CN113135967B - 一种N-(β-L-吡喃鼠李糖基)阿魏酸酰胺的制备方法及应用 - Google Patents

一种N-(β-L-吡喃鼠李糖基)阿魏酸酰胺的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种化合物I N‑(β‑L‑吡喃鼠李糖基)阿魏酸酰胺的制备方法，以及所述化合物I在制备用于缓解或治疗受试者中线粒体功能异常和Aβ诱导的线粒体功能异常，治疗抑郁症，改善或提高认知功能的药物中的用途。
Figure DDA0002371145940000011

Description

一种N-(β-L-吡喃鼠李糖基)阿魏酸酰胺的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种药物的制备方法，具体地，本发明涉及一种N-(β-L-吡喃鼠李糖基)阿魏酸酰胺的制备方法及应用。
背景技术
线粒体是真核细胞中的动态细胞器，在ATP产生、细胞钙缓冲和细胞凋亡中起着重要作用。线粒体DNA基因突变可以导致线粒体活性氧(ROS)清除功能的受损，引起ROS在线粒体内堆积，使线粒体发生氧化损伤，可能会导致组织器官发生一系列改变。SIRT3，一种主要存在于线粒体内的NAD依赖的组蛋白去乙酰化酶，可以通过发挥其去乙酰化酶的活性，使线粒体呼吸链复合体亚基蛋白质去乙酰化，促进线粒体为细胞提供能量的功能。SIRT3参与线粒体能量代谢和细胞衰老，是治疗衰老和年龄相关疾病的分子靶点。
近年来，一些研究表明，淀粉样蛋白-β(Aβ)通过外膜复合物的转位酶进入线粒体，即线粒体还可能作为Aβ的靶点，导致认知能力下降和记忆力下降。
目前N-(β-L-吡喃鼠李糖基)阿魏酸酰胺)可能具有抗氧化作用并治疗或缓解线粒体功能异常、Aβ诱导的线粒体功能异常、提高认知能力尚未报道。专利CN110117302A中公开了N-(β-L-吡喃鼠李糖基)阿魏酸酰胺的制备方法，其以1-氨基-2,3,4-O-三乙酰基鼠李糖和(4-O-TBS)-阿魏酸酰氯为原料，得到N-(β-L-吡喃鼠李糖基)阿魏酸酰胺，反应中存在以1-氨基-2,3,4-O-三乙酰基鼠李糖为原料，成本高、合成步骤多，产品纯化困难且不适合大生产、反应收率比较低等问题。
合成路线如下：
Figure BDA0002371145920000021
针对上述问题，本发明提供一种N-(β-L-吡喃鼠李糖基)阿魏酸酰胺的制备方法及应用，其原料廉价易得、反应条件温和、转化率高、反应步骤少、收率高、产品纯度高并应用于缓解或治疗线粒体功能异常、缓解或治疗Aβ诱导的线粒体功能异常、改善或提高认知能力等优点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种N-(β-L-吡喃鼠李糖基)阿魏酸酰胺的制备方法及其医药用途。
本发明提供一种式I的化合物N-(β-L-吡喃鼠李糖基)阿魏酸酰胺的制备方法，包括以下步骤：
1)化合物2与化合物3在碱存在条件下反应，得到化合物1；
2)化合物1在脱保护剂条件下进行脱保护反应，得到化合物I；
合成路线如下：
Figure BDA0002371145920000022
化合物3结构式如下：
Figure BDA0002371145920000023
其中，
P选自All、Boc、TMS、TES、TBS、TIPS、TBDPS、THP、MOM、MTM、MEM、BOM、SEM、EE、Bn、PMB、Cbz、DMB和Tr；X选自Cl和Br。
在一个优选实施方案中，所述步骤1)的反应温度为-25℃-100℃，反应溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、叔丁醇、正丁醇、吡啶、二氯甲烷、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃(2-MeTHF)、水或它们的组合；所述步骤2)的反应温度为-5℃-60℃，反应溶剂为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、叔丁醇、正丁醇、乙腈、1,4-二氧六环、四氢呋喃、二氯甲烷或它们的组合。
在一个优选实施方案中，所述的碱选自无机碱或有机碱的一种或多种，所述化合物2与碱的摩尔比为1：1-7；化合物2与化合物3的摩尔比为0.8-3：1-4；化合物1与脱保护剂的摩尔比为1：0.1-4。
在一个优选实施方案中，所述方法进一步包括将鼠李糖化合物与氨源进行取代反应，得到化合物2的步骤。
在一个优选实施方案中，所述取代反应的反应温度为15℃-100℃，取代反应的反应时间为0.5-60h，反应溶剂为醇类溶剂；所述鼠李糖与所述氨源的摩尔比为1：1-10，优选为1：1-7。
在一个优选实施方案中，所述方法进一步包括将化合物5在有机溶剂中进行羟基保护反应以得到化合物6、将化合物6进行碱解反应得到化合物7、以及将化合物7进行卤代反应以得到化合物3的步骤，合成路线如下：
Figure BDA0002371145920000031
在一个优选实施方案中，所述化合物5在缚酸剂条件下与羟基保护试剂进行羟基保护反应，得到化合物6，所述化合物6在碱性条件下进行碱解反应后得到化合物7，化合物7与卤代试剂反应得到化合物3。
所述羟基保护反应在合适的有机溶剂中进行，反应温度为-5-70℃，羟基保护反应的反应时间为1-24h；所述化合物5与所述缚酸剂的摩尔比为1：1-6，所述化合物5与所述羟基保护试剂的摩尔比为1：1-5。
所述碱解反应溶剂优选为四氢呋喃水溶液，所述碱解反应温度优选为室温，反应时间为1-10h；所述化合物5与所述碱的摩尔比为1：0.1-1。
所述卤代反应的反应温度为10-60℃，卤代反应的反应时间为1-10h，卤代反应溶剂选自二氯甲烷、乙腈或其组合；所述化合物7与所述卤代试剂的摩尔比为1：1-5。
式1的化合物是新化合物，因此本发明另一方面还涉及式1的化合物：
Figure BDA0002371145920000041
在一个方面，本文提供了N-(β-L-吡喃鼠李糖基)阿魏酸酰胺及其药学上可接受的盐在制备用于缓解或治疗受试者细胞中的线粒体功能异常的药物中的用途。
在一些实施方案中，所述线粒体功能异常是Aβ蛋白，例如Aβ42多肽的寡聚体诱导的线粒体功能异常。
在一些实施方案中，所述线粒体功能异常包括但不限于线粒体中的蛋白乙酰化水平升高、活性氧水平升高、膜电位降低和/或耗氧量减少；所述药物用于降低线粒体中的蛋白乙酰化水平、抑制线粒体中的膜电位降低和/或抑制线粒体中的氧消耗减少。
在一个方面，本文提供了N-(β-L-吡喃鼠李糖基)阿魏酸酰胺及其药学上可接受的盐在制备用于提高受试者中SIRT3活性或水平的药物中的用途。在一些实施方案中，所述药物还增强AMPK磷酸化和/或增强PGC-1的活性或水平。在一些实施方案中，所述药物降低了锰超氧化物歧化酶(SOD2)和寡霉素敏感性赋予蛋白(OSCP)的乙酰化水平。
在一个方面，本文提供了N-(β-L-吡喃鼠李糖基)阿魏酸酰胺及其药学上可接受的盐在制备用于降低受试者细胞中的线粒体蛋白乙酰化、氧化应激水平或活性氧水平的药物中的用途。优选地，所述细胞是神经细胞，例如SK-N-SH细胞。
在一个方面，本文提供了N-(β-L-吡喃鼠李糖基)阿魏酸酰胺及其药学上可接受的盐在制备用于预防、缓解或治疗抑郁症的药物中的用途。所述药物可以快速且持续地在短期或长期时段内发挥预防、缓解或治疗作用，例如在给药1小时内即发挥作用，并且在更长的时间，例如超过24小时、2天、3天、7天、10天、15天或甚至更长的时间内均能维持作用。而且，通过单次给药或者优选地多次重复给药均能有效地维持对抑郁症及其症状的预防、缓解或治疗作用。
在一个方面，本文提供了N-(β-L-吡喃鼠李糖基)阿魏酸酰胺及其药学上可接受的盐在制备用于预防受试者认知能力障碍，改善或提高受试者认知能力的药物中的用途。在一些实施方案中，所述认知能力下降是反应抑制能力和/或记忆能力。本发明的其他方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1显示化合物I 1HNMR图谱。
图2显示化合物I HPLC图谱。
图3显示用PL171处理SK-N-SH细胞24小时后对细胞活性无影响。
图4显示研究PL171对ROS基础水平的影响。
图5A-I显示PL171促进线粒体SIRT3水平及其活性。
图6A-L显示PL171通过增强AMPK/PGC-1来促进SIRT3的表达。
图7A-C显示PL171抑制Aβ42O诱导的SK-N-SH细胞中ROS的产生。
