CN113116889A - 醋甲唑胺在防治新型冠状病毒及并发症药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物化学技术领域，特别涉及种醋甲唑胺在防治新型冠状病毒及并发症药物中的应用，本发明提供的醋甲唑胺不仅能有效抑制病毒感染，而且能进一步改善新冠病毒引起的代谢并发症；能有效改善RAS系统中ACE2调控的多种代谢疾病；安全性高，副作用小，适用性广，有利于迅速推广。

Description

醋甲唑胺在防治新型冠状病毒及并发症药物中的应用

技术领域

本发明涉及药物化学技术领域，特别涉及种醋甲唑胺在防治新型冠状病毒及并发症药物中的应用。

背景技术

COVID-19是全球性的流行性疾病，至今仍然在全球范围内快速传播。截止至2021.3.19，COVID-19已经在全球216个国家和地区造成120915219人感染和2674078人死亡，严重危害全球人类的生命健康。

血管紧张素转化酶ACE2(Angiotensin-converting enzyme 2)是SARS-CoV和SARS-CoV-2侵入宿主的主要受体，以往的研究聚焦于通过抑制ACE2与病毒的Spike蛋白的结合来抑制病毒的侵袭，但忽视了ACE2作为拮抗RAS系统的重要分子在机体代谢中受到病毒攻击后的影响。病毒侵入细胞导致ACE2内化和脱落，引起膜上ACE2下调，因此受损的ACE2可能带来一定的代谢损伤，使得有代谢基础病(如高血压，心脏病，糖尿病，肥胖等)的新冠患者病情更容易恶化。同时新冠患者常常伴有肝脂肪变性、肾小球损伤及血管内皮功能障碍等症状，导致机体出现高血糖、高血压和高密度脂蛋白胆固醇降低等糖脂代谢紊乱。据研究报道，有5％-29％的COVID-19患者患有“新发”糖尿病，并伴随疾病不良预后；25％-69％的重型COVID-19患者出现静脉血栓栓塞，是导致死亡的重要病因。因此，COVID-19不仅仅是肺炎疾病，更是涉及多器官损伤的系统性代谢疾病。

目前用于治疗COVID-19的方法，包括抗病毒药、抗体、抗炎药和免疫调节疗法，均鲜有显示出强大的疗效。虽然COVID-19疫苗已在少数发达国家接种，可增强机体防御能力，但目前疫苗市场供给量严重不足、保护时间较短、且大量病毒变异株导致抗体效果大大降低或无效，更重要的是在非发达国家，很难达到疫苗接种普及，这些因素都将影响彻底消灭新冠病毒。另一方面，对于COVID-19引起的并发症仍然缺少关注，而且没有针对并发症的特效药物。因此，阐明COVID-19及其并发症的分子机制，并针对相关靶点进行临床药物研发是全球的重要难题和重大需求，开发出更有效，更经济，更少副作用的抗病毒药物以保护易感人群以及用于治疗COVID-19带来的代谢并发症，仍将是我们能否最终战胜COVID-19的关键。

Methazolamide(醋甲唑胺)是一种磺胺衍生物，用作碳酸酐酶(carbonicanhydrase)抑制剂，是一种降低眼压的药物，可以降低青光眼和其他眼病引起的眼压升高,常用来治疗青光眼。目前没有研究证明Methazolamide与新冠病毒有关联，对其进一步的功能却更没有更深入的研究。我们用详实的细胞实验和动物实验证实Methazolamide不仅能有效抑制新冠病毒感染，而且还能良好地改善病毒引起的代谢并发症。由于Methazolamide是临床用药，安全性高，副作用少，时间短，因此是一种理想快速的防治新冠肺炎药物。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供了醋甲唑胺在防治新型冠状病毒及并发症药物中的应用。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

