CN113122578A - 一种高效构建细胞文库的电击转化方法 - Google Patents
一种高效构建细胞文库的电击转化方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113122578A CN113122578A CN202011601166.0A CN202011601166A CN113122578A CN 113122578 A CN113122578 A CN 113122578A CN 202011601166 A CN202011601166 A CN 202011601166A CN 113122578 A CN113122578 A CN 113122578A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- cells
- sgrna
- library
- cell library
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 title abstract description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 65
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 claims abstract description 62
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 37
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims abstract description 20
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 15
- 230000035939 shock Effects 0.000 claims abstract description 12
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims description 25
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 claims description 16
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 15
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 14
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 claims description 9
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 claims description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 9
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 abstract description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 210
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 18
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 17
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 16
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 12
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 7
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 6
- 208000021601 lentivirus infection Diseases 0.000 description 6
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 5
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 239000003596 drug target Substances 0.000 description 4
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 238000010356 CRISPR-Cas9 genome editing Methods 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 2
- 238000010357 RNA editing Methods 0.000 description 2
- 230000026279 RNA modification Effects 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 2
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 2
- 238000001303 quality assessment method Methods 0.000 description 2
- 101150066583 rep gene Proteins 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 1
- 101150044789 Cap gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 206010017472 Fumbling Diseases 0.000 description 1