图8A-E显示PL171抑制Aβ42O诱导的SK-N-SH细胞中MMP的减少。
图9A-D显示PL171抑制Aβ42O诱导的SK-N-SH细胞中耗氧量的减少。
图10A-B显示用30μM PL171预处理SK-N-SH细胞4小时，然后用10μMAβ42O刺激24小时后，SK-N-SH细胞的线粒体裂解物中的MnSOD的乙酰化水平。
图11A-C显示PL171抑制由Aβ42O诱导引起的SIRT3和PGC-1α减少。
图12A-B显示PL171通过SIRT3改善Aβ42O诱导的氧化应激和线粒体功能异常。
图13A-B显示PL171通过SIRT3调节抑制Aβ42O诱导的细胞衰老。
图14A-C显示通过强迫游泳不动时间(图A，急性；图B，中长时段)和悬尾实验(图C)评估的在小鼠中的抗抑郁效果。
图15A-B显示停止信号任务(Stop-signal task)模型及其流程的示意图，图15C显示给药日程表。
图16A-B显示在大鼠认知能力测试模型中PL171给药对Stop trial操作的影响。
图17A-B显示在大鼠认知能力测试模型中PL171给药对Go trial操作的影响。
发明详述
以下结合具体实施方案及附图，对本发明作进一步说明。应理解，这些实施方案仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。
本文的实施方案中，如果对于反应温度或操作温度没有做出具体说明，则该温度通常指室温。
在本发明中，术语“结构式n所示的化合物”、“结构式n所示的中间体”、“化合物n”表示相同的意义，都是指编号为n的化合物，其中n是指编号I、1、2、3、4、5、6、7。类似地，本文中有时将化合物I称为PL171或N-(β-L-吡喃鼠李糖基)阿魏酸酰胺，它们表示相同的意义。
本发明提供一种N-(β-L-吡喃鼠李糖基)阿魏酸酰胺的制备方法，包括以下步骤：
1)化合物2与化合物3在碱存在条件下反应，得到化合物1；
2)化合物1在脱保护剂条件下进行脱保护反应，得到化合物I；
合成路线如下：
Figure BDA0002371145920000071
化合物3结构式如下：
Figure BDA0002371145920000072
其中，P选自All(烯丙基)、Boc(叔丁氧羰基)、TMS(三甲基硅基)、TES(三乙基硅基)、TBS(叔丁基二甲基硅基)、TIPS(三异丙基硅基)、TBDPS(叔丁基二苯基硅基)、THP(2-四氢吡喃基)、MOM(甲氧基甲基)、MTM(甲硫基甲基)、MEM(甲氧基乙氧基甲基)、BOM(苄氧基甲基)、SEM(三甲基硅基乙氧基甲基)、EE(乙氧基乙基)、Bn(苄基)、PMB(对甲氧基苄基)、Cbz(苄氧羰基)、DMB(3,4-二甲氧基苄基)和Tr(三苯甲基)；X选自Cl和Br；优选地，P选自TBS、Boc、Cbz和THP；X选自Cl；更优选地，P选自TBS。
在一个优选实施方案中，所述步骤1)的反应温度为-25℃-100℃，反应溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、叔丁醇、正丁醇、吡啶、二氯甲烷、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃(2-MeTHF)、水或它们的组合；所述步骤2)的反应温度为-5℃-60℃，反应溶剂为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、叔丁醇、正丁醇、乙腈、1,4-二氧六环、四氢呋喃、二氯甲烷或它们的组合。
优选地，所述步骤1)的反应温度为-5℃-70℃，反应溶剂为甲醇、二氯甲烷、四氢呋喃或2-甲基四氢呋喃或其组合；所述步骤2)的反应温度为0℃-30℃，反应溶剂为甲醇；
更优选地，所述步骤1)的反应温度为-5℃-30℃；所述步骤2)的反应温度为20℃-30℃。
所述步骤1)中反应的进程及所述步骤2)中反应的进程可以采用本领域中的常规监测方法(例如TLC、HPLC或NMR)进行监控。
在一个优选实施方案中，所述步骤1)的反应时间为1-24h；所述步骤2)的反应时间为0.5-3h；优选地，所述步骤1)的，反应时间为1-12h；所述步骤2)的反应时间为0.5-2h。
在一个优选实施方案中，所述的碱选自无机碱或有机碱的一种或多种；化合物2与碱的摩尔比为1：1-7；化合物2与化合物3的摩尔比为0.8-3：1-4；所述化合物1在脱保护剂条件下进行脱保护反应，得到化合物I；化合物1与脱保护剂的摩尔比为1：0.1-4。
优选地，所述化合物2与碱的摩尔比为1：1-4；化合物2与化合物3的摩尔比为1：1-4；化合物1与脱保护剂的摩尔比为1：0.2-3。
更优选地，所述化合物2与碱的摩尔比为1：1.5-3；化合物2与化合物3的摩尔比为1：1-3；化合物1与脱保护剂的摩尔比为1：0.3-2.2。
本发明中，所述无机碱选自碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、碳酸镁、碳酸锂、氢氧化锂、氢氧化铯、氢氧化镁、氢氧化钙、氢氧化锶、氢氧化钡、氢氧化钠或氢氧化钾的一种或者几种；所述有机碱选自甲醇钠、乙醇钠、N,N-二异丙基乙胺(DIEA)、三乙胺、二乙胺、三丙胺、三正丁胺、吡啶、N,N-二甲基吡啶、三乙烯二胺、1,5-二氮杂二环[5.4.0]十一烯-5、1,5-二氮杂二环[4.3.0]壬烯-5、4-二甲氨基吡啶、N-甲基吗啉、四甲基乙二胺中的一种或多种。
优选地，所述碱选自N,N-二异丙基乙胺(DIEA)、吡啶、碳酸钠中的一种。
在一个优选实施方案中，所述脱保护剂选自四丁基氟化铵(TBAF)、三氟乙酸(TFA)、钯碳(Pd/C)、氢氧化钯碳(Pd(OH)2/C)、哌啶(Piperidine)、盐酸甲醇溶液(HCl-MeOH)、乙酸(AcOH)、甲酸(HCOOH)、氟化铯(CsF)、氟化铵(NH4F)、氟化钾(KF)、氢氟酸-吡啶溶液(HF Py)、氢氟酸-三乙胺溶液(3HF TEA)中的一种或多种；优选地，所述脱保护剂为四丁基氟化铵(TBAF)、氟化铯(CsF)、氟化铵(NH4F)、氟化钾(KF)、氢氟酸-吡啶(HF Py)、氢氟酸-三乙胺(3HF TEA)中的一种或多种。
所述化合物1的制备方法包括以下后处理步骤：反应结束后，过滤，旋干、溶解、用柱层析纯化，所述的过滤，旋干、溶解、用柱层析纯化可以按照本领域中该类操作的常规方法进行。
所述化合物I的制备方法优选包括以下后处理步骤：反应结束后，旋干、溶解、稀释、过滤、干燥，所述的旋干、溶解、稀释、过滤、干燥可以按照本领域中该类操作的常规方法进行。
在一个优选实施方案中，鼠李糖化合物与氨源进行取代反应，得到化合物2。
在一个优选实施方案中，鼠李糖化合物与氨源在缚酸剂条件下进行所述取代反应，得到化合物2。
在一个优选实施方案中，所述取代反应的反应温度为15℃-100℃，取代反应的反应时间为0.5-60h，反应溶剂为醇类溶剂。
所述醇类溶剂选自无水甲醇、无水乙醇、异丙醇、丁醇中的一种或多种。
优选地，所述取代反应的反应温度为20℃-80℃，反应溶剂为无水甲醇；所述取代反应的反应时间为0.5-49h。
在一个优选实施方案中，所述鼠李糖化合物与所述氨源的摩尔比为1：1-10，所述鼠李糖化合物与所述缚酸剂的摩尔比为1：1.5-4；优选地，所述鼠李糖化合物与所述氨源的摩尔比为1：1-7，所述鼠李糖化合物与所述缚酸剂的摩尔比为1：2-3.4。
在一个优选实施方案中，所述氨源选自碳酸氢铵、碳酸铵、氨水、氨气中的一种；优选地，所述氨源选自碳酸氢铵、碳酸铵、氨气中的一种。
所述缚酸剂为有机碱或无机碱，所述有机碱为二异丙基乙基胺、二乙胺、三丙胺，N,N-二甲基吡啶，三乙胺，三正丁胺，三乙烯二胺，1,5-二氮杂二环[5.4.0]十一烯-5，1,5-二氮杂二环[4.3.0]壬烯-5，4-二甲氨基吡啶，吡啶，N-甲基吗啉，四甲基乙二胺中的一种或多种；所述无机碱为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、氢氧化铯、氢氧化镁、氢氧化钙、氢氧化锶、氢氧化钡、碳酸钾、碳酸钠、碳酸铯、碳酸锂、碳酸镁、碳酸氢钠、碳酸氢钾中的一种或多种。
优选地，所述缚酸剂为三乙胺。
在一个优选实施方案中，鼠李糖化合物在氨气-醇溶液中进行取代反应，得到化合物2；
所述氨气-醇溶液中氨气的质量分数为8-20％；优选地，所述氨气-醇溶液中氨气的质量分数为10-17％。
在一个优选实施方案中，鼠李糖化合物选自L-鼠李糖、D-鼠李糖中的一种或多种；所述L-鼠李糖包括α-L-鼠李糖、β-L-鼠李糖；所述D-鼠李糖包括α-D-鼠李糖、β-D-鼠李糖；所述α-L-鼠李糖包括无水α-L-鼠李糖(CAS:6014-42-2)、一水α-L-鼠李糖(CAS:6155-35-7)；所述β-L-鼠李糖包括无水β-L-鼠李糖(CAS:6155-36-8)、一水β-L-鼠李糖；
优选地，所述鼠李糖化合物选自L-鼠李糖；
更优选地，所述鼠李糖化合物选自一水α-L-鼠李糖(CAS:6155-35-7)。
更优选的合成路线如下：
Figure BDA0002371145920000101
所述化合物2的制备方法优选包括以下后处理步骤：反应结束后，旋干、重结晶；所述的旋干、重结晶可以按照本领域中该类操作的常规方法进行。
所述取代反应的进程可以采用本领域中的常规监测方法(例如TLC、HPLC或NMR)进行监控。
在一个优选实施方案中，所述化合物3是以化合物5为起始原料，经过羟基保护、碱解反应、卤代反应得到，合成路线如下：
Figure BDA0002371145920000111
在一个优选实施方案中，所述化合物5在缚酸剂条件下与羟基保护试剂进行羟基保护反应，得到化合物6，所述化合物6在碱性条件下进行碱解反应后得到化合物7，化合物7与卤代试剂反应得到化合物3。
所述羟基保护反应中所述缚酸剂选自吡啶、2-甲基吡啶、喹啉、咪唑、三乙胺、吗啉、N,N-二异丙基乙胺(DIEA)中的一种或多种。
优选地，所述羟基保护反应中所述缚酸剂选自N,N-二异丙基乙胺。
本发明中，所述羟基保护试剂皆为本领域已知的羟基保护试剂，优选为叔丁基二甲基氯硅烷(TBSCl)。
所述羟基保护反应在合适的有机溶剂中进行，反应温度为-5-70℃，羟基保护反应的反应时间为1-24h；所述化合物5与所述缚酸剂的摩尔比为1：1-6，所述化合物5与所述羟基保护试剂的摩尔比为1：1-5。
所述有机溶剂优选选自二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基乙酰胺(DMAC)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、六甲基磷酰胺(HMPA)、二氯甲烷(DCM)中的一种或多种。
优选地，所述羟基保护反应的反应时间为3-12h。
优选地，所述化合物5与所述缚酸剂的摩尔比为1：2-5，所述化合物5与所述羟基保护试剂的摩尔比为1：1.5-4。
优选地，所述羟基保护反应中反应温度为20-30℃，反应溶剂为DCM。
所述化合物6的制备方法优选包括以下后处理步骤：反应结束后，萃取、洗涤、干燥、过滤、旋干、打浆、过滤、干燥，所述的萃取、洗涤、干燥、过滤、旋干、打浆、过滤、干燥可以按照本领域中该类操作的常规方法进行。
在一个优选实施方案中，所述碱解反应溶剂选自四氢呋喃、水或其组合；所述碱包括碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钾、氢氧化钠中的一种或多种。
优选地，所述碱解反应溶剂为四氢呋喃水溶液；所述碱为碳酸钾；优选所述碱解反应温度为室温，反应时间为1-10h。
所述四氢呋喃水溶液中四氢呋喃与水的体积比为1-50：1；优选地，所述四氢呋喃水溶液中四氢呋喃与水的体积比为5-20：1。
在碱解反应中，所述化合物6与所述碱的摩尔比为1：0.1-1；优选地，所述化合物6与所述碱的摩尔比为1：0.15-0.5。
所述化合物7的制备方法优选包括以下后处理步骤：反应结束后，萃取、洗涤、干燥、过滤、旋干、打浆、过滤、干燥，所述的萃取、洗涤、干燥、过滤、旋干、打浆、过滤、干燥可以按照本领域中该类操作的常规方法进行。
所述卤代反应中反应温度为10-100℃，优选10-60℃，卤代反应的反应时间为1-10h，卤代反应溶剂选自二氯甲烷、乙腈或其组合；所述化合物7与所述卤代试剂的摩尔比为1：1-5。
优选地，所述卤代反应的反应温度15-50℃，所述卤代反应中所述反应溶剂为二氯甲烷；所述化合物7与所述卤代试剂的摩尔比为1：1-3。
在一个优选实施方案中，卤代试剂选自三甲基氯硅烷、三甲基溴硅烷、三乙基氯硅烷、叔丁基二甲基氯硅烷、苯基二甲基氯硅烷、草酰氯、乙酰氯、三氯氧磷、五氯化磷、五溴化磷、二氯亚砜、磺酰氯或其组合；优选地，所述卤代试剂为草酰氯。
所述化合物3的制备方法优选包括以下后处理步骤：反应结束后，旋干，所述的旋干可以按照本领域中该类操作的常规方法进行。
PL171的活性和功能
本发明人发现，PL171(即N-(β-L-吡喃鼠李糖基)阿魏酸酰胺)能够提高SIRT3的表达或活性。在一些实施方案中，PL171促进了SIRT3基因的表达，和/或促进了SIRT3蛋白的活性。进一步地，本发明人发现，PL171还能提高AMPK磷酸化和PGC-1α的表达。由于已知AMPK介导的PGC-1α是SIRT3基因的转录因子之一，因此很可能PL171能通过促进AMPK活性来促进PGC-1α和SIRT3的表达和活性。
SIRT3，如本文所用的，属于哺乳动物体内“sirtuin家族”7成员，是一种NAD依赖的组蛋白去乙酰化酶，主要存在于线粒体内。SIRT3存在两种形式：44kDa的长链和28kDa的短链，其在细胞内主要通过短链SIRT3发挥作用。SIRT3参与线粒体能量代谢和细胞衰老，是治疗衰老和年龄相关疾病的分子靶点。
PGC-1α，如本文所用的，全名为过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)共激活因子-1α。该蛋白和其他转录因子参与氧化磷酸化、脂质代谢和线粒体生物合成的调节。已知SIRT3是PGC-1α的一个转录靶点。
在本申请中，证实了PL171能显著提高SIRT3表达和活性或防止其降低，从而减弱Aβ42O诱导的神经元缺陷。当SIRT3的活性被阻断时，所有这些效应都不存在，表明PL171通过靶向SIRT3发挥作用。
而且，通过如实施例所述的进一步的研究发现，PL171能显著增加PGC-1α的mRNA和蛋白质水平，并防止Aβ诱导的蛋白质下降，进而修复Aβ所致的线粒体供能损伤。因此，PL171促进SIRT3的表达可能是通过PGC-1α。
本发明中PL171不仅可以预防Aβ42O诱导的氧化应激和线粒体损伤，还可以抑制Aβ42O介导的细胞衰老。
PL171在改善或提高认知功能方面的效果
如本文所用，术语“认知功能”从广义上讲，是指人对感觉输入信息的获取、编码、操作、提取和使用的过程，包括注意、记忆、知觉和思维等。认知功能的障碍泛指由各种原因(从生理老化到意识障碍)导致的不同程度的认知功能损害的临床综合征。其表现形式众多，例如学习或记忆障碍、执行功能的障碍、痴呆、失语、失用、失认、以及其他精神、神经活动的改变等。
为了测试PL171在预防认知功能障碍、改善或提高认知功能方面的效果，发明人采用了停止信号任务(Stop-signal task)模型，它是一种常用的反应抑制行为模型，广泛用于临床病人认知功能的评估和实验室动物研究。该模型以“赛马模型”为理论基础设计，可以测试动物的反应抑制能力，在一定程度上也反映动物的学习记忆能力、决策反应能力和运动反应能力。反应抑制能力与工作记忆和注意力调控一起构成执行功能的主要组成部分，是一种重要的认知功能。反应抑制指抑制已经形成的动作反应冲动，是执行控制的一个关键组成部分；具体来说，反应抑制就是抑制不再需要或不恰当的行为，以便人们可以对外界环境进行各种灵活的、有目的的行为反应。
在本公开中，对正常大鼠施用PL171后，发现停止信号反应时间(SSRT)明显缩短(对照组没有改变)，Stop trial操作正确率则显著提高，该结果表明PL171药物显著提高了大鼠的反应抑制能力。
本文提到的上述所有特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本文所披露的各个特征可以用任何可提供相同、等同或类似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所披露的特征仅为等同或类似特征的有限实例，很显然本发明并不仅限于此。
本发明的积极进步效果在于：本发明的制备方法原料廉价易得、反应条件温和、转化率高、收率高、后处理简单、生产成本低、制得的产品化学纯度高。所制备的PL171(即N-(β-L-吡喃鼠李糖基)阿魏酸酰胺)能在治疗线粒体功能障碍、提高SIRT3水平和活性、治疗抑郁症、提高认知能力等方面发挥作用。
实施例
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。
除非另有定义，文中所使用的所有专业与科学术语与本领域熟练人员所熟知的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或等同的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的具体实施方式与材料仅作示范之用。
实施例1
Figure BDA0002371145920000151
制备化合物7
Figure BDA0002371145920000152
将化合物5(8.50g,43.80mmol)溶在DMF(60mL)中，加入咪唑(11.74g,175.00mmol)，在0℃下分批加TBSCl(13.20g,87.60mmol)，然后放于21℃搅拌12小时；TLC显示反应完全，反应液倒入水(300mL×5)中，用乙酸乙酯萃取,合并有机层，用饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干得到黄色固体，用石油醚：乙酸乙酯＝3:1打浆，得到白色固体13g(化合物6)，干燥，然后加入到反应瓶中，加入THF(42.5mL)和H2O(4.3mL)体系搅拌，加入K2CO3(0.25eq，相对于化合物6的用量计算)，体系在25±5℃搅拌反应3.5小时,反应结束，加入水(10ml)，搅拌10min，用3％HCl水溶液调节体系pH至4-5，分液，收集有机层，用20％NaCl水溶液(10ml)洗涤，静置、分液、收集有机层，MgSO4进行干燥，过滤，减压浓缩干，加入正庚烷(17ml)和乙酸乙酯(2ml)，20±5℃下搅拌1h，过滤，干燥，得到化合物7，结构经1H NMR确认；
1H NMR(600MHz,CD3OD)δ：7.43-7.46(d,1H),7.02(s,1H),6.90-6.92(d,1H),6.67-6.69(d,1H),6.17-6.20(d,1H),3.68(s,3H),0.84(s,9H),0.00(s,6H)。
制备化合物3
Figure BDA0002371145920000161
室温下，将化合物7(13.00g,39.77mmol)溶在二氯甲烷(150mL)中，滴加二氯亚砜(14.19g,119.31mmol)，滴完后回流搅拌1小时，反应液直接旋干，加入二氯甲烷，再旋干，得到黄色的油13.50g(化合物3)。
制备化合物2
Figure BDA0002371145920000162
在一个100mL的聚四氟闷罐中加入化合物4(5.00g，27.5mmol)，20ml的无水甲醇和碳酸氢铵(4.82g,60.92mmol)，再加入三乙胺(9.25g,91.38mmol)，将反应放入油浴中并升温到65℃，搅拌40分钟；然后将反应放在21℃搅拌48小时；TLC监测，原料未反应完全，反应液直接旋干，得到淡黄色泡沫状固体10.20g(化合物2)，直接用于下一步反应。
制备化合物1
Figure BDA0002371145920000163
化合物2(5.80g,26.30mmol)溶于甲醇(50mL)中，加入碳酸钠(8.36g,78.91mmol)，放于0℃搅拌10分钟后慢慢加入溶于四氢呋喃的化合物3(17.21g,52.64mmol)，然后放于21℃搅拌12小时，过滤，滤液直接旋干，加入100毫升二氯甲烷溶解粗品，加入100-200目的硅胶拌样，用柱层析(二氯甲烷：甲醇＝1:0-10：1)纯化，得到淡黄色泡沫固体3.90g(化合物1)，收率：32.7％。
1H NMR(600MHz,CD3OD)δ：7.38-7.40(d,1H),7.01(s,1H),6.90-6.92(d,1H),6.67-6.68(d,1H),6.47-6.50(d,1H),5.11(s,1H),3.69(m,1H),3.68(s,3H),3.36(m,1H),3.20(m,1H),3.15(m,1H),1.13-1.14(d,3H),0.84(s,9H),0.00(s,6H)。
MS(ESI)m/z:[M+Na]+476.2073；[M-H]+452.2070。
制备化合物I
Figure BDA0002371145920000171
把化合物1(3.90g,8.60mmol)溶在甲醇(50mL)中，0℃下滴加1N的四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液(8.60mL)，滴完后在21℃搅拌1小时，TLC(二氯甲烷：甲醇＝7:1)显示反应完全，反应液旋干，加入尽量少的甲醇溶解，然后加入二氯甲烷稀释，直到有固体析出，再加入等量的二氯甲烷，继续搅拌10分钟，然后过滤，滤饼用二氯甲烷洗，得到白色固体产品2.90g(化合物I)，收率：65.1％。
1H NMR(600MHz,CD3OD)δ：7.42-7.45(d,1H),7.07(s,1H),6.95-6.97(d,1H),6.70-6.71(d,1H),6.48-6.51(d,1H),5.16(s,1H),3.80(s,3H),3.73(m,1H),3.41(m,1H),3.25(m,2H),1.19-1.20(d,3H)。
MS(ESI)m/z:[M+Na]+362.1208；[M-H]+338.1210。
实施例2
Figure BDA0002371145920000181
制备化合物7
Figure BDA0002371145920000182
向反应瓶中加入DCM(32mL)，化合物5(8.00g，1.00eq)，DIEA(16.97g，3.0eq)，体系在20-25℃搅拌，于20-30℃分批加入TBSCl(12.4g，2.00eq)。体系搅拌反应4小时，将体系加入到冰水(0-10℃，16mL)；体系，静置分液；有机相用1M HCl水溶液(16mL)洗涤，调节体系pH＝5-6；体系搅拌，静置分液；有机相真空减压浓缩至体系无馏分蒸出，收集残留物化合物6(黄色油状物，20.16g粗品)；
将化合物6(黄色油状物，20.16g粗品)溶于THF(32mL)于H2O(1.6mL)，搅拌，向体系分批加入Na2CO3(0.88g，0.20eq)，于25-30℃下搅拌4小时，向体系加入H2O(12mL)，于25±5℃下，向体系加入1M HCl水溶液调节体系pH至4-5，分液，水相用乙酸乙酯(12mL)萃取，合并有机相用饱和NaCl水溶液(12mL)洗涤；分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，有机相减压浓缩至体系无馏分蒸出，向体系加入正庚烷(20mL)和乙酸乙酯(4mL)，搅拌，过滤，滤饼用正庚烷和乙酸乙酯的混合溶液(0.5V，正庚烷：乙酸乙酯＝10:1)淋洗，收集固体，干燥，得到化合物7(11.2g；纯度：99.99％，收率87.76％)类白色固体，结构经1H NMR确认；
1H NMR：(CD3OD，400MHz)δ：0.16(s,6H)，1.00(s,9H)，3.84(s,3H)，6.35(d,J＝15.89Hz,1H)，6.84(d,J＝8.19Hz,1H)，7.07(dd,J＝8.19,1.96Hz,1H)，7.18(d,J＝1.96Hz,1H)，7.61(d,J＝15.89Hz,1H)。
制备化合物3
Figure BDA0002371145920000191
于反应瓶中加入DCM(40mL)，化合物7(10.00g，1.00eq)，DMF(0.015g，0.005eq)，搅拌,在15-25℃下滴加草酰氯(6.17g，1.50eq)，体系在15-25℃下搅拌3小时，反应结束，将体系减压浓缩至无溶剂蒸出，得到化合物3(10.8g)黄色油状物，结构经1H NMR确认:
1H NMR：(CDCl3，400MHz)δ：0.20(s,6H)，1.01(s,9H)，3.87(s,3H)，6.51(d,J＝15.41Hz,1H)，6.89(d,J＝8.19Hz,1H)，7.00-7.16(m,2H)，7.78(d,J＝15.41Hz,1H)。
制备化合物2
Figure BDA0002371145920000192
于反应釜中加入NH3-MeOH(氨气质量分数10％)100mL,分批加入化合物4(20.0g)，体系升温至35-40℃，搅拌24h，反应结束，将体系转出，体系减压浓缩至干，向体系加入50mL无水乙醇，体系浓缩至干，向体系加入50mL无水乙醇，体系于5-15℃搅拌2小时，过滤，滤饼干燥，得到化合物2(11.34g，收率57.04％)为类白色固体，产物结构经1H NMR确认结构:
1H NMR：(D2O，400MHz)δ：1.16-1.36(m,3H)，3.25-3.44(m,2H)，3.57(br d,J＝9.03Hz,1H)，3.84(br s,1H)，4.30(br s,1H)。
制备化合物1
Figure BDA0002371145920000201
室温下，于反应瓶中加入2-MeTHF(120mL)，化合物2(10.00g，1.00eq)，吡啶(7.27g，1.50eq),搅拌，体系降温至0-5℃，于0-5℃下滴加化合物3(20.03g，1.00eq)的2-MeTHF(0.10L)的溶液，滴毕，体系在0-5℃下搅拌2小时，反应结束。于10-15℃下向体系加入MeOH(10mL)，搅拌，向体系加入饱和食盐水(40mL)，体系分液，所得有机相减压浓缩至干，将所得粗品用MTBE(80mL)和正庚烷(40mL)于65-80℃下搅拌2小时，将体系降温至20-30℃，过滤，收集滤饼，干燥(40-50℃)，得到化合物1(19.00g，收率：68.34％，纯度：99.99％)类白色固体，产物结构经1H NMR确认:
1H NMR：(CD3OD，400MHz)δ：0.17(s,6H)，1.00(s,9H)，1.30(d,J＝5.65Hz,3H)，3.33-3.41(m,2H)，3.51(s,1H)，3.78-3.92(m,4H)，5.26(d,J＝1.00Hz,1H)，6.65(d,J＝15.69Hz,1H)，6.85(d,J＝8.16Hz,1H)，7.08(dd,J＝8.16,1.88Hz,1H)，7.19(d,J＝1.88Hz,1H)，7.55(d,J＝15.56Hz,1H)。
制备化合物I
Figure BDA0002371145920000202
于反应瓶中加入化合物1(8.00g，1.00eq)和THF(80mL)，搅拌，于15-25℃下向体系滴加TBAF(1.84g，0.40eq)，体系在20-25℃下搅拌反应1小时，反应结束。将体系减压浓缩至无液体蒸出，得到PL171的粗品(黄色固体，8.00g)。
1H NMR：(CD3OD，400MHz)δ：1.30(d,J＝5.62Hz,3H)，3.32-3.43(m,2H)，3.46-3.55(m,1H)，3.77-3.95(m,4H)，5.26(d,J＝0.61Hz,1H)，6.59(d,J＝15.65Hz,1H)，6.80(d,J＝8.07Hz,1H)，7.06(dd,J＝8.19,1.83Hz,1H)，7.16(d,J＝1.71Hz,1H)，7.53(d,J＝15.65Hz,1H).
实施例3：实验材料和实验方法
本发明所用试剂和原料均市售可得。
Aβ42O(Aβ42寡聚体)制备
将Aβ42多肽用六氟异丙醇(HFIP)处理后重悬于二甲基亚砜(DMSO)中，然后置于DMEM/F12无酚红培养基中稀释至100μM，离心，然后在4℃条件下温育24小时；其中，Aβ42肽购自Genicbio(A-42-T-2)。
细胞培养
SK-N-SH细胞购自ATCC。将细胞系置于含有10％胎牛血清(FBS)和100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素的改良型培养基中，于恒温孵育箱中培养。
细胞存活率的测量
将SK-N-SH细胞以1×104个细胞/孔接种在96孔板中，在用指定浓度的PL171处理24h后，使用Cell Titer-Glo发光测定法(Promega，G7573)检测细胞存活，通过BioTekSynergy NEO(Bio-Tek，USA)测量值。如图3显示，使用30uM的PL171处理长达24h，SK-N-SH细胞的存活率未受影响。
线粒体分离
将SK-N-SH细胞接种到60mm培养皿中，用PBS洗涤细胞(1.5×106细胞/皿)一次，用胰蛋白酶-EDTA溶液分解后以200g离心10分钟，弃上清，再用预冷的PBS重悬沉淀，在4℃条件下以600g速度离心5分钟，再用含有100μM PMSF的1mL线粒体分离液进行重悬，冰上孵育10分钟，细胞重悬液再经过1ml胰岛素针抽拉10次而进行匀浆，在4℃条件下以600g速度离心10分钟，收集上清后，再在4℃条件下以11000g速度离心10分钟获得线粒体，然后用蛋白质印迹分析线粒体裂解物。
活性氧(ROS)分析
使用2,7-二氯-荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)(Beyotime，S0033)作为探针以检测细胞内ROS水平，即将SK-N-SH细胞置于1×104细胞/孔密度接种在96孔板中，然后用指定浓度的Aβ42O或PL171将细胞处理24h后，将细胞与10μM DCFH-DA置于无血清和酚红的培养基中培养30分钟，培养基置于37℃、含有5％CO2/95％空气(v/v)的潮湿培养箱中，用PBS洗涤细胞两次，然后在激光测量，共聚焦显微镜(Operetta，Perkin Eimer，USA)下观察。或者，用1％Triton X-100在37℃下处理96孔黑色板中的细胞10分钟，使用BioTek SynergyNEO(Bio-Tek，USA)在激发光波长为488nm、发射波长为525nm下测量荧光。
线粒体ROS检测
将细胞在有或无PL171的情况下预温育4h，再用10uM Aβ42O处理24小时。处理结束时，将细胞用2.5μM MitoSOX Red线粒体超氧化物指示剂(Invitrogen,M36008)和3μg/mL核染色染料Hoechst(Beyotime,C1022)在37℃共染色20min。使用BioTek SynergyNEO在510/580nm(MitoSOX)和350/461nm(Hoechst)记录荧光信号。用Hoechst信号强度将MitoSOX荧光信号标准化处理。
线粒体膜电位的测定
将SK-N-SH细胞以10,000个细胞/孔的密度接种到96孔板(Costar，3904)中。将细胞用指定浓度的Aβ42O或Aβ42-1O或用指定浓度的PL171预处理4或24h后，与Aβ42O再处理24h，使用JC-1试剂盒(Beyotime，C2006)检测细胞的线粒体膜电位(MMP)水平；即将细胞在37℃下加入混合的JC-1染色溶液30min，用稀释的JC-1染色缓冲液洗涤两次，在ZeissObserver Z1显微镜下观察细胞。使用BioTek SynergyNEO(Bio-Tek，USA)在490/530nm(绿色)检测单体和525/590nm聚集体(红色)检测荧光强度，膜电位表示为红色/绿色荧光强度的比值。
细胞耗氧率的测定
采用安捷伦Seahorse XFe24细胞能量代谢分析仪测定SK-N-SH(神经母细胞瘤细胞)的细胞耗氧率。首先，将神经母细胞瘤细胞以3×104的密度种于24孔板，细胞经30uMPL171预处理4h，对照组则给予对应的溶剂后，再应用10μM Aβ42O孵育24h。在进行细胞耗氧率测定前，细胞需要置于37℃，不含CO2的孵育箱中，用含25mM葡萄糖，2mM谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠的无碳酸氢盐的无缓冲培养液处理45min。在测定细胞基础耗氧量之后，再依次加入寡霉素、FCCP解偶联剂、鱼藤酮，最后加入抗霉素A。测得的数据由Seahorse XFe24软件进行分析。
SA-β-gal测量(β-半乳糖苷酶活性的测定)
使用商业试剂盒(Beyotime，C0602)通过SA-β-gal染色测量细胞衰老，将SK-N-SH细胞(5×104细胞/孔)置于含有5％FBS的培养基中在24孔板中培养，在不存在或存在PL171的情况下用Aβ42O处理72h后，进行SA-β-gal染色，通过Zeiss Observer Z1显微镜对蓝色染色细胞拍照计数。每次试验，至少对10个不同的视野(60-100细胞/视野)进行计数。
逆转录和实时荧光定量PCR
在用指定浓度的PL171处理细胞后，通过sigma公司(T9424)的提供的TRI试剂对2×105细胞/孔密度的细胞总RNA进行提取，再应用TakaRa(RR036B)的PrimeScript RTmaster mix进行逆转录，进行逆转录反应后，选择SYBR Green Qpcr master mix(ExCellBio)进行实时荧光定量PCR操作，将HPRT作为内参。
蛋白印迹
将细胞(1×105细胞/孔)用PL171处理24h或用PL171预处理4h然后用Aβ42O再处理24h。对于线粒体裂解物制备，将细胞接种并如之前描述的分离线粒体。采用10％或12％的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)将神经母细胞瘤细胞总的细胞裂解液或者线粒体裂解液分离出来，电泳的条件为400mA恒流，4℃，2h，转膜后，用含有0.1％Tween-20的5％无脂牛奶封闭液常温封闭1h，封闭完成后，再孵育一抗。所使用到的一抗包括：
SIRT3，品牌Cell Signaling Technology提供，货号5490S；
ATP5A，品牌Abclonal，货号A5884；
SIRT1，品牌Proteintech，货号13161-1-AP；
OSCP，品牌Santa Cruz Biotechnology，货号sc-365162；
ATP5Ok139，品牌Abcam，货号ab214339；
SOD2，品牌Santa Cruz Biotechnology，货号sc-133134；
SOD2k68，品牌Abcam，货号ab137037；
PGC-1α，品牌Proteintech，货号66369-1-Ig；
AMPKα兔单克隆，品牌Beyotime，货号AF1627；
Phospho-AMPKα，品牌Beyotime，货号AA393；
肌动蛋白(Actin)，品牌Sigma，货号#A2066；
4℃条件下过夜后，加入HRP偶联二抗，然后与ECL底物一起孵育，通过成像系统拍照、分析。
统计分析
通过Prism 6.0(GraphPad Software Inc，San Diego，CA)分析数据，两组数据之间采用非配对t-test(双尾)比较，两组以上数据的分析采用单因素方差结合Bonferronipost-test，p<0.05的表示具有显著性差异。
实施例4：PL171提高线粒体SIRT3水平及其活性
线粒体蛋白乙酰化与线粒体功能密切相关，检测了PL171对线粒体蛋白乙酰化状态的影响。简言之，用不同浓度的PL171处理SK-N-SH细胞24h，然后分离线粒体，制备裂解物，通过蛋白质印迹法使用抗乙酰化抗体(Ac-k)测量线粒体蛋白的总乙酰化。结果如图5A所示，其表明PL171剂量依赖性地降低线粒体蛋白的总乙酰化的影响。
还通过用PL171以30μM处理细胞0.5-24h，观察线粒体蛋白质脱乙酰化的程度的变化过程。结果如图5B所示，其表明30μM 171处理24h处理后，细胞线粒体蛋白的乙酰化程度最低。
由于SIRT3在线粒体蛋白去乙酰化中起重要作用，测定了线粒体中SIRT3的表达量。免疫印迹结果显示，PL171使线粒体SIRT3的增加约36％(见图5C、5F)。
为了检测SIRT3活性，使用特异性抗体检测SIRT3底物，包括锰超氧化物歧化酶(SOD2)和寡霉素敏感性赋予蛋白(OSCP)的乙酰化水平，通过免疫印迹分别检测68和139位点的乙酰化。结果显示，PL171以剂量依赖方式降低MnSOD和OSCP的乙酰化，30μM的PL171使MnSOD(SODk68/MnSOD)和OSCP(ATP5O/OSCP)的乙酰化分别降低约20％和32％(见图5C、D、E)；用SIRT3抑制剂(SIRT3 inh.，3-TYP，20μM，4h)预处理显著阻断了PL171的作用(见图5G、H、I)。
上述结果表明，PL171可以通过增加线粒体中SIRT3的水平或活性以促进线粒体蛋白去乙酰化来保护线粒体功能。
实施例5：PL171通过增强AMPK磷酸化介导的PGC-1来促进SIRT3的表达
用不同浓度的PL171处理SK-N-SH细胞24h，然后收集细胞，制备裂解物。PL171在30μM时剂量依赖性地增加SIRT3在总细胞裂解物中的表达约25％，而对SIRT1水平几乎没有影响(见图6A、B、G、H)，表明PL171对SIRT3的特异性作用。
用PL171处理24h显著促进了SIRT3而非SIRT1的mRNA水平(见图6C、6I)。
SIRT3基因的表达受转录因子PGC-1α参与线粒体生物发生的控制，因此检测了PL171对PGC-1mRNA和蛋白质表达的刺激，结果表明用PL171处理24h能促进PGC-1αmRNA和蛋白质水平，说明PL171可能通过增强PGC-1来促进SIRT3的表达(见图6D-F)。
此外，已知AMPK的激活可以刺激CREB介导的PGC-1表达上调，从而转入调控SIRT3表达。因此检测了PL171对AMPK的影响，结果显示PL171能促进AMPK磷酸化，而通过使用AMPK活性抑制剂化合物C(compound C)预处理能够降低PL171对AMPK的影响，抑制SIRT3的表达(见图6J-L)。
实施例6：PL171抑制Aβ42O诱导的SK-N-SH细胞中ROS的产生
首先，在将人神经细胞SK-N-SH用PL171处理24h后，将基础ROS产生降低了约15％(参见图4，30uM PL171)。Aβ42O可诱导ROS的产生，从而引起神经元的氧化应激。用不同浓度的Aβ42O处理人神经细胞SK-N-SH 24h，并通过用DCFH-DA染色测量细胞ROS水平，结果见图7A，其表明Aβ42O诱导ROS的增加，但通过用PL171预处理，ROS的生成呈现剂量依赖性地降低，30μM的PL171几乎完全抑制Aβ42O诱导的ROS产生，结果见图7B。
为了特定地检测线粒体ROS，使用了线粒体超氧化物指示剂MitoSOX，结果见图7C。数据显示Aβ42O(10uM，24h)将线粒体ROS刺激增加了约26％，而通过与PL171(30uM，4h)预温育能显著抑制这种刺激增加。
这些结果表明PL171保护神经细胞免受Aβ42O诱导的氧化损伤。
实施例7：PL171抑制Aβ42O诱导的SK-N-SH细胞中线粒体膜电位(MMP)的降低
Aβ42O可诱导MMP的丧失，将JC-1探针用于评估SK-N-SH细胞中的MMP，红色荧光和绿色荧光分别代表线粒体膜的高和低渗透性，该比率可代表MMP的变化。
与对照组相比，用Aβ42O处理显著降低了红色/绿色荧光的比值(图8A)，表明由Aβ42O诱导的MMP去极化，Aβ42-1作为阴性对照没有明显效果(图8A)；Aβ42O对MMP的作用是时间和剂量依赖性的，Aβ42O(10μM)分别在8h、16h和24h使MMP下降约12％、32％和36％(图8B)。用PL171预处理4h显著地预防了Aβ42O诱导的SK-N-SH细胞中MMP的减少(图8C)；Aβ42O(10μM，24h)诱导MMP降低34％，通过与30μMPL171预孵育4h，其减弱至约10％，当将PL171预孵育期延长至24h时，PL171的保护作用更加显著(图8D)，同时PL171在没有Aβ42O的细胞中没有改变MMP，而作为阳性对照的鱼藤酮产生约37％的降低(图8E)。
实施例8：PL171抑制Aβ42O诱导的SK-N-SH细胞中氧消耗的减少
Aβ在线粒体中积累，从而导致ATP耗竭，呼吸速率下降，呼吸酶活性降低，使用海马仪器分析了氧消耗率(OCR)，检测PL171对线粒体功能的影响。
与对照组相比，Aβ42O(10μM，24h)OCR受损，PL171(30μM，4h预处理)的存在抑制Aβ42O诱导的线粒体损伤(图9A)；Aβ42O基础下降呼吸21％，通过与30μM PL171预培养4h回复至对照水平(图9B)；Aβ42O使ATP产生减少约25％，而用PL171(30μM)预处理4h使ATP水平恢复到与对照相似的水平(图9C)；与对照组相比，Aβ42O使线粒体最大呼吸受损22％，而经PL171预处理，线粒体最大呼吸受损可被完全抑制(图9D)；上述数据表明PL171可以抑制Aβ42O诱导的氧消耗减少，包括ATP产生，基础呼吸和最大呼吸，并维持健康的线粒体功能。
实施例9：PL171抑制Aβ42O诱导的SK-N-SH细胞中的乙酰化水平的升高
用30μM PL171预处理4h，然后用10μMAβ42O处理24h,观察SK-N-SH细胞的线粒体裂解物中的MnSOD的乙酰化水平
线粒体蛋白乙酰化与线粒体功能密切相关，Aβ42O(10μM)增加了MnSOD的乙酰化水平，其通过与30μM PL171预孵育4h而显著下调(图10A，10B)，所述数据表明PL171可以通过促进SIRT3功能促进线粒体蛋白去乙酰化来抑制Aβ42O诱导线粒体功能异常。
实施例10：PL171抑制由Aβ42O诱导的SIRT3和PGC-1α减少
与对照组相比，Aβ42O(10μM，24h)降低了SIRT3和PGC-1α的表达，用PL171预处理4h减弱了Aβ42O诱导的SIRT3和PGC-1表达的减少，30μM的PL171预孵育完全阻断了由Aβ42O导致的SIRT3和PGC-1α表达的减少(图11A，11B，11C)。
