CN113142193B - 一种细胞程序冷冻方法、系统、设备、介质及装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种细胞程序冷冻方法、系统、设备、介质及装置，属于细胞冷冻技术领域，方法包括：S1获取降温速率k以及盛放有液氮的保温腔的温度分布函数T＝a×h2+b×h+c，h为测温点到保温腔上边沿的距离，T为测温点位置处的温度，a、b、c均为常数；S2控制细胞保存管按照v＝(k‑b)/2ah的实时速度在保温腔内下降，并在细胞保存管下降的过程中实时获取在同一时刻、同一高度位置上细胞保存管内、外的温度T1和T2；S3判断T1与T2的差值Δt是否超过预设的温差阈值，是则进入S4，否则继续S2，直至细胞保存管到达预设的保温温度T0的位置；S4控制细胞保存管停止，直至T1与T2的差值Δt小于等于温差阈值时，继续S2。本发明能够有效提高细胞冷冻效果以及复苏率。
Description
技术领域
本发明涉及细胞冷冻技术领域，特别涉及一种细胞程序冷冻方法、系统、设备、介质及装置。
背景技术
近年来，随着现代生物医学全面迈向分子医学，个体化诊疗时代，对于大规模、高质量的生物标本及相关信息资源的需求也急剧增长。许多发达国家高度重视人类遗传资源的保护与开发，建立各类生物样本库和以人口为基础的生物银行及虚拟生物银行，并将其视为发展生物医药领域核心竞争力的战略举措。建立生物细胞资源库，保存生物细胞(目前多为精细胞、胚胎或卵细胞和干细胞)，对于物种资源保存、育种与繁殖等领域具有重要的意义。
程序降温作为一种有效的降温手段被广泛应用于细胞的冷冻保存过程中，其中液氮熏蒸法由于设备简单，被广泛采用。该方法利用液氮表面不同气层温度不同对液氮进行预冷，当预冷完成后，样品浸入液氮完成冷冻。
但是，由于液氮表层温度不固定，所以冷冻过程中，细胞样品的降温速率以及预冷温度不一致，从而造成细胞保存效果千差万别。
发明内容
针对现有技术存在的细胞程序冷冻过程中降温速率与预冷温度不一致的问题，本发明的目的在于提供一种细胞程序冷冻方法、系统、设备、介质及装置。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
第一方面，本发明提供一种细胞程序冷冻方法，包括以下步骤：
S1、获取降温速率k以及盛放有液氮的保温腔的温度分布函数T＝a×h2+b×h+c，其中，h为测温点到保温腔上边沿的距离，T为所述测温点位置处的温度，a、b、c均为常数；
S2、控制细胞保存管按照v＝(k-b)/2ah的实时速度在所述保温腔内下降，并在所述细胞保存管下降的过程中，实时获取在同一时刻、同一高度位置上所述细胞保存管内、外的温度T1和T2；
S3、判断所述T1与所述T2的差值Δt是否超过预设的温差阈值，是则进入S4，否则继续S2，直至控制所述细胞保存管到达预设的保温温度T0的位置；
S4、控制所述细胞保存管停止，直至所述T1与所述T2的差值Δt小于等于所述温差阈值时，继续S2。
优选的，在S2中，所述T1温度的获取步骤包括：
在与所述细胞保存管同一高度的位置布置对照管；
在所述对照管内盛放热物理性质与所述细胞保存管内的液体的热物理性质一致的对照溶液，或者在所述对照管内盛放与所述细胞保存管相同的液体；
通过测温元件采集所述对照管内液体的温度为所述T1温度。
优选的，在S3中，所述预设的保温温度T0的位置h0通过所述保温腔的温度分布函数T＝a×h2+b×h+c计算获得。
另一种优选的，在S3中，所述控制所述细胞保存管到达预设的保温温度T0的位置通过以下步骤实现：
将实时获取到的T1与T0对比，判断T1是否小于T0，是则控制所述细胞保存管继续下降，否则控制所述细胞保存管停止。
进一步的，在S3中控制所述细胞保存管到达预设的保温温度T0的位置后，还包括S5，
S5、等待预设的保温时长后，控制所述细胞保存管在所述保温腔中上升直至移出所述保温腔。
第二方面，本发明还提供一种细胞程序冷冻系统，所述系统用于执行如上所述的方法，所述系统包括：
获取模块，所述获取模块用于获取降温速率k、保温腔的温度分布函数、同一时刻、同一高度位置上所述细胞保存管内、外的温度T1和T2、预设的保温温度TO、预设的温差阈值以及预设的保温时长；
判断模块，所述判断模块用于判断所述T1与所述T2的差值Δt是否超过预设的温差阈值，以及用于判断所述细胞保存管是否到达预设的保温温度T0的位置；