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 1
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 1
- 241000222712 Kinetoplastida Species 0.000 description 1
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000701945 Parvoviridae Species 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 241000712907 Retroviridae Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003287 bathing Methods 0.000 description 1
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 1
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011536 re-plating Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
- C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
- C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一种高效构建细胞文库的电击转化方法，所述方法包括：构建sgRNA表达细胞；将Cas9mRNA加入到所述sgRNA表达细胞中，进行电击转化反应。与现有技术相比，本发明方法通过改变构建细胞文库的方法及技术路线，最终形成一套能够快速高效构建细胞文库的方法，能够不受限于细胞起始量的限制，且能够显著缩短sgRNA细胞文库的构建时间，从而有效缩减人工成本和时间成本，并有效拓展细胞文库构建方法的适用范围。
Description
技术领域
本发明涉及基因编辑技术，更具体的涉及一种高效构建细胞文库的电击转化方法
背景技术
基因编辑技术能够让人类对目标基因进行定点“编辑”，从而实现对生物体基因组特定DNA片段的修饰。CRISPR-Cas系统是原核生物的一种获得性免疫系统，运用重复间隔序列转录所得的向导RNA(gRNAs)有助于Cas蛋白识别并切割外源致病RNA。CRISPR-Cas9系统是目前在真核生物中使用较为广泛的基因编辑工具，能够准确高效的实现对靶向基因的编辑。与此同时，CRISPR-Cas9系统也被广泛应用于高通量药物靶点的筛选中。在高通量筛选应用中，针对多个靶向基因设计导向RNA序列(sgRNAs)，运用酶切连接的方式将其插入表达载体后，形成sgRNAs质粒文库。该文库经慢病毒转染的方式成功整合到表达有Cas9的宿主细胞后，即可在宿主细胞内进行基因编辑，从而形成靶向基因功能缺失的细胞文库，可用于后续的药物靶点筛选。在该过程中，快速高效的构建可同时高效表达Cas9蛋白和sgRNAs的细胞文库以确保细胞编辑效率对于高通量筛选至关重要。
目前通常采用慢病毒侵染的方式构建Cas9蛋白/sgRNAs细胞文库，首先用慢病毒侵染的方式构建Cas9稳转细胞系，待Cas9蛋白在细胞内稳定表达后，筛选Cas9表达量较高且表达量均一的细胞进行大量扩增。待细胞数目扩增到足够量时，再运用慢病毒侵染的方式将sgRNAs导入Cas9稳定表达的细胞中，随着sgRNAs在细胞内的转录实现细胞文库的编辑。该方法可将Cas9/sgRNAs表达/转录元件随机插入宿主细胞基因组中，实现Cas9蛋白/sgRNAs的稳定表达/转录。但该方法构建细胞文库所需的细胞起始量大，细胞扩增所需时间长，不适用于原代细胞以及干细胞等细胞模型。
发明内容
为了解决现有技术中构建细胞文库所需的细胞起始量大，细胞扩增所需时间长等问题。本发明提供了一种高效构建细胞文库的电击转化方法。
本发明涉及：
1、一种高效构建细胞文库的方法，包括：
1)构建sgRNA表达细胞；和
2)将Cas9 mRNA通过电击转化导入所述sgRNA表达细胞中。
2、根据项1所述的方法，其中步骤1)中，通过病毒侵染方式构建sgRNA表达细胞。
3.根据项2所述的方法，其中所述病毒侵染方式中病毒感染复数不超过0.3。
4.根据项3所述的方法，其中所述病毒侵染方式中病毒感染复数为0.1-0.3。
5.根据项1-4任一项所述的方法，其中所述病毒为AVV或慢病毒。
6、根据项1-5任一项所述的方法，其中所述Cas9 mRNA与所述sgRNA表达细胞的比值为约1X106-1X107个细胞每1μg-120μg Cas9 mRNA，优选为约1X106-1X107个细胞每2μg-100μg Cas9 mRNA。
7、根据项1-6任一项所述的方法，其中当所述电击转化的细胞数为约1X106时，所述电击转化的电压为200-400V，时长为1ms，脉冲数为1个。
8、根据项1-6任一项所述的方法，其中当所述电击转化的细胞数为约1X107时，所述电击转化的电压为400-700V，时长为1ms，脉冲数为2个。
9、根据项7所述的方法，所述电击转化的电压为250-400V、300-400V、250-350V、250-300V或200-300V。
10、根据项8所述的方法，所述电击转化的电压为400-650V、400-600V、400-550V、400-500V、400-450V、450-700V、500-700V、550-700V或600-700V。
11.根据项1-10中任一项所述的方法制备的细胞文库。
12.包含项11所述的细胞文库的组合物。
13.包含项11所述的细胞文库或项12所述的组合物的试剂盒或制品。
上述“约”指数值范围可以上下浮动5％-10％以内的范围。
与现有技术相比，本发明方法通过改变构建细胞文库的方法及技术路线，最终形成一套能够快速高效构建细胞文库的方法，能够不受限于细胞起始量的限制，且能够显著缩短sgRNA细胞文库的构建时间，从而有效缩减人工成本和时间成本，并有效拓展细胞文库构建方法的适用范围。