Methazolamide(醋甲唑胺)，分子式为C₅H₈N₄O₃S₂，CAS号为554-57-4，结构式如下：

醋甲唑胺在防治新型冠状病毒的药物中的应用。

醋甲唑胺在防治新型冠状病毒引起的并发症的药物中的应用。

醋甲唑胺在作为激活ACE2激活剂药物中的应用。

醋甲唑胺在防治代谢疾病的药物中的应用。

醋甲唑胺在防治肥胖、糖尿病、心血管疾病、肺肾纤维化、动脉粥样硬化的药物中的应用。

新冠感染可引起高血糖，高血压，低HDL-C，肾小球及血管内皮炎性损伤，血栓等，我们将与上述症状较为对应的代谢性疾病如糖尿病，高血压，糖尿病肾病，动脉粥样硬化进行生物信息学分析，寻找上述四种代谢性疾病的共性差异性表达基因及调控通路。在DisGeNET和OpenTarget数据库中，分别选取糖尿病、高血压、糖尿病肾病和动脉粥样硬化四个代谢疾病前400个相关基因，各取交集得到48个基因和72个基因，进一步取交集得到20个基因，这20个基因即四种代谢性疾病的核心共性基因。在此基础上，将这20个基因与新冠感染相关基因表达谱进行比对，发现ACE2在多个新冠感染相关基因谱中变化一致，均在感染后表达降低，表明ACE2可能是调控新冠感染糖脂代谢紊乱的关键分子。下一步在体外细胞系中敲降ACE2,发现炎症、纤维化和动脉粥样硬化相关基因表达发生明显增强，糖脂代谢相关基因紊乱。同样的，在ob/ob小鼠代谢紊乱模型中，过表达ACE2可降低小鼠空腹血糖，改善葡萄糖耐量和胰岛素抵抗，血浆总胆固醇、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白含量，血液中炎症因子含量和肾脏损伤因子KIM-1均下降。肝脏脂肪和肾脏糖原都有所下降。同时肝脏，肾脏，主动脉中糖异生、糖原合成、葡萄糖摄取和脂肪合成通路在过表达ACE2后都发生显著改善。这些结果表明，激活ACE2通路可显著改善代谢失调。因此，我们下一步着重在于寻找ACE2激活剂。利用“天河2号”超级计算机和CMAP数据库进行多重筛选，最终得到15个候选小分子可潜在激活ACE2，抑制病毒感染。进一步通过大量体外细胞实验，筛选出Methazolamide为最终激活ACE2改善新冠患者代谢紊乱的药物。然后在高脂小鼠模型中进一步验证Methazolamide对代谢的改善作用，最后在SARS-CoV-2和假病毒实验中验证Methazolamide对病毒的抑制作用，以及可逆转病毒感染引起的代谢基因紊乱。

