CN113122521A - 具有脂肪酶活性的多肽及其用途 - Google Patents

Abstract

描述的是使用脂肪酶进行水解和酯化的方法。在通过水解生产中链脂肪酸的第一方法中，该方法包括提供与SEQ ID No.3具有至少90％相同性程度的多肽，并使多肽与中链脂肪酸酯和水接触以产生中链脂肪酸。在形成酯的第二方法中，该方法包括提供与SEQ ID No.3具有至少90％相同性程度的多肽；并使多肽与长链脂肪酸、醇和水接触以形成长链脂肪酸和醇的酯。

Description

具有脂肪酶活性的多肽及其用途

技术领域

本发明提供了具有脂肪酶活性的多肽、编码该多肽的多核苷酸、生产该多肽的方法以及该多肽的用途。

背景技术

脂肪酶广泛分布于植物、动物和微生物中。微生物脂肪酶由于其在宽范围的pH和温度下的活性以及来自一些微生物的脂肪酶的底物特异性而被广泛使用。

脂肪酶具有多种催化能力，用于将三酰甘油酯水解成甘油和游离脂肪酸、水解和/或酯交换酯，以及由甘油和游离脂肪酸合成酯。脂肪酶已广泛用于以下工业：食品加工、油加工、生物柴油生产、去垢剂制备、酯键化合物和手性药物的合成(Abhishek Kumar Singh，Mausumi Mukhopadhyay，Overview of Fungal Lipase:A Review，2012，166(2):486-520)等。在脂肪酶在化学工业中的应用中，八碳酸甲酯(methyl octanoate)(C8甲基酯)或十碳酸甲酯(methyl decanoate)(C10甲基酯)的水解、蓖麻油或氢化蓖麻油的水解、以及生物柴油的生产已经引起了很多关注和努力。然而，不同的脂肪酶对于不同的底物和/或反应可能具有不同的特异性和/或活性水平，因此通常无法预测脂肪酶的特异性或选择性。

用于八碳酸甲酯或十碳酸甲酯水解的最广泛使用的商业脂肪酶是衍生自米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)和南极假丝酵母(Candida Antarctica)的脂肪酶。然而，这些脂肪酶的高价格限制了这些酶促方法的工业应用。因此，对于脂肪酶在化学工业中的应用，诸如脂肪酶在脂肪酸甲基酯(诸如八碳酸甲酯或十碳酸甲酯)的水解中的工业应用，需要具有高酶活性和潜在更廉价价格的新脂肪酶。

用于生产生物柴油的最广泛使用的商业脂肪酶是来自Novozyme 435(来自南极假丝酵母)和Eversa Transform 2.0(来自疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)，以下简称Eversa)的脂肪酶。类似地，为了促进脂肪酶在生物柴油生产中的工业应用，需要具有高特异性酶活性和潜在更廉价的价格的新脂肪酶。

因此，目的是筛选和开发具有脂肪酶活性的新多肽。一些脂肪酶在催化八碳酸甲酯或十碳酸甲酯等的水解中或在催化生物柴油的生产中具有高效率以满足工业生产的需要。

发明内容

本文描述的是具有脂肪酶活性的分离的多肽、编码该多肽的分离的多核苷酸、生产该多肽的方法以及该多肽的用途或应用。

一些多肽具有对中链至短链脂肪酸酯的偏好，并且可以用于短链至中链脂肪酸酯(诸如C4-C12脂肪酸酯)的水解。更具体地，一些多肽用于催化八碳酸甲酯或十碳酸甲酯的水解。

所描述多肽中的一些在催化用于生产生物柴油的酯交换或酯化反应中是优异的。

在第一方面，提供了具有脂肪酶活性的分离的多肽，其选自：

1)具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽，

2)具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的氨基酸序列和用于促进所述SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的表达和纯化的序列的多肽，和

3)为1)或2)的任意多肽的片段或衍生物的多肽，其中所述片段或衍生物具有脂肪酶活性。

本发明的多肽还包括与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的多肽具有至少90％，优选至少95％，更优选至少98％，甚至更优选至少99％序列相同性的多肽。

SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:3的多肽可分别衍生自太瑞斯梭孢壳霉(Thielaviaterrestris)和龙眼焦腐病菌(Lasiodiplodia theobromae)。

在第二方面，提供了一种分离的多肽，其选自：

a)编码本发明多肽的多核苷酸；

b)与a)的多核苷酸互补的多核苷酸；和

c)含有10至40个碱基对的a)或b)的多核苷酸片段。

在一个或多个实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的核酸序列。

在一个或多个实施方案中，多核苷酸由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的核酸序列组成。

在一个或多个实施方案中，多核苷酸可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。

在第三方面，提供了核酸构建体，其包含本发明的多核苷酸。

在一个或多个实施方案中，所述核酸构建体包含编码本发明多肽的一个或多个多核苷酸，或与编码本发明多肽的多核苷酸互补的一个或多个多核苷酸。

在一个或多个实施方案中，所述核酸构建体包含选自SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的核酸序列，或其互补序列。

在一个或多个实施方案中，所述核酸构建体是载体，诸如克隆载体或表达载体。

在一个或多个实施方案中，所述核酸构建体包含AOX1启动子、信号肽α-因子、表达框His4和多克隆位点。

在一个或多个实施方案中，所述核酸构建体具有pPIC9K质粒作为其骨架。

在第四方面，提供了重组细胞或宿主细胞，其包含第三方面的核酸构建体。

在一个或多个实施方案中，所述重组细胞是植物细胞。

在一个或多个实施方案中，所述重组细胞是微生物细胞。

在一个或多个实施方案中，所述重组细胞是毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞或大肠杆菌(Escherichia coli)细胞。

在第五方面，提供了包含根据第一方面的具有脂肪酶活性的多肽、或根据第四方面的宿主细胞以及任选地包含赋形剂的组合物。

在一个或多个实施方案中，所述赋形剂是选自活性炭、铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等的吸附材料。

在第六方面，提供了一种生产脂肪酸，特别是中链脂肪酸的方法。该方法包括提供与SEQ ID No.3具有至少90％相同性程度的多肽；使多肽与脂肪酸酯(优选中链脂肪酸酯)和水接触以产生脂肪酸。优选地，所述多肽与SEQ ID No.3具有95％的相同性程度，更优选98％、99％或100％。

在一个或多个实施方案中，所述脂肪酸甲基酯是单酯。例如，其中中链脂肪酸酯是选自辛酸酯(caprylate ester)(八碳酸酯(octanoate ester))、癸酸酯(caprate ester)(十碳酸酯(decanoate ester))和月桂酸酯(十二碳酸酯)中的至少一种。优选地，所述酯为甲基酯(methyl ester)或乙基酯(ethyl ester)。例如，所述酯可以是八碳酸甲酯或十碳酸甲酯或其混合物。

接触步骤可以在以下条件之一下进行：

A)20℃和70℃，优选30℃和40℃的温度；

B)3和9，或5.5和9.0，或6.0和9.0的pH；

C)100毫巴和更低的压力。

在一个实施方案中，多肽以30ppm或更大的浓度(或剂量)存在。多肽可以单批次或多批次加入。

在一个实例中，所形成的产物可具有至少320的酸值(AV)。在另一个实例中，酸值为至少330。在另一个实例中，酸值为至少340。

在第七方面，提供了一种用于水解的反应混合物，其特征在于该反应混合物包含一种或多种脂肪酸酯、水和根据第一方面的多肽、根据第四方面的宿主细胞或根据第五方面的组合物。

在一个或多个实施方案中，多肽可以以30ppm或更大，或优选40ppm或更高的浓度存在。多肽可以以单剂量或多剂量加入。

1脂肪酶单位定义为在测试条件(pH 8.0和37℃)下每分钟释放1μmol脂肪酸的酶的量。用于单位活性计算的底物是三丁酸甘油酯(tributyrin)、月桂酸乙烯酯(vinyllaurate)或橄榄油。

在第八方面，提供了形成酯的方法，所述方法包括提供与SEQ ID No.3具有至少90％相同性程度的多肽；和使多肽与长链脂肪酸、醇和水接触以形成长链脂肪酸和醇的酯。优选地，所述多肽与SEQ ID No.3具有95％的相同性程度，更优选98％、99％或100％。

长链脂肪酸可以以油(特别是酸性油)、动物脂或棕榈游离脂肪酸馏出物(PFAD)提供。醇可以是C1-C4醇，例如甲醇或乙醇。C1-C4醇指具有一至四个碳原子(即C1术语指一个碳原子，如此等等)和至少一个羟基的化合物。多肽可是根据第一方面的，宿主细胞是根据第四方面的，或组合物是根据第五方面的。所述酯可用于生产生物柴油，所述方法包括使底物与根据第一方面的多肽、根据第四方面的宿主细胞或根据第五方面的组合物接触的一个或多个步骤。有利地，使用PFAD或酸性油(它们是通常丢弃的副产物)为该方法提供了更大的可持续性和效率。

在一个实施方案中，长链脂肪酸酯可用于接触步骤中。长链脂肪酸酯可有助于脂肪酸的溶解性。

在一个实施方案中，在接触步骤中可以使用碱。该碱可以有利地允许脂肪酸离子化并增加脂肪酶的活性。碱可以是无机碱、有机碱或聚合物支载体碱(polyer supportedbase)。可以使用的无机碱的实例包括氢氧化物，如氢氧化钠或氢氧化钾。

在一个实施方案中，相对于长链脂肪酸和任选地长链脂肪酯(如果存在的话)的重量，水以3至12重量％存在。

在一个实施方案中，多肽以至少20ppm的浓度存在。多肽可以以单剂量或多剂量加入。

在第九方面，提供了根据第一方面的分离的多肽、根据第四方面的重组细胞或根据第五方面的组合物在炼油、油脂化学(oleochemical)工业、化学工业、饲料生产、食品制备、药物制备、生物柴油制备或在脂肪酸甲基酯的水解中的应用。