以及升降控制模块，所述升降控制模块用于根据所述判断模块的判断结果生成升降指令，以便于通过所述升降指令控制升降装置带动所述细胞保存管在所述保温腔内升降。
第三方面，本发明还提供一种电子设备，包括存储有可执行程序代码的存储器；以及与存储器耦合的处理器；其中，处理器调用存储器中存储的可执行程序代码，执行如上所述的方法。
第四方面，本发明还提供一种计算机可读存储介质，存储有计算机程序，所述计算机程序被处理器运行时执行如上所述的方法。
第五方面，本发明还提供一种细胞程序冷冻装置，其特征在于：包括
底座；
保温腔，所述保温腔安装在所述底座上，所述保温腔内盛放有液氮；
管架，所述管架上安装有细胞保存管；
测温元件，所述测温元件至少配置有两个以分别在同一时刻测量所述细胞保存管内、外两侧同一高度位置的温度；
升降装置，所述升降装置安装在所述底座上，所述升降装置的输出端与所述管架固定连接，以带动所述管架在所述保温腔内升降；
以及控制装置，所述控制装置包括如上所述的电子设备，且所述电子设备与所述测温元件以及所述升降装置电性连接。
进一步的，还包括对照管，所述对照管固定安装在所述管架上，且所述对照管与所述细胞保存管等高布置；其中，在所述对照管内布置有所述测温元件以间接地获得所述细胞保存管内侧的温度。
采用上述技术方案，由于在控制细胞保存管在盛有液氮的保温腔内下降的过程中，通过不断地获取细胞保存管内、外两侧的温度，确保下降过程中细胞保存管内、外两侧的温差始终低于预设的温差阈值，以及在温差超过该温差阈值时停止下降，在温差低于该温差阈值时继续下降，直至达到预设的保温温度位置，从而提高程序冷冻过程中细胞的保存效果。
附图说明
图1为本发明一种细胞程序冷冻装置的结构示意图；
图2为本发明一种细胞程序冷冻方法的流程图；
图3为本发明一种细胞程序冷冻方法中获取细胞保存管内侧温度的方法流程图；
图4为本发明一种细胞程序冷冻方法的流程示意图；
图5为本发明一种细胞程序冷冻系统的结构示意图；
图6为本发明一种电子设备的结构示意图。
图中:1-控制装置、2-显示屏、3-保温腔、4-管架、5-对照管、6-细胞保存管、7-第一测温元件、8-第二测温元件、9-弯臂、10-滑块、11-螺杆、12-导轨、13-电机、14-底座。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
需要说明的是，在本发明的描述中，术语“上”、“下”、“左”、“右”、“前”、“后”等指示的方位或位置关系为基于附图所示对本发明结构的说明，仅是为了便于描述本发明的简便，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
对于本技术方案中的“第一”和“第二”，仅为对相同或相似结构，或者起相似功能的对应结构的称谓区分，不是对这些结构重要性的排列，也没有排序、或比较大小、或其他含义。
另外，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“连接”应做广义理解，例如，连接可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个结构内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据本发明的总体思路，联系本方案上下文具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
实施例一
一种细胞程序冷冻装置，如图1所示，其包括控制装置1、保温腔3、管架4、细胞保存管6、测温元件、升降装置和底座14。
其中，底座14配置为一平台，使用时安装在桌面上。保温腔3配置为由导热系数低的材料(例如发泡材料)制作而成的筒状结构，其顶部设置有开口；或者配置保温腔3为真空杯。保温腔3内盛放有液氮，液氮的液面通常具有保温腔3的上沿具有一定的距离，例如10cm。另外，该保温腔3液面以上的温度分布满足温度分布函数T＝a×h2+b×h+c，其中，h为测温点到保温腔上边沿的距离，T为所述测温点位置处的温度，a、b、c均为常数并通过实验获得。