与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：

1.本发明提供的Methazolamide不仅能有效抑制病毒感染，而且能进一步改善新冠病毒引起的代谢并发症。

2.本发明提供的Methazolamide是ACE2的酶活性直接激动剂，能有效改善RAS系统中ACE2调控的多种代谢疾病。

3.本发明提供的Methazolamide为临床药物，安全性高，副作用小，适用性广，有利于迅速推广。

附图说明

图1醋甲唑胺与ACE2结合和解离的过程图；

图2醋甲唑胺激活ACE2酶活性测试结果图；

图3HUVEC细胞的RT-PCR检测炎症和糖脂代谢基因结果图；

图4为HUVEC细胞用4个炎症因子(G6pc，Glut2，Pparα,Pparγ)处理之后RT-PCR检测结果图；

图5为高脂饮食小鼠的GTT和ITT测试结果图；

图6为高脂饮食小鼠的禁食血糖和Insulin测定结果图；

图7为高脂饮食小鼠的血液中的炎症因子TNFα，肾脏损伤分子KIM-1测定结果图；

图8为高脂饮食小鼠的谷氨酸转氨酶ALT和天门冬氨酸氨基转移酶AS测定结果图；

图9为高脂饮食小鼠的肝脏油红O染色图；

图10为高脂饮食小鼠肝脏油红O定量结果图；

图11为高脂饮食小鼠肾脏糖元染色图；

图12为高脂饮食小鼠肾脏糖元定量结果图；

图13为高脂饮食小鼠肝脏中糖脂代谢相关基因的表达图；

图14为高脂饮食小鼠主动脉组织中糖脂代谢相关基因的表达；

图15为高脂饮食小鼠血液中Ang II/Ang-(1-7)的转换率变化情况图；

图16为高脂饮食小鼠肾脏主动脉组织中ACE2酶活性变化情况图；

图17为醋甲唑胺抑制病毒侵袭和改善病毒感染后引起的代谢基因紊乱的结果图；

图18为假病毒侵入细胞实验，GFP荧光表达情况图；

图19为假病毒侵入细胞实验统计荧光强度图。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

醋甲唑胺在作为激活ACE2激活剂药物中的应用。

1)表面等离子共振(SPR)法：将纯化的ACE2蛋白偶联到CM7传感芯片上，再通过微注射流卡盘将Methazolamide溶液传送至传感芯片表面，Biacore T100追踪记录Methazolamide与ACE2结合和解离的过程。

2)长势良好的HUVEC细胞用ACE2 Lysis裂解后，用BCA测蛋白浓度，取20ug蛋白与Methazolamide共孵育30min,加底物反应，5min内用动力学模式检测荧光强度。

3)HUVEC细胞用Methazolamide处理16h，收集细胞用Trizol裂解，提取RNA，RT-PCR检测炎症和糖脂代谢基因。

实验结果证实，Methazolamide可以与ACE2直接结合并激活其酶活性，而且Methazolamide可显著激活ACE2及其通路下游糖脂代谢和炎症基因。图1为Methazolamide与ACE2可直接结合，图2为Methazolamide激活ACE2酶活性，且有剂量依赖效果，药物组-1(0.15nM),药物组-2(1.5nM)为Methazolamide的两个不同剂量处理组。图3为Methazolamide激活ACE2通路下游糖脂代谢和炎症相关基因。药物-1(0.04mM)，药物-2(0.2mM)，药物-3(1mM)为Methazolamide三个不同的剂量处理组。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。

实施例2

醋甲唑胺在防治代谢疾病的药物中的应用及在防治新型冠状病毒引起的并发症的药物中的应用。

1)HUVEC细胞用4个炎症因子(TNFα，IL-4，IL-6，INFγ)共处理32h后,再用Methazolamide处理16h，收集细胞用Trizol裂解，提取RNA，RT-PCR检测炎症和糖脂代谢基因。

新冠感染导致炎症因子风暴，在体外细胞系中用4种炎症因子共处理脐静脉内皮细胞，模拟新冠病毒感染的细胞状态，Methazolamide可改善炎症因子带来的糖脂基因紊乱。实验结果证实，Methazolamide可挽救炎症因子引起的糖脂代谢紊乱。图4为G6pc，Glut2，Pparα,Pparγ炎症因子处理之后RT-PCR检测结果图。药物-1(0.04mM)，药物-2(0.2mM)，药物-3(1mM)为Methazolamide三个不同的剂量处理组。○为空白对照组，□为炎症因子处理组，△为炎症因子+药物处理组-1(0.04mM)，▽为炎症因子+药物处理组-2(0.2mM)，◇为炎症因子+药物处理组-3(1mM)。#为炎症因子处理组与空白对照组类比，*为炎症因子+药物组与炎症因子处理组类比。#p<0.05；##p<0.01；###p<0.001。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。