进一步描述了用于脂质水解、酯的酯交换或酯的合成的方法，其涉及使用根据第一方面的分离的多肽、根据第四方面的重组细胞或根据第五方面的组合物。

进一步描述了根据第一方面的多肽在脂质诸如脂肪酸甲酯(八碳酸甲酯或十碳酸甲酯)、蓖麻油和氢化蓖麻油的水解以及生物柴油的生产中的应用。

附图说明

图1A示出了阳性转化株GS115(P9K-TTL)(左侧)与没有转化载体的对照GS115(右侧)的比较。清晰和钙沉积(即，阳性转化株GS115(P9K-TTL)周围的光环)显示该重组菌株具有脂肪酶活性。

图1B示出了阳性转化株GS115(P9K-LTL3)(标记为“LTL3”)(左侧)与没有转化载体的对照GS115(右侧)的比较。阳性转化株GS115(P9K-LTL3)周围的光环圈显示该重组菌株具有脂肪酶活性。

图2示出了TTL的底物特异性。用三丁酸甘油酯、高油酸向日葵油、橄榄油、月桂酸乙烯酯、甘油一丁酸酯(monobutyrin)和一油精(monoolein)测试TTL的初始水解活性。

图3示出了25℃至90℃之间的TTL活性。

图4示出了在3.7至10.0范围的不同pH条件的TTL的初始水解活性。

图5示出了LTL3的底物特异性。用三丁酸甘油酯、椰子油、月桂酸乙烯酯和橄榄油测试LTL3的初始水解活性。

图6示出了LTL3在20℃至100℃之间的活性。

图7示出了在3至10范围的不同pH条件的LTL3的初始水解活性。

图8示出了LTL3介导的生物柴油转化的TLC分析。

图9示出了pPIC9K质粒的限制酶切图谱。

图10示出了用于水解C8C10酯的各种酶的比较。

图11示出了在不同真空强度的酸值的图表。

具体实施方式

除非另外定义或上下文另外明确指出，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可以使用与在此描述的那些类似或等价的任何方法和材料，但是现在描述优选的方法和材料。

在公开组合的情况下，该组合的元素的每个子组合也被具体公开并且在本发明的范围内。反之，在公开了不同的元素或元素组的情况下，也公开了它们的组合。在本发明的任何元素被公开为具有多个替代物的情况下，在此也公开了本发明的实例(其中每个替代物单独地或以与其他替代物的任何组合被排除)；本发明的多于一个元素可以具有这样的排除，并且具有这样的排除的元素的所有组合由此被公开。

在对值的范围进行列举的情况下，应理解，还具体公开了介于所述范围的上限与下限之间的每个居间的整数值及其每个分数，以及此类值之间的每个子范围。任何范围的上限和下限都能够独立地包括在该范围之内或排除于该范围之外，并且每个其中包括任一个、零个或两个界限的范围也包括在本发明之内。当讨论的值具有固有极限时，例如当组分可以以0至100％的浓度存在时，或当水溶液的pH可以为1至14的范围时，具体公开了这些固有极限。在明确叙述一个值时，应理解与所叙述的值大约相同数量或量的值也在发明的范围内，基于该值的范围也在发明的范围内。

词语“基本上”不排除“完全”，例如“基本上不含”Y的组合物可以完全不含Y。必要时，词语“基本上”可以从本发明的定义中省略。

尽管这些术语中的每一个具有不同的含义，但是术语“包含”，“由……组成”和“基本上由……组成”可以在整个本申请中彼此互换。术语“具有”具有与“包含”相同的含义，并且可以用术语“由…组成”或“基本上由…组成”代替。

术语“相应mRNA”是指用于产生本发明的cDNA的cDNA合成模板的mRNA或者可以是用于产生本发明的cDNA的cDNA合成模板的mRNA。

术语“相应基因组DNA”是指编码感兴趣的mRNA的基因组DNA(例如相应于本发明的cDNA)，该基因组DNA包括mRNA的链之一的序列，其中基因组DNA(或cDNA)序列中的胸腺嘧啶残基被mRNA中的尿嘧啶残基替代。

关于分子的术语“分离的”要求分子从其原始环境(例如，天然环境，如果它是天然存在的)中移走。例如，存在于活动物中的天然存在的多核苷酸或多肽是未分离的，但与天然系统中的一些或全部共存物质分开的相同多核苷酸或DNA或多肽是分离的。这样的多核苷酸可以是载体的一部分和/或这样的多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，并且仍然是分离的，因为载体或组合物不是其天然环境的一部分。例如，存在于活动物中的天然存在的多核苷酸是未分离的，但与天然系统中的一些或全部共存物质分开的相同多核苷酸是分离的。从“分离的”的定义中特别排除的是：以体外核酸制备物或以转染/转化的宿主细胞制备物存在的天然存在的染色体(诸如染色体铺展)、人工染色体文库、基因组文库和cDNA文库，其中宿主细胞是体外异源制备物或作为单一菌落的异源群体而铺板培养。还特别排除的是上述文库，其中指定的多核苷酸占载体分子中核酸插入物数目的小于5％(也可以指定为10％、25％、50％或75％)。进一步特别排除的是全细胞基因组DNA或全细胞RNA制备物(包括所述全细胞制备物，其被机械剪切或酶促消化)。进一步特别排除的是以体外制备物或以通过电泳(包括其印迹转移)分开的异质混合物的上述全细胞制备物，其中本发明的多核苷酸没有进一步与电泳介质中的异源多核苷酸分开(例如，通过从琼脂糖凝胶或尼龙印迹中的异质条带群切除单个条带来进一步分开)。

术语“纯化的”不要求绝对纯度；相反，其旨在作为相对定义。明确设想将起始材料或天然材料纯化到至少一个数量级，优选两个或三个数量级，更优选四个或五个数量级。术语“纯化的”在本文中进一步用于描述已经与其它化合物分开的本发明的多肽或多核苷酸，所述其它化合物包括但不限于多肽或多核苷酸、碳水化合物、脂质等。术语“纯化的”可用于指定本发明的单体多肽与寡聚形式(诸如同-或异二聚体、三聚体等)的分开。术语“纯化的”也可用于指定共价闭合的(即环状)多核苷酸与线性多核苷酸的分开。基本上纯的多肽或多核苷酸通常分别包含约50％，优选60至90％重量/重量的多肽或多核苷酸样品，更通常为约95％，并且优选超过约99％纯，但是可以指定为50到100之间的任何整数百分比。多肽和多核苷酸的纯度或均一性可通过本领域熟知的多种方法来指示，诸如对样品进行琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后在染色凝胶时观察单一条带。为了某些目的，可以通过使用HPLC或本领域熟知的其它手段提供更高的解析。作为可选的实施方案，本发明的多肽和多核苷酸的纯化可以表示为相对于异源多肽和多核苷酸(DNA、RNA或两者)的“至少”百分比纯度。作为一个优选的实施方案，本发明的多肽和多核苷酸相对于异源多肽和多核苷酸分别为至少：10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、96％、98％、99％或100％纯。作为进一步优选的实施方案，多肽和多核苷酸具有相对于异源多肽和多核苷酸分别为90％和100％范围之间的任何数目(精确至千分位)的纯度(例如，至少99.995％纯的多肽或多核苷酸)，或者相对于除了载体中存在的化合物和分子以外的所有化合物和分子的以重量/重量比率形式的纯度。表示纯度百分比的每个数目(精确至千分位)可以被认为是单独的纯度种类。

如在本文可互换使用的，术语“(一个或多个)核酸分子”、“(一个或多个)寡核苷酸”和“(一个或多个)多核苷酸”包括单链或双链形式的多于一个核苷酸的RNA或DNA(单链或双链的、编码的、互补的或反义的)、或RNA/DNA杂合序列(尽管以上种类中的每一个可以是特别指定的)。术语“核苷酸”在本文中用作形容词以描述包含单链或双链形式的任何长度的RNA、DNA或RNA/DNA杂合序列的分子。更准确地说，表述“核苷酸序列”包括核酸物质本身，并且因此不限于在生物化学上表征特定DNA或RNA分子的序列信息(即选自四个碱基字母的一连串字母)。术语“核苷酸”在本文中也用作名词以指代单个核苷酸或各种核苷酸，意指分子或较大核酸分子中的单个单元，其包含嘌呤或嘧啶、核糖或脱氧核糖糖部分和磷酸基团，或在寡核苷酸或多核苷酸内的核苷酸的情况下的磷酸二酯键。术语“核苷酸”在本文中还用于涵盖“修饰的核苷酸”，该修饰的核苷酸包含至少一个修饰，诸如(a)替代的连接基团，(b)嘌呤的类似形式，(c)嘧啶的类似形式，或(d)类似的糖。对于类似的连接基团、嘌呤、嘧啶和糖的实例，参见例如PCT公开No.WO95/04064，其公开内容通过引用整体并入本文。本发明的优选修饰包括但不限于：5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤(xantine)、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿核苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基鸟苷(beta-D-galactosylqueosine)、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基鸟苷(beta-D-mannosylqueosine)、5′-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、uracil-5-oxyacetic acid(v)ybutoxosine、假尿嘧啶、鸟苷(queosine)、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶和2,6-二氨基嘌呤。本发明的多核苷酸序列可以通过任何已知的方法(包括合成、重组、体外产生或其组合)以及使用本领域已知的任何纯化方法来制备。亚甲基甲基亚氨基连接的寡核苷酸以及具有的混合的骨架化合物可以按美国专利号5,378,825；5,386,023；5,489,677；5,602,240；和5,610,289(其公开内容通过引用整体并入本文)中所述来制备。formacetal和thioformacetal连接的寡核苷酸可以按美国专利号5,264,562和5,264,564(其公开内容通过引用整体并入本文)中所述来制备。环氧乙烷连接的寡核苷酸可以按美国专利号5,223,618(公开内容通过引用整体并入本文)中所述来制备。次磷酸酯寡核苷酸可以按美国专利号5,508,270(其公开内容通过引用整体并入本文)中所述来制备。烷基膦酸酯寡核苷酸可以按美国专利号4,469,863(其公开内容通过引用整体并入本文)中所述来制备。3′-脱氧-3′-亚甲基膦酸酯寡核苷酸可以按美国专利号5,610,289或5,625,050(其公开内容通过引用整体并入本文)中所述来制备。亚磷酰胺寡核苷酸可以按美国专利号5,256,775或美国专利号5,366,878(其公开内容通过引用整体并入本文)中所述来制备。烷基硫代膦酸酯寡核苷酸可以按公开的PCT申请WO 94/17093和WO 94/02499(其公开内容通过引用整体并入本文)中所述来制备。3′-脱氧-3′-氨基氨基磷酸酯寡核苷酸可以按美国专利号5,476,925(其公开内容通过引用整体并入本文)中所述来制备。磷酸三酯寡核苷酸可以按美国专利号5,023,243(其公开内容通过引用整体并入本文)中所述来制备。硼烷磷酸酯(boranophosphate)寡核苷酸可以按美国专利号5,130,302和5,177,198(其公开内容通过引用整体并入本文)中所述来制备。

本文可互换使用的术语“多肽”和“蛋白质”是指氨基酸的聚合物，而与聚合物的长度无关；因此，肽、寡肽和蛋白质包括在多肽的定义内。该术语也不指定或排除本发明多肽的化学或表达后修饰，尽管这些多肽的化学或表达后修饰可作为具体实施方案被包括或排除。因此，例如，术语多肽明确地包括对多肽的修饰，包括糖基、乙酰基、磷酸基、脂类基团等的共价连接。此外，具有这些修饰的多肽可以被指定为本发明所包括或排除的单个物种。天然或其它化学修饰(诸如上述实例中列出的那些)可以出现在多肽的任何地方，包括肽骨架、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。可以理解同样类型的修饰可以相同或不同程度地存在于给定多肽的多个位点。同样地，给定多肽可含有很多类型的修饰。多肽可以是分枝的，例如，由于遍在蛋白化作用，并且它们可以是分枝或不分枝的环状。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸酯的形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚定物形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒基化、硫酸化、转移-RNA介导的将氨基酸添加到蛋白质上诸如精氨酰化和泛素化。[参见例如Creighton,(1993),Posttranslational CovalentModification of Proteins,W.H.Freeman and Company,New York B.C.Johnson,Ed.,Academic Press,New York 1-12；Seifter,et al.,(1990)Meth Enzymol 182:626-646；Rattan et al.,(1992)Ann NY Acad Sci 663:48-62]。在该定义中还包括含有一个或多个氨基酸类似物(包括，例如，非天然存在的氨基酸、仅在不相关的生物系统中天然存在的氨基酸、来自哺乳动物系统的修饰的氨基酸等)的多肽、具有取代连接的多肽，以及天然存在和非天然存在的本领域已知的其它修饰。

如本文所用，术语“重组多核苷酸”和“多核苷酸构建体”可互换使用，以指代已经人工设计并且包含至少两个在其原始天然环境中不作为邻接核苷酸序列发现的核苷酸序列的线性或环状、纯化的或分离的多核苷酸。特别地，这些术语意指多核苷酸或cDNA与“骨架”核酸相邻，该多核苷酸或cDNA在其天然环境中不与“骨架”核酸相邻。另外，为了“富集”，cDNA将占核酸骨架分子群中核酸插入物数量的5％或更多。根据本发明的骨架分子包括核酸，诸如表达载体、自我复制核酸、病毒、整合核酸，以及用于维持或操纵感兴趣的核酸插入物的其它载体或核酸。优选地，富集的cDNA占重组骨架分子群中核酸插入物数量的15％或更多。更优选地，富集的cDNA占重组骨架分子群中核酸插入物数量的50％或更多。在一个高度优选的实施方案中，富集的cDNA占重组骨架分子群中核酸插入物数量的90％或更多(包括90到100％之间的精确至千分位的任何数目，例如99.5％)。

术语“相同性程度”，“序列相同性百分比”和“同源性百分比”在本文中可互换使用，以指代多核苷酸和多肽之间的比较，并且通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列来确定，其中所述多核苷酸或多肽序列在比较窗口中的部分与用于两个序列的最佳比的参考序列(其不包含添加或缺失)相比可包含添加或缺失(即，缺口)。通过确定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中位置的总数目并将结果乘以100以得到序列相同性的百分比来计算百分比。使用任何本领域已知的各种序列比较算法和程序来评价相同性。这些算法和程序包括但绝不限于TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTA、CLUSTAL W、FASTDB[Pearson and Lipman,(1988),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(8):2444-2448；Altschul et al.,(1990),J.Mol.Biol.215(3):403-410；Thompson et al.(1994),Nucleic Acids Res.22(2):4673-4680；Higginset al.,(1996),Meth.Enzymol.266:383-402；Altschul et al.,(1993),Nature Genetics3:266-272；Brutlag et al.(1990)Comp.App.Biosci.6:237-24]，其公开内容通过引用整体并入本文。

具有脂肪酶活性的多肽

已经发现具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的氨基酸序列的多肽具有脂肪酶活性。可以通过用相似氨基酸或相似性质的氨基酸保守取代一个或多个氨基酸来修饰多肽。保守性取代通常不改变蛋白质或多肽的性质。“相似氨基酸或相似性质的氨基酸”意指具有相似侧链的氨基酸残基家族。具有相似侧链的氨基酸残基例如是具有碱性侧链的氨基酸(诸如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(诸如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电极性侧链的氨基酸(诸如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(诸如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸缬氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(诸如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳族侧链的氨基酸(诸如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。用来自相同家族的氨基酸残基取代多肽的一个或多个位点将基本上不影响多肽或蛋白质的活性。

多肽可以衍生自从SEQ ID NO:1(TTL)或SEQ ID NO:3(LTL3)取代、缺失或添加一个或多个氨基酸，同时保持原始多肽的脂肪酶活性。这些修饰可以多达原始序列的序列相同性的10％，因此提供与SEQ ID No.1或SEQ ID No.3具有至少90％相同性程度的多肽。在一个实例中，“更多”意指小于10，优选地小于8，并且甚至更优选地小于5。

考虑到序列及其生物学功能，可通过使用常规技术来测定SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:3序列中的氨基酸残基哪个可被取代或缺失。例如，通过比对来自不同物种但具有相同、相似或明显不同活性的序列，可以确定这些序列中的哪些氨基酸残基可以被取代或缺失。然后可以通过本领域的常规方法(包括本发明公开的方法)验证修饰后的序列的活性。

此外，通常需要在基因克隆操作中设计合适的切割位点，其在所表达的蛋白质的末端引入一个或多个其它残基，诸如用于限制性内切核酸酶识别的残基。通常还需要向蛋白质的N-末端、C-末端或其它合适的区域添加一些氨基酸，用于构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得从宿主细胞自动分泌的重组蛋白、或纯化重组蛋白。该蛋白的合适区域包括但不限于合适的接头肽、信号肽、原区肽、前导肽、末端延伸、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白、蛋白A、Xa因子或凝血酶或肠激酶的蛋白水解酶位点。氨基酸序列的氨基末端(N-末端)或羧基末端(C-末端)也可以含有一个或多个多肽片段作为蛋白质标签。可使用任何合适的标记。例如，标签可以是FLAG、HA、HA1、c-Myc、聚组氨酸(Poly-His)、聚精氨酸(Poly-Arg)、Strep-TagII、AU1、EE、T7、4A6、ε、B、gE和Ty1。这些标签可用于蛋白质纯化。应当理解，这些标签和标记不影响所得多肽的活性。因此，可以通过在SEQ ID No.1或SEQ IDNo.3的多肽的C-末端和/或N-末端处添加一个或几个氨基酸来获得多肽，并且该多肽仍然保持脂肪酶活性。

多肽可以具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的多肽具有至少90％，优选至少95％，更优选至少98％，甚至更优选至少99％的相同性程度的氨基酸序列，其具有脂肪酶活性。两个序列的序列相同性可以使用常规手段计算，例如NCBI上的BLAST或使用默认参数的比对。

在一些实施方案中，这些氨基酸序列来自太瑞斯梭孢壳霉或龙眼焦腐病菌，优选地，这些氨基酸序列的多肽具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的多肽的活性相同或相似的脂肪酶活性。

在一些实施方案中，所述多肽是具有底物特异性的脂肪酶。在一些实施方案中，所述多肽在一些底物上具有高水解效率。在一些实施方案中，多肽具有20到70℃，优选30℃到50℃，更优选35℃到45℃或40℃到50℃之间(包括两个端点)的最适工作温度。在一些实施方案中，多肽的最适pH在5.5到9之间，优选在6.5到7.5之间，包括两个端点。在一些实施方案中，多肽的酶活性可以通过金属离子抑制或增强。在一些实施方案中，多肽可以具有与一些市售酶相似水平的水解活性。在一些实施方案中，多肽可用于水解脂肪酸甲基酯，诸如具有短链至中链(C4～C12)脂肪酸残基的脂肪酸甲基酯，实例包括八碳酸甲酯或十碳酸甲酯。

在一些实施方案中，所述多肽在生物柴油的生产中可以具有高效率。在一些实施方案中，多肽可以具有20℃到60℃之间，优选30℃到50℃之间，更优选35℃到45℃之间或40℃到50℃之间(包括两个端点)的最适工作温度。在一些实施方案中，多肽的最适pH可以在5.5到9.0之间，优选在6.5到7.5之间，包括两个端点。在一些实施方案中，多肽的酶活性可以通过金属离子抑制或增强。在一些实施方案中，多肽可以具有与一些市售酶相似水平的合成活性。在一些实施方案中，多肽可用于各种底物的酯交换或酯化以生产作为生物柴油的脂肪酸甲酯/乙酯，特别是用于由棕榈游离脂肪酸馏出物(PFAD)、混合的植物酸油、用过的烹饪油、动物脂、粗棕榈油、植物油和甲醇或乙醇来制备生物柴油。

在一些实施方案中，根据所使用的宿主细胞，多肽可以是糖基化或未糖基化的。

在一些实施方案中，多肽可以是天然纯化的，通过化学手段合成的，或通过重组基因技术由原核或真核宿主诸如细菌、酵母、植物或哺乳动物细胞产生的。

编码本发明多肽的多核苷酸

还描述了多核苷酸，该多核苷酸是编码多肽的编码序列。SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:4及其子序列是此类多核苷酸的实例。“编码序列”意指与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4高度同源，或在高严格条件下与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4杂交的核苷酸序列，或属于与上述核苷酸序列高度同源的家族的基因分子。编码所述多肽的核苷酸序列可与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示的编码区序列、或其片段、或其编码所述多肽但在一些位点具有不同核苷酸的变体相同。“简并变体”是指编码包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的氨基酸序列，但与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:42的核苷酸序列相比具有简并性的核苷酸序列。

多肽的编码序列可以是编码成熟多肽的序列、编码成熟多肽和各种额外的编码序列的序列、编码成熟多肽(和任选地额外的编码序列)和非编码序列的序列。

多肽或其片段的编码序列可通过PCR、重组技术或人工合成获得。关于PCR，基因组可以从原始微生物(诸如太瑞斯梭孢壳霉、龙眼焦腐病菌)获得，然后可以根据所述多核苷酸的核苷酸序列设计探针，以从基因组DNA中扩增脂肪酶基因。

还描述了上述多核苷酸的片段，所述片段通常包含10至40个，或优选15至30个碱基，并且可以用作引物或探针。本文的“片段”是指编码序列的连续部分。

核酸构建体

核酸构建体(其可以是单链或双链的)可以含有多核苷酸的编码序列并且与一个或多个控制序列可操作地连接，使得控制序列指导编码序列在合适的条件下在宿主细胞中的表达以提供SEQ ID No.1或3的多肽。可以以各种方式修饰多核苷酸或编码序列以保证多肽的表达。根据表达质粒或载体的特征，可能需要或必需在插入核酸构建体之前对多核苷酸进行修饰。核苷酸序列可通过使用重组DNA技术修饰。

控制序列可以是合适的启动子，该启动子是用于将多核苷酸表达为多肽并且被宿主细胞识别的核苷酸序列。控制序列也可以是与多核苷酸的3’端连接的终止子的编码区。可以使用在所选宿主细胞中起作用的任何终止子。控制序列也可以是与多核苷酸5’端连接的合适前导肽(leader peptide)或前导肽(leading peptide)的编码区。可使用在所选宿主细胞中起作用的任何前导肽。控制序列可以是信号肽的编码区，该信号肽连接到多肽的氨基酸末端并指导多肽进入宿主细胞的分泌途径。用于基因操作和蛋白表达的各种控制序列及其在脂肪酶基因的重组表达中的用途是已知的。

也可以使用含有SEQ ID No.2或4的多核苷酸的克隆载体或表达载体。这些载体也可以含有上述控制序列。

表达质粒或表达载体可以是任何载体，诸如质粒或病毒，其可以通过重组DNA技术操作以引起感兴趣的核苷酸序列的表达。可以根据载体与宿主细胞(其将被该载体转化)的相容性选择载体。所述载体可以是线性或闭合的环状载体。表达载体优选含有允许载体整合到宿主细胞基因组中或允许载体独立于宿主细胞中的基因组而自主复制的组分。

表达载体可以含有一种或多种允许容易转化、转染、转导等的可选择标志物。可选择标志物是基因序列，其提供宿主细胞对抗生素或病毒的抗性、对重金属的抗性、从原养型到营养缺陷型的改变等。

表达载体可以含有人工序列，其含有多个限制性内切核酸酶识别位点，从而提供外源DNA的各种可插入位点和解决方案。表达载体可以含有编码促进蛋白质的提取和纯化的肽(诸如6His)的序列。

可以将多核苷酸的多于一个的拷贝插入宿主细胞中以增加多核苷酸产物的产量。多核苷酸拷贝数的增加可以通过将序列的至少一个额外拷贝整合到宿主细胞基因组中或通过包括可扩增的可选择标志物基因和多核苷酸来实现，并且可以通过在合适的选择剂存在下培养细胞来筛选包含额外的多核苷酸拷贝的细胞。

在一些实施方案中，表达载体可用于在大肠杆菌(E.coli)中表达多肽。因此，在一些实施方案中，表达载体含有启动子AOX1、信号肽α-因子、表达框His4、终止子AOX1和/或多克隆位点。优选地，核酸构建体或表达载体具有pPIC9K质粒作为骨架。

重组宿主细胞

可以使用用于生产多肽的含有本发明的多核苷酸的重组宿主细胞。将含有多核苷酸的载体导入宿主细胞，使得该载体成为染色体的组分，或者如前所述自主地自我复制。主要根据编码多肽的基因及其来源来选择宿主细胞。

宿主细胞可以是植物细胞、单细胞微生物或非单细胞微生物。单细胞微生物可以是诸如革兰氏阳性菌，包括但不限于芽孢杆菌属(Bacillus)，例如嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)和苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)；或者链霉菌属(Streptomyces)，诸如青紫链霉菌(Streptomyceslividans)；或革兰氏阴性菌，诸如大肠杆菌和假单胞菌(Pseudomonas)。优选地，细菌宿主细胞是枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或大肠杆菌。

本发明的宿主细胞可以是真核细胞，诸如哺乳动物、昆虫、植物、酵母或真菌细胞。优选地，宿主细胞是真菌细胞。如本文所用，“真菌”或“真菌的”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、接合菌门(Zygomycota)和卵菌纲(Oomycete)。

或者，宿主细胞可以是原核细胞。如本文所用，“原核细胞”包括假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、肠杆菌属(Enterobacter)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链霉菌属(Streptomyces)和埃希氏菌属(Escherichia)的细胞。宿主细胞可以是假单胞菌属、芽孢杆菌属、链霉菌属和埃希氏菌属的细胞。实例包括枯草芽孢杆菌、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、毕赤酵母、大肠杆菌和青紫链霉菌等。优选地，宿主细胞是大肠杆菌或毕赤酵母的细胞。

可通过常规转染或转化方法将包含SEQ ID No.2或4的多核苷酸序列的核酸构建体转化到宿主细胞中。转染方法通常包括瞬时转染和稳定转染。用于转染的技术包括化学转染(诸如DEAE-葡聚糖法、磷酸钙法和人工脂质体法)和物理转染(诸如显微注射、电穿孔和基因枪)。

应用

SEQ ID No.1或3的多肽可用于食品工业、制药工业、化学工业等。具体地，所述多肽可用于油或脂肪的水解以及酯交换或酯化反应以产生脂肪酸甲基/乙基酯。该多肽可用于乳制品中的乳脂的水解，以增强奶酪、奶粉和奶油的风味，促进奶酪的成熟，并改善乳制品的质量；可用于面团，以改善产品的弹性、食物的感官和面包的新鲜度等。该多肽可用于化学工业中脂肪酸甲基酯(诸如八碳酸甲酯或十碳酸甲酯)的水解，用于生产脂肪酸；可以添加到去垢剂中用于去除油污、常规清洁，漂白等；可以用于工业废料的清洁或有机废料的降解；可以添加到各种底物中用于生产脂肪酸甲基/乙基酯(即生物柴油)等。

该多肽可用于脂肪酸甲基酯的水解，例如中链和短链脂肪酸甲酯的水解，特别是含有C4～C12链脂肪酸的脂肪酸甲基酯的水解，最优选八碳酸甲酯或十碳酸甲基酯的水解。用于上述各个领域中的本发明的多肽的量可以常规地确定，优选在每克油60至200微克、或更优选每克油80至120微克的范围内。

该多肽可用于生产生物柴油，例如将棕榈游离脂肪酸馏出物(PFAD)、混合的植物酸油、用过的烹饪油、动物脂、粗棕榈油、植物油转化为脂肪酸甲基酯或脂肪酸乙基酯。所使用的多肽的量可以为至少20ppm，优选至少50ppm。

多肽、编码序列或多核苷酸、核酸构建体和细胞可用于食品工业、医疗和健康工业、化学工业等。特别地，多肽、编码序列或多核苷酸、核酸构建体和细胞可用于脂肪酸酯的水解，诸如含有C4～C12链的脂肪酸甲基酯，尤其是八碳酸甲酯或十碳酸甲酯。特别地，多肽、编码序列或多核苷酸、核酸构建体和细胞可用于酯交换或酯化反应中以获得用于生产生物柴油的脂肪酸甲基/乙基酯，例如底物可以是棕榈游离脂肪酸馏出物(PFAD)、混合的植物酸油、用过的烹饪油、动物脂、粗棕榈油、植物油等。

在一个实例中，组合物包含脂肪酸甲基酯、水、多肽或产生该多肽的细胞，或含有编码该多肽的多核苷酸的细胞。脂肪酸甲基酯可以是八碳酸甲酯或十碳酸甲酯，并且可以被多肽水解以产生脂肪酸。用于脂肪酸甲基酯的水解的多肽的量可以为至少30ppm，优选至少40ppm。

在另一个实例中，可以提供一种组合物，其包含油或PFAD、醇(特别是C1-C4醇如甲醇或乙醇)和多肽、或产生该多肽的细胞、或包含编码该多肽的多核苷酸的细胞。所述多肽可引起脂肪酸的酯化或酯交换，以提供可用作生物柴油的酯。用于将游离脂肪酸或甘油三酯转化为脂肪酸甲基/乙基酯的多肽的量可以为至少20ppm，优选至少50ppm。所用水的重量为油重量的3至12％，优选为4-8％，更优选为4-6％。

可以以纯酶制剂的形式或以组合物的形式提供多肽。所述组合物可以是粉末组合物、液体组合物或糊剂组合物。当以组合物的形式提供时，根据组合物的用途，组合物可以包含不同的赋形剂。可以将赋形剂添加到本发明的组合物中，包括但不限于以下稳定剂或其他组分中的一种或多种：山梨糖醇、山梨酸钾、苯甲酸甲酯、苯甲酸乙酯、蔗糖、甘露糖、海藻糖、淀粉、氯化钠、氯化钙等。

一种进行炼油、油脂化学反应、饲料改良、食品制备、药物制备的方法，其中该方法在以下条件下进行：a)在20℃到70℃，优选30℃至50℃，更优选35℃至45℃或40℃至50℃之间的温度，和/或b)3至9，优选5.5至9.0，优选6.5至7.5之间的pH，和/或c)一定量的多肽和水。

根据制造商推荐的条件或根据常规方法或条件(诸如Sambrook et al.,Molecular Cloning:A laboratory Guide(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所指定的)进行以下实施例中未指定的实验方法。关于试剂的用法和量，除非另有说明，否则采用常规用法和剂量。除非另有说明，百分比是指重量百分比。

实施例

材料和实验方法

菌株和质粒：

菌株：毕赤酵母GS115(Invitrogen，产品编号C181-00)、大肠杆菌DH5-α(NewEngland Biolabs，目录#C2987I)

质粒：pPIC9K(Invitrogen，产品编号V175-20)

培养基和溶液：

LB：10g/L胰蛋白胨(Sigma Aldrich)，5g/L酵母提取物(Sigma Aldrich)，10g/L氯化钠(Sigma Aldrich)

LB琼脂培养基：10g/L胰蛋白胨(Sigma Aldrich)，5g/L酵母提取物(SigmaAldrich)，10g/L氯化钠(Sigma Aldrich)，20g/L细菌培养用琼脂(Bactoagar)(SigmaAldrich)

YPD：20g/L蛋白胨(Sigma Aldrich)，20g/L D-葡萄糖(Sigma Aldrich)，10g/L酵母提取物(Sigma Aldrich)

YPD琼脂培养基：20g/L蛋白胨(Sigma Aldrich)，20g/L D-葡萄糖(SigmaAldrich)，10g/L酵母提取物(Sigma Aldrich)，20g/L细菌培养用琼脂(Sigma Aldrich)

RDB琼脂培养基(以下称为RDB)：1M山梨糖醇(Sigma Aldrich)，20g/L D-葡萄糖(Sigma Aldrich)，34g/L不含硫酸铵和氨基酸的酵母氮基(Sigma Aldrich)，100g/L硫酸铵(Alfar Aesar)，0.4mg/L生物素(Sigma Aldrich)，20g/L细菌培养用琼脂(SigmaAldrich)，50mg/L L-谷氨酸(Sigma Aldrich)，50mg/L L-甲硫氨酸(Sigma Aldrich)，50mg/L L-赖氨酸(Sigma Aldrich)，50mg/L L-亮氨酸(Sigma Aldrich)，50mg/L L-异亮氨酸(Sigma Aldrich)

BMGY：0.1M磷酸钾缓冲剂，pH 6.0(Merck)，34g/L不含硫酸铵和氨基酸的酵母氮基(Sigma Aldrich)，10g/L酵母提取物(Sigma Aldrich)，20g/L蛋白胨(Sigma Aldrich)，100g/L硫酸铵(Alfar Aesar)，0.4mg/L生物素(Sigma Aldrich)，1％v/v甘油(Fisher)

BMGY琼脂培养基：0.1M磷酸钾缓冲剂，pH 6.0(Merck)，34g/L不含硫酸铵和氨基酸的酵母氮基(Sigma Aldrich)，10g/L酵母提取物(Sigma Aldrich)，20g/L蛋白胨(SigmaAldrich)，100g/L硫酸铵(Alfar Aesar)，0.4mg/L生物素(Sigma Aldrich)，1％v/v甘油(Fisher)，20g/L细菌培养用琼脂(Sigma Aldrich)

BMMY：0.1M磷酸钾缓冲剂，pH 6.0(Merck)，34g/L不含硫酸铵和氨基酸的酵母氮基(Sigma Aldrich)，10g/L酵母提取物(Sigma Aldrich)，20g/L蛋白胨(Sigma Aldrich)，100g/L硫酸铵(Alfar Aesar)，0.4mg/L生物素(Sigma Aldrich)，1％v/v甲醇(Merck)

BMMY琼脂培养基：0.1M磷酸钾缓冲剂，pH 6.0(Merck)，34g/L不含硫酸铵和氨基酸的酵母氮基(Sigma Aldrich)，10g/L酵母提取物(Sigma Aldrich)，20g/L蛋白胨(SigmaAldrich)，100g/L硫酸铵(Alfar Aesar)，0.4mg/L生物素(Sigma Aldrich)，1％v/v甲醇(Merck)，20g/L细菌培养用琼脂(Sigma Aldrich)

发酵基础盐培养基(Fermentation Basal Salt Medium)：26.7mL/L 85％磷酸(Alfar Aesar)，0.93g/L硫酸钙(Alfar Aesar)，18.2g/L硫酸钾(Sigma Aldrich)，14.9g/L硫酸镁七水合物(Merck)，4.13g/L氢氧化钾(Sigma Aldrich)，40g/L甘油(VWR)

PTM微量盐(PTM Trace Salts)：6g/L硫酸铜(II)(Sigma Aldrich)，80mg/L碘化钠(Sigma Aldrich)，3g/L一水硫酸锰(Sigma Aldrich)，200mg/L二水合钼酸钠(SigmaAldrich)，20mg/L硼酸(Sigma Aldrich)，500mg/L氯化钴(Sigma Aldrich)，20g/L氯化锌(Sigma Aldrich)，65g/L七水合硫酸铁(II)(Merck)，200mg/L生物素，5mL/L硫酸(SigmaAldrich)

限制性内切核酸酶NotI、EcoRI、SalI和SnaB1的来源是经由Axil ScientificSingapore从New England Biolabs购买的。PCR聚合酶KOD热启动DNA聚合酶购自MerckSingapore。DNA连接酶T4 DNA连接酶和HiFi DNA Assembly是经由Axil ScientificSingapore从New England Biolabs购买的。商业脂肪酶疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyceslanuginosa)脂肪酶(TLL)、Eversa Trans 2.0、南极假丝酵母(Candida antartica)脂肪酶B(CalB)购自Sigma Aldrich。

酶活性的定义：水解反应中脂肪酶活性的单位(U)对应于在测试条件下每分钟释放1μmol游离脂肪酸的酶的量。

计算水解脂肪酶活性：单位/mL酶＝(滴定的NaOH的体积(mL)x使用的NaOH的摩尔浓度(M)x时间(min)x使用的酶的稀释系数x 1000)/使用的酶的体积(mL)

通过酯化的生物柴油生产中脂肪酶活性的单位(U)对应于在给定的实验条件下每分钟消耗的一微摩尔游离脂肪酸。

实施例1：重组pPIC9K质粒的构建

P9K-TTL的构建：TTL的多核苷酸(SEQ ID NO.:2)由Bio Basic Asia Pacific合成，并通过限制性内切核酸酶识别EcorI和AvrII在框内克隆到可商购pPIC9K载体中的α因子分泌，从而获得重组质粒P9K-TTL。基因的表达由AOX1启动子驱动，并由AOX1终止子终止。图9显示了可以使用的pPIC9K质粒的实例。

P9K-LTL3的构建：LTL3的多核苷酸(SEQ ID NO.:4)由Bio Basic Asia Pacific合成，并利用Gibson Assembly通过SnaB1限制性消化位点在框内克隆到可商购pPIC9K载体中的α因子分泌，从而获得重组质粒P9K-LTL3。基因的表达由AOX1启动子驱动，并由AOX1终止子终止。图9显示了可以使用的pPIC9K质粒的实例。

实施例2：重组菌株的构建和选择

毕赤酵母GS115菌株的感受态细胞是根据Wu等人的方案(Wu S.and LetchworthG.J.,Biotechniques,Vol.36,No.1,2018,DOI:10.2144/04361DD02)制备的。将8x 108个细胞重悬于100mM LiAc、10mM DTT、0.6M山梨糖醇和10mM Tris-HCl,pH 7.5中30分钟。用1M山梨糖醇洗涤细胞，并重悬于1M冰冷的山梨糖醇中至终浓度为1010个细胞/mL。分别使用300ng的P9K-LTL3和P9K-TTL转化毕赤酵母GS115。如Wu等人先前所述进行转化。

将转化株铺在RDB上并在30℃培养4天。将阳性克隆转移到BMGY琼脂上，并在30℃培养1天。然后将克隆转移至补充有1％三丁酸甘油酯(对于GS115(P9K-TTL))和2％三丁酸甘油酯(对于GS115(P9K-LTL3))的BMMY琼脂中，以GS115菌株作为对照，诱导4天，获得如图所示的平板：图1A示出了阳性转化株GS115(P9K-TTL)(左侧)与对照GS115(右侧)的比较。图1B示出了阳性转化株GS115(P9K-LTL3)(左侧)与对照GS115(右侧)的比较。

实施例3：脂肪酶在GS115中的重组表达和酶活性的初步测试

为了通过发酵进行TTL(SEQ ID No.1)和LTL3(SEQ ID No.3)脂肪酶表达，首先将GS115(P9K-TTL)和GS115(P9K-LTL3)在BMGY液体培养基中于30℃、220rpm在以20％烧瓶体积的摇瓶中预培养过夜。在达到2至6之间的OD600后，根据Invitrogen,Life Technologies的建议方案进行发酵。在补充有4.35mL/L PTM微量盐的发酵基础盐培养基中进行发酵，初始设置为30℃，pH 5.0、1500rpm，1L/L/min(或1vvm，容器体积/分钟)。首先在20到24小时内进行甘油分批阶段，其中溶解氧水平保持在20％以上，直到达到90至150g/L的湿细胞量。其次，在甘油补料分批阶段，将18.15mL/L/h恒定速率的补充有12mL/L PTM微量盐的50％v/v甘油进料到烧瓶中约4小时，直到达到180至220g/L的湿细胞量。最后，为了通过pPIC9K质粒上的AOX1启动子诱导蛋白质表达，以增量方式添加了补充有12mL/L PTM微量盐的甲醇。对于前四个小时，进料速度设置为3.6mL/L/h。接下来的两个小时，进料速度提高到7.3mL/L/h。最终进料速度设定为10.9mL/L/h直至发酵结束。通过以14 000离心20分钟收获含有分泌的TTL脂肪酶的培养上清液，并用0.22μm膜(Nalgene)过滤。

从培养上清液收获的分泌的脂肪酶的活性按如下所示进行计算。脂肪酶活性的单位(U)对应于在测试条件下每分钟释放1μmol游离脂肪酸的酶的量。

GS115(P9K-TTL)：通过在1L生物反应器中发酵获得蛋白质浓度为(0.616mg/ml)的400ml TTL(SEQ ID No.1)。使10μl的粗上清液与390μl的水和50μl的月桂酸乙烯酯(作为底物)在37℃、2000rpm反应15分钟。需要2.12ml的50mM NaOH来中和所释放的游离脂肪酸(对照：0.4ml)。因此，TTL对月桂酸乙烯酯的单位活性被确定为920U/ml。

GS115(P9K-LTL3)：在1L生物反应器中发酵获得0.551mg/mL的总蛋白质产量。使2μL粗LTL3(SEQ ID No.3)与138μL水、40μL 200mM Tris-HCl pH 7.2缓冲剂和120μL底物(三丁酸甘油酯、月桂酸乙烯酯或橄榄油)在2mL管(Eppendorf)中，在37℃、2000rpm反应30分钟。用50mM NaOH中和所释放的游离脂肪酸，单位活性分别被计算为333、3833和133U/mL。不添加酶的反应混合物用作对照。用牛血清白蛋白(Sigma Aldrich)作为标准品，用Bradford试剂(Sigma Aldrich)测量蛋白质浓度。

实施例4：脂肪酶的表征

1.TTL(SEQ ID No.1)的底物特异性

GS115(P9K-TTL)：在1.5mLEppendorf管中，使用实施例3中制备的1μL TTL、399μL磷酸盐缓冲盐水(PBS)和50μL底物进行水解。反应在37℃在热混合器上以2000rpm进行15分钟。图2中示出了TTL针对不同底物的单位活性：月桂酸乙烯酯(4322±214U)、一丁酸酯(422±69U)、一油精(656±102U)、三丁酸甘油酯(577±126U)、高油酸向日葵油(111±69U)和橄榄油(456±51U)。

2.TTL(SEQ ID No.1)的最适温度

GS115(P9K-TTL)：在1.5mL Eppendorf管中，使用1μL的TTL、399μL磷酸盐缓冲盐水(PBS)和50μL底物进行水解。反应在30-80℃的温度在热混合器上以2000rpm进行15分钟。然后通过将所指示温度的酶的活性标准化为37℃酶的活性来计算残余活性。TTL具有50℃的最适温度(如图3所示)。

3.TTL(SEQ ID No.1)的最适pH

GS115(P9K-TTL)：在1.5mL Eppendorf管中使用1μL的TTL、399μL pH范围为(3-10)的缓冲剂和50μL底物进行水解。反应在37℃在热混合器上以2000rpm进行15分钟。然后通过将所指示pH的酶的活性标准化为pH7.0时酶的活性来计算残余活性。TTL具有6至8的最适pH范围，其中最适值为7(如图4所示)。

4.LTL3(SEQ ID No.3)的底物特异性

GS115(P9K-LTL3)：在2mL Eppendorf管中使用2μL的LTL3、138μL水、40μL 0.2MTris-HCl缓冲剂(pH 7.2)和120μL的不同底物进行水解。反应在37℃在热混合器(Eppendorf)上以2000rpm进行15分钟。图5中示出了LTL3针对不同底物的单位活性：针对三丁酸甘油酯为494U/mg，针对月桂酸乙烯酯为5807U/mg，针对椰子油为181U/mg，针对橄榄油为121U/mg。可以看出，与短链(C4-C6脂肪酸)如丁酸酯和长链(大于14个碳原子)如一油精酯和橄榄油(其主要由油酸(C18)和棕榈酸(C16)和酯构成)相比，LTL3对中链脂肪酯和酸(如月桂酸乙烯酯)具有选择性。LTL3对单酯的选择性也可优于甘油三脂或二酰甘油酯(diacylglyceride)。

5.LTL3(SEQ ID No.3)的最适温度

GS115(P9K-LTL3)：在2mL Eppendorf管中使用2μL的LTL3、138μL水、40μL 0.2M柠檬酸钠-柠檬酸缓冲剂(pH 6.0)和120μL三丁酸甘油酯进行水解。该反应在20至100℃的温度在热混合器(Eppendorf)上以2000rpm进行15分钟。用50mM NaOH中和所释放的游离脂肪酸。从图6可以看出，LTL3在20至70℃的温度范围内显示出至少300U mg-1的酶活性。37至70℃的温度范围显示出更高的酶活性，尤其是在60至70℃的温度。

6.LTL3(SEQ ID No.3)的最适pH

GS115(P9K-LTL3)：在2mL Eppendorf管中使用2μL的LTL3、138μL水、40μL不同的pH3.0至10.0的0.2M缓冲剂和120μL的三丁酸甘油酯进行水解。反应在37℃在热混合器(Eppendorf)上以2000rpm进行15分钟。用50mM NaOH中和所释放的游离脂肪酸。从图7中可以看出，LTL3在3至9的pH值以高活性运作，特别地LTL3在5至6的pH值特别有活性。实施例5：通过TTL(SEQ ID No.1)和LTL3(SEQ ID No.3)水解C8C10甲基酯

按如下进行购自Wilmar Oleochemicals Co.,Ltd的C8C10甲基酯(八碳酸甲酯和十碳酸甲酯的混合物，产品规格为50-58％的C8甲基酯和35-50％的C10甲基酯)的TTL水解：在50mL敞口圆底烧瓶中，在16mL水中使4mL(3.53g)的C8C10甲基酯与480μg(固体酶的质量)或136ppm(固体酶的质量相对于甲基酯的质量)的TTL酶(来自实施例3)反应。用加热板维持40℃的反应温度，并使用磁力搅拌器以400rpm搅拌。88小时后，根据以下所示的计算方法计算出C8C10甲基酯的水解率为98.4％。

通过在25mL敞口圆底烧瓶中，在40℃使4mL(3.53g)的C8C10甲基酯底物与8mL水和600μg或170ppm(固体酶的质量相对于甲基酯的重量)的LTL3酶(来自实施例3)反应来进行LTL3对C8C10甲基酯的水解。在400rpm搅拌下在加热板上进行反应。在所需时间之后，将混合物以4000rpm旋转20分钟以使相分离成轻相和重相。轻相包含所需产物(C8和C10游离脂肪酸)和痕量的甲醇。重相包含水、酶和痕量的甲醇。收集轻相并进行真空蒸发(例如使用旋转蒸发仪)以除去残留的甲醇。

对于酶，百分比值是液体酶溶液的体积相比于油的重量。以ppm为单位的酶剂量是酶蛋白质的质量相对于油(或底物)的质量。

24小时和48小时后，根据以下所示的计算方法计算出C8C10甲基酯的水解率分别为85％和95％。至少90％(即90％转化)的水解产率是优选的，因为产物具有足够的纯度来要求最少的加工或不需要额外的加工，特别是可能不具有成本效益的蒸馏。95％的水解产率可以提供可以是商业级的产品，即，该产品无需额外加工即可出售。约320的酸值大致对应于酯的90％水解。

水解％＝(AV-AV₀)/(SV-AV₀)

通过将反应后的酸值除以357的皂化值(SV)来计算水解率。AV：水解产物的酸值，AV₀：0.26的初始酸值。通过滴定在离心和干燥后获得的轻相产物来确定酸值。

在45℃的反应温度、500rpm搅拌下，使用20g的C8C10甲基酯、40g的水和不同浓度的LTL3进行另一组实验，并连续施加50-55毫巴的真空压力以除去产生的甲醇。如上通过离心和干燥获得产物。利用44ppm(固体酶的质量相对于甲基酯的重量)的LTL3浓度，在24小时和48小时后分别获得88.0％和95.3％的水解率。利用30ppm的LTL3，在24小时、48小时和72小时后，分别获得73.9％(酸值为264.71)，89.8％(酸值为320.78)和94.7％(酸值为338.45)的水解率。

结果表明，脂肪酶TTL和LTL3对C8C10甲基酯具有良好的水解活性。特别地，LTL3能够在给定的反应时间内以低至30ppm的浓度进行水解，以得到高纯度的水解产物。这在使用少量酶并避免产品的纯化和分离困难，特别是能耗大的蒸馏方面，提供了显著更高的操作效率。

实施例6：与市售脂肪酶的酶活性比较

表1.Eversa(Novozyme)和LTL3对C8C10甲酯的水解

条件：40℃，1000rpm，在热混合器(Eppendorf)中在15mL管中的开盖反应。

表1示出了使用LTL3相比市售Eversa脂肪酶进行水解的比较。从表1可以看出，LTL3脂肪酶更有效，并且需要较少量的LTL3脂肪酶来实现较高的水解率和水解产率。

图10示出了用于水解C8C10甲基酯的LTL3、Eversa和RML脂肪酶(Novozymes)之间的比较。在100ppm(酶的重量相对于酯的重量)时，明显的是，在所有时间点，LTL3均比相同质量比率的Evesa和RML脂肪酶更有效地催化水解。LTL3在31小时后产生酸值为353.02的水解产物(水解率98.8％)，其高于100ppm的RML和Eversa，它们在31小时后分别产生酸值为271.34(水解率75.9％)和241.16(水解率67.5％)的水解产物。使用RML获得的水解结果为78％的LTL3样品；并且通过Eversay获得的一个结果是69％的LTL3样品。即使使用750ppm的Eversa(是所使用的LTL3剂量的7.5倍)，水解产物在31小时后具有329.01的酸值(水解率92.1％)，其低于利用LTL3所获得的酸值。

结果表明，LTL3在水解C8C10甲基酯方面比Eversa和RML更有效。酶促水解C8C10甲基酯以实现更高的水解率(例如大于95％，特别是大于98％)的能力对于工业应用至关重要，因为这样的高水解率可以直接产生水解产物(C8C10脂肪酸)，这直接满足产品特异性。这极大地简化了分离和纯化，特别是可以避免能耗大的蒸馏步骤，从而可以显著降低生产成本。

实施例7：在低压条件下用LTL3(SEQ ID No.3)水解C8C10酯

表2.在不同压力条件下水解C8C10甲酯

使用以下实验设置研究了C8/10-OMe酯的水解率：20g的C8/10-OMe、40mL的水、100ppm的LTL3脂肪酶，45℃，在不同真空下(50-55、60、70或80毫巴)。结果显示在上表和图11中。可以看出，在较低的操作压力下，酸值增加，换句话说，存在较高的水解率。

实施例8：通过LTL3(SEQ ID No.3)由棕榈脂肪酸馏出物进行生物柴油生产

将0.75克PFAD(棕榈脂肪酸馏出物)和0.25克PME(棕榈甲基酯)加入反应器中，然后加入水、甲醇(MeOH)和LTL3酶。将混合物在37℃以350rpm搅拌孵育24小时。通过在4,000g离心10分钟除去重相(含有甘油、水和酶)，并通过用0.1M NaOH进行滴定来测试轻相(含有PME和未反应的PFAD)的酸值。PFAD是棕榈油蒸馏后的残留物，并且是棕榈油精制过程的副产品，通过寻找进一步处理PFAD的手段，整个棕榈油精制过程的效率得以提高。NaOH以NaOH的重量相对于PFAD和PME的重量的ppm提供。

对于酶，百分比值是液体酶溶液的体积相比于油的重量。以ppm计的酶剂量是酶蛋白质的质量相对于油(或底物)的质量。

表3.利用不同量的H₂O通过LTL3将PFAD转化为生物柴油

实验条件：反应温度37℃，2000rpm热混合器，过夜

在3-12重量％范围内的水含量允许发生酯化，从而提供率良好的产物酯。4-8重量％，特别是4-6重量％的水含量范围给出更好的结果。6％的水剂量提供最低的酸值，即形成最多的酯产物。

水剂量影响酯化反应。不受理论的束缚，据信水提供了溶解NaOH的介质和大多数脂肪酶具有活性并更好地起作用的油-水界面。而且，PFAD包含少量的MAG、DAG和TAG。尽管脂肪酶可以催化酯交换，但对于某些脂肪酶来说，先将DAG/DAG/TAG水解为游离脂肪酸并且然后将这些脂肪酸酯化以产生酯的反应路线可能会更有效，从而导致关于脂肪酶是否可以真正起作用或具有足够的酶促活性的不确定性。另外，如果水含量太高，则逆水解反应可能变得更有利并且降低酯化率。

也可以使用除氢氧化钠以外的碱，以及包括其他无机碱(如金属氢氧化物和氢氧化铵)、有机碱和聚合物支载体碱。金属氢氧化物的实例包括第1族金属(碱金属)氢氧化物、第2族(碱土)金属氢氧化物和第3族金属氢氧化物。可能的有机碱的实例包括烷基胺和芳基胺、氢氧化季铵。碱诸如氢氧化钠和氢氧化钾是更普遍使用的，但不限于此。

表4.利用不同量的NaOH通过LTL3将PFAD转化为生物柴油

实验条件：反应温度37℃，利用热混合器2000rpm，过夜

从结果可以看出，随着存在的碱的量从0增加至400ppm，酸值降低，即更多的酸被转化成酯。200ppm NaOH是优选的，因为更多的NaOH导致形成更多的皂，这引起混合物中的乳状液。

AV值为6.0相当于约97％的PFAD转化为PME，这与Eversa transform2.0的性能相当。图8示出了将反应的薄层色谱(TLC)样品与起始物料和产物比较。可以看出，几乎完全转化为PME。

表5.用不同量的LTL3将PFAD转化为生物柴油

实验条件：反应温度37℃过夜

可以看出，即使在22ppm的低剂量下，酯化在24小时后仍能令人满意地进行。110ppm和220ppm的酶剂量提供更高产率的酯产物。由于LTL3酶催化酯化和水解反应，因此可能的是，对酯水解的影响可能大于酯合成，从而取决于酶剂量导致平衡移动，这导致略高的AV。

表6.LTL3介导的PFAD向PME的转化

反应温度45℃，30分钟，40℃过夜。LTL3酶浓度为约22mg/mL

当使用3％的LTL3酶提供9.75的酸值时，可获得最佳结果。在TLC上也观察到少量的三酰甘油(TAG)、单酰甘油(MAG)和二酰甘油(DAG)。PFAD包含少量的MAG、DAG和TAG。尽管脂肪酶可催化酯交换，但对于某些脂肪酶来说，先将DAG/DAG/TAG水解为游离脂肪酸并且然后将这些脂肪酸酯化以产生酯的反应路线可能会更有效，从而导致关于脂肪酶是否可以真正起作用或具有足够的酶促活性的不确定性。

实施例9：通过LTL3由酸性油生产生物柴油

酸性油产自碱洗植物油(诸如大豆油)，以去除脂肪酸并生成皂料。皂料被重新酸化以形成称为酸性油的产物。酸性油是在植物油精制中作为副产物而产生的，因此本发明方法提供了使用酸性油的手段并提高了植物油精制过程的效率。NaOH以NaOH的重量相对于所使用的酸性油的重量的ppm来提供。

表7.在不同NaOH量下通过LTL3将酸性油转化为FAME

实验条件：反应温度37℃过夜

可以观察到，在添加NaOH的情况下，酸性油的转化大大提高。然而，过量的NaOH可能导致酯的直接水解。对于使用160至533ppm NaOH的实验，观察到更好的酸性油转化率。

表8.用不同量的水通过LTL3将酸性油转化为FAME.

实验条件：反应温度37℃，使用Eppendorf热混合器2000rpm，24小时。

可以观察到，在6％至12％的水存在下，酸性油转化为酯的效率更高。特别地，8-10％的水含量为LTL3提供最佳活性。

表9：利用不同量的LTL3将酸性油转化为FAME

实验条件：反应温度37℃，使用Eppendorf热混合器2000rpm，24小时。

低至50ppm的LTL3剂量在22小时后提供酸值低于10的产物。或者，更长的反应时间可能获得相同的酸值。

序列表

<110> 丰益国际有限公司

<120> 具有脂肪酶活性的多肽及其用途

<130> WN2018LPS01001

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 291

<212> PRT

<213> Thielavia terrestris

<400> 1

Ala Pro Thr Ser Arg Arg Gln Asp Ala Val Thr Thr Gln Gln Leu Asp

1 5 10 15

Asn Leu Lys Leu Phe Val Gln Trp Ser Val Ala Ala Thr Cys Asn Ser

20 25 30

Glu Lys Ser Ala Gly Gln Pro Val Thr Cys Pro Pro Gly Gln Cys Ser

35 40 45

Leu Phe Glu Ser His Asn Ala Thr Val Val Ala Ser Phe Ile Gly Thr

50 55 60

Leu Leu Asp Thr Arg Gly Phe Val Gly Val Asp Pro Val Ser Gln Gln

65 70 75 80

Ile Val Val Ser Phe Arg Gly Thr Thr Ser Val Gln Asn Trp Ile Ala

85 90 95

Asp Leu Thr Phe Val Gln Val Pro Cys Asp Leu Thr Pro Gly Cys Leu

100 105 110

Val His Thr Gly Phe Trp Gly Ser Trp Gly Glu Val Ala Ala Arg Thr

115 120 125

Leu Ala Ala Val Arg Asp Ala Lys Ala Ala His Pro Ala Tyr Ser Val

130 135 140

Ile Val Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Val Ala Thr Leu Ala Ala