上述的细胞保存管6用于装载待冷冻的细胞，该细胞保存管6固定安装在管架4上，从而通过管架4带动细胞保存管6在保温腔3内升降，进而进行程序降温。而升降装置则安装在底座14上，该升降装置的输出端与管架4固定连接，以便于带动管架4在保温腔3内升降。本实施例中，配置升降装置包括电动推杆和弯臂9，电动推杆竖直地安装在底座14上，而弯臂9的一端固定在电动推杆的输出端上、另一端与管架4固定连接。如图1所示，电动推杆包括滑块10、螺杆11、导轨12和电机13。其中，导轨12竖直布置并固定在底座14上；螺杆11平行于导轨12，且螺杆11的上端、下端分别通过轴承可转动连接在导轨12顶部的横板以及底座14上；电机13固定在底座14上，且电机13的输出轴与螺杆11的下端通过联轴器或者齿轮传动机构连接；滑块10滑动连接在导轨12上，且滑块10上设置有与螺杆11相适配的螺纹孔，从而使电机13启动后，带动螺杆11转动，再由螺杆11带动滑块10升降，并通过弯臂9带动管架4及其上安装的细胞保存管6能够在保温腔3内升降。或者在另一个实施例中，升降装置还可以配置为气缸，其缸体固定安装在底座14上，其输出端用于弯臂9的固定。
另外，通过测温元件分别测量细胞保存管6内、外两侧的温度，例如本实施例中，配置测温元件包括第一测温元件7和第二测温元件8，第一测温元件7和第二测温元件8均选择为热电偶，其中，第一测温元件7的探头伸入到细胞保存管6的内部以获取其内侧的温度，而第二测温元件8的探头则位于细胞保存管6的外部以获取其外侧的温度，并且第一测温元件7的探头与第二测温元件8的探头位于同一高度位置。可以理解的是，测温元件至少配置有两个以便于分别获取同一时刻细胞保存管6内、外两侧的温度，但是，为了提高测温准确率，还可以配置测温元件有多个，从而降低单侧单点位测量的误差。
控制装置1包括一电子设备，该电子设备包括存储有可执行程序代码的存储器以及与该存储器耦合的处理器，另外该处理器还与上述的测温元件以及升降装置电性连接；其中，处理器调用存储器中存储的可执行程序代码，从而执行可执行程序代码所承载的细胞程序冷冻方法的步骤。
使用时，首先根据保温腔3的结构获得(事先实验获得)其温度分布函数T＝a×h2+b×h+c，将待冷冻的细胞以及必要的细胞保护剂一起放置到细胞保存管6中，根据要求的降温速率k获得细胞保护管6的实时下降速度v＝(k-b)/2ah，再通过控制装置1控制升降装置带动管架4及其上固定安装的细胞保护管6安装该速度下降，其中h可通过电机13的转动角度计算获得，再在下降过程中对比第一测温元件7和第二测温元件8的温度差值，确保该差值低于预设的温差阈值，并当差值达到该温差阈值时，通过控制装置1使细胞保护管6停止下降，如此，直至第一测温元件7测得的温度数据达到冷冻温度为止。可见，本实施例提供的装置，能够使细胞程度冷冻过程得到实时的监控，并能够根据监控结果做出快速的调整，从而使冷冻效果得到提升。
在一个优选实施例中，设置控制装置1还包括显示屏2，显示屏2与控制装置1中的处理器电性连接，并优选为该显示屏2为触摸屏，从而通过显示屏2对控制参数(降温速率k、温差阈值)进行输入和修改。
实施例二
其与实施例一的区别在于：本实施例中，如图1所示，还包括对照管5，该对照管5固定安装在管架4上，且对照管5与细胞保存管6等高布置，使用时，对照管5内填充热物理性质(包括结晶焓、导热系数、比热容)与细胞保护管6中液体的热物理性质相同的等体积对照溶液，或者直接填充与细胞保护管6相同的等体积液体。另外，在对照管5的内布置测温元件(即第一测温元件7)，从而以间接测量的方式，将该第一测温元件7测得的温度作为细胞保存管6内侧的温度，同时，取消实施例一中布置在细胞保护管6内侧的第一测温元件7。
如此设置，能够避免测温对待冷冻细胞的影响，从而进一步提高细胞冷冻效果。
实施例三
一种细胞程序冷冻方法，该方法基于上述实施例一的装置进行，该方法藉由上述装置中的电子设备执行，并实现如图2所示的步骤。
步骤S1、获取降温速率k以及盛放有液氮的保温腔的温度分布函数T＝a×h2+b×h+c，其中，h为测温点到保温腔上边沿的距离，T为测温点位置处的温度，a、b、c均为常数；
步骤S2、通过升降装置控制细胞保存管按照v＝(k-b)/2ah的实时速度在保温腔内下降，并在细胞保存管下降的过程中，实时获取在同一时刻、同一高度位置上细胞保存管内、外的温度T1和T2；
步骤S3、判断T1与T2的差值Δt(绝对值)是否超过预设的温差阈值，是则进入S4，否则继续S2，直至细胞保存管到达预设的保温温度T0的位置；
