CN113115858A

CN113115858A - 玉米皮菌体蛋白发酵饲料及其制备方法

Info

Publication number: CN113115858A
Application number: CN202010391929.7A
Authority: CN
Inventors: 刘占英; 李永丽; 胡建华; 燕亚平
Original assignee: Inner Mongolia University of Technology
Current assignee: Inner Mongolia University of Technology
Priority date: 2019-12-31
Filing date: 2020-05-11
Publication date: 2021-07-16
Anticipated expiration: 2040-05-11
Also published as: CN110934223A; CN113115858B

Abstract

本发明公开了玉米皮菌体蛋白发酵饲料及其制备方法。本发明公开的玉米皮菌体蛋白发酵饲料的制备方法，包括：向以玉米皮为主的发酵物料中添加一级发酵菌剂进行一级发酵，得到一级培养产物；向该培养产物中添加二级发酵菌剂进行二级发酵，得到二级发酵产物，所得二级发酵产物即为玉米皮菌体蛋白发酵饲料；一级发酵菌剂的活性成分为黑曲霉、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母；二级发酵菌剂的活性成分为布氏乳杆菌。本发明的玉米皮菌体蛋白发酵饲料及其制备方法具有广泛的应用前景。

Description

玉米皮菌体蛋白发酵饲料及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物饲料发酵领域中，玉米皮菌体蛋白发酵饲料及其制备方法。

背景技术

近年来，蛋白饲料资源制约逐渐成为中国饲料行业甚至畜牧生产发展的瓶颈。目前，中国饲料粮约占粮食总产量的35％，预计到2020和2030年，比重将分别达到45％和50％，但粮食预期年增量只有1％左右，饲料粮缺口的出现在所难免，其中蛋白质饲料资源更加紧张。据统计，预计到2030年我国蛋白饲料的缺口将达到2790万吨，因此，继续增加蛋白饲料的产量、缓解我国蛋白饲料紧张的局面是重中之重。同时，尝试利用新型饲料成分来代替日渐紧缺的常规饲料成分将会成为未来饲料发展的必然趋势，其中粮食深加工所得到的一些副产物作为新型饲料来源更会是一个重要的研究方向。

玉米皮是玉米淀粉加工和以玉米为原料发酵企业的主要副产物，其大约占玉米总质量的 15％左右，其因纤维素和半纤维素等成分含量高而难被利用，通常直接烘干后作为粗纤维成分廉价出售用于饲料，但因纤维素和半纤维素含量太高，适口性和饲喂效果并不好。此外，这种处理方式水耗和能耗较大，且产生有害气体。同时，对发酵和玉米深加工产业而言，附加值较低，产业链较短，必然会导致主体产品成本增高，利润率下降，市场竞争力变弱，社会效益降低。如若可以更深层次的开发利用玉米皮，就能极大地带动玉米加工企业的经济效益，增加这些企业利润，从而增加玉米需求量和价格，提高农民收入。

目前，抗生素饲料对预防动物疾病、提高动物生产性能和创造经济效益起到了巨大的推动作用。随着生活水平的提高，人们对消费品质量越来越重视，畜产品的安全问题日益成为人们关注的焦点，目前欧盟已经禁止使用抗生素。开发高效、无残留、无公害的绿色饲料是社会发展的迫切要求和必然结果。

发明内容

本发明的目的是提供一种玉米皮菌体蛋白发酵饲料及其制备方法。

本发明提供的玉米皮菌体蛋白发酵饲料的制备方法，包括：向以玉米皮为主的发酵物料中添加一级发酵菌剂进行一级发酵，得到一级培养产物；向所述培养产物中添加二级发酵菌剂进行二级发酵，得到二级发酵产物，所得二级发酵产物即为玉米皮菌体蛋白发酵饲料；

所述一级发酵菌剂的活性成分为黑曲霉(Aspergillus niger)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；

所述二级发酵菌剂的活性成分为布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)。

上述方法中，所述黑曲霉(Aspergillus niger)可为黑曲霉(Aspergillus niger)CGMCC 3.17612。所述黑曲霉(Aspergillus niger)CGMCC 3.17612为中国普通微生物菌种保藏管理中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所邮编100101)保藏编号为CGMCC 3.17612的菌株。

所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)可为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis) CGMCC 1.15792。所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC 1.15792为中国普通微生物菌种保藏管理中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所邮编100101)保藏编号为CGMCC 1.15792的菌株。

所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)可为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CICC 32236。所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC 32236为中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)(地址：北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼邮编100015)收藏编号为CICC 32236的菌株。

所述布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)可为布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri) CGMCC 1.15607。所述布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)CGMCC 1.15607为中国普通微生物菌种保藏管理中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所邮编100101)保藏编号为CGMCC 1.15607的菌株。

