86-4.66(m，3H)，4.2-4.50(m，2H)，4.43-4.15(m，1H)，4.13-3.98(m，3H)，3.75-3.65(m，2H)，3.61(dd，J＝11.1，3.4Hz，1H)，3.59-3.51(m，4H)，2.70-2.60(m，6H)，2.58-2.52(m，1H)，2.50(s，3H)，2.16-1.80(m，10H)，1.52(d，J＝7.1Hz，3H)，1.09(s，9H).
实施例4：
合成(2S，4R)-1-((S)-2-(2-(2-(4-(4-((3-内型)-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯氧基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-羰基)苯基)哌嗪-1-基)乙氧基)乙酰胺)-3，3，二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯烷-2-甲酰胺(化合物I-4)
将实施例1步骤2中的2-氯-4-氟苯甲腈(即化合物10a)换成2-(三氟甲基)-4-氟苯甲腈(即化合物10b)，将实施例1步骤8中的化合物V1换成化合物V2，合成方法同实施例1。
化合物I-4的核磁数据如下：
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.67(s，1H)，7.79(d，J＝8.4Hz，1H)，7.44(d，J＝8.7Hz，2H)，7.38-7.31(m，5H)，7.05(d，J＝8.4Hz，1H)7.24(d，J＝2.4Hz，1H)，7.17(dd，J＝8.4，2.4Hz，1H)，6.87(d，J＝8.7Hz，2H)，4.92-4.66(m，4H)，4.61-4.48(m，2H)，4.33-4.18(m，1H)，4.14-4.05(m，3H)，3.71-3.62(m，3H)，3.34-3.26(m，4H)，2.72-2.66(m，2H)，2.65-2.58(m，4H)，2.58-2.54(m，1H)，2.53(s，3H)，2.16-1.85(m，10H)，1.49(d，J＝7.0Hz，3H)，1.03(s，9H).
实施例5：
合成(2S，4R)-1-((S)-2-(2-(2-(4-(5-((3-内型)-(3-氯-4-氰基苯氧基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-羰基)吡啶-2-基)哌嗪-1-基)乙氧基)乙酰氨基)-3，3二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯烷-2-甲酰胺(化合物I-5)
将实施例3中步骤4①中的化合物13c
换成化合物13d
合成方法同实施例3。
化合物I-5的核磁数据如下：
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.67(s，1H)，8.64(d，J＝2.0Hz，1H)，7.97(dd，J＝9.2，2.0Hz，1H)，7.58(d，J＝8.7Hz，1H)，7.37-7.32(m，4H)，7.29(d，J＝4.8Hz，1H)，7.22(d，J＝8.9Hz，1H)，6.94(d，J＝2.2Hz，1H)，6.79(dd，J＝8.7，2.2Hz，1H)，6.58(d，J＝9.2Hz，1H)，4.88-4.66(m，4H)，4.60-4.46(m，2H)，4.35-4.19(m，1H)，4.16-4.07(m，3H)，3.72-3.61(m，3H)，3.54-3.47(m，4H)，2.70-2.64(m，2H)，2.64-2.59(m，4H)，2.57-2.53(m，1H)，2.51(s，3H)，2.19-1.84(m，10H)，1.51(d，J＝7.2Hz，3H)，1.06(s，9H).