实施例11：PL171通过SIRT3改善Aβ42O诱导的氧化应激和线粒体功能异常
与对照组相比，Aβ42O(10μM，24h)将MMP降低32％，其通过PL171(30μM，预孵育4h)成功预防，在SIRT3抑制剂(20μM，4h)预处理的细胞中，Aβ42O使MMP降低28％，而PL171没有改变(图12A)。PL171抑制Aβ42O介导的ROS水平的增加，当同时用PL171应用3-TYP时，这种作用减弱(图12B)。这些数据表明PL171通过SIRT3来介导对Aβ42O诱导的氧化应激和线粒体功能异常的保护作用。
实施例12：PL171通过SIRT3调节抑制Aβ42O诱导的细胞衰老
通过SA-β-gal的染色，观察到Aβ42O(10μM，72h)使SA-β-gal阳性细胞的数量增加超过两倍(图13A)；通过用PL171预处理4h，与对照组相比，30μM的PL171将Aβ42O促进的SA-β-gal阳性细胞的数量减少至对照水平，在具有20μM 3-TYP(SIRT3抑制剂)的细胞中，Aβ42O(10μM，72h)导致SA-β-gal阳性细胞数量的增加与没有3-TYP的细胞相似(图13B)，PL171和3-TYP的共处理没有改变Aβ42O的作用，所述数据表明PL171通过促进SIRT3活性保护神经元细胞免受Aβ42O诱导的线粒体相关细胞衰老。
实施例13：对PL171在小鼠中急性抗抑郁的药效评价
1、试剂及药品：
媒介物为三蒸水；
盐酸氟西汀(FLX)：东京化成工业株式会社，产品编号：F0750。
PL171
2、动物：健康C57BL/6J小鼠，雄性，体重18～22g，自上海斯莱克实验动物有限公司,实验前到达中国科学院上海药物研究所动物饲养中心(动物生产许可证:SCXK9[沪]2004-0002，使用许可证：SYXK[沪]2003-0029)，并在动物设施中适应3天以上，6只/笼饲养。(动物生产许可证:SCXK9[沪]2004-0002，使用许可证：SYXK[沪]2003-0029)。
3、方法：将健康C57BL/6J小鼠随机分为5组，每组10只，分别为媒介物组(三蒸水)；对照组(盐酸氟西汀20.0mg/kg)；PL171高、中、低剂量组(50.0，15.0，2.0mg/kg)，灌胃给药1次。实验期间动物自由取食和饮水，单次给药1h后，将小鼠放于直径约18cm，水深18cm，水温25℃的容器内，小鼠游泳时间为6min，测定4min之内小鼠漂浮不动的时间(即小鼠在水中停止挣扎，或动物呈漂浮状态，仅有细小的肢体运动以保持头部浮在水面)。该时间又称为强迫游泳不动时间，是本领域已知的用于测定抑郁程度的指标，该时间越短说明小鼠的活动性越高，因而抗抑郁效果越好。
4、强迫游泳不动时间的数据
组别 强迫游泳不动时间(平均值±标准误,单位为秒)
媒介物 132.7±12.7
20mg/Kg FLX 88.2±14.2
5mg/Kg 171 79.0±9.9
15mg/Kg 171 79.1±10.3
50mg/Kg 171 94.4±11.2
5、结论
PL171的低、中、高三种给药剂量，均能显著降低小鼠强迫游泳的不动时间，抗抑郁效果明显。
实施例14：PL171在小鼠中长时段抗抑郁的药效评价
一、强迫游泳实验
1、试剂及药品：与实施例13相同
2、动物：与实施例13相同
3、方法：将健康C57BL/6J小鼠随机分为5组，每组10只，分别为媒介物组(三蒸水)；对照组(盐酸氟西汀20.0mg/kg)；PL171高、中、低剂量组(50.0，15.0，5.0mg/kg)，灌胃给药，1次/天，连续7天。实验期间动物自由取食和饮水，末次给药24h后，将小鼠放于直径约18cm，水深18cm，水温25℃的容器内，小鼠游泳时间为6min，测定4min之内小鼠漂浮不动的时间(即小鼠在水中停止挣扎，或动物呈漂浮状态，仅有细小的肢体运动以保持头部浮在水面)。
4、强迫游泳不动时间的数据
组别 强迫游泳不动时间(平均值±标准误,单位为秒)
媒介物 139.7±12.2
20mg/Kg FLX 121.4±14.3
5mg/Kg PL171 74.3±13.5
15mg/Kg PL171 73.3±9.9
50mg/Kg PL171 99.3±8.6
5、结论
PL171的三种给药剂量抗抑郁效果显著，由于给药后24后测强迫游泳，氟西汀需2-3周起效，也表明PL171可能有快速的抗抑郁作用。
二、悬尾实验
1、试剂及药品：与实施例13相同
2、动物：将经过连续给药7天，强迫游泳实验后的C57BL/6J小鼠
3、方法：将经过连续给药7天，强迫游泳实验后的健康C57BL/6J小鼠继续灌胃给药，1次/天，连续至14天。实验期间动物自由取食和饮水。末次给药24h后，将小鼠尾部距末端约1cm处用夹子固定，使其倒吊于距地面15cm左右的横杆上，动物为克服不正常体位而挣扎活动，但活动一段时问后，出现间断性不动，显示绝望状态，悬挂6min，累计各组后4min内的不动时间。该时间又称悬尾不动时间，也是本领域已知的用于测定抑郁程度的指标，该时间越短说明小鼠的活动性越高，因而抗抑郁效果越好。
4、悬尾不动时间的数据
组别 悬尾不动时间(平均值±标准误,单位为秒)
媒介物 82.8±11.9
20mg/Kg FLX 46.2±4.9
5mg/Kg PL171 54.4±6.4
15mg/Kg PL171 46.9±8.9
50mg/Kg PL171 30.8±8.7
5、结论
化合物PL171的三种给药剂量均能显著降低小鼠的不动时间，提示抗抑郁效果显著，呈明显剂量-效应关系。阳性药氟西汀连续给药14天后，小鼠也表现显著抗抑郁效果。由于氟西汀连续7天给药无明显作用，而PL171给药7天即产生抗抑郁作用，提示PL171抗抑郁效果显著，且抗抑郁的起效时间快，起效剂量也比氟西汀低。结合之前对SIRT3作为PL171发挥作用的关键分子的研究，很可能对抑郁症的预防和治疗效果也是通过对SIRT3活性/水平的提高来实现的。
总之，实施例13-14的结果表明，PL-171在单次给药和多次重复给药中均能够以相比于阳性对照更小的剂量快速且在较长时间内持续地发挥对抑郁症及其症状的预防、缓解和治疗作用。
实施例15：PL171对反应抑制能力影响的测试结果
一、停止信号任务(Stop-signal task)模型的简介
停止信号任务(Stop-signal task)模型如图15A和15B所示，其进一步的细节描述于2017年12月21日在Acta Pharmacologica Sinica volume出版的参考文献，“PrefrontalAMPA receptors are involved in the effect of methylphenidate on responseinhibition in rats”，其通过引用完整并入本文。简言之，提供具有3个戳鼻端口的室，中间的端口用作奖赏端口(reward)，每次正确的试验都会提供一滴水，用红外探测器监视进入这三个端口中任何一个端口的戳鼻。从离开初始端口到将鼻子戳入动作端口之间经过的时间定义为Go反应时间(Go RT)。
测量了以下行为学评估指标：
行为测试包括一个session，一个session有320个trial，第21-320个trial用于参数计算。分3个block，每个block含100个trial，其中80个go trial，20个stop trial。
(1)停止信号反应时间(Stop-signal reaction time,SSRT)：指示反应抑制能力和内在决策力。SSRT值越小，反应抑制能力越好，反之越差。
每个正确的go trial都可以计算出一个Go反应时间(Go RT)，将每个block的GoRT从小到大排列，取第n个Go RT的值，然后减去20个stop trial的stop signal出现的延迟时间(stop-signal delay，SSD)的平均值。最后得到的SSRT为3个block算出的3个SSRT的平均值。
SSRT＝GoRT(n)-SSD平均值，其中n＝Go trial数x(1-stop正确率)。
(2)Stop trial操作正确率(Stop accuracy)：指示反应抑制能力和惩戒反应。Stop accuracy的变化可以反映反应抑制能力的改变，如果变大，表明反应抑制能力增强。
Go trial反应时间(GoRT)＝动物探鼻进入action port的时刻(ms)-从initialport撤出鼻子的时刻(ms)。