附图说明
图1为sgRNA序列扩增反应程序；
图2为PA-1细胞文库sgRNA分布曲线；
图3为HCC1937细胞文库sgRNA分布曲线。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本发明，并非用于限制本发明。
除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但不用来限制本发明的范围。
目前，构建sgRNA表达的细胞文库(即将sgRNA质粒文库介导进入Cas9表达的细胞中)通常采用如下技术路径：首先，通过慢病毒侵染的方式构建Cas9稳转细胞系(通常为了监测Cas9蛋白在细胞中的表达，在载体构建时会在Cas9后融合表达一个标记蛋白，比如GFP或者mCherry等)，待Cas9蛋白得以稳定表达后，通过流式分选的方法得到表达量较高且表达较为均一的Cas9稳转细胞系。然后，运用慢病毒侵染的方式将sgRNA表达载体介导进入Cas9稳转细胞中，构建成为可编辑的sgRNA细胞文库，继而用于后续的细胞筛选中。该技术路径可以将关键元件Cas9蛋白和sgRNA的表达片段随机插入靶向基因的基因组中，实现关键元件的稳定表达，保障靶向细胞能够有效的进行编辑。但同时该技术路径所需的细胞起始量大，细胞文库构建时间长，且要求靶向细胞对于慢病毒侵染具有较为敏感的响应。因此，该方法并不适合细胞起始量有限、在体外培养时间较短的细胞，比如原代细胞或者干细胞等细胞模型。
本发明提供了一种高效构建细胞文库的电击转化方法。所述方法包括以下内容。
1)构建sgRNA表达细胞；和
2)将Cas9 mRNA通过电击转化导入所述sgRNA表达细胞中。
其中，sgRNA(sgRNAs)也称为单分子向导RNA，是CRISPR基因敲除敲入系统中重要的组成部分，是作用于动质体(kinetoplastid)体内一种称为RNA编辑(RNA editing)的后转录修饰过程中。也是一种小型非编码RNA。可与pre-mRNA配对，并在其中插入一些尿嘧啶(U)，产生具有作用的mRNA。向导RNA编辑的RNA分子，长度大约是60～80个核苷酸，是由单独的基因转录的，具有3'寡聚U的尾巴，中间有一段与被编辑mRNA精确互补的序列，5'端是一个锚定序列，它同非编辑的mRNA序列互补。
Cas9 mRNA是Cas9和mRNA的混合物，可以通过商购获得，也可以根据需要自行制备。
电击转化(electrotransformation),也有人称作高压电穿孔法(high-voltageelectroproration,简称电穿孔法electroproration),可用于将DNA导入真核细胞(如动物细胞和植物细胞)和原核细胞(转化大肠杆菌和其他细菌等)。电转化技术的主要优点在于:对于磷酸钙DNA共沉淀法以及其他技术难以转化的细胞，电穿孔法仍可适用。电转化的效率高，既可用于克隆化基因的瞬间表达，也可用于建立整合有外源基因的细胞系。
在一个具体的实施方式中，在步骤1)中，通过病毒侵染方式构建sgRNA表达细胞。进一步地，所述病毒侵染方式中病毒感染复数不超过0.3，例如可以为0.01、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3，优选地，所述病毒侵染方式中病毒感染复数为0.1-0.3。其中，病毒感染复数(multiplicity of infection，MOI)是指在一个系统中感染病毒的细胞数和总细胞数之比。
在一个具体的实施方式中，所述病毒为AVV或慢病毒。其中，AVV即腺相关病毒(adeno-associated virus),也称腺伴随病毒,属于微小病毒科依赖病毒属,是目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒，需要辅助病毒(通常为腺病毒)参与复制。它编码两个末端的反向重复序列(ITR)中的cap和rep基因。ITRs对于病毒的复制和包装具有决定性作用。cap基因编码病毒衣壳蛋白，rep基因参与病毒的复制和整合。AAV能感染多种细胞。rep基因产物存在时，病毒DNA很容易整合到人类第19号染色体。慢病毒(Lentiviruses)属于逆转录病毒科。慢病毒核蛋白质前整合复合物具有噬核特性，病毒基因组运输至细胞核，从而使慢病毒可以感染和在非有丝分裂细胞中复制。这一特性使慢病毒成为基因治疗的转移载体。
将Cas9 mRNA通过电击方法导入sgRNA表达细胞中时，需要控制Cas9mRNA与sgRNA表达细胞的比值。在一个具体的实施方式中，所述Cas9mRNA与所述sgRNA表达细胞的比值为约1X106-1X107个细胞每1μg-120μg Cas9 mRNA，例如约1X106个细胞每1μg Cas9 mRNA、约2X106个细胞每1μg Cas9 mRNA、约3X106个细胞每1μg Cas9 mRNA、约4X106个细胞每1μgCas9 mRNA、约5X106个细胞每1μg Cas9 mRNA、约6X106个细胞每1μg Cas9 mRNA、约7X106个细胞每1μg Cas9 mRNA、约8X106个细胞每1μg Cas9 mRNA、约9X106个细胞每1μg Cas9 mRNA、例如约10X106个细胞每1μg Cas9 mRNA、约1X106个细胞每120μg Cas9 mRNA、约10X106个细胞每120μg Cas9 mRNA，优选为约1X106-1X107个细胞每2μg-100μg Cas9 mRNA。
将Cas9 mRNA通过电击转化导入表达细胞时，电击转化的条件的控制至关重要。针对相同的细胞，不同的电击转化条件会对细胞活率、电转效率、编辑效率等产生影响。
在一个具体的实施方式中，当所述电击转化的细胞数为约1X106时，所述电击转化的电压为200-400V，例如可以为200V、250V、300V、350V、400V，时长为1ms，脉冲数为1个。
在一个具体的实施方式中，当所述电击转化的细胞数为约1X107时，所述电击转化的电压为400-700V，例如可以为400V、450V、500V、550V、600V、650V、700V，时长为1ms，脉冲数为2个。
本发明还提供上述方法制备的细胞文库。
本发明还提供包含上述细胞文库的组合物。