实施例6：
合成(2S，4R)-1-((S)-2-(2-(2-(4-(5-((3-内型)-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯氧基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-羰基)吡啶-2-基)哌嗪-1-基)乙氧基)乙酰氨基)-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺(化合物I-6)
将实施例1步骤2中的2-氯-4-氟苯甲腈(即化合物10a)换成2-(三氟甲基)-4-氟苯甲腈(即化合物10b)，步骤1-步骤3的合成方法同实施例1。
步骤4：合成4-(5-((3-内型)-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯氧基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-羰基)吡啶-2-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(化合物5d)
①合成4-((8-(6-氟吡啶-2-甲酰基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-(3-内型)-基)氧基)-2-(三氟甲基)苯甲腈(化合物14d)
向烧瓶中加入0.102g化合物13d、0.248g化合物4b、0.179g DIPEA、5ml DMF，室温搅拌下加入0.323g HATU，室温搅拌反应1小时，反应完全后加入25ml乙酸乙酯，然后用水洗两次，每次10ml，用10ml饱和氯化钠水溶液洗涤一次，有机层用无水硫酸钠干燥、过滤，滤液减压蒸除溶剂，残余物经硅胶柱色谱层析(按二氯甲烷∶甲醇(V/V)＝20∶1洗脱)纯化得0.258g化合物14d。
化合物14d的质谱数据：MS(ESI)：m/z：419.7(M+H)+。
②合成4-(5-((3-内型)-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯氧基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-羰基)吡啶-2-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(化合物5d)
向烧瓶中加入0.209g化合物14d、0.111g N-Boc哌嗪、0.199g碳酸钾、3ml DMSO，搅拌下升温至100℃，反应18小时，反应完全后，体系降至室温，加入30ml乙酸乙酯，然后用水洗两次，每次10ml，用10ml饱和氯化钠水溶液洗涤一次，有机层用无水硫酸钠干燥、过滤，滤液减压蒸除溶剂，残余物经薄层色谱层析(按二氯甲烷∶异丙醇(V/V)＝50∶1至20∶1)得0.082g化合物5d。
化合物5d的质谱数据：MS(ESI)：m/z：585.8(M+H)+。
步骤5-步骤8的合成方法同实施例1。
化合物I-6的核磁数据如下：
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.69(d，J＝2.0Hz，1H)，8.66(s，1H)，7.85(dd，J＝8.8，2.2Hz，1H)，7.77(d，J＝8.4Hz，1H)，7.38-7.29(m，5H)，7.24(d，J＝2.4Hz，1H)，7.17(dd，J＝8.4，2.4Hz，1H)，7.11(d，J＝8.4Hz，1H)，6.53(d，J＝9.2Hz，1H)，4.93-4.69(m，4H)，4.64-4.52(m，2H)，4.38-4.23(m，2H)，4.09-3.93(m，3H)，3.73-3.57(m，7H)，2.74-2.67(m，2H)，2.65-2.55(m，5H)，2.52(s，3H)，2.30-1.91(m，10H)，1.01(s，9H).
实施例7：
合成(2S，4R)-1-((S)-2-(2-(2-(4-(5-((3-内型)-(3-氯-4-氰基苯氧基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-羰基)嘧啶-2-基)哌嗪-1-基)乙氧基)乙酰氨基)-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯烷-2-甲酰胺(化合物I-7)
将实施例1步骤4中的化合物11a
换成化合物11b
将实施例1步骤8中的化合物V1换成化合物V2，合成方法同实施例1。
化合物I-7的核磁数据如下：
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.67(s，1H)，8.48(s，2H)，7.59(d，J＝8.7Hz，1H)，7.47(d，J＝7.8Hz，1H)，7.43-7.34(m，4H)，7.29(d，J＝7.8Hz，1H)，6.94(d，J＝2.3Hz，1H)，6.79(dd，J＝8.7，2.3Hz，1H)，5.08(p，J＝7.0Hz，1H)，4.87-4.66(m，3H)，4.60-4.48(m，2H)，4.40-4.14(m，1H)，4.13-4.06(m，1H)，4.01(d，J＝23.0Hz，2H)，3.96-3.90(m，4H)，3.75-3.66(m，2H)，3.62(dd，J＝11.3，3.6Hz，1H)，2.72-2.66(m，2H)，2.65-2.58(m，4H)，2.58-2.54(m，1H)，2.53(s，3H)，2.18-1.82(m，10H)，1.48(d，J＝6.9Hz，3H)，1.07(s，9H).