145 150 155 160

Ala Tyr Leu Arg Arg Ala Gly Phe Ala Ala Asp Leu Tyr Thr Tyr Gly

165 170 175

Ser Pro Arg Ile Gly Asn Ala Ala Phe Val Glu Phe Val Thr Ala Gln

180 185 190

Pro Gly Gly Glu Tyr Arg Val Thr His Thr Asp Asp Pro Val Pro Arg

195 200 205

Leu Pro Pro Leu Val Ala Asn Tyr Arg His Thr Ser Pro Glu Tyr Trp

210 215 220

Ile Ser Ser Thr Ser Gln Gly Pro Val Thr Pro Ala Asp Val Gln Tyr

225 230 235 240

Cys Pro Gly Tyr Ala Asn Val Gln Cys Asn Gly Gly Thr Glu Gly Leu

245 250 255

Asp Ile Asp Ala His Asn Trp Tyr Phe Gln Pro Leu Asp Gly Cys Ser

260 265 270

Ala Arg Gly His Ala Ala Gln Glu Gly Gly Arg Gly Ile Ile Thr Ser

275 280 285

Ala Gly Ser

290

<210> 2

<211> 873

<212> DNA

<213> Thielavia terrestris

<400> 2

gctccaactt ctagaagaca agatgctgtt actactcaac aattggataa cttgaagttg 60

tttgttcaat ggtctgttgc tgccacttgt aactccgaga agtccgctgg acagcctgtt 120

acctgtcctc caggacagtg ttccctgttc gagtcccaca acgctactgt tgttgcttct 180

ttcatcggta ccttgttgga cactagagga ttcgtcggtg tcgaccctgt ctcacagcag 240

atcgttgttt ctttcagagg tactacctct gttcagaact ggattgctga tttgaccttc 300

gttcaagttc cttgtgactt gacccctggt tgtttggttc atactggttt ctggggttcc 360

tggggtgaag tcgccgctcg taccttggcc gctgttagag acgccaaggc cgctcaccca 420

gcttactcag tcatcgtcac cggtcatagt ttgggtggtg ctgttgctac cttggccgcc 480

gcttacctga gaagagctgg tttcgctgct gatttgtaca cttacggttc tccaagaatt 540

ggtaacgctg ccttcgtcga gtttgttact gcccagccag gtggtgagta cagagttacc 600

cacaccgacg acccagttcc aagactgcca cctttggtcg ctaactacag acacacttcc 660

ccagaatact ggatttcctc tacttcccag ggtccagtta ccccagctga tgttcaatac 720

tgtccaggtt acgctaacgt tcaatgtaac ggtggtaccg agggtttgga cattgatgct 780

cataactggt actttcaacc attggatggt tgctctgcta gaggtcatgc tgctcaagaa 840

ggtggtagag gtattattac ttctgctggt tct 873

<210> 3

<211> 431

<212> PRT

<213> Lasiodiplodia theobromae

<400> 3

Ala Pro Ala Pro Val Pro Glu Asn Gly Leu Glu Lys Arg Gln Ser Leu

1 5 10 15

Ser Ser Val Leu Ser Ala Leu Ser Gly Leu Thr Glu Pro Thr Ala Ile

20 25 30

Leu Ser Gln Leu Glu Ala Val Glu Ala Thr Ser Thr Pro Thr Ser Val

35 40 45

Glu Gln Ala Gln Glu Gln Leu Glu Ala Ile Tyr Gly Thr Thr Pro Thr

50 55 60

Asn Ile Phe Glu Asn Ile Ala Gln Gln Ile Ala Asp Gly Leu Ser Thr

65 70 75 80

Leu Thr Ile Val Gln Ala Leu Gly Phe Ser Pro Ser Gly Glu Asn Ser

85 90 95

Glu Thr Asn Ser Asn Thr Arg Glu Pro Ser Thr Thr Ile Tyr Pro Lys

100 105 110

Lys Ser Ser Ser Asp Ala Pro Tyr Ser Ile Thr Glu Glu Glu Leu Arg

115 120 125

Gln Ala Ile Tyr Ile Pro Ser Asp Phe Thr Tyr Gly Asp Lys Pro Pro

130 135 140

Val Ile Phe Val Pro Gly Thr Gly Ser Tyr Gly Gly Ile Ser Phe Gly

145 150 155 160

Ser Asn Leu Arg Lys Leu Leu Thr Gly Val Ser Tyr Ala Asp Pro Val

165 170 175

Trp Leu Asn Val Pro Asp Ala Leu Leu Arg Asp Ala Gln Thr Asn Gly

180 185 190

Glu Phe Val Ala Tyr Ala Ile Asn Tyr Ile Ser Gly Ile Ser Gly Asp

195 200 205

Ala Asn Val Ser Val Val Ser Trp Ser Gln Gly Gly Leu Asp Thr Gln

210 215 220

Trp Ala Phe Thr Tyr Trp Pro Ser Thr Arg Ala Leu Val Ser Asp Phe

225 230 235 240

Val Pro Val Ser Pro Asp Phe His Gly Thr Val Leu Ala Asn Val Ile

245 250 255

Cys Leu Asn Pro Gly Ala Gly Gly Val Gly Leu Gly Pro Cys Ala Pro

260 265 270

Ala Val Leu Gln Gln Glu Tyr Asn Ser Asn Phe Val Thr Ala Leu Arg

275 280 285

Ala Ala Gly Gly Ala Asp Ala Tyr Val Pro Thr Thr Ser Val Phe Ser

290 295 300

Gly Phe Leu Asp Glu Ile Val Gln Pro Gln Ser Gly Thr Gly Ala Ser

305 310 315 320

Ala Tyr Ile Asn Asp Ala Arg Gly Val Gly Thr Thr Asn Ala Glu Val

325 330 335

Gln Val Val Cys Lys Gly Lys Gly Pro Ala Gly Gly Phe Tyr Thr His

340 345 350

Glu Ser Leu Leu Val Asn Pro Leu Thr Tyr Ala Leu Leu Val Asp Ala

355 360 365

Leu Thr His Asp Gly Pro Gly Ser Val Asp Arg Leu Asp Leu Asp Thr

370 375 380

Val Cys Ser Thr Val Val Ala Pro Gly Leu Gly Leu Asp Ala Leu Leu

385 390 395 400

Glu Ile Glu Gly Val Asn Val Leu Ala Ala Val Asn Leu Leu Thr Tyr

405 410 415

Ser Asp Arg Arg Leu Ala Glu Pro Ala Leu Met Ser Tyr Ala Ala

420 425 430

<210> 4

<211> 1296

<212> DNA

<213> Lasiodiplodia theobromae

<400> 4

gccccagccc ctgtccctga aaatgggctc gagaagaggc agtccctgag cagcgtcctg 60

agcgccctca gtggcctgac cgaacctacg gccatcttgt ctcagctcga ggcggttgaa 120

gcgacatcga cgcccaccag cgtcgagcag gcgcaggagc agctcgaggc catctacggg 180

acgacaccaa ccaacatctt cgagaacatc gcgcagcaaa tcgccgacgg actgtcgacg 240

ctgaccatcg tccaagccct cggcttctcc cccagcggcg agaactcgga gaccaacagc 300

aacacgcgcg aaccgtcgac gaccatctac cccaagaagt cgtcctccga cgccccctat 360

tccatcactg aggaagagct ccgccaagcc atctacatcc cctccgactt cacgtacggc 420

gacaagccgc cggtcatctt cgtgccgggc acgggctcgt acggcggcat cagcttcgga 480

tcgaacctgc gcaagctgct gacgggcgtg tcgtacgcgg acccggtatg gctcaacgtg 540

ccggacgcgc tgctgcgcga cgcgcagacg aacggcgagt tcgtggcgta cgccatcaac 600

tacatctcgg gcatatccgg cgacgccaac gtgtcggtcg tctcgtggtc gcagggcggg 660

ctggacacgc agtgggcttt tacttattgg ccgtcgacgc gcgccctggt ctccgacttc 720

gtgcccgtca gcccggactt ccacggcacc gtcctggcta atgtcatctg cctcaacccg 780

ggcgccggtg gtgttggtct gggcccctgc gcgcccgcgg tgctgcagca ggaatacaac 840

agcaacttcg tcacggccct gcgcgcggct ggtggtgcgg acgcctatgt gccgacgacg 900

tctgttttct ccggcttcct cgacgagatc gtccagccgc agtccggcac cggcgcgtcc 960

gcgtacatca atgatgctag gggtgtgggc acgaccaatg ctgaggtgca ggtcgtgtgc 1020

aagggcaagg gtcccgctgg cggtttttac acccacgaga gcttgctggt caacccgctg 1080

acctatgctc tcctcgtcga tgccttgacc cacgatgggc ccggcagtgt ggacaggctg 1140

gatctggata ccgtgtgctc gaccgtcgtg gcgcccggcc tgggactgga tgcgttgttg 1200

gagattgagg gcgtgaatgt tctggcggct gtcaatctgt tgacctactc agataggagg 1260

ttggctgagc cggcgctgat gtcatatgcg gcttaa 1296

Claims (17)

1.一种通过水解生产中链脂肪酸的方法，所述方法包括：

(a)提供与SEQ ID No.3具有至少90％相同性程度的多肽；和

(b)使所述多肽与中链脂肪酸酯和水接触以产生所述中链脂肪酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述中链脂肪酸酯是单酯。

3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述中链脂肪酸酯是选自辛酸酯、癸酸酯和月桂酸酯中的至少一种中链脂肪酸酯。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述接触步骤在以下条件中的至少一种下进行：

(a)20℃至70℃的温度；

(b)3至9的pH；

(c)在100毫巴和更低的压力进行所述中链脂肪酸酯与所述多肽的反应。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述多肽以30ppm或更高的浓度存在。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述中链脂肪酸具有至少320的酸值。

7.一种形成酯的方法，所述方法包括：

(a)提供与SEQ ID No.3具有至少90％相同性程度的多肽；和

(b)使所述多肽与长链脂肪酸、醇和水接触以形成所述长链脂肪酸和所述醇的酯。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述接触步骤进一步包括长链脂肪酯。

9.根据权利要求7至8中任一项所述的方法，其中所述醇为C1-C4醇。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述醇为甲醇或乙醇。

11.根据权利要求7至10中任一项所述的方法，其中所述接触步骤进一步包括碱。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述碱是氢氧化物。

13.根据权利要求11至12中任一项所述的方法，其中相对于所述长链脂肪酸的重量，所述碱以160至533ppm存在。

14.根据权利要求7至13中任一项所述的方法，其中相对于所述长链脂肪酸的重量，所述水以3至12重量％存在。

15.根据权利要求7至14中任一项所述的方法，其中所述多肽以至少20ppm的浓度存在。

16.根据权利要求7至15中任一项所述的方法，其中所述长链脂肪酸由棕榈脂肪酸馏出物或酸性油提供。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述多肽与SEQ ID No.3具有至少95％的相同性程度。

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