本发明还提供包含上述细胞文库或组合物的试剂盒或制品。
实施例
1.sgRNA表达细胞的构建
1.1在150mm的细胞培养皿中接种5X106个PA-1细胞或者HCC1937细胞，并且在PA-1细胞中加入18ml MEM基础培养基(Corning，#10-022-CV)和10％小牛血清(Biowest，#S1580)，在HCC1937细胞中加入18ml RPMI1640基础培养基(中科迈晨，#CM10040)和10％小牛血清后，5％CO2细胞培养箱中培养过夜。
1.2在细胞培养基中加入1‰聚凝胺(10μg/ml)，同时加入7.5μl(病毒加入量的计算公式如下)滴度为2.0X108 TU/ml的成药靶点相关基因的sgRNA病毒文库，该病毒文库中包含有关于2897个基因的共8828条sgRNAs(EdiGene，#HTSLV220206)，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养过夜。
在该公式中，为了尽量保证每个被侵染的细胞中有且只有一条sgRNA，病毒感染复数(MOI)控制在0.1-0.3之间，病毒滴度以实际检测得到的病毒滴度为准；
1.3病毒侵染过夜后，弃去原培养基，加入5ml pH7.4，1X PBS缓冲液(全式金，#FG701-01)进行清洗，弃去清洗用PBS之后，更换成新鲜的细胞培养基(细胞)，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养；
1.4细胞换液48h后，弃去原培养基，加入5ml PBS进行清洗后，弃去清洗用PBS之后，加入3ml胰酶，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中消化约5-10min后，加入5ml细胞培养基终止消化反应；
1.5用移液枪轻轻吹打细胞，将消化所得到的细胞悬液转移到一个新的15ml培养管中，在室温下200rpm离心5min；
1.6弃上清，用适量的细胞培养基重悬细胞后，进行细胞计数(个/ml)；
1.7将细胞重悬液重新进行铺板，每个细胞培养皿中接种5X106个病毒侵染后的细胞，另外接种同样细胞量的野生型细胞作为阴性对照，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养过夜；
1.8弃上清，用5ml PBS清洗细胞后，更换为含2-4mg/ml嘌呤霉素的细胞培养基，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养；
1.9换液48h后，阴性对照组中的细胞将全部死亡。此时，弃去病毒侵染后细胞组中的细胞培养基，加入5ml PBS进行清洗，弃去清洗后的PBS缓冲液，加入新鲜的细胞培养基，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中进行培养。待细胞状态恢复后，进行后续的实验操作。
2.Cas9 mRNA的电击转化
2.1在上述150mm细胞培养皿中加入3ml 0.25％1X胰酶-EDTA(Gibco，#25200072)，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中消化约5-10min后，加入5ml细胞培养基终止消化反应；
2.2用移液枪轻轻吹打细胞，将消化所得到的细胞悬液转移到一个新的15ml培养管中，在室温下200rpm离心5min；
2.3弃上清，加入5ml pH7.0-7.3，1X DPBS(Gibco，#14190250)后，轻轻地用移液器反复吹打，在室温下200rpm离心5min。弃上清，重复一次该清洗过程后，用适量opti-MEM重悬细胞，进行细胞计数(个/ml)；
2.4根据不同的样本分组需求，对上述细胞进行分组处理：
2.6.1阴性对照组：取1X106个细胞，用opti-MEM补液至100μl，用移液枪将其加入1mm间隙的电转杯(小试)或者5ml规格的电转杯(大试)中，按照设定的电转条件进行电转反应；
2.6.2 GFP mRNA实验组：取1X106个细胞，用opti-MEM补液至100μl，加入2μg GFPmRNA混匀后，用移液枪将其加入1mm间隙的电转杯中，按照设定的电转条件进行电转反应，其中GFP mRNA是运用体外转录试剂盒(NEB，#E2060S)，通过体外转录的方式得到的；
2.6.3 Cas9 mRNA实验组：取1X106个细胞，用opti-MEM补液至100μl，加入2μgCas9 mRNA(TriLink，#4464NT)混匀后，用移液枪将其加入1mm间隙的电转杯中，按照设定的电转条件进行电转反应；
2.7在6孔板中提前加入2ml新鲜的细胞培养基，待电转反应结束后，将细胞从电转杯中吸出6孔板中，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养；
2.8电转反应5天后，弃去6孔板中的细胞培养基，加入2ml PBS缓冲液清洗细胞。弃去PBS缓冲液，加入1ml胰酶，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中消化5-10min后，加入2ml细胞培养基终止消化；在室温下200rpm离心5min后，弃上清；
2.9根据不同的分析需求，对不同组别的样本进行处理：
2.9.1电转效率检测
2.9.1.1在阴性对照组和GFP mRNA实验组中各取1X104个细胞，用PBS将细胞重悬后，运用流式细胞分析仪的方法，以阴性对照组细胞画门，检测GFP表达细胞在实验组中的占比(％)；
2.9.2编辑效率检测
2.9.2.1在阴性对照组和Cas9 mRNA实验组中各取1X106个细胞，提取基因组，用于细胞编辑效率的检测；
2.9.2.2用200μl PBS缓冲液重悬细胞后，加入20μl蛋白酶K(600mAU/ml)；
2.9.2.3加入200μl AL缓冲液后，震荡混匀，置于56℃温浴10min；
2.9.2.4加入200μl乙醇后，震荡混匀，将其加入DNeasy Mini spin column(QIAGEN,#69504)中，置于2ml收集管中，室温下12,000rpm离心1min；
2.9.2.5弃去废液后，在DNeasy Mini spin column中加入500μl AW1缓冲液，室温下12,000rpm离心1min；