实施例3

醋甲唑胺在作为激活ACE2激活剂药物中的应用、在防治代谢疾病的药物中的应用、在防治肥胖、糖尿病、心血管疾病、肺肾纤维化、动脉粥样硬化的药物中的应用。

1)60％高脂喂养C57BL/6J小鼠造模6个月，250mg/kg Methazolamide通过每天灌胃的方式持续给药4周，禁食15h，注射葡萄糖后，尾静脉取血测30，60，90，120min时的GTT，禁食6h，注射胰岛素后，尾静脉取血测测30，60，90，120min时的ITT和禁食血糖。

2)取小鼠肝脏，肾脏分别做油红O和糖元染色。取小鼠血清和肝脏做脂质检测。

3)小鼠血清ELISA检测炎症因子TNFα,肾脏损伤因子KIM-1和ANGII/ANG-(1-7)活性转换率。

4)取小鼠肝脏和肾脏组织提取RNA，RT-PCR检测糖异生、葡萄糖摄取、脂肪合成和炎症相关基因的表达。

5)取肾脏和主动脉组织提取蛋白，BCA测蛋白浓度，用ACE2酶活性试剂盒检测酶活性。

测试结果如下所示：图5为葡萄糖耐量试验(GTT)结果、胰岛素糖耐量试验(ITT)，图6为禁食血糖和Insulin测定结果图，图7为血液中的炎症因子TNFα，肾脏损伤分子KIM-1测定结果图，图8为谷氨酸转氨酶ALT和天门冬氨酸氨基转移酶AS测定结果图，图9为肝脏油红O染色图，图10为肝脏油红O定量结果图，图11为肾脏糖元染色图，图12为肾脏糖元定量结果图，图13为肝脏中糖脂代谢相关基因的表达图；图14为主动脉组织中糖脂代谢相关基因的表达，图15为血液中Ang II/Ang-(1-7)的转换率变化情况图，图16为肾脏主动脉组织中ACE2酶活性变化情况图。#为DIO组与Lean组类比，$为DIO+药物组与DIO组类比。#p<0.05；##p<0.01；###p<0.001。$p<0.05；$$p<0.01；$$$p<0.001。实验结果证实，Methazolamide可明显降低血糖，胰岛素抵抗，肝脏和血清中的总胆固醇含量，血清中谷氨酸转氨酶ALT,天门冬氨酸氨基转移酶AST的含量，减轻炎症，减轻肾脏损伤，增强ACE2酶活性，改善肝脏，肾脏，主动脉中高脂饮食带来的糖脂代谢相关基因紊乱。

实施例4

醋甲唑胺在防治新型冠状病毒的药物中的应用、在防治新型冠状病毒引起的并发症的药物中的应用。

1)Methazolamide处理人的脐静脉内皮细胞HUVEC 6h后，SARS-CoV-2病毒感染细胞18h，用Trizol裂解细胞，提取RNA，RT-PCR检测糖脂代谢相关基因Glut2,Pgc1α,Pparα,Pparγ表达。

2)Methazolamide处理人的脐静脉内皮细胞HUVEC 6h后，假病毒感染细胞18h,显微镜下观察GFP荧光表达情况，并统计荧光强度。

实验结果如下：图17为SARS-CoV-2感染后，Methazolamide可改善代谢基因异常。图18和图19为假病毒侵入细胞实验，Methazolamide抑制假病毒感染效率和荧光强度图。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。实验结果证明，Methazolamide可有效抑制病毒感染，并改善病毒感染带来的代谢基因紊乱。

以上所述仅为本发明专利的较佳实施例而已，并不用以限制本发明专利，凡在本发明专利的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明专利的保护范围之内。

Claims (5)

1.醋甲唑胺在防治新型冠状病毒的药物中的应用。

2.醋甲唑胺在防治新型冠状病毒引起的并发症的药物中的应用。

3.醋甲唑胺在作为激活ACE2激活剂药物中的应用。

4.醋甲唑胺在防治代谢疾病的药物中的应用。

5.醋甲唑胺在防治肥胖、糖尿病、心血管疾病、肺肾纤维化、动脉粥样硬化的药物中的应用。

Images