(3)Go反应时间(Go reaction time)：指示运动反应能力和奖赏反应。
(4)Go trial操作正确率(Go accuracy)：指示记忆能力，Go accuracy可以反映动物对行为任务操作规则的运用。如果Go accuracy变小，表明影响动物对已经熟悉的操作规则的运用，涉及记忆能力的改变。
Go正确率＝操作正确的Go trial个数/240(3个block的go trial个数为240)。
Stop正确率＝操作正确的Stop trial个数/60(3个block的stop trial个数为60)。
二.实验设计
1.药物配制及使用：
配制：用ddH2O将PL171配成1.0mg/ml的溶液，4℃保存。
使用：10mg/kg的剂量按1.0ml/100g给与，即100g体重给1ml的药物。5mg/kg的剂量，把药物稀释一倍后使用。
等体积ddH2O作为对照，按1.0ml/100g体重。
给药：喂食1.0mg/ml的PL171溶液。
2.动物：
从SLACC(中国上海)购买雄性Sprague-Dawley大鼠(160-180g)。将所有大鼠分组饲养在12:12的明/暗周期下(上午8:00开灯)。食物和水可随意获得。每天对大鼠称重，以确保维持其原始体重的约95％。所有实验程序均按照《美国国家卫生研究院实验动物的护理和使用指南》(NIH第80-23号出版物，1996年)进行，并由各研究所动物实验伦理委员会批准和监控复旦大学脑科学学院(中国上海)。
3.给药日程表(见图15C)
基线(Baseline)：大鼠连续两天测试比较稳定后，开始给药。这两天测试的平均值作为基线。Test1：连续给药2次后的测试(每次剂量10mg/kg)，在第2次给药后3小时进行行为测试。Test2：连续给药5次后的测试(前2次剂量10mg/kg，后3次剂量5mg/kg)，在第5次给药后3小时进行行为测试。Test3：在第5次给药后48小时的测试，用来对照Test1和Test2的结果是药物影响，还是重复的行为测试造成的。
三.实验结果
实验结果一：药物对Stop trial操作的影响
图16结果表明，服药后大鼠的反应抑制能力显著提高，如图16A所示，服药后大鼠的停止信号反应时间(SSRT)明显缩短，喝水对照组没有改变。停止服药后48小时，大鼠的SSRT不再减小，表明Test1和Test2中SSRT变化，是药物的效应。
如图16B所示，服药后大鼠Stop trial操作正确率显著提高，喝水对照组没有影响(**p<0.01,*p<0.05,Wilcoxon秩和检验)。
实验结果二：药物对Go trial操作的影响
图17结果表明，服药后大鼠的运动反应能力和行为任务规则的运用不受影响。如图17A所示，服药后大鼠的Go反应时间(GoRT)没有变化，说明药物对大鼠的运动反应能力没有影响。如图17B所示，服药后大鼠的Go trial操作正确率(Go accuracy)不受影响，说明药物不影响大鼠对行为规则的运用。
总之，上述结果表明，PL171显著降低了动物停止信号反应时间，增加了Stop的正确率；PL171改善和提高了大鼠反应抑制能力，显著改善和提高了大鼠的认知能力。
本领域技术人员将进一步认识到，在不脱离其精神或中心特征的情况下，本发明可以以其他具体形式来实施。由于本发明的前述描述仅公开了其示例性实施方案，应该理解的是，其他变化被认为是在本发明的范围内。因此，本发明不限于在此详细描述的特定实施方案。相反，应当参考所附权利要求来指示本发明的范围和内容。

Claims (15)

1.一种制备式I的化合物N-(β-L-吡喃鼠李糖基)阿魏酸酰胺的方法，所述方法包括以下步骤：
1)化合物2与化合物3在碱存在条件下反应，得到化合物1；
2)化合物1在脱保护剂条件下进行脱保护反应，得到化合物I；
Figure FDA0004155632360000011
化合物3结构式如下：
Figure FDA0004155632360000012
其中，
P选自All、Boc、TMS、TES、TBS、TIPS、TBDPS、THP、MOM、MTM、MEM、BOM、SEM、EE、Bn、PMB、Cbz、DMB和Tr；
X选自Cl和Br。
2.根据权利要求1所述方法，其中，
所述步骤1)的反应温度为-25℃-100℃，反应溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、叔丁醇、正丁醇、吡啶、二氯甲烷、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃(2-MeTHF)、水或它们的组合；
所述步骤2)的反应温度为-5℃-60℃，反应溶剂为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、叔丁醇、正丁醇、乙腈、1,4-二氧六环、四氢呋喃、二氯甲烷或它们的组合。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，
在步骤1)中，所述的碱选自无机碱或有机碱的一种或多种；化合物2与碱的摩尔比为1：1-7；化合物2与化合物3的摩尔比为0.8-3：1-4；以及
在步骤2)中，化合物1与脱保护剂的摩尔比为1：0.1-4。
4.根据权利要求1所述方法，进一步包括将鼠李糖化合物与氨源进行反应，得到化合物2的步骤。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述反应的反应温度为15℃-100℃，反应时间为0.5-60h，反应溶剂为醇类溶剂；所述鼠李糖化合物与所述氨源的摩尔比为1：1-10。
6.根据权利要求1所述的方法，进一步包括将化合物5在有机溶剂中进行羟基保护反应以得到化合物6、将化合物6进行碱解反应得到化合物7、以及将化合物7进行卤代反应以得到化合物3的步骤，
Figure FDA0004155632360000021
7.根据权利要求6所述的方法，其中
所述化合物5在缚酸剂条件下与羟基保护试剂进行羟基保护反应，得到化合物6；所述化合物6在碱性条件下进行碱解反应后得到化合物7；
化合物7与卤代试剂反应得到化合物3。
8.根据权利要求7所述的方法，其中
所述羟基保护反应中反应温度为-5-70℃，羟基保护反应的反应时间为1-24h；所述化合物5与所述缚酸剂的摩尔比为1：1-6，所述化合物5与所述羟基保护试剂的摩尔比为1：1-5；
所述碱解反应溶剂为四氢呋喃水溶液，所述碱解反应温度为室温，反应时间为1-10h；所述化合物6与所述碱的摩尔比为1：0.1-1；
所述卤代反应中反应温度为10-60℃，卤代反应的反应时间为1-10h，卤代反应溶剂选自二氯甲烷、乙腈或其组合；所述化合物7与所述卤代试剂的摩尔比为1：1-5。
9.用于制备N-(β-L-吡喃鼠李糖基)阿魏酸酰胺的式1的化合物：
Figure FDA0004155632360000031
其中，P选自All、Boc、TMS、TES、TBS、TIPS、TBDPS、THP、MOM、MTM、MEM、BOM、SEM、EE、Bn、PMB、Cbz、DMB和Tr。
10.式1的化合物用于制备N-(β-L-吡喃鼠李糖基)阿魏酸酰胺的用途：
Figure FDA0004155632360000032
其中，P选自All、Boc、TMS、TES、TBS、TIPS、TBDPS、THP、MOM、MTM、MEM、BOM、SEM、EE、Bn、PMB、Cbz、DMB和Tr。
11.式I的化合物N-(β-L-吡喃鼠李糖基)阿魏酸酰胺及其药学上可接受的盐在制备用于提高受试者中SIRT3活性或水平的药物中的用途
Figure FDA0004155632360000033
12.根据权利要求11所述的用途，其中所述药物还增强AMPK和/或PGC-1的活性或水平。
13.式I的化合物N-(β-L-吡喃鼠李糖基)阿魏酸酰胺及其药学上可接受的盐在制备用于降低受试者细胞中的线粒体蛋白乙酰化的药物中的用途
Figure FDA0004155632360000041
14.根据权利要求13所述的用途，其中所述细胞是神经细胞。
15.式I的化合物N-(β-L-吡喃鼠李糖基)阿魏酸酰胺及其药学上可接受的盐在制备用于改善或提高受试者反应抑制能力的药物中的用途
Figure FDA0004155632360000042
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