2.9.2.6弃去废液后，在DNeasy Mini spin column中加入500μl AW2缓冲液，室温下14,000rpm离心3min；
2.9.2.7弃去废液后，将DNeasy Mini spin column转移至一个新的2ml收集管中，在吸附膜上加入50-200μl去离子水，室温静置2min后，于12,000rpm离心1min；
2.9.2.8取1.5μl基因组提取物进行NanoDrop 2000(ThermoFisher)检测，得到基因组提取物的浓度；
2.9.2.9取200ng基因组提取物作为模板，按照表1所示将其与Q5高保真酶混合液(NEB；#M0492L)、10μM正向引物(SEQ ID NO:1：AGTCGCCAGGAATGTGGCTCTG；Invitrogen)、10μM反向引物(SEQ ID NO:2：TGATTTGCGCATCTCCAGAAAG；Invitrogen)和去离子水(Invitrogen，#10977015)进行混合加样。将该反应体系置于PCR扩增仪中，按照图1设定PCR反应程序，具体为：98℃30s，1个循环；98℃10s，60℃20s，72℃15s，20个循环；72℃10min，1个循环；4℃保存，进行PCR扩增反应。
表1 PCR扩增加样体系
2.9.2.10将PCR产物进行一代测序，运用分析网站对电击转化的细胞编辑效率进行分析(https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-analysis)；
3.运用电转方法构建细胞文库
3.1参照步骤1“sgRNA表达细胞的构建”中所描述的方法，运用sgRNA文库病毒侵染细胞，经嘌呤霉素筛选后，可表达sgRNA文库的细胞；
3.2运用步骤2“Cas9 mRNA的电击转化”所摸索的电转条件，将Cas9mRNA导入可表达sgRNA文库的细胞中；
3.3电转反应5天后，取细胞样本，按照2.9.2中所描述的方法进行基因组的提取；细胞样本取样量需根据sgRNA文库大小进行计算，通常细胞取样量为sgRNA文库中Oligos数目的500-1000倍；
3.4取1-2μg基因组提取物作为模板，按照表2所示将其与Q5High-Fidelity 2XMaster Mix(NEB；#M0492L)、10μM正向引物(SEQ ID NO:3：TATCTTGTGGAAAGGACGAAACACC，Invitrogen)、10μM反向引物(SEQ ID NO:4：AATACGGTTATCCACGCGGC，Invitrogen)和去离子水(Invitrogen，#10977015)。将该反应体系置于PCR扩增仪中按照图1设定PCR反应程序，具体为：98℃30s，1个循环；98℃10s，60℃20s，72℃15s，20个循环；72℃10min，1个循环；4℃保存，进行PCR扩增反应。
表2 PCR扩增加样体系
3.5针对稳定插入的sgRNA序列部分进行PCR扩增反应后，将PCR产物进行二代测序，通过生物信息学方法对文库中sgRNA的丢失情况以及分布情况进行分析，评估该方法在细胞文库构建中的可行性和可靠性。
研究结果：
运用电转方法构建细胞文库，需经历以下几个阶段：阶段一，运用单个sgRNA表达的细胞进行小体积电转，通过检测细胞活率、GFP表达细胞的比例和细胞编辑效率选择适宜的小体积电转条件。阶段二，在小体积电转条件的基础上，运用单个sgRNA表达的细胞进行大体积电转，通过检测细胞活率、GFP表达细胞的比例和细胞编辑效率选择适宜的大体积电转条件。阶段三，运用sgRNA文库表达的细胞，按照步骤二中确定的大体积电转条件进行细胞文库构建，通过评估细胞文库中sgRNA的丢失率以及sgRNA的分布情况，评估电击转化方法构建细胞文库的可行性和可靠性。
1.小体积电转条件的测试
在PA-1细胞系中稳定表达序列为CGTTTTCCTGCCTGAACACG(SEQ ID NO:7)的sgRNA，设定多种小体积电转条件(表3)对Cas9 mRNA进行电击转化反应。
表3小体积电转条件
结果显示，在PA-1细胞中，当电压从200V逐步上升至300V后，细胞活率从91％降低到76％，但电转效率从86％上升至97％，sgRNA在细胞中的编辑效率从49％上升至80％。另外，当电压在300V的基础上继续上调至400V之后，细胞活率从76％持续下降至53％。与此同时，如表4所示，电转效率基本维持在97％-98％，sgRNA在细胞中的编辑效率维持在79％-81％。由此得知，在一定的电转范围内，随着电压的提升，虽然细胞活率会有一定程度的下降，但是电转效率和sgRNA在细胞中的编辑效率也会呈现大幅度的提升。在这个范围内调整电转条件，以细胞活率的降低换取电转效率的提升是可取的。但是，在该范围之外继续升高电压，细胞活率呈现显著的下降趋势，但是电转效率和sgRNA在细胞内的编辑效率并未有明显的变化。因此，在这种情况下，提升电压并不可取。由此可见，如表4所示，当电转条件为300-400V，时长为1ms，脉冲数为1个时，细胞活率和电击转化效率以及sgRNA在细胞内的编辑效率能够达到较好的平衡，最佳的小体积电转条件是在保证细胞活率的同时，能够显著提升电转效率和sgRNA在细胞中的编辑效率，这样的电转条件会成为阶段二中设定大体积电转条件的基础和参考。
表4细胞系PA-1中小体积电转评估参数
2.大体积电转条件的测试
在PA-1细胞系中稳定表达序列为CGTTTTCCTGCCTGAACACG(SEQ ID NO:5)的sgRNA，参照阶段一中检测效果较好的小体积电转条件，设定多个大体积电转检测条件进行电击转化反应，具体的反应条件如表5所示。理论上来讲，电转反应的效果是由场强决定的。因此，若要大体积电转的场强与小体积电转的场强相同，其电压应为小体积电转的3倍。但是，在大体积电转的场景下，高电压会产生明显的放电现象，细胞在电转后基本全部死亡。在这种状况下，降低电压，增加脉冲数作为替代条件被应用于大体积电转条件的摸索中。结果显示，通过降低电压，增加脉冲数的做法，可以在提高细胞活率，产生高效的电转效率和sgRNA在细胞中的编辑效率。
表5大体积电转条件