其中，预设的保温温度T0的位置h0可以通过保温腔的温度分布函数T＝a×h2+b×h+c计算获得；或者，还可以通过以下步骤实现：将实时获取到的T1与T0对比，判断T1是否小于T0，是则通过升降装置控制细胞保存管继续下降，否则通过升降装置控制细胞保存管停止。
步骤S4、通过升降装置控制细胞保存管停止，直至T1与T2的差值Δt(绝对值)小于等于温差阈值时，则继续S2。
例如，将本实施例提供的方法应用于精子冷冻时：1、取三名志愿者健康的精子各2ml，37℃恒温箱内自然液化；2、再用精子计数板在显微镜下初检精子活动率，每个样本重复两次检测，每次检测计数200个精子，比较两次检测值，直至两次测量值的误差百分比在可以接受的范围内，否则重新制备检测样本，再次检测；3、精子分级方法为a级：快速前进、b级：缓慢前进、c级：原地摆动、d级：不动，通过计算前向运动精子冷冻复苏率(简称：精子冷冻复苏率)，计算方法：精子冷冻复苏率＝(冻后a级精子百分率+冻后b级精子百分率)/(冻前a级精子百分率+冻前b级精子百分率；4、与市售精子保护液进行1：1混合，分别装入细胞保护管6中进行冷冻；5、安装第一测温元件7和第二测温元件8，按照上述步骤进行冷冻，具体程序为降温速率采用10K/min，降低到-80℃，持续20min，完成预冷冻，然后继续以10K/min降低到-196℃的液氮中冷冻2周后取出。
另外，设置对照组，采用人工液氮熏蒸法冷冻，即，将装有精子和保护液的冻存管放到距离液氮表面10cm的位置10min，然后把冻存管浸入液氮中，保存2周后取出。
冷冻结束的精子均放入37℃温水中解冻，解冻完成后，再次计算精子冷冻复苏率。结果如表1所示，可以看出，采用本实施例方法进行冷冻的细胞，其复苏率高于采用人工液氮熏蒸法冷冻的细胞。
表1-不同精子冷冻方式复苏率(不同上标代表有显著差异,P<0.05)
实施例四
其与实施例三的区别在于：本实施例中，在步骤S2中，细胞保存管内侧T1温度并不是直接获取，而是通过以下步骤间接地获得，如图3所示。
步骤S21、在与细胞保存管同一高度的位置布置对照管；
步骤S22、在对照管内盛放热物理性质与细胞保存管内的液体一致的对照溶液，或者在对照管内盛放与细胞保存管相同的液体；参照实施例四，优选在对照管5中加入等量人造精浆混合液；
步骤S23、通过测温元件采集对照管内液体的温度即为细胞保存管内侧的T1温度。
实施例五
其与实施例三的区别在于：步骤S3中，在细胞保存管到达预设的保温温度T0的位置后，还包括步骤S5，如图4所示。
步骤S5、等待预设的保温时长后，通过升降装置控制细胞保存管在保温腔中上升直至移出保温腔。
实施例六
一种细胞程序冷冻系统，该系统用于执行上述实施例的方法，如图5所示，系统包括：
获取模块，获取模块用于获取降温速率k、保温腔的温度分布函数、同一时刻、同一高度位置上细胞保存管内、外的温度T1和T2、预设的保温温度TO、预设的温差阈值以及预设的保温时长；
判断模块，判断模块用于判断T1与T2的差值Δt是否超过预设的温差阈值，以及用于判断细胞保存管是否到达预设的保温温度T0的位置；
以及升降控制模块，升降控制模块用于根据判断模块的判断结果生成升降指令，以便于通过升降指令控制升降装置带动细胞保存管在保温腔内升降。
实施例七
一种电子设备，如图6所示，包括存储有可执行程序代码的存储器以及与该存储器耦合的处理器；其中，处理器调用存储器中存储的可执行程序代码，执行上述任一实施例的方法。
实施例八
一种计算机存储介质，计算机存储介质中存储有计算机程序，计算机程序被处理器运行时执行上述任一实施例的方法。
本申请是参照根据本申请实施例的方法、设备(系统)、和计算机程序产品的流程图和/或方框图来描述的。应理解可由计算机程序指令实现流程图和/或方框图中的每一流程和/或方框、以及流程图和/或方框图中的流程和/或方框的结合。可提供这些计算机程序指令到通用计算机、专用计算机、嵌入式处理机或其他可编程数据处理设备的处理器以产生一个机器，使得通过计算机或其他可编程数据处理设备的处理器执行的指令产生用于实现在流程图一个流程或多个流程和/或方框图一个方框或多个方框中指定的功能的装置。
这些计算机程序指令也可存储在能引导计算机或其他可编程数据处理设备以特定方式工作的计算机可读存储器中，使得存储在该计算机可读存储器中的指令产生包括指令装置的制造品，该指令装置实现在流程图一个流程或多个流程和/或方框图一个方框或多个方框中指定的功能。