上述方法中，所述发酵物料中玉米皮的质量百分比含量可为40-50％，如45％。

上述方法中，所述发酵物料可由玉米皮、麸皮、硫酸盐、磷酸盐、镁盐、钠盐和水组成。

所述玉米皮的含水率可为9％。所述硫酸盐可为硫酸铵。所述磷酸盐可为磷酸二氢钾。所述镁盐可为硫酸镁。所述钠盐可为氯化钠。

所述发酵物料中所述玉米皮、所述麸皮、所述硫酸盐、所述磷酸盐、所述镁盐、所述钠盐的质量含量分别为40-50％、1.6-2.5％、1.3-1.5％、0.2-0.3％、0.2-0.3％、0.1-0.2％。所述发酵物料含水率为50％-60％。

具体的，所述发酵物料中所述玉米皮、所述麸皮、所述硫酸盐、所述磷酸盐、所述镁盐、所述钠盐的质量含量可为50％、2.5％、1.3％、0.2％、0.3％、0.2％。所述发酵物料的含水率为 50％。

所述发酵物料中所述玉米皮、所述麸皮、所述硫酸盐、所述磷酸盐、所述镁盐、所述钠盐的质量含量还可为45％、2.05％、1.3％、0.3％、0.3％、0.1％。所述发酵物料的含水率为55％。

所述发酵物料中所述玉米皮、所述麸皮、所述硫酸盐、所述磷酸盐、所述镁盐、所述钠盐的质量含量也可为40％、1.6％、1.5％、0.2％、0.2％、0.1％。发酵物料含水率为60％。

上述方法中，所述一级发酵可在25-35℃(如30℃)下进行。所述一级发酵的时间可为 7-20天(如10天)。

所述二级发酵可在15-32℃(如25℃)下进行。所述二级发酵的时间可为7-30天(如20天)。

上述方法中，所述一级发酵菌剂中所述黑曲霉(Aspergillus niger)、所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的活菌含量分别可为(1.09-2.17×10⁹)、(1.33-1.6)×10¹⁰、(4.67-7)×10¹⁰cfu/kg菌剂。

具体的，所述一级发酵菌剂可为一级发酵菌剂A、一级发酵菌剂B和一级发酵菌剂C，所述一级发酵菌剂A中所述黑曲霉(Aspergillus niger)、所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的活菌含量分别可为2.17×10⁹、1.33×10¹⁰、4.67×10¹⁰cfu/kg菌剂，所述一级发酵菌剂B中所述黑曲霉(Aspergillusniger)、所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和所述酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae) 的活菌含量分别可为1.3×10⁹、1.6×10¹⁰、5.6×10¹⁰cfu/kg菌剂，所述一级发酵菌剂C中所述黑曲霉(Aspergillus niger)、所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的活菌含量分别可为1.09×10⁹、1.33×10¹⁰、7×10¹⁰cfu/kg 菌剂。

所述一级发酵菌剂的添加量可满足所述一级发酵菌剂与所述发酵物料的质量比为10:100。

所述二级发酵菌剂中所述布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)活菌含量可为1.88 ×10⁸cfu/mL。

所述二级发酵菌剂的添加量可满足所述二级发酵菌剂与所述发酵物料的体积为2:100。

利用所述玉米皮菌体蛋白发酵饲料的制备方法制备的玉米皮菌体蛋白发酵饲料，也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了一种成套微生物，所述成套微生物包括所述黑曲霉、所述枯草芽孢杆菌和所述酿酒酵母。

进一步，所述成套微生物还可包括所述布氏乳杆菌。

所述成套微生物可由所述黑曲霉、所述枯草芽孢杆菌和所述酿酒酵母组成，还可由所述黑曲霉、所述枯草芽孢杆菌和所述酿酒酵母与所述布氏乳杆菌组成。

所述成套微生物可用于制备动物饲料。

本发明还提供了一种成套产品，所述成套产品由所述一级发酵菌剂、所述二级发酵菌剂和/或所述发酵物料组成。

所述成套产品可用于制备动物饲料。

本发明还提供了所述方法在制备动物饲料中的应用；

或，所述玉米皮菌体蛋白发酵饲料在饲养动物中的应用；

或，所述成套微生物在制备动物饲料中的应用；

或，所述成套产品在制备动物饲料中的应用；

或，所述玉米皮菌体蛋白发酵饲料在提高奶牛产奶量中的应用；

或，所述玉米皮菌体蛋白发酵饲料在制备提高奶牛产奶量产品中的应用；

或，所述成套微生物在提高奶牛产奶量中的应用；

或，所述成套微生物在制备提高奶牛产奶量产品中的应用；

或，所述成套产品在提高奶牛产奶量中的应用；

或，所述成套产品在制备提高奶牛产奶量产品中的应用。

上述应用中，所述动物可为哺乳动物，如牛。所述牛可为奶牛。

本发明的优点是：

(1)该发明用的是玉米淀粉加工后的副产物，对其进行二次加工，既为畜牧养殖业提供一种质优价廉的无抗化菌体蛋白微生物饲料，又解决了当前玉米加工副产物——玉米皮利用不充分的问题，提高其附加值；采用的固态发酵方式，其具有设备构造简单、投资少、耗能低、操作简单等特点；所有发酵产物即为产品，不存在其他废物，污染少。