在PA-1细胞中，当电压从400V上升至500V，脉冲数为2时，细胞活率没有显著变化，维持在96-97％，但是电转效率和编辑效率均显著上升。其中，电转效率从90％上升至97％，且编辑效率从59％上升至85％。但是，如表6所示，当电压继续上升，从500V上升至700V时，细胞活率开始下降，从96％下降至80％。与此同时，电转效率并未发生显著变化，维持在97％-98％，编辑效率稍有下降，从85％下降至81％。由此可见，就PA-1细胞系而言，可行的电转条件的范围是500-700V，时长1ms，脉冲数2个。其中，就PA-1细胞系而言，最佳的大体积电转条件是电压500V，时长1ms，脉冲数2个。
表6细胞系PA-1中大体积电转评估参数
3.运用电转方法构建细胞文库
在PA-1细胞系中稳定表达成药靶点相关基因的sgRNA文库，该文库包含2897个基因相关的8828条sgRNA。运用阶段二所确定的大体积电转最佳条件在上述表达sgRNA文库的细胞中电转介导Cas9 mRNA的表达后，通过文库中sgRNA的丢失个数以及sgRNA的分布情况，评估电转方法在文库构建方面的可行性和可靠性。
如表7所示，当平均测序深度为3064X时，运用电转方法得到的细胞文库中，sgRNA有7条未检测到，占文库中sgRNA总数的0.08％，但基因个数并未丢失。与此同时，如图2所示，sgRNA分布曲线中，90分位数与10分位数的比值为3.36，表明sgRNA的分布均一，文库质量良好。
表7 PA-1细胞文库质量评估参数
4.电转方法构建细胞文库在HCC1937细胞株上的应用
为了验证电转方法构建细胞文库流程的稳定性以及方法的可靠性，我们应用另一株贴壁细胞对该方法流程进行验证。
在小体积电转条件测试阶段，采用表3的条件，运用稳定表达sgRNA的细胞株HCC1937中进行多种电转条件的测试。结果显示，在HCC1937细胞株中，当电压从200V逐步上升至300V后，细胞活率从96％降低到81％，但电转效率从73％上升至95％，sgRNA在细胞中的编辑效率从50％上升至73％。另外，当电压在300V的基础上继续上调至400V之后，细胞活率从81％持续下降至60％。与此同时，如表8所示，电转效率基本维持在95％-97％，sgRNA在细胞中的编辑效率维持在73％-79％。因此，在细胞株HCC1937中，小体积电转可行的电转条件的范围是200-400V，时长1ms，脉冲数1个。其中，最佳条件为电压300V，时长1ms，脉冲1个。
表8细胞系HCC1937中小体积电转评估参数
如表5所示，以小体积电转结果为基础，在稳定表达sgRNA的细胞株HCC1937中对大体积电转条件进行测试。结果显示，在HCC1937细胞株中，当电压从400V上升至600V，时长为1ms，脉冲数为2时，细胞活率从98％降至90％，电转效率从92％升至96％，编辑效率从61％升至80％。但若电压从600V上升至700V后，细胞活率从90％下降至83％，而电转效率和编辑效率并未发生显著变化。如表9所示，电转效率维持在96％-97％，编辑效率维持在80％-81％。由此可见，就HCC1937细胞株而言，可行的电转条件的范围是400-700V，时长1ms，脉冲数2个。其中，最佳的大体积电转条件是电压600V，时长1ms，脉冲数2个。
表9细胞系HCC1937中大体积电转评估参数
运用阶段二所确定的大体积电转最佳条件，在可表达成药靶点相关基因的sgRNA文库中电转Cas9 mRNA后，通过文库中sgRNA的丢失个数以及sgRNA的分布情况，评估细胞文库质量。如表10显示，当平均测序深度为1000X时，运用电转方法得到的细胞文库中，sgRNA有10条未检测到，占文库中sgRNA总数的0.11％，但基因个数并未丢失。与此同时，如图3所示，sgRNA分布曲线中，90分位数与10分位数的比值为3.69，表明sgRNA的分布均一，文库质量良好。由此可见，运用电击转化的方法构建细胞文库的实验流程在不同的细胞株上可以得到稳定的重现。
表10 HCC1937细胞文库质量评估参数
使用本发明的方法构建细胞文库共分为三个阶段：阶段一，确定小体积电转的最佳条件；阶段二，基于阶段一摸索的电转条件确定大体积电转的最佳条件；阶段三，运用阶段二确定的电转条件构建细胞文库。在阶段一中，小体积电转的电压条件可在200-400V之间进行设定，最佳条件应在250-350V之间，电转时长为1ms，脉冲数为1个。在阶段二中，电压条件的设定应为小体积电转下电压的三倍，但是因为高电压条件下放电导致细胞活率极低，所以通过降低电压，增加脉冲数的方法进行大体积电转。大体积电转的电压条件可设定在400-700V之间，最佳条件为500-600V之间，电转时长为1ms，脉冲数为2个。
与现有技术相比，该方法首先运用慢病毒侵染的方式在野生型细胞中导入sgRNAs，运用可稳定表达sgRNA的细胞进行Cas9 mRNA电转后，即可在短时间内实现细胞文库的编辑。由于无需建立任何稳转的细胞系，因此减少了对细胞的淘汰。通过检测细胞文库中sgRNA的丢失数、基因丢失数以及sgRNA分布均一度等指标，得知该技术路径能够保证细胞文库的质量。由此可见，该技术路径可有效提高细胞利用率，细胞文库构建周期从原来的1-2个月缩短至15天，能够不受限于细胞起始量的限制，且能够显著缩短sgRNA细胞文库的构建时间，从而有效缩减人工成本和时间成本，并有效拓展细胞文库构建方法的适用范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 博雅缉因（北京）生物科技有限公司
<120> 一种高效构建细胞文库的电击转化方法
<130> PD01300
<150> CN201911394724.8
<151> 2019-12-30
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificial
<400> 1
agtcgccagg aatgtggctc tg 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificial
<400> 2
tgatttgcgc atctccagaa ag 22
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificial
<400> 3