这些计算机程序指令也可装载到计算机或其他可编程数据处理设备上，使得在计算机或其他可编程设备上执行一系列操作步骤以产生计算机实现的处理，从而在计算机或其他可编程设备上执行的指令提供用于实现在流程图一个流程或多个流程和/或方框图一个方框或多个方框中指定的功能的步骤。
以上结合附图对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
Claims (7)
1.一种细胞程序冷冻方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、获取降温速率k以及盛放有液氮的保温腔的温度分布函数T=a×h2+b×h+c，其中，h为测温点到保温腔上边沿的距离，T为所述测温点位置处的温度，a、b、c均为常数；
S2、控制细胞保存管按照v=（k-b）/2ah的实时速度在所述保温腔内下降，并在所述细胞保存管下降的过程中，实时获取在同一时刻、同一高度位置上所述细胞保存管内、外的温度T1和T2；
S3、判断所述T1与所述T2的差值Δt是否超过预设的温差阈值，是则进入S4，否则继续S2，直至控制所述细胞保存管到达预设的保温温度T0的位置；
S4、控制所述细胞保存管停止，直至所述T1与所述T2的差值Δt小于等于所述温差阈值时，继续S2；
在S2中，所述T1温度的获取步骤包括：在与所述细胞保存管同一高度的位置布置对照管；在所述对照管内盛放热物理性质与所述细胞保存管内的液体的热物理性质一致的对照溶液，或者在所述对照管内盛放与所述细胞保存管相同的液体；通过测温元件采集所述对照管内液体的温度为所述T1温度；
在S3中，所述预设的保温温度T0的位置h0通过所述保温腔的温度分布函数T=a×h2+b×h+c计算获得；
在S3中，所述控制所述细胞保存管到达预设的保温温度T0的位置通过以下步骤实现：将实时获取到的T1与T0对比，判断T1是否小于T0，是则控制所述细胞保存管继续下降，否则控制所述细胞保存管停止。
2.根据权利要求1所述的细胞程序冷冻方法，其特征在于：在S3中控制所述细胞保存管到达预设的保温温度T0的位置后，还包括S5，
S5、等待预设的保温时长后，控制所述细胞保存管在所述保温腔中上升直至移出所述保温腔。
3.一种细胞程序冷冻系统，其特征在于：所述系统用于执行如权利要求1-2任一项所述的方法，所述系统包括：
获取模块，所述获取模块用于获取降温速率k、保温腔的温度分布函数、同一时刻、同一高度位置上所述细胞保存管内、外的温度T1和T2、预设的保温温度TO、预设的温差阈值以及预设的保温时长；
判断模块，所述判断模块用于判断所述T1与所述T2的差值Δt是否超过预设的温差阈值，以及用于判断所述细胞保存管是否到达预设的保温温度T0的位置；
以及升降控制模块，所述升降控制模块用于根据所述判断模块的判断结果生成升降指令，以便于通过所述升降指令控制升降装置带动所述细胞保存管在所述保温腔内升降。
4.一种电子设备，其特征在于：包括存储有可执行程序代码的存储器；以及与存储器耦合的处理器；其中，处理器调用存储器中存储的可执行程序代码，执行如权利要求1-2任一项所述的方法。
5.一种计算机可读存储介质，存储有计算机程序，其特征在于：所述计算机程序被处理器运行时执行如权利要求1-2任一项所述的方法。
6.一种细胞程序冷冻装置，其特征在于：包括
底座；
保温腔，所述保温腔安装在所述底座上，所述保温腔内盛放有液氮；
管架，所述管架上安装有细胞保存管；
测温元件，所述测温元件至少配置有两个以分别在同一时刻测量所述细胞保存管内、外两侧同一高度位置的温度；
升降装置，所述升降装置安装在所述底座上，所述升降装置的输出端与所述管架固定连接，以带动所述管架在所述保温腔内升降；
以及控制装置，所述控制装置包括如权利要求4所述的电子设备，且所述电子设备与所述测温元件以及所述升降装置电性连接。
7.根据权利要求6所述的细胞程序冷冻装置，其特征在于：还包括对照管，所述对照管固定安装在所述管架上，且所述对照管与所述细胞保存管等高布置；其中，在所述对照管内布置有所述测温元件以间接地获得所述细胞保存管内侧的温度。
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