实施例8：
合成(2S，4R)-1-((S)-2-(2-(2-(4-(5-((3-内型)-(3-氯-4-氰基苯氧基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-羰基)吡嗪-2-基)哌嗪-1-基)乙氧基)乙酰氨基)-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯烷-2-甲酰胺(化合物I-8)
将实施例1步骤4中的化合物11a
换成化合物11c
将实施例1步骤8中的化合物V1换成化合物V2，合成方法同实施例1。
化合物I-8的核磁数据如下：
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.63(s，1H)，8.42(s，1H)，7.93(s，1H)，7.61(d，J＝8.0Hz，1H)，7.51(d，J＝8.7Hz，1H)，7.32-7.21(m，5H)，6.85(d，J＝2.3Hz，1H)，6.71(dd，J＝8.7，2.3Hz，1H)，4.92-4.88(m，1H)，4.85-4.62(m，3H)，4.58-4.46(m，2H)，4.37-4.11(m，1H)，4.13-3.95(m，3H)，3.78-3.72(m，4H)，3.73-3.65(m，2H)，3.61(dd，J＝11.1，3.7Hz，1H)，2.70-2.55(m，7H)，2.50(s，3H)，2.15-1.80(m，10H)，1.45(d，J＝7.1Hz，3H)，1.03(s，9H).
实施例9：
合成(2S，4R)-1-((S)-2-(3-(2-(4-(4-((3-内型)-(3-氯-4-氰基苯氧基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-羰基)苯基)哌嗪-1-基)乙氧基)丙酰氨基)-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺(化合物I-9)
将实施例1步骤6中的化合物12a换成化合物12b，合成方法同实施例1。
化合物I-9的核磁数据如下：
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.67(s，1H)，7.58(d，J＝8.7Hz，1H)，7.42(d，J＝8.6Hz，2H)，7.37-7.27(m，5H)，7.22(d，J＝8.9Hz，1H)，6.94(d，J＝2.2Hz，1H)，6.87(d，J＝8.7Hz，2H)，6.79(dd，J＝8.7，2.2Hz，1H)，4.88-4.66(m，3H)，4.61-4.48(m，3H)，4.40-4.22(m，2H)，4.09(d，J＝11.0Hz，1H)，3.79-3.71(m，2H)，3.67-3.59(m，3H)，3.36-3.25(m，4H)，2.75-2.59(m，6H)，2.53-2.41(m，6H)，2.21-1.93(m，10H)，0.89(d，J＝8.2Hz，9H).
实施例10：
合成(2S，4R)-1-((S)-2-(2-(2-(4-(6-((3-内型)-(3-氯-4-氰基苯氧基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-羰基)哒嗪-3-基)哌嗪-1-基)乙氧基)乙酰氨基)-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯烷-2-甲酰胺(化合物I-10)
将实施例1步骤4中的化合物11a
换成化合物11d
将实施例1步骤8中的化合物V1换成化合物V2，合成方法同实施例1。
化合物I-10的核磁数据如下：
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.65(s，1H)，8.02(d，J＝9.2Hz，1H)，7.66(d，J＝8.2Hz，1H)，7.51(d，J＝8.8Hz，1H)，7.32-7.27(m，4H)，7.25-7.21(m，1H)，6.87(d，J＝2.3Hz，1H)，6.80(d，J＝9.2Hz，1H)，6.72(dd，J＝8.8，2.3Hz，1H)，5.01(p，J＝6.8Hz，1H)，4.82-4.61(m，3H)，4.57-4.43(m，2H)，4.39-4.16(m，1H)，4.11-4.03(m，1H)，3.97(d，J＝22.4Hz，2H)，3.85-3.79(m，4H)，3.72-3.63(m，2H)，3.58(dd，J＝11.7，3.7Hz，1H)，2.70-2.64(m，2H)，2.63-2.55(m，5H)，2.50(s，3H)，2.16-1.83(m，10H)，1.52(d，J＝7.1Hz，3H)，1.00(s，9H).
实施例11：
合成(2S，4R)-1-((S)-2-(3-(2-(2-(4-(4-((3-内型)-(3-氯-4-氰基苯氧基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-羰基)苯基)哌嗪-1-基)乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺(化合物I-11)
将实施例1步骤6中的化合物12a换成化合物12c，合成方法同实施例1。
化合物I-11的核磁数据如下：
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.67(s，1H)，7.58(d，J＝8.7Hz，1H)，7.48-7.39(m，3H)，7.38-7.31(m，4H)，7.05(d，J＝8.4Hz，1H)，6.94(d，J＝2.2Hz，1H)，6.87(d，J＝8.7Hz，2H)，6.79(dd，J＝8.7，2.3Hz，1H)，4.85-4.64(m，3H)，4.60-4.46(m，3H)，4.37-4.20(m，2H)，4.06(d，J＝11.2Hz，1H)，3.77-3.68(m，2H)，3.66-3.56(m，7H)，3.32-3.24(m，4H)，2.73-2.61(m，6H)，2.55-2.44(m，6H)，2.19-1.94(m，10H)，0.94(d，J＝8.2Hz，9H).
实施例12：
合成(2S，4R)-1-((S)-2-(2-(2-(4-(5-((3-内型)-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯氧基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-羰基)嘧啶-2-基)哌嗪-1-基)乙氧基)乙酰氨基)-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺(化合物I-12)
步骤1：(3-内型)-羟基-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-羧酸叔丁酯(化合物2)
向烧瓶中加入6.101gα-去甲基托品醇(即化合物1)、12.593g Boc酸酐、30ml四氢呋喃，搅拌下40℃反应2小时，反应完成后，减压蒸除溶剂，残余物经硅胶柱色谱层析(按石油醚∶乙酸乙酯(V/V)＝3∶1的比例洗脱)纯化，得9.198g化合物2。
步骤2：合成(3-内型)-(4氰基-3-(三氟甲基)苯氧基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-羧酸叔丁酯(化合物3b)
向烧瓶中加入4.498g化合物2、45ml四氢呋喃，室温搅拌下加入0.960g钠氢(60％含量)，搅拌10分钟后加入5.7g化合物10b，室温搅拌反应18小时，反应完成后，减压蒸除溶剂，向残余物中加入45ml水，用二氯甲烷萃取三次，每次30ml，收集并合并有机相，有机相用无水硫酸钠干燥、过滤，滤液减压蒸除溶剂，残余物经硅胶柱色谱层析(按石油醚∶乙酸乙酯(V/V)＝5∶1洗脱)纯化，得6.814g化合物3b。
化合物3b的质谱数据：MS(ESI)：m/z：395.9M+。
步骤3：合成4-(8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-(3-内型)-氧基)-2-(三氟甲基)苯甲腈(化合物4b)
向烧瓶中加入6.814g化合物3b、9ml三氟乙酸、3ml二氯甲烷，搅拌溶清后室温反应35分钟，反应完全后，减压蒸除溶剂，向残余物中加入60ml水，用碳酸钠调节pH至9-10，用二氯甲烷萃取三次，每次45ml，收集有机相后合并，有机相用无水硫酸钠干燥并过滤，滤液减压蒸除溶剂得4.294g化合物4b。
化合物4b的质谱数据：MS(ESI)：m/z：296.8(M+H)+。
步骤4：合成4-(5-((3-内型)-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯基氧)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-羰基)嘧啶-2-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(化合物5b)
向烧瓶中加入2.250g化合物4b、2.434g化合物11b、DIPEA 1.965g、30ml二氯甲烷，室温搅拌下加入HATU 3.764g，继续室温搅拌反应1小时，反应完全后加入30ml二氯甲烷，依次用30ml水洗一次，10ml氢氧化钠水溶液(1M)洗涤一次，10ml水洗一次，有机相用无水硫酸钠干燥后过滤，滤液减压蒸除溶剂得3.811g化合物5b。
化合物5b的质谱数据：MS(ESI)：m/z：586.7(M+H)+。
步骤5：合成4-((8-(2-(哌嗪-1-基)嘧啶-5-羰基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)-(内型)-氧基)-2-(三氟甲基)苯甲腈(化合物6b)
向烧瓶中加入3.518g化合物5b、4.5ml三氟乙酸、1.5ml二氯甲烷，搅拌溶清后室温反应30分钟，反应完全后，减压蒸除溶剂，向残余物中加入50ml水，用碳酸钠调节pH至9-10，随后二氯甲烷萃取三次，每次24ml，收集有机相后合并，有机相经无水硫酸钠干燥、过滤，滤液减压蒸除溶剂得2.819g化合物6b。
化合物6b的质谱数据：MS(ESI)：m/z：486.8(M+H)+。
步骤6：合成2-(2-(4-(5-((3-内型)-(4氰基-3-(三氟甲基)苯氧基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-羰基)嘧啶-2-基)哌嗪-1-基)乙氧基)乙酸叔丁酯(化合物7b)
向烧瓶中加入1.993g化合物6b、4.303g化合物12a、1.903g碳酸钾、60ml DMF，微波325W反应5分钟，降至室温，加入200ml乙酸乙酯，依次水洗三次，每次100ml，100ml饱和氯化钠水溶液洗涤一次，有机相经无水硫酸钠干燥、过滤，滤液减压蒸除溶剂，残余物经硅胶柱色谱层析(按二氯甲烷∶甲醇(V/V)＝20∶1洗脱)纯化，得1.611g化合物7b。
化合物7b的质谱数据：MS(ESI)：m/z：644.7(M+H)+。
步骤7：合成2-(2-(4-(5-((3-内型)-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯氧基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-羰基)嘧啶-2-基)哌嗪-1-基)乙氧基)乙酸(化合物8b)
向烧瓶中加入1.611g化合物7b、35ml三氟乙酸、12ml二氯甲烷，搅拌溶清后室温反应30分钟，反应完全后，减压蒸除溶剂得2.565g粗品化合物8b。
化合物8b的质谱数据：MS(ESI)：m/z：588.8(M+H)+。
步骤8：合成(2S，4R)-1-((S)-2-(2-(2-(4-(5-((3-内型)-(4-氰基-3-(三氟甲基)苯氧基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-羰基)嘧啶-2-基)哌嗪-1-基)乙氧基)乙酰氨基)-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺(化合物I-12)
向步骤7所得的粗品化合物8b(2.565g，以化合物7b的量计，化合物7b的量为1.611g)中加入3.205g DIPEA、2.014g化合物V1、100ml二氯甲烷，室温搅拌下加入1.407gHATU，继续室温搅拌反应1小时，反应完全后，加入150ml二氯甲烷，用水洗三次，每次150ml，有机层用无水硫酸钠干燥后过滤，滤液减压蒸除溶剂，残余物经硅胶柱色谱层析(按二氯甲烷∶甲醇(V/V)＝20∶1的比例洗脱)纯化，得0.876g化合物I-12。
化合物I-12的核磁数据如下：
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.66(s，1H)，8.51(s，2H)，7.77(d，J＝8.4Hz，1H)，7.38-7.29(m，5H)，7.24(d，J＝2.4Hz，1H)，7.17(dd，J＝8.4，2.4Hz，1H)，7.11(d，J＝8.4Hz，1H)，5.15-5.04(m，1H)，4.89-4.67(m，3H)，4.62-4.50(m，2H)，4.38-4.23(m，2H)，4.11-3.94(m，7H)，3.78-3.69(m，2H)，3.65(dd，J＝11.0，3.4Hz，1H)，2.79-2.71(m，2H)，2.67-2.56(m，5H)，2.55(s，3H)，2.40-1.99(m，10H)，1.03(s，9H).
实施例13：
合成2-(2-(对甲苯磺酰氧基)乙氧基)乙酸叔丁酯(化合物12a)
步骤1：合成2-(苄氧基)乙醇(化合物12a-1)
向烧瓶中加入15.001g乙二醇、45ml四氢呋喃，搅拌下加入2.320g钠氢(60％含量)，室温搅拌30分钟后加入9.920g溴化苄。室温搅拌反应15小时，反应完成后，减压蒸除四氢呋喃，向残余物中加入100ml水，用30ml石油醚萃取以除去残余的溴化苄，水相用100ml乙酸乙酯萃取，分去水层，有机层水洗两次，每次50ml；用50ml饱和氯化钠水溶液洗涤一次，随后用无水硫酸钠干燥、过滤，滤液减压蒸除溶剂得6.302g化合物12a-1。
步骤2：合成2-(2-(苄氧基)乙氧基)乙酸叔丁酯(化合物12a-2)
向烧瓶中加入5.931g化合物12a-1、15.131g溴乙酸叔丁酯、18ml二氯甲烷、0.303g四丁基溴化铵，冰浴下加入35％的氢氧化钠水溶液18ml，搅拌30分钟后转至室温搅拌反应18小时。反应完成后，加入30ml二氯甲烷，分液，有机层用水洗涤两次，每次20ml；然后用无水硫酸钠干燥、过滤，滤液减压蒸除溶剂，残余物经硅胶柱色谱层析(按石油醚∶乙酸乙酯(V/V)＝5∶1洗脱)纯化得8.998g化合物12a-2。
步骤3：合成2-(2-(羟基)乙氧基)乙酸叔丁酯(化合物12a-3)
向氢化反应釜中加，8.998g化合物12a-2、0.451g钯碳(含量5％)、40ml甲醇，催化加氢15小时(反应温度45℃，氢气压力0.4MPa)，反应完全后，滤除钯碳，滤液减压蒸除溶剂得5.599g化合物12a-3。
步骤4：合成2-(2-(对甲苯磺酰氧基)乙氧基)乙酸叔丁酯(化合物12a)
向烧瓶中加入5.599g化合物12a-3、8.095g三乙胺、60ml二氯甲烷，搅拌下加入9.151g对甲苯磺酰氯，室温搅拌反应18小时。反应完全后，反应液水洗两次，然后用无水硫酸钠干燥、过滤，滤液减压蒸除溶剂，残余物经硅胶柱色谱层析(按石油醚∶乙酸乙酯(V/V)＝3∶1洗脱)纯化得6.199g化合物12a。
实施例14：
合成3-(2-(对甲苯磺酰氧基)乙氧基)丙酸叔丁酯(化合物12b)
步骤1：合成3-(2-羟基乙氧基)丙酸叔丁酯(化合物12b-1)
向烧瓶中加入27.00g乙二醇、3.40g氢氧化钠，搅拌下升温至80℃，体系溶清后降至室温，搅拌下滴加11.00g丙烯酸叔丁酯，30分钟滴加完毕，滴完后室温反应18小时。反应完成后，向体系中加入200ml乙酸乙酯，用水洗涤两次，每次100ml，用100ml饱和氯化钠水溶液洗涤一次，然后用无水硫酸钠干燥、过滤，滤液减压蒸除溶剂得7.53g化合物12b-1粗品，不经进一步纯化直接用于下一步反应。
步骤2：合成3-(2-(对甲苯磺酰氧基)乙氧基)丙酸叔丁酯(化合物12b)
向烧瓶中加入7.53g化合物12b-1、4.05g吡啶、80ml二氯甲烷，搅拌下加入9.02g对甲苯磺酰氯，室温反应18小时。反应完成后，依次用40ml水、40ml盐酸(1M)洗涤反应液，用无水硫酸钠干燥、过滤，滤液减压蒸除溶剂，残余物经硅胶柱色谱层析(按石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1至5∶1洗脱)纯化得8.20g化合物12b。
实施例15：
合成4-(4-(叔丁氧羰基)哌嗪-1-基)苯甲酸(化合物11a)
步骤1：合成4-(4-(乙氧基羰基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(化合物11a-1)
向烧瓶中加入1.999g 4-氟苯甲酸乙酯、3.108g N-Boc哌嗪、3.013g碳酸钾、10mlDMSO，搅拌下120℃反应15小时，反应完成后，体系降至室温，搅拌下加入15ml石油醚、70ml水，搅拌10分钟后过滤，滤饼分别用5ml石油醚冲洗一次、10ml水洗一次，滤饼干燥后得1.805g化合物11a-1。
步骤2：合成4-(4-(叔丁氧羰基)哌嗪-1-基)苯甲酸(化合物11a)
向烧瓶中加入1.002g化合物11a-1、0.360g氢氧化钠、10ml甲醇、5ml水，回流反应1小时，反应完全后体系降至室温，加入30ml水，搅拌下用稀盐酸调节pH至2-3，过滤，滤饼水洗至中性，滤饼干燥后得0.799g化合物11a。
化合物11a的质谱数据：MS(ESI)：m/z：306.9(M+H)+。
实施例16：
合成5-(4-(叔丁氧羰基)哌嗪-1-基)吡嗪-2-羧酸(化合物11c)
向烧瓶中加入0.099g 5-溴吡嗪-2-羧酸、0.276g N-Boc哌嗪、4ml DMF，微波325W反应3分钟，反应完成后降至室温，加入15ml二氯甲烷，用1M盐酸洗涤三次，每次10ml，收集有机层，有机层用无水硫酸钠干燥、过滤，滤液减压蒸除溶剂得0.130g化合物11c。
化合物11c的质谱数据：MS(ESI)：m/z：308.8(M+H)+。
实施例17：
合成2-(4-(叔丁氧羰基)哌嗪-1-基)嘧啶-5-羧酸(化合物11b)
将实施例16中的5-溴吡嗪-2-羧酸换成2-溴嘧啶-5-羧酸，合成方法同实施例16。
化合物11b的质谱数据：MS(ESI)：m/z：307.3(M-H)-。
实施例18：
合成6-(4-(叔丁氧羰基)哌嗪-1-基)哒嗪-3-羧酸(化合物11d)
将实施例15步骤1中的4-氟苯甲酸乙酯换成6-溴哒嗪-3-羧酸甲酯，合成方法同实施例15。
化合物11d的质谱数据：MS(ESI)：m/z：307.3(M-H)-。
实施例19：VCaP细胞增殖测定
步骤1：培养基的配制：
(1)VCaP测定培养基A的配制：500ml RPMI 1640培养基(Corning目录号31318005)中加入50ml胎牛血清(TICO目录号FBS76500)，5ml青霉素-链霉素溶液(Beyotime目录号C0222)。
(2)VCaP测定培养基B的配制：在RPMI 1640培养基中加入人工合成雄激素美曲勃龙R1881(Sigma，目录号R0908)，使之浓度为1nM。
步骤2：细胞接种：
VCaP细胞(购自中国科学院细胞库目录号SCSP-5034)用VCaP测定培养基A以8000个/孔(90μL)接种于96孔板中。细胞培养四天以除去雄激素。
步骤3：10倍浓度化合物培养基混合溶液的配制：
(1)用DMSO配制10mM的待测化合物储备液。
(2)浓度1：取50μL储备液加入75μL的DMSO；
浓度2：于96孔板中取浓度1溶液25μL加入25μL的DMSO；
浓度3：于96孔板中取浓度2溶液25μL加入25μL的DMSO；
浓度4：于96孔板中取浓度3溶液25μL加入25μL的DMSO；
浓度5：于96孔板中取浓度4溶液25μL加入25μL的DMSO；
浓度6：于96孔板中取浓度5溶液25μL加入25μL的DMSO；
浓度7：于96孔板中取浓度6溶液25μL加入25μL的DMSO；
浓度8：于96孔板中取浓度7溶液25μL加入25μL的DMSO；
浓度9：于96孔板中取浓度8溶液25μL加入25μL的DMSO；
(3)取(2)中浓度1-9的溶液各2μL分别加至98μL的VCaP测定培养基B中(对照孔中加入2μL的DMSO)。每个浓度及对照均平行三孔。
步骤4：细胞中加入化合物：
取上述制备好的10倍浓度化合物培养基混合液10μL，加至已培养四天除去雄激素的细胞相应孔中，使对应孔中所含化合物的终浓度为8μM、4μM、2μM、1μM、0.5μM、0.25μM；其中每孔R1881终浓度为0.1nM。细胞继续培养4天。
步骤5：细胞增殖活性检测：
细胞中除去旧培养基并重新加入等体积的VCaP测定培养基A，并在每孔中加入10μL的CCK8(DOJINDO目录号：PF725)。在37℃培养箱中放置2-3小时后，于酶标仪450nm处读数。
通过上述方法得到表1的测定结果，用观察到的抑制50％VCaP细胞增殖的化合物浓度(IC50)表征化合物的效力；其中IC50值如下定义：A(IC50＜1μM)，B(1μM≤IC50≤4μM)，C(IC50＞4μM)。
表1
实施例20：蛋白免疫印迹实验(Western-blot)测定化合物对AR蛋白的降解作用
(1)Western-blot测定化合物对AR蛋白的降解作用的细胞蛋白样品的制备：
人前列腺癌细胞VCaP(购于中科院细胞库)传代培养后，用胰酶消化后制成6×105个/mL细胞悬液，接种于6孔板，5mL/孔，于37℃，5％的CO2细胞孵育箱中培养过夜。加入受试药物后培养16h。用冰的PBS缓冲溶液洗涤两遍后每孔加入800微升的RIPA裂解液，于冰上裂解30分钟后收集裂解物于离心管，于4℃，12000rpm离心10分钟。上清液转移至新的离心管中。用BSA蛋白定量试剂盒对蛋白进行定量，将蛋白浓度调成一致后加入5×上样缓冲液，混合后于100℃变性5分钟，-20℃保存或直接用于Western-Blot检测。
(2)蛋白免疫印迹实验(Western-blot，WB)具体步骤如下：
配制合适浓度的SDS-PAGE胶：分离胶浓度为8％，浓缩胶浓度为5％。根据蛋白定量结果调整上样体积。蛋白样品在浓缩胶中的电压为90V，进入分离胶后电压调整至130V。待溴酚蓝完全跑出PAGE胶时停止电泳。将转膜装置放入冰水浴中，180mA恒流转膜1.2小时。取出PVDF膜，浸没于含5％的脱脂牛奶TBST溶液中，于摇床室温封闭1小时。TBST缓冲溶液洗涤5次，加入相应稀释比例的一抗，置于4℃孵育过夜。TBST缓冲溶液洗涤5次，每次6分钟。加入一定稀释比例的二抗，室温孵育2小时。TBST缓冲溶液洗涤5次，每次6分钟。使用上海培清的凝胶成像仪对膜进行曝光。
(3)结果：
如图1所示，当给药浓度为100nM时，在VCaP细胞中观察到化合物I-2相对于对照组对AR蛋白具有明显的降解作用。
实施例21：片剂的制备
按照表2的配方，将化合物I-1、乳糖、微晶纤维素、交联聚维酮进行混合，添加羟丙基纤维素水溶液进行造粒，干燥后再添加交联聚维酮、硬脂酸镁进行混合，然后压制成片，包薄膜衣。
表2
实施例22：
按照表3的配方，将化合物I-2、乳糖、微品纤维素、交联聚维酮进行混合，添加羟丙基纤维素水溶液进行造粒，干燥后再添加交联聚维酮、硬脂酸镁进行混合，然后灌胶囊。
表3
本发明涉及的化合物均可按照实施例21和实施例22的方法进行片剂和胶囊的制备，且上述实施例21和实施例22中涉及的混合、造粒、压片和灌胶囊所需机器均为制剂制备中常用规格的机器即可。
Claims (6)
1.如式I所示的一种基于VHL配体诱导的双功能分子化合物，
其中：
R1为氯或者三氟甲基；
R2为H或CH3；
X1、X2、X3、X4分别独立的表示CH或者N，且X1、X2、X3、X4中的0-2个可同时为N；
所述L为接头，且L为结构
2.根据权利要求1所述的双功能分子化合物，其特征在于，所述的L为以下结构：
3.根据权利要求2所述的双功能分子化合物，其特征在于，所述双功能分子化合物选自下列结构：
4.一种药物组合物，其特征在于，其中含有有效治疗量的权利要求1-3任意一项所述的化合物以及药学上可接受的辅料。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型为片剂或胶囊。
6.权利要求1-3中任意一项所述的双功能分子化合物在制备治疗或预防肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤为前列腺癌或乳腺癌。
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| XIN HAN等: "Discovery of ARD-69 as a Highly Potent Proteolysis Targeting Chimera (PROTAC) Degrader of Androgen Receptor (AR) for the Treatment of Prostate Cancer", 《JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY》 * |
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