(2)该发明所生产的产品属于微生物发酵饲料,将原料中的纤维素和半纤维素降解(纤维素和半纤维素降解率为45-55％和28-35％)为可溶性糖，并转化为菌体蛋白(发酵产物蛋白含量为21-26％，较发酵前提高90％-136％)，不仅能提高饲料利用率，而且饲料中含有大量的菌体蛋白，为动物提供优质蛋白源，且菌体蛋白中氨基酸比例均衡，蛋白质质量较优，有利于提高奶或肉产量和质量。另外，多菌种发酵后产生芳香气味，还可以增加适口性，同时，饲料中含有大量的有益微生物和酶，其中枯草芽孢杆菌、黑曲霉和乳酸菌均为奶牛瘤胃中的有益微生物，产生的多种纤维素和半纤维素水解酶有助于瘤胃中对粗纤维日粮的降解，可增加反刍动物对粗纤维饲料的消化利用，此外，可调节动物肠道有益菌群，提高动物的抗病能力，减少或消除抗生素使用；

(3)该发明制得的玉米皮菌体蛋白发酵饲料中含有酵母菌，它含有丰富的蛋白质(30～ 40％左右)、B族维生素和氨基酸等物质，可广泛用作动物饲料的蛋白质补充物。它能促进动物的生长发育，缩短饲养期，增加产品产量(例如奶产量)，提高产品质量(例如奶品质)；

(4)该发明制得的玉米皮菌体蛋白发酵饲料中含有黑曲霉，能产生纤维素酶、半纤维素酶等多种水解酶和糖化酶，能提高粗饲料的利用率，节约饲喂成本；

(5)该发明制得的玉米皮菌体蛋白发酵饲料中含有枯草芽孢杆菌，其不但能产生半纤维素酶、纤维素酶和淀粉酶等多种水解酶，而且能合成维生素B1、B2、B6、烟酸等多种B族维生素，提高动物体内干扰素和巨噬细胞的活性；此外，枯草芽孢杆菌迅速消耗环境中的游离氧，造成肠道低氧，促进有益厌氧菌生长；

(6)该发明制得的玉米皮菌体蛋白发酵饲料中含有布氏乳杆菌，产生乙酸等酸性物质，降低饲料的pH值，从而抑制杂菌和致病菌，增加饲料的有氧稳定性；

(7)该发明采用的工艺是多菌种混合发酵，微生物间协同合作，极大促进玉米皮快速降解和发酵，具有如下特点：①多菌共生酶系互补；②节约能源，简化工艺设备，生化反应更加完善；③通过不同代谢能力的组合，能够完成单个菌种难以完成的复杂代谢作用；④酶促作用生成的单糖等营养物立即被其他微生物所利用，在维持降解物浓度的同时，消除了酶解产物对酶的抑制作用；⑤通过微生物间的互惠共生和偏利共生关系，可将玉米皮发酵成集营养、免疫、抗感染、易吸收等特点为一体的目的生物发酵饲料产品。

因此，本发明的玉米皮菌体蛋白发酵饲料不但可以提供优质蛋白质，而且还可以提供多种益生菌和酶，不但能保证蛋白质的供给，而且对减少或消除抗生素使用，保障养殖业绿色发展亦有一定作用，具有广泛的应用前景。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的黑曲霉(Aspergillus niger)CGMCC 3.17612为中国普通微生物菌种保藏管理中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所邮编100101)菌株，保藏日期为2015年1月26日，自该保藏日起公众可从中国普通微生物菌种保藏管理中心获得该菌株。

下述实施例中的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC 1.15792为中国普通微生物菌种保藏管理中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所邮编100101)菌株，保藏日期为2016年7月10日，自该保藏日起公众可从中国普通微生物菌种保藏管理中心获得该菌株。

下述实施例中的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC 32236为中国工业微生物菌种保藏管理中心(地址：北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼邮编100015)(CICC) 菌株，收藏时间为2008年1月17日。

下述实施例中的布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)CGMCC 1.15607为中国普通微生物菌种保藏管理中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所邮编100101)菌株，保藏日期为2015年1月15日，自该保藏日起公众可从中国普通微生物菌种保藏管理中心获得该菌株。

玉米皮：含水量为9％左右。

麸皮：小麦麸。

实施例1、玉米皮菌体蛋白发酵饲料的制备

一、玉米皮菌体蛋白发酵饲料的制备

1、一级发酵菌剂的制备

将黑曲霉(Aspergillus niger)CGMCC 3.17612在麦芽汁琼脂培养基中进行斜面培养，培养温度为25℃；斜面培养结束后挑菌接种至麦芽汁液体培养基中进行摇瓶培养，培养条件为25℃、3d；摇瓶培养结束后将所得培养液接种至玉米皮麸皮固态发酵基础培养基中进行接曲培养，培养条件为25℃、2-7d，培养结束得到黑曲霉菌剂，该菌剂中活菌含量为 6.52×10⁹cfu/kg。