tatcttgtgg aaaggacgaa acacc 25
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificial
<400> 4
aatacggtta tccacgcggc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> artificial
<400> 5
cgttttcctg cctgaacacg 20
Claims (10)
1.一种高效构建细胞文库的方法，包括：
1)构建sgRNA表达细胞；和
2)将Cas9 mRNA通过电击转化导入所述sgRNA表达细胞中。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤1)中，通过病毒侵染方式构建sgRNA表达细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述病毒侵染方式中病毒感染复数不超过0.3。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述病毒侵染方式中病毒感染复数为0.1-0.3。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述病毒为AVV病毒或慢病毒。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其中所述Cas9 mRNA与所述sgRNA表达细胞的比值为约1X106-1X107个细胞每1μg-120μg Cas9 mRNA，优选为约1X106-1X107个细胞每2μg-100μg Cas9 mRNA。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其中当所述电击转化的细胞数为约1X106时，所述电击转化的电压为200-400V，时长为1ms，脉冲数为1个。
8.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其中当所述电击转化的细胞数为约1X107时，所述电击转化的电压为400-700V，时长为1ms，脉冲数为2个。
9.根据权利要求7所述的方法，所述电击转化的电压为250-400V、300-400V、250-350V、250-300V或200-300V。
10.根据权利要求8所述的方法，所述电击转化的电压为400-650V、400-600V、400-550V、400-500V、400-450V、450-700V、500-700V、550-700V或600-700V。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2019113947248 | 2019-12-30 | ||
| CN201911394724 | 2019-12-30 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113122578A true CN113122578A (zh) | 2021-07-16 |
Family
ID=76772300
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202011601166.0A Pending CN113122578A (zh) | 2019-12-30 | 2020-12-29 | 一种高效构建细胞文库的电击转化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113122578A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113981547A (zh) * | 2021-11-12 | 2022-01-28 | 博雅缉因（北京）生物科技有限公司 | 一种高效构建sgRNAs质粒文库的方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103668472A (zh) * | 2013-12-31 | 2014-03-26 | 北京大学 | 利用CRISPR/Cas9系统构建真核基因敲除文库的方法 |
| CN106399377A (zh) * | 2016-09-07 | 2017-02-15 | 同济大学 | 一种基于CRISPR/Cas9高通量技术筛选药物靶点基因的方法 |
| CN110272875A (zh) * | 2019-07-09 | 2019-09-24 | 广州华腾生物医药科技有限公司 | 一种悬浮细胞kbm5高效基因编辑稳定细胞系的建立方法 |
-
2020
- 2020-12-29 CN CN202011601166.0A patent/CN113122578A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103668472A (zh) * | 2013-12-31 | 2014-03-26 | 北京大学 | 利用CRISPR/Cas9系统构建真核基因敲除文库的方法 |
| CN106399377A (zh) * | 2016-09-07 | 2017-02-15 | 同济大学 | 一种基于CRISPR/Cas9高通量技术筛选药物靶点基因的方法 |
| CN110272875A (zh) * | 2019-07-09 | 2019-09-24 | 广州华腾生物医药科技有限公司 | 一种悬浮细胞kbm5高效基因编辑稳定细胞系的建立方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| RAN ZHAO ET AL.: "CRISPR-Cas12a-Mediated Gene Deletion and Regulation in Clostridium ljungdahlii and Its Application in Carbon Flux Redirection in Synthesis Gas Fermentation", 《ACS SYNTH. BIOL.》 * |