将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC 1.15792在LB琼脂培养基中进行斜面培养，培养温度为37℃；斜面培养结束后挑菌接种至LB液体培养基中进行摇瓶培养，培养条件为37℃、1d；摇瓶培养结束后将所得培养液接种至玉米皮麸皮固态发酵基础培养基中进行接曲培养，培养条件为37℃、1-2d，培养结束得到枯草芽孢杆菌菌剂，该菌剂中活菌含量为 4.0×10¹⁰cfu/kg。

将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC 32236在YPD琼脂培养基中进行斜面培养，培养温度为30℃；斜面培养结束后挑菌接种至YPD液体培养基中进行摇瓶培养，培养条件为30℃、3d；摇瓶培养结束后将所得培养液接种至玉米皮麸皮固态发酵基础培养基中进行接曲培养，培养条件为30℃、3d，培养结束得到酿酒酵母菌剂，该菌剂中活菌含量为1.4×10¹¹cfu/kg。

其中，玉米皮麸皮固态发酵基础培养基的制备方法如下：将玉米皮18.6kg、麸皮18.6kg、水60.6kg、硫酸盐(即硫酸铵)1.5kg、磷酸盐(即磷酸二氢钾)0.2kg、镁盐(即硫酸镁) 0.3kg、钠盐(即氯化钠)0.2kg，置于配料容器中混合，得到玉米皮麸皮固态发酵基础培养基。

将所得黑曲霉菌剂、枯草芽孢杆菌菌剂和酿酒酵母菌剂分别按照不同比例混合，分别得到一级发酵菌剂A、一级发酵菌剂B和一级发酵菌剂C。

一级发酵菌剂A中黑曲霉菌剂、枯草芽孢杆菌菌剂和酿酒酵母菌剂的质量比为1:1:1，黑曲霉、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母的活菌含量分别为2.17×10⁹、1.33×10¹⁰、4.67×10¹⁰cfu/kg 菌剂。

一级发酵菌剂B中黑曲霉菌剂、枯草芽孢杆菌菌剂和酿酒酵母菌剂的质量比为1:2:2，黑曲霉、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母的活菌含量分别为1.3×10⁹、1.6×10¹⁰、5.6×10¹⁰cfu/kg 菌剂。

一级发酵菌剂C中黑曲霉菌剂、枯草芽孢杆菌菌剂和酿酒酵母菌剂的质量比为1:2:3，黑曲霉、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母的活菌含量分别为1.09×10⁹、1.33×10¹⁰、7×10¹⁰cfu/kg 菌剂。

2、二级发酵菌剂的制备

将布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)CGMCC 1.15607在MRS琼脂培养基中进行斜面培养，培养在37℃下进行；斜面培养结束后挑菌接种至MRS液体培养基中进行摇瓶培养，培养条件为37℃、2d；摇瓶培养结束后将所得培养液接种至MRS液体培养基中进行发酵罐培养，培养条件为37℃、2d，培养结束得到二级发酵菌剂，该菌剂中活菌含量为1.88×10⁸cfu/mL。

3、发酵物料的制备

将玉米皮50kg、麸皮2.5kg、水45.5kg、硫酸盐(即硫酸铵)1.3kg、磷酸盐(即磷酸二氢钾)0.2kg、镁盐(即硫酸镁)0.3kg、钠盐(即氯化钠)0.2kg，置于配料容器中混合，得到发酵物料A。发酵物料A中玉米皮、麸皮、水、硫酸盐、磷酸盐、镁盐、钠盐的质量添加量分别为50％、2.5％、45.5％、1.3％、0.2％、0.3％、0.2％，％表示质量百分比。

将玉米皮45kg、麸皮2.05kg、水50.95kg、硫酸盐(即硫酸铵)1.3kg、磷酸盐(即磷酸二氢钾)0.3kg、镁盐(即硫酸镁)0.3kg、钠盐(即氯化钠)0.1kg，置于配料容器中混合，得到发酵物料B。发酵物料B中玉米皮、麸皮、水、硫酸盐、磷酸盐、镁盐、钠盐的质量添加量分别为45％、2.05％、50.95％、1.3％、0.3％、0.3％、0.1％，％表示质量百分比。

将玉米皮40kg、麸皮1.6kg、水56.4kg、硫酸盐(即硫酸铵)1.5kg、磷酸盐(即磷酸二氢钾)0.2kg、镁盐(即硫酸镁)0.2kg、钠盐(即氯化钠)0.1kg，置于配料容器中混合，得到发酵物料C。发酵物料C中玉米皮、麸皮、水、硫酸盐、磷酸盐、镁盐、钠盐的质量添加量分别为40％、1.6％、56.4％、1.5％、0.2％、0.2％、0.1％，％表示质量百分比。

4、灭菌

将各发酵物料分别移入发酵池，用高温蒸汽于121℃灭菌20min。

5、接种、发酵培养

待灭菌后的发酵物料A冷却至30℃～40℃时，将一级发酵菌剂A按10％(质量比)接种于灭菌后的发酵物料A中(即一级发酵菌剂A与发酵物料A的质量比为10:100)，混合均匀在25℃下进行一级发酵，通风培养7天，得到一级培养产物。培养结束后将二级发酵菌剂接种于所得一级培养产物中，二级发酵菌剂的接种量满足二级发酵菌剂与发酵物料A的体积比为2:100，混合均匀后在32℃条件下发酵7天后，即得到二级发酵产物，包装，即得到玉米皮菌体蛋白发酵饲料，将该发酵饲料记为玉米皮菌体蛋白发酵饲料甲。

待灭菌后的发酵物料B冷却至30℃～40℃时，将一级发酵菌剂B按10％(质量比)接种于灭菌后的发酵物料B中(即一级发酵菌剂B与发酵物料B的质量比为10:100)，混合均匀在30℃下进行一级发酵，通风培养10天，得到一级培养产物。培养结束后将二级发酵菌剂接种于所得培养产物中，二级发酵菌剂的接种量满足二级发酵菌剂与发酵物料B的体积比为 2:100，混合均匀后在25℃条件下发酵20天后，即得到二级发酵产物，包装，即得到玉米皮菌体蛋白发酵饲料，将该发酵饲料记为玉米皮菌体蛋白发酵饲料乙。

待灭菌后的发酵物料C冷却至30℃～40℃时，将一级发酵菌剂C按10％(质量比)接种于灭菌后的发酵物料C中(即一级发酵菌剂C与发酵物料C的质量比为10:100)，混合均匀在35℃下进行一级发酵，通风培养14天，得到一级培养产物。培养结束后将二级发酵菌剂接种于所得培养产物中，二级发酵菌剂的接种量满足二级发酵菌剂与发酵物料C的体积比为 2:100，混合均匀后在15℃条件下发酵30天后，即得到二级发酵产物，包装，即得到玉米皮菌体蛋白发酵饲料，将该发酵饲料记为玉米皮菌体蛋白发酵饲料丙。

二、对照饲料的制备

一)对照饲料1

1、一级发酵菌剂的制备

将步骤一的黑曲霉菌剂、枯草芽孢杆菌菌剂以及酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae) CICC 31923菌剂混合，得到一级发酵菌剂1，其中，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae) CICC 31923菌剂的制备方法如下：将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC 31923 在YPD琼脂培养基中进行斜面培养，培养在30℃下进行；斜面培养结束后挑菌接种至YPD液体培养基中进行摇瓶培养，培养条件为30℃、3d；摇瓶培养结束后将所得培养液接种至玉米皮麸皮固态发酵基础培养基中进行接曲培养，培养条件为30℃、3d，培养结束得到酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)CICC 31923菌剂。所用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) CICC 31923为中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)菌株，收藏时间为2007年2月 16日。

一级发酵菌剂1中黑曲霉、枯草芽孢杆菌以及酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae) CICC 31923的活菌含量分别为2.17×10⁹、1.33×10¹⁰、4.67×10¹⁰cfu/kg菌剂。

2、二级发酵菌剂的制备

同步骤一的2。

3、发酵物料的制备

按照步骤一的3中的发酵物料A的制备方法制备。

4、灭菌

同步骤一的4。

5、接种、发酵培养

待灭菌后的发酵物料A冷却至30℃～40℃时，将一级发酵菌剂1按10％接种于灭菌后的发酵物料A中(即一级发酵菌剂1与发酵物料A的质量比为10:100)，混合均匀在25℃下发酵，通风培养7天，得到培养产物。培养结束后将二级发酵菌剂接种于所得培养产物中，二级发酵菌剂的接种量满足二级发酵菌剂与发酵物料A的体积比为2:100，混合均匀后在32℃ 条件下发酵7天后包装，即得到对照发酵饲料，将该发酵饲料记为对照饲料1。

二)对照饲料2

1、一级发酵菌剂的制备

将步骤一的黑曲霉菌剂、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC 1.108菌剂以及酿酒酵母菌剂混合，得到一级发酵菌剂2，其中，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC 1.108菌剂的制备方法如下：将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC 1.108在LB琼脂培养基中进行斜面培养，培养在37℃下进行；斜面培养结束后挑菌接种至LB液体培养基中进行摇瓶培养，培养条件为37℃、1d；摇瓶培养结束后将所得培养液接种至玉米皮麸皮固态发酵基础培养基中进行接曲培养，培养条件为37℃、1-2d，培养结束得到枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)CGMCC 1.108菌剂。其中，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis) CGMCC 1.108为中国普通微生物菌种保藏管理中心菌株，保藏日期为1956年5月1日。

一级发酵菌剂2中黑曲霉、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC 1.108以及酿酒酵母的活菌含量分别为1.3×10⁹、1.6×10¹⁰、5.6×10¹⁰cfu/kg菌剂。

2、二级发酵菌剂的制备

同步骤一的2。

3、发酵物料的制备

按照步骤一的3中的发酵物料A的制备方法制备。

4、灭菌

同步骤一的4。

5、接种、发酵培养

待灭菌后的发酵物料A冷却至30℃～40℃时，将一级发酵菌剂2按10％接种于灭菌后的发酵物料A中(即一级发酵菌剂2与发酵物料A的质量比为10:100)，混合均匀在25℃下发酵，通风培养7天，得到培养产物。培养结束后将二级发酵菌剂接种于所得培养产物中，二级发酵菌剂的接种量满足二级发酵菌剂与发酵物料A的体积比为2:100，混合均匀后在32℃ 条件下发酵7天后包装，即得到对照发酵饲料，将该发酵饲料记为对照饲料2。

三)对照饲料3

1、一级发酵菌剂的制备

同步骤一的1。

2、二级发酵菌剂的制备

将布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)CGMCC 1.12965在MRS琼脂培养基中进行斜面培养，培养在37℃下进行；斜面培养结束后挑菌接种至MRS液体培养基中进行摇瓶培养，培养条件为37℃、2天；摇瓶培养结束后将所得培养液接种至MRS液体培养基中进行发酵罐培养，培养条件为37℃、2d，培养结束得到二级发酵菌剂，该菌剂中活菌含量为1.39× 10⁸cfu/mL。其中，布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)CGMCC 1.12965为中国普通微生物菌种保藏管理中心菌株，保藏日期为2014年8月19日。

3、发酵物料的制备

按照步骤一的3中的发酵物料A的制备方法制备。

4、灭菌

同步骤一的4。

5、接种、发酵培养

待灭菌后的发酵物料A冷却至30℃～40℃时，将一级发酵菌剂A按10％接种于灭菌后的发酵物料A中(即一级发酵菌剂A与发酵物料A的质量比为10:100)，混合均匀在25℃下发酵，通风培养7天，得到培养产物。培养结束后将二级发酵菌剂接种于所得培养产物中，二级发酵菌剂的接种量满足二级发酵菌剂与发酵物料A的体积比为2:100，混合均匀后在32℃ 条件下发酵7天后包装，即得到对照发酵饲料，将该发酵饲料记为对照饲料3。

四)对照饲料4

1、玉米皮的预处理：将玉米皮机械粉碎并过40目筛，利用高温高压法对其进行预处理。

2、有益发酵菌剂的制备：将所需的发酵菌株木霉、黑曲霉分别经过斜面培养、摇瓶培养和接曲培养后按体积比30：70的比例混合制成一级固体发酵剂；将所需菌种酿酒酵母、毕赤酵母以及枯草芽孢杆菌分别经试管培养、摇瓶培养和种子罐培养后再按5％～10％的接种量将所培养的菌液分别接入液体培养基培养2天后，成为成熟液，随后按体积比，酿酒酵母：毕赤酵母：枯草芽孢杆菌＝20：20：60配制成二级固态发酵剂；将所需的乳酸菌经过斜面培养、摇瓶培养和接曲培养后制成三级固体发酵剂。

PDA培养基：称取200g去皮马铃薯之后切成小块，加适量的去离子水煮沸30min左右，煮沸期间需要不断搅拌。用纱布将马铃薯块过滤，将滤液用去离子水补足定容到1000ml。加入2％的葡萄糖，pH自然，121℃灭菌30min。PDA培养基用于培养和保藏木霉和黑曲霉。

麦芽汁培养基(g/L)：12Brix.麦芽汁1.0L,琼脂15.0g，自然pH，121℃灭菌20min。麦芽汁培养基用于培养和保藏木霉和黑曲霉。

LB培养基(g/L)：蛋白胨10.0，酵母提取粉5.0，氯化钠10.0，硫酸锰0.005，pH＝7.0， 121℃灭菌20min。LB培养基用于培养和保藏枯草芽孢杆菌。

YPD培养基(g/L)：蛋白胨20.0，酵母提取粉10.0，葡萄糖20.0，自然pH，121℃灭菌15min。YPD培养基用于培养和保藏酿酒酵母、毕赤酵母。

MRS培养基(g/L)：葡萄糖20.0，蛋白胨10.0，酵母提取粉4.0，牛肉浸粉8.0，磷酸二氢钾2.0，乙酸钠5.0，硫酸镁0.2，柠檬酸三铵2.0，硫酸锰0.05，吐温80 1.0mL， pH＝6.2±0.2，115℃灭菌20min。MRS培养基用于培养和保藏乳酸菌。

以上培养基做平板或斜面培养时需向其中加入20g琼脂。

3、配料：按以下重量称取混合原料；玉米麸皮75kg、豆粕8kg、磷酸氢钙1.5kg、食盐1.6kg、氯化镁1.2kg、硫酸锌0.8kg、亚硒酸钠0.25kg、水30kg，置于配料容器中混合。

4、灭菌：将发酵物料移入灭菌罐，用高温蒸汽于121℃灭菌20min。

5、接种、发酵培养：待灭菌后的发酵物料冷却至30℃时移入发酵池，将一级固态固体发酵剂按3g接种于发酵物料，混合均匀在30℃条件下发酵，通风培养2天。随后将配制的二级固态发酵剂5g接入发酵池混合均匀于25℃条件下发酵培养2天。最后再将配制的三级固态发酵剂2g接种于发酵物料，混合均匀后在35℃条件下发酵2天。

6、灭活、干燥、粉碎：发酵结束后将发酵产物进行菌体灭活、脱水干燥至水分为10％～ 15％，粉碎后即为对照饲料4。

实施例2、玉米皮菌体蛋白发酵饲料的检测

1、实施例1得到的玉米皮菌体蛋白发酵饲料甲-丙以及对照饲料1-4的理化指标和卫生指标见表1和2。

表1玉米皮菌体蛋白发酵饲料理化指标检测结果

由表1可见，本发明发酵饲料甲-丙粗纤维含量低于蛋白饲料规定的18％，符合蛋白饲料要求，而对照饲料3-4高于18％，不符合蛋白饲料要求；发酵饲料甲-丙和对照饲料的粗蛋白含量全部大于蛋白饲料规定的20％，符合蛋白饲料要求，且各发酵饲料粗蛋白含量均明显高于对照饲料。

表2玉米皮菌体蛋白发酵饲料卫生指标检测结果

表2中，“ND”表示未检出。

由表2可见，本发明的玉米皮菌体蛋白发酵饲料甲-丙以及对照饲料1-4中无机污染物含量未检出；真菌毒素含量符合卫生指标要求；天然毒素和有机污染物含量未检出；益生菌含量显著增多，饲喂效果明显，奶牛产奶量增加。

2、检测方法补充

2.1总糖

2.1.1样品中总糖的水解和提取

准确称取待测样品1.0g，放入100mL锥形瓶中，加15mL蒸馏水和6mol/L的HCl 水溶液10mL，沸水浴条件下加热水解30min。待水解液冷却后离心过滤，用氢氧化钠溶液调至中性，转移到1000mL容量瓶中，定容混匀，得到稀释1000倍总糖待测液。

2.1.2葡萄糖标准曲线的绘制及总糖的测定

配制0.1mg/mL-0.7mg/mL不同浓度梯度的葡萄糖标准溶液，取不同浓度的葡萄糖标准溶液2mL，DNS试剂2mL加到试管中摇匀，沸水浴5min。反应结束后立即冰浴终止反应，加16mL蒸馏水摇匀，用分光光度计测其吸光度(540nm)。以吸光度为横坐标，葡萄糖浓度为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线。

取6只25mL比色管，编号1-6。在6只试管中加入总糖待测液3mL，DNS试剂2mL，沸水浴5min，冷却后加入蒸馏水至刻度线，在540nm下测OD值。对比葡萄糖标准曲线计算其总糖。

2.1.3计算

按下列公式可完成待测样品中总糖含量的计算，％为质量百分比。

2.2真蛋白的测定

2.2.1实验步骤

准确称取待测样品1g左右(精确至0.0001g)置于200ml烧杯中，加50ml水中，加热至沸。然后加入20ml硫酸铜溶液，20ml的2.5％(m/m)氢氧化钠水溶液，用玻璃棒充分搅拌，放置1h以上。用定性滤纸过滤，然后用60～80摄氏度热水洗涤沉淀5或6次，用氯化钡溶液5滴和盐酸溶液1滴检查滤纸，直至不生成白色硫酸钡沉淀为止。将沉淀和滤纸放在65摄氏度烘箱干燥2h，然后全部转移到凯氏烧瓶中，按半微量凯氏定氮法进行氮的测定。

2.2.2计算公式

式中：

V2：滴定试样所消耗盐酸标准滴定溶液的体积，单位为毫升(mL)

V1：滴定空白所消耗盐酸标准滴定溶液的体积，单位为毫升(mL)

c：盐酸标准滴定溶液的浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；

m：试样质量，单位为克(g)

V：试样消煮液总体积，单位为毫升(mL)

V’：蒸馏用消煮液体积，单位为毫升(mL)；

6.25：氮换算成粗蛋白的平均系数。

2.3饲料中酵母菌的检测

准确称取发酵物料1g，放入盛有9mL无菌水中漩祸混合15min，制成10^-1浓度菌悬液，再吸取10^-1稀释的菌悬液1mL加入到9mL无菌水中，充分振荡、摇匀，稀释成10^-2浓度菌悬液。吸取10uL，10^-2浓度菌悬液滴到血球板0.0025mm²计数区域，然后滴入等体积的美兰染色液，使其混合均匀，加盖盖玻片，切勿产生气泡，染色3-5min左右，并于染色后 5min内转至显微镜下测定酵母活性并计算酵母活菌数量。

计算公式为：

酵母细胞数/g＝80小格内酵母细胞个数/80×400×10^6.×稀释倍数

2.4饲料中布氏乳杆菌的检测

称取新鲜的饲料料25g，装人盛有225mL 0.85％灭菌生理盐水的三角瓶内，加少量玻璃珠摇床震荡30分钟，将此溶液再稀释10¹～10⁷倍后，分别吸取100μL于倒好的培养基上，涂布均匀。乳酸菌计数采用MRS培养基，37℃培养48h。测定微生物时，每个稀释梯度均接种3个培养皿。

实施例2、本发明的玉米皮菌体蛋白发酵饲料可以提高奶牛产奶量

本实施例在泌乳期奶牛中饲喂实施例1的饲料，检测本发明的玉米皮菌体蛋白发酵饲料对奶牛产奶量的影响，具体步骤如下：

选取21头荷斯坦黑白花奶牛，通过随机分配，平均分成7组，每组3头，分别为：1号试验组、2号试验组、3号试验组、1号对照组、2号对照组、3号对照组、4号对照组。其中 1号试验组饲喂玉米皮菌体蛋白发酵饲料甲；2号试验组饲喂玉米皮菌体蛋白发酵饲料乙， 3号试验组饲喂玉米皮菌体蛋白发酵饲料丙；1号对照组饲喂对照饲料1；2号对照组饲喂对照饲料2；3号对照组饲喂对照饲料3；4号对照组饲喂对照饲料4。将各试验组和对照组奶牛进行栓系式饲喂，每天早晨七点与晚上七点由专人饲喂。采用自由饮水，自由采食的方式，每天4：30和15：30进行挤奶工作，记录产奶量。试验期为30天。

产奶量测定：饲喂开始时，每日对对照组和试验组每头奶牛产奶量进行测定，计算每组奶牛平均日产奶量及总产奶量。

结果显示，试验结束时1号试验组、2号试验组、3号试验组、1号对照组、2号对照组、3号对照组、4号对照组的平均日产奶量分别为29kg、30kg、29.5kg、27.5kg、27kg、28.5kg、28kg，总产奶量分别为870kg、900kg、885kg、825kg、810kg、855kg、840kg，1号试验组、 2号试验组、3号试验组平均日产奶量及总产奶量相对于各试验组均显著增加，表明，实施例 1的玉米皮菌体蛋白发酵饲料可以提高奶牛产奶量。

Claims

1.玉米皮菌体蛋白发酵饲料的制备方法，包括：向以玉米皮为主的发酵物料中添加一级发酵菌剂进行一级发酵，得到一级培养产物；向所述培养产物中添加二级发酵菌剂进行二级发酵，得到二级发酵产物，所得二级发酵产物即为玉米皮菌体蛋白发酵饲料；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述黑曲霉(Aspergillus niger)为黑曲霉(Aspergillus niger)CGMCC 3.17612；

和/或，所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)CGMCC 1.15792；

和/或，所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CICC 32236；

和/或，所述布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)为布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)CGMCC 1.15607。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述发酵物料中玉米皮的质量百分比含量为40-50％。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述发酵物料由玉米皮、麸皮、硫酸盐、磷酸盐、镁盐、钠盐和水组成。

5.利用权利要求1-4中任一所述的方法制备的玉米皮菌体蛋白发酵饲料。

6.成套微生物，包括权利要求1或2中所述黑曲霉、所述枯草芽孢杆菌和所述酿酒酵母。

7.根据权利要求6所述的微生物，其特征在于：所述成套微生物还包括权利要求1或2中所述布氏乳杆菌。

8.成套产品，由权利要求1-4中任一所述一级发酵菌剂、所述二级发酵菌剂和/或所述发酵物料组成。

9.权利要求1-4中任一所述方法在制备动物饲料中的应用；

或，权利要求5所述的玉米皮菌体蛋白发酵饲料在饲养动物中的应用；

或，权利要求6或7所述的成套微生物在制备动物饲料中的应用；

或，权利要求8所述的成套产品在制备动物饲料中的应用；

或，权利要求5所述的玉米皮菌体蛋白发酵饲料在提高奶牛产奶量中的应用；

或，权利要求5所述的玉米皮菌体蛋白发酵饲料在制备提高奶牛产奶量产品中的应用；

或，权利要求6或7所述的成套微生物在提高奶牛产奶量中的应用；

或，权利要求6或7所述的成套微生物在制备提高奶牛产奶量产品中的应用；

或，权利要求8所述的成套产品在提高奶牛产奶量中的应用；

或，权利要求8所述的成套产品在制备提高奶牛产奶量产品中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述动物为哺乳动物。