| 肖斌 等: "基于Crispr/Cas9 技术构建真核细胞激酶敲除文库质粒", 《实用医学杂志》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113981547A (zh) * | 2021-11-12 | 2022-01-28 | 博雅缉因（北京）生物科技有限公司 | 一种高效构建sgRNAs质粒文库的方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Giuliano et al. | Generating single cell–derived knockout clones in mammalian cells with CRISPR/Cas9 | |
| Pardi et al. | In vitro transcription of long RNA containing modified nucleosides | |
| CN109563514B (zh) | 使用化学修饰的引导rna的高特异性基因组编辑 | |
| US20170044541A1 (en) | miRNAs Enhancing Cell Productivity | |
| EP3170893A1 (en) | Method for extracting differentiated cells | |
| CN108148866B (zh) | 一种hcbp6基因敲除细胞系及其构建方法 | |
| CN113122578A (zh) | 一种高效构建细胞文库的电击转化方法 | |
| Chen et al. | Construction and identification of a human liver specific microRNA eukaryotic expression vector | |
| CN104031916A (zh) | 新型RNAi前体及其制备和应用 | |
| Chen et al. | Study of circular RNA translation using reporter systems in living cells | |
| CN111808858B (zh) | 一种siRNA序列及其靶标在提高PEDV毒价中的应用 | |
| Tatomer et al. | RNAi screening to identify factors that control circular RNA localization | |
| CN108441496B (zh) | 一种抑制鸡SOX5基因表达的shRNA序列及其应用 | |
| Berkhout et al. | Design and Evaluation of Guide RNA Transcripts with a 3′-Terminal HDV Ribozyme to Enhance CRISPR-Based Gene Inactivation | |
| Chemello et al. | Isolation and transcriptomic profiling of single myofibers from mice | |
| CN116376978A (zh) | 一种基于核酶催化方式的mRNA环化和翻译方法 | |
| CN109507429A (zh) | 基于CRISPR/cas9和过氧化物酶APEX2系统识别分析特异性位点相互作用蛋白的方法 | |
| Hammack | A Simple Method to Generate Gene Knockout Clones in Human Cells Using Transcription Activator-Like Effector Nuclease (TALEN) | |
| Aherne et al. | Manipulating miRNA expression to uncover hidden functions | |
| Lu | Quantitative Analysis of Extracellular Vesicle Release Using Artificial MicroRNAs | |
| Diggins et al. | Techniques for Characterizing Cytomegalovirus-Encoded miRNAs | |
| CN113981547A (zh) | 一种高效构建sgRNAs质粒文库的方法 | |
| WO2011001965A1 (ja) | small RNA二本鎖およびヘアピン型RNAの設計方法 | |
| CN104560996B (zh) | 一种抑制小鼠GH基因表达的shRNA的载体及其应用 | |
| CN117487777A (zh) | 一种VI-J型CRISPR-Cas13基因编辑系统及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 40050634 Country of ref document: HK |
|
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20220706 Address after: 102206 2nd floor, building 2, No.22, kekeyuan Road, Changping District, Beijing Applicant after: Beijing Jiyin Medical Technology Co.,Ltd. Address before: 102206 2nd floor, building 2, No.22, kekeyuan Road, Changping District, Beijing Applicant before: EDIGENE BIOTECHNOLOGY Inc. |
|
| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210716 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |