CN113115588A - 用于聚氨酯酶促分解的新型氨基甲酸酯水解酶 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于聚氨酯酶促分解的新的氨基甲酸酯水解酶，并涉及将聚氨酯完全分解成限定的单体的酶促方法。
Description
本发明涉及用于聚氨酯酶促分解的新型氨基甲酸酯水解酶(Urethanase)，以及将聚氨酯完全分解成特定单体的酶促方法。
聚氨酯已在许多正常生活领域中得到认可。例如，它们可以在软质泡沫(床垫、海绵、软垫家具)、硬质泡沫(绝缘材料、建筑材料)、热塑性塑料(运动鞋)或涂层(漆、油墨、胶粘剂)中找到。由于对产品不断增长的需求，进行越来越大量的生产。与此同时，对于使不再需要的聚氨酯产品尽可能可持续地再循环并使得可以再利用所述聚合物的结构单元的方法的需求增长。为此，聚氨酯中的键必须有针对性地裂解，以能够获得特定分解产物和因此使其可再利用。
除了酶在活生物体中发挥的生理功能之外，酶还能以多样化方式用于催化在该上下文之外的化学反应。在此，所述反应可以在比常规化学过程更温和的条件，例如较低温度、中性pH值下以及不使用侵蚀性化学品进行。由此，可以节能、使副产物形成最少化并保护环境，这有助于降低运行成本。在某些情况下，只有通过使用酶，不稳定的反应物才能进行反应(Jaeger, K.-E. & Reetz, M. T. (1998) Microbial lipases form versatiletools for biotechnology. Trends in biotechnology, 16, 396-403)。此外，酶通常是区域选择性、立体选择性和对映选择性的，这使得产物的纯化明显简化并因此能够有效合成难以获得的产物(Hasan, F., Shah, A. A. & Hameed, A. (2006) Industrialapplications of microbial lipases. Enzyme and Microbial Technology, 39, 235-251)。
聚氨酯的再循环主要通过热再循环进行。该过程通常在非常高的温度下且通过非常长的反应时间以分批法的形式以及通过使用催化剂来进行。在此可能发生的是，裂化反应中聚合物链的热分解导致不希望且非特定的分解产物，或也发生环氧环的形成，这导致高的异味和再循环原料中链的不利交联，并因此会使得不可能再利用尤其与人接触的产品，尤其是在制造家具和床垫的泡沫材料生产中。替代地，也进行完全燃烧和由此利用能量，在此虽然获得了能量，但不允许聚合物结构单元的有效再利用。
已知聚氨酯可以被细菌和真菌以一定程度分解。在此，聚酯聚氨酯比聚醚聚氨酯明显更容易受到微生物/酶促分解的影响(Nakajima-Kambe，T., Shigeno-Akutsu, Y.,Nomura, N., Onuma, F. & Nakahara, T. (1999) Microbial degradation ofpolyurethane, polyester polyurethanes and polyether polyurethanes. Appliedmicrobiology and biotechnology, 51, 134-140)。
聚酯聚氨酯的分解可以通过酯键的水解容易地实现。聚酯的相对容易的分解不足为奇，因为在脂质分解时，疏水底物中的酯键从性质而言也必定裂解，且没有氨基甲酸酯键的聚酯也可以被酯酶和脂肪酶相对容易地分解(Marten, E., Müller, R.-J. & Deckwer,W.-D. (2003) Studies on the enzymatic hydrolysis of polyesters I. Lowmolecular mass model esters and aliphatic polyesters. Polymer degradation andstability, 80, 485-501；Marten, E., Müller, R.-J. & Deckwer, W.-D. (2005)Studies on the enzymatic hydrolysis of polyesters. II. Aliphatic-aromaticcopolyesters. Polymer degradation and stability, 88, 371-381.)。在各种文献资源中，用于分解聚氨酯的酶已被表征为酯酶(Allen, A. B., Hilliard, N. P. & Howard,G. T. (1999) Purification and characterization of a soluble polyurethanedegrading enzyme from Comamonas acidovorans. International biodeterioration &biodegradation, 43, 37-41；Blake, R., Norton, W. & Howard, G. (1998) Adherenceand growth of a Bacillus species on an insoluble polyester polyurethane.International biodeterioration & biodegradation, 42, 63-73；Crabbe, J. R.,Campbell, J. R., Thompson, L., Walz, S. L. & Schultz, W. W. (1994)Biodegradation of a colloidal ester-based polyurethane by soil fungi.International biodeterioration & biodegradation, 33, 103-113；Darby, R. T. &Kaplan, A. M. (1968) Fungal susceptibility of polyurethanes. Appliedmicrobiology, 16, 900-905；Howard, G. T., Norton, W. N. & Burks, T. (2012)Growth of Acinetobacter gerneri P7 on polyurethane and the purification andcharacterization of a polyurethanase enzyme. Biodegradation, 23, 561-573；Kaplan, A. M., Darby, R. T., Greenberger, M. & Rodgers, M. (1968) Microbialdeterioration of polyurethane systems. Dev Ind Microbiol, 82, 362-371；Kay,M., Morton, L. & Prince, E. (1991) Bacterial degradation of polyesterpolyurethane. International biodeterioration, 27, 205-222；Vega, R. E., Main,T. & Howard, G. T. (1999) Cloning and expression in Escherichia coli of apolyurethane-degrading enzyme from Pseudomonas fluorescens. Internationalbiodeterioration & biodegradation, 43, 49-55)。那里没有氨基甲酸酯键裂解的明确证据，因为在任何情况下都没有基于具有氨基甲酸酯基团的分子的裂解来进行酶表征。
在许多出版物和专利中描述了聚(酯)氨基甲酸酯用真菌或细菌的分解。但是，这种分解大多只针对相对容易裂解的酯键，并且大多仅通过聚合物分解的宏观观察来证明。这里没有如在本发明中的酯键和氨基甲酸酯键的受控分解，并且经常导致长的分解时间。这些出版物表明，氨基甲酸酯水解酶是广泛使用的酶，但是其没有证明如本发明中所用的它们的特异性能力、使用可能性和分组归类(JP09192633, Tang, Y. W., Labow, R. S.,Santerre, J. P. (2003) Enzyme induced biodegradation of polycarbonate-polyurethanes: dose dependence effect of cholesterol esterase. Biomaterials24 (12), 2003-2011, Vega, R. E., Main, T. & Howard, G. T. (1999) Cloning andexpression in Escherichia coli of a polyurethane-degrading enzyme fromPseudomonas fluorescens. International biodeterioration & biodegradation, 43,49-55)。
用于聚(酯)氨基甲酸酯酶促分解的分解方法是已知的，其中在第一步骤中通过仅使用聚(酯)氨基甲酸酯作为碳源从食酸丛毛单胞菌(Comamonas acidovorans)菌种的培养物中获得酯酶。在复杂的后处理步骤中分离出酯酶，并将其以分批方式用于分解聚(酯)氨基甲酸酯。在此，在多阶段方法中导致长的分解时间，并且没有证明氨基甲酸酯键的特异性裂解(JP 09201192、JP 10271994)。
在许多专利和出版物中描述了聚(酯)氨基甲酸酯用角质酶、酯酶和/或脂肪酶的分解。然而，这里的分解仅针对酯键相对简单的裂解，而不是特异性地针对氨基甲酸酯键。另外，没有描述用于有针对性地控制分解的裂解酯键和氨基甲酸酯键的酶的有针对性的组合。可以认为所描述的方法仅导致很少或没有导致氨基甲酸酯键的裂解。因此不能有效地回收所用的二胺(EP 0968300、US 6,180,381)。
WO 2013/134801描述了使用EC 3类酶分解基于聚醚多元醇的芳族聚氨酯。在此没有说明特异性的酶序列，以致于在所提到的专利中没有证明如本发明中所示的所述方法在特定氨基甲酸酯键分解中的特异性，以及没有证明酯键的受控裂解和氨基甲酸酯键的单独裂解。此外，没有描述在聚合物分解过程中为了维持氨基甲酸酯水解酶活性而调节混合物的pH值。另外，没有描述区域选择性分解，以及没有描述脂族聚(酯)氨基甲酸酯的分解。
WO 2006/019095描述了氨基甲酸酯水解酶和通过蛋白质工程获得的该酶的变体。所述酶可以裂解基于TDA或MDA的氨基甲酸酯低聚物。但是在此，键不是区域选择性裂解，也没有与酯酶组合用于聚合物分解的应用。此外，没有描述来自GatA或Aes家族或任何其它种类的其它氨基甲酸酯水解酶。
因此，本发明的目的是提供可用于氨基甲酸酯键的酶促裂解并优选用于聚氨酯的完全酶促分解的其它酶。此外，应提供能够将聚氨酯分解成特定单体的酶促方法。
该目的通过在权利要求书和下面说明书中公开的实施方案来实现。
在第一个实施方案中，本发明涉及具有选自SEQ ID No.3、SEQ ID No.2、SEQ IDNo.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No. 6、SEQ ID No.8、SEQ ID No.10的氨基酸序列的多肽和所述多肽的变体或具有根据SEQ ID No.7的氨基酸序列的多肽或其变体，其特征在于所述多肽具有氨基甲酸酯水解酶活性。
所提及的多肽参考标记
| SEQ ID No. | 内部命名 | 研究命名 |
| 1 | Enz01 | GatA61 |
| 2 | Enz02 | Aes70 |
| 3 | Enz03 | Aes72 |
| 4 | Enz04 | Aes170 |
| 5 | Enz05 | Aes174 |
| 6 | Enz06 | Aes175 |
| 7 | Enz07 | GatA197 |
| 8 | Enz08 | Aes214 |
| 9 | Enz09 | GatA250 |
| 10 | Enz10 | AesGö56 |
| 11 | Ref01 | SB12 |
| 12 | Ref02 | SB23 |
多肽
术语“多肽”是本领域技术人员公知的。它是指通过肽键彼此连接的至少50，优选至少70个氨基酸的链。多肽既可以包含天然存在的、也可以包含合成的氨基酸。其优选包含已知的蛋白原氨基酸。
对于SEQ ID No.1至5、9和10，通过添加、缺失或替换各多肽中包含的氨基酸的最多10%，优选最多5%来获得变体。SEQ ID No.7的优选变体通过添加、缺失或替换SEQ IDNo.7中定义的氨基酸的最多5％来获得。上述多肽的特别优选的变体通过添加、缺失或替换所公开序列的最多20，优选最多10，更优选最多5个氨基酸来获得。SEQ ID No.6和SEQ IDNo.8的优选变体通过添加、缺失或替换最多3，更优选最多2个氨基酸来获得。上述修饰原则上可以在多肽的各个所需位置连续或不连续地进行。然而，它们优选仅在多肽的N端和/或C端进行。然而，根据本发明通过添加、替换或缺失氨基酸而获得的各个变体的特征在于如下文本申请中所定义的氨基甲酸酯水解酶活性。
如通过SEQ ID No.3、SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQID No.8和SEQ ID No.10所定义的多肽形成在系统发育上不同于迄今已知的具有氨基甲酸酯水解酶活性的唯一酶Ure的种类(见图1)。在该种类中，迄今没有获知具有相应活性的酶。该种类的多肽在下文中也称为“类似Aes的”。
氨基甲酸酯水解酶活性
术语“氨基甲酸酯水解酶活性”是指多肽酶促催化氨基甲酸酯基团裂解的能力。在该方法中，每摩尔氨基甲酸酯基团产生1摩尔胺、1摩尔醇和1摩尔的CO2。
所述氨基甲酸酯基团可以是芳族或脂族键合的氨基甲酸酯基团。在芳族键合的氨基甲酸酯基团的情况下，氮原子直接与芳环键合。在脂族键合的氨基甲酸酯基团的情况下，氮原子与烷基键合。其优选是具有至少一个，更优选至少两个，最优选至少三个碳原子的未支化烷基。在本发明的一个优选实施方案中，具有氨基甲酸酯水解酶活性的多肽能够酶促裂解芳族键合的氨基甲酸酯基团。
可以通过裂解合适的模型底物来检查多肽是否具有氨基甲酸酯水解酶活性。
对于裂解芳族键合的氨基甲酸酯基团的能力，优选将4-硝基苯基氨基甲酸乙酯(ENPC)用作模型底物。通过测定4-硝基苯胺的浓度增加来证明裂解。这优选在405 nm的波长处以光度法进行。所述酶活性优选在作为底物的0.2mg/L ENPC的存在下在含有6.25体积％乙醇且包含100 mM K2HPO4/KH2PO4的反应缓冲液，pH 7中测定。酶与ENPC在反应缓冲液中的温育优选在室温下进行，且优选持续24小时。
对于裂解脂族键合的氨基甲酸酯基团的能力，优选将苯乙基氨基甲酸乙酯(EPEC)用作模型底物。通过测定苯乙胺的浓度增加来证明裂解。这优选通过HPLC进行。所用的反应缓冲液和反应条件优选对应于以上对于ENPC描述的参数。
酶促裂解
术语“氨基甲酸酯基团的酶促裂解”是指在具有氨基甲酸酯水解酶活性的多肽存在下的上述氨基甲酸酯基团的裂解与在相同反应条件下使用不含酶的反应缓冲液温育时或在相同条件下在无活性多肽存在下使用反应缓冲液温育时相比更迅速。无活性多肽的优选模型是牛血清白蛋白。如果在存在要测定的多肽的情况下，氨基甲酸酯基团的裂解比在使用BSA的在其它方面相同的对照中进行更迅速，则所述多肽具有如本申请中所理解的氨基甲酸酯水解酶活性。
用途
在另一个实施方案中，本发明涉及具有选自SEQ ID No.3、SEQ ID No.2、SEQ IDNo.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No. 6、SEQ ID No.8、SEQ ID No.10的氨基酸序列的多肽和所述多肽的变体或具有根据SEQ ID No.7的氨基酸序列的类似GatA的多肽或其变体的用途，其特征在于所述多肽具有用于氨基甲酸酯键的酶促裂解的氨基甲酸酯水解酶活性。
除非另外明确定义，否则以上给出的所有定义也适用于所述实施方案。
氨基甲酸酯分解成低分子量分解产物
在另一个实施方案中，本发明涉及将聚酯聚氨酯分解成低分子量分解产物的方法，其包括以下步骤：
a)裂解所述聚酯聚氨酯中包含的酯基团；和
b)用具有氨基甲酸酯水解酶活性的多肽裂解所述聚酯聚氨酯中包含的氨基甲酸酯基团；
条件是方法步骤a)和b)可以任意顺序进行或者同时进行。
特别适合作为具有氨基甲酸酯水解酶活性的肽的是在本申请中描述的具有如选自SEQ ID No.1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的组所定义的氨基酸序列和与上述序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的肽。非常特别优选具有如SEQ ID No.3或7所定义的氨基酸序列和与上述序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的肽。
因此，在一个特别优选的实施方案中，本发明涉及将聚酯聚氨酯分解成低分子量分解产物的方法，其包括以下步骤：
a)裂解所述聚酯聚氨酯中包含的酯基团；和
b)用多肽处理所述聚氨酯，所述多肽具有氨基甲酸酯水解酶活性且具有选自SEQID No.1至SEQ ID No.10的氨基酸序列和与上述序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；
条件是方法步骤a)和b)可以任意顺序进行或者同时进行。
优选在方法步骤b)之前进行方法步骤a)。
方法步骤a)优选用脂肪酶进行。该脂肪酶优选是水溶性的且不以固定形式存在。在此，“固定”是指生物技术中通常已知的肽的结合，特别是抗体或酶在血管表面或水不溶性颗粒上的结合。
特别优选地使用能够裂解三丁酸甘油酯的脂肪酶。还更特别优选地使用具有如SEQ ID No.11或SEQ ID No.12所定义的氨基酸序列或与上述两个序列之一具有至少90％、优选至少95％的序列同一性的氨基酸序列并能够裂解三丁酸甘油酯的多肽。方法步骤a)优选在其中所用脂肪酶显示出活性的反应条件下进行。这样的条件可以通过使用常见生化方法的常规实验来确定。
由于根据本发明具有氨基甲酸酯水解酶活性的多肽在中性范围内具有其最大活性，所以方法步骤b)优选在6.0至10.0，优选6.0至8.0的pH值下进行。pH值可以使用本领域技术人员已知且合适的所有碱进行调节。
术语“聚酯聚氨酯”是指由一种或多种聚酯多元醇和一种或多种异氰酸酯形成的聚氨酯。所述聚氨酯可以是发泡的或非发泡的。其优选是发泡的。为了增加比表面积，优选在进行方法步骤a)和b)之前将所述聚氨酯粉碎。当聚氨酯应以非发泡形式使用时，这是特别优选的。可以以本领域技术人员熟悉的所有方式，优选通过研磨、刨片、撕裂或切割进行粉碎。
所述聚氨酯包含至少一种芳族、脂族或脂环族异氰酸酯作为异氰酸酯组分。所述聚氨酯优选仅包含芳族异氰酸酯。优选的芳族异氰酸酯是亚甲基二苯基异氰酸酯(MDI)、具有三个或更多个核的MDI变体、萘二异氰酸酯和甲苯二异氰酸酯。特别优选的芳族异氰酸酯是亚甲基二苯基异氰酸酯(MDI)、具有三个或更多个核的MDI变体和甲苯二异氰酸酯。具有三个或更多个核的MDI变体是合成的副产物，且也可包含在聚氨酯中。要分解的聚氨酯特别优选包含甲苯2,4-二异氰酸酯和甲苯2,6-二异氰酸酯。
术语“聚酯多元醇”是本领域技术人员已知的，其是每分子平均含有至少1.5，优选至少1.8，更优选至少2.0个羟基的聚酯。包含在要分解的聚氨酯中的聚酯多元醇特别优选具有1.5至6.0的官能度。它们含有任意组合的芳族和/或脂族多元醇以及芳族和/或脂族多元羧酸作为结构组分。
基于聚酯的聚氨酯泡沫的低分子量分解产物优选具有最多1000g/mol的分子量。其优选是
(i)衍生自用于制备所涉聚氨酯的异氰酸酯的胺，例如在甲苯2,4-二异氰酸酯的情况下的甲苯-2,4-二胺；和
(ii)用于形成在合成所涉聚氨酯中使用的聚酯多元醇的醇和羧酸。
在本申请中，“多元醇”应理解为是指具有至少两个羟基的各种化合物。所述多元醇优选具有最多300g/mol的分子量。作为基于聚酯的聚氨酯泡沫的低分子量分解产物的优选多元醇选自下组：乙二醇、二乙二醇、1,4-丁二醇、三乙二醇、丙二醇、1,2-二丙二醇、新戊二醇、甘油、1,1,1-三羟甲基丙烷、蔗糖、山梨糖醇和季戊四醇。
在本申请中，“多元羧酸”应理解为是指含有至少两个羧基的各种化合物。所述多元羧酸优选具有最多300g/mol的分子量。作为基于聚酯的聚氨酯泡沫的低分子量分解产物的优选多元羧酸选自琥珀酸、戊二酸、己二酸、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、苯三甲酸、油酸和蓖麻油酸。作为基于聚酯的聚氨酯泡沫的低分子量分解产物的特别优选的多元羧酸选自琥珀酸、戊二酸、己二酸、邻苯二甲酸、对苯二甲酸和苯三甲酸。
在本申请中，“多胺”应理解为是指含有至少两个氨基的各种化合物。所述多胺优选具有最多300g/mol的分子量。作为基于聚酯的聚氨酯泡沫的低分子量分解产物的优选多胺选自下组：亚甲基-4,4'-二胺、亚甲基-2,4'-二胺、亚甲基-2,2'-二胺、甲苯-2,4-二胺、甲苯-2,6-二胺、六亚甲基二胺、异佛尔酮二胺、苯二亚甲基二胺、五亚甲基二胺、对苯二胺、丁二胺和H12-亚甲基二胺。更优选选自下组的多胺：亚甲基-4,4'-二胺、亚甲基-2,4'-二胺、亚甲基-2,2'-二胺、萘-1,4-二胺、萘-1,5-二胺、萘-1,6-二胺、甲苯-2,4-二胺和甲苯-2,6-二胺。特别优选选自下组的多胺：亚甲基-4,4'-二胺、亚甲基-2,4'-二胺、亚甲基-2,2'-二胺、甲苯-2,4-二胺和甲苯-2,6-二胺。
根据本发明的方法能够在两个方面有效地再循环聚氨酯：(i)该方法本身由于温和的反应条件而不需要使用高能量；(ii)由于形成了本身作为有价值化学原料的特定分解产物，因此能够在材料方面利用该聚氨酯。
相比之下，热糖酵解在非常高的温度下进行，所涉热糖酵解目前是用于再循环聚氨酯的最常用化学分解法且已经工业上投入实践。在此，关注点在于多元醇的获得，而胺作为干扰因子被分离出来且不进行回收。在非酶促水解中，多元醇和胺均作为产物获得。然而，该方法在高温和高环境压力下进行。
附图概述：
图1：本申请中公开的氨基酸序列的系统发育分析的结果
以下实施例仅用于阐明本发明。它们不应以任何方式限制权利要求书的范围。
实施例
用ENPC测试酶活性
在“MTS 2/4”平板振摇器(IKA，Staufen)上在室温和900 rpm下将0.2 mg/ml的ENPC在含有6.25体积%乙醇的pH 7.0下的100 mM KH2PO4/K2HPO4中温育24小时。
过滤样品后，将各自100μL转移到具有平底的透明96孔板“ UV-Star”(GreinerBio-One，Frickenhausen)中，并测定在405和480nm的吸光度。测量在480 nm的值，因为4-硝基苯胺在此不再明显吸收，并且因此在这两个波长处出现高的值的情况下，很有可能其不是4-硝基苯胺而是在405nm具有吸光度的另一物质。
在氨基甲酸酯水解酶的水解情况下，几乎无色的ENPC裂解成4-硝基苯胺、CO2和乙醇，其中在“Infinite M1000PRO”微量滴定板光度计(Tecan，Männedorf，瑞士)中可以在405nm处检测到4-硝基苯胺。使用3.4.2.0版本的“ i-control”软件(Tecan，Männedorf，瑞士)来控制光度计。另外使用“二甲氨基苯基偶氮苯磺酰胺(Dabsylamine)”法通过HPLC检测4-硝基苯胺。
高压液相色谱法(HPLC)
高压液相色谱法在用于UV和可见光区域的配备有自动进样器和DAD(二极管阵列检测器)的Agilent Technologies(Santa Clara，USA) 1100系列仪器上进行。对于所有测量，使用具有3.5μm粒径和4.6 x 75 mm尺寸的“Zorbax XDB-C18”柱(AgilentTechnologies，Santa Clara，USA)。在所有方法中注入5µL样品并将柱调温至40℃。流量通常为1.5 ml/min。由于使用反相柱，在所有方法中用增加浓度的有机溶剂进行洗脱。
使用“二甲氨基苯基偶氮苯磺酰胺”方法来检测和定量二甲氨基苯基偶氮苯磺酰化的脂族胺和氨基甲酸酯。由于高固有吸收，可以在没有衍生化的情况下通过该方法定量芳族胺和氨基甲酸酯。除AcN以外，还用作洗脱液的是pH 7.0的10 mM磷酸钠缓冲液，向其中加入0.005％(w/v)的叠氮化钠以防止微生物生长。为了预防由受污染的泵阀引起的压力问题，稍后将5％(v/v)的dd H2O添加到AcN中并调适该方法(“二甲氨基苯基偶氮苯磺酰胺95”)。使用“二甲氨基苯基偶氮苯磺酰胺-12-MeOH”方法来测定来自4,4'-MDA与EC的酶催化反应的MDEC量，其中水性组分被酸化，且由此质子化的芳族胺很早被洗脱。利用“二甲氨基苯基偶氮苯磺酰胺95-H2O”方法来研究4,4'-MDA与DMC、2,4-TDA与DMC以及2,4-TDA与EC的反应，该方法与“二甲氨基苯基偶氮苯磺酰胺95”的不同之处仅在于使用纯dd H2O代替缓冲液。使用A.02.09[017]版本的“OpenLAB CDS ChemStationLC”软件(AgilentTechnologies, Santa Clara, USA)分析数据。
二甲氨基苯基偶氮苯磺酰胺：洗脱液：AcN和10 mM Na2HPO4/NaH2PO4，pH 7.0
t [min] AcN
0 5
6.5 85
8.0 5
10.0 5
二甲氨基苯基偶氮苯磺酰胺95：洗脱液：含5%(v/v)dd H2O的AcN和10 mM Na2HPO4/NaH2PO4，pH 7.0
t [min] AcN(+ 5% (v/v) dd H2O) %
0 5
6.5 90
8.0 5
10.0 5
二甲氨基苯基偶氮苯磺酰胺-12-MeOH-lang：洗脱液：甲醇和含0.1%(v/v)甲酸的dd H2O
t [min] 甲醇%
0 5
2.5 35
8.0 70
8.5 85
10.0 5
12.0 5
| SEQ ID No. | 研究命名 | ENPC的水解 |
| 1 | GatA61 | + |
| 2 | Aes70 | + |
| 3 | Aes72 | + |
| 4 | Aes170 | + |
| 5 | Aes174 | + |
| 6 | Aes175 | + |
| 7 | GatA197 | + |
| 8 | Aes214 | + |
| 9 | GatA250 | + |
| 10 | AesGö56 | + |
| 11 | SB12 | + |
| 12 | SB23 | + |
用EPEC测试酶活性
如对于ENPC所述进行测试。如上所述通过HPLC检测形成的苯乙胺。
| SEQ ID No. | 研究命名 | EPEC的水解 |
| 1 | GatA61 | + |
| 2 | Aes70 | - |
| 3 | Aes72 | + |
| 4 | Aes170 | - |
| 5 | Aes174 | + |
| 6 | Aes175 | - |
| 7 | GatA197 | + |
| 8 | Aes214 | + |
| 9 | GatA250 | + |
| 10 | AesGö56 | - |
| 11 | SB12 | + |
| 12 | SB23 | + |
酶的系统发育分析
使用10.1.0版本的“MegAlign”程序(DNASTAR，Madison，USA)创建用于氨基甲酸酯水解酶相关性的系谱树。使用“ClustalW”以标准设置创建系谱树。
使用“Clustal Omega”程序(Sievers等，2011)创建不同蛋白质的比对。
使用BLASTP(Altschul等，1990)对蛋白质序列进行数据库搜索。
使用来自NCBI的“ORF Finder”在线应用程序(Wheeler等，2007)找出经测序的宏基因组序列中的开放阅读框(ORF)。
将相同的水解酶基因减少为一个代表，并使用ORF检查所有序列，以获得基因的完整序列。在搜索中还允许使用替代性的起始密码子。在此显而易见的是，对于来自pLip214的基因，存在与aes类似的N端区域，但不能找到起始密码子。该基因片段不位于宏基因组载体的插入片段的边缘，这可解释截短基因。为了进一步分析，将与aes类似但无起始密码子的区域用作该基因的序列。将所识别的推定的氨基甲酸酯水解酶基因进行计算机翻译，并使用BLASTP与NCBI数据库进行比较。根据其在脂肪酶库中的编号以及与GatA或Aes的类似性来命名所述推定的氨基甲酸酯水解酶。
为了将这两个所识别的氨基甲酸酯水解酶种类(GatA和Aes)的各个成员相互比较，在每种情况下使用“Clustal Omega”程序形成比对，并另外使用“MegAlign”程序创建系谱树，其中为所述系谱树创建这两个种类的共同比对。还将来自文献的酶(Ure、Ana和NfpolyA)的序列(它们均与GatA类似)一起引入所述序列比较中。
所述系谱树如图1所示。这表明所述两个种类位于不同的分支中，其中在某些情况下这两个种类内的类似性关系不太明显，这可由节点处较小的自举(bootstrapping)值看出。GatA种类内看起来存在比Aes种类内更大的差异，这可由该种类中较大的分支长度看出。尤其Aes70和Aes72以及Aes175和Aes214显示出非常高的类似性，这既通过该系谱树中相对短的分支、也通过BLASTP搜索中发现具有最大类似性的相同蛋白质表明。
制备用于分解试验的聚氨酯泡沫
以常规用于制备聚氨酯泡沫材料的加工方式根据一步法使以下所列的原料进行相互反应。表观密度为38 kg/m3 (DIN EN ISO 845，2009年10月版)，40％压缩率下的压缩硬度为3.5kPa (DIN EN ISO 3386-1，2015年10月版)。
配方：
100份 Desmophen 2200B
3份 水
19份 Desmodur T80
19份 Desmodur T65
0.7份 N,N'-二甲基哌嗪
1份 Tegostab 8325。
原料：
Desmophen®2200B，Covestro Deutschland AG公司；基于己二酸、二乙二醇和1,1,1-三羟甲基丙烷的支化聚酯多元醇，具有约60mg KOH/g的羟基值。
Desmodur®T80，Covestro Deutschland AG公司；混合比为约80:20的甲苯2,4-和2,6-二异氰酸酯的异构体混合物。
Desmodur®T65，Covestro Deutschland AG公司；混合比为约67:33的甲苯2,4-和2,6-二异氰酸酯的异构体混合物。
N,N'-二甲基哌嗪，abcr GmbH公司的催化剂
Tegostab®B 8325，泡沫稳定剂，Evonik公司
水；去离子水。
所述配方可以用90至115的指数进行。所述指数是指异氰酸酯基团与异氰酸酯反应性基团的摩尔比乘以100。
聚氨酯泡沫的分解
使用的底物是用甲苯二异氰酸酯制备的聚酯聚氨酯。分解发生在两个反应步骤中。首先，将所述泡沫用脂肪酶温育。在此产生的低聚物在中和后用氨基甲酸酯水解酶裂解成单体。
在第一步骤中，将1g泡沫与20ml pH 7.0的磷酸钾缓冲液和大约30mg CalB冻干物“Chirazyme L2”(Roch，Basel，瑞士)(在此被称为SEQ ID No.12)加入50ml的离心管中，并在37℃和200 rpm下温育5天。通过与没有酶的阴性对照比较，用“MH2”显微镜(Olympus，Hamburg)拍摄残余泡沫块。然后将浑浊的溶液在25℃和4000 rpm下在大容量离心机中离心10分钟。用1M NaOH将澄清的上清液调节至pH 7.0。在室温下约6小时后，将稍微降低的pH值重新滴定至7.0，并对溶液进行无菌过滤。将该可溶性低聚物在4℃下储存直至使用。
为了进一步使用，将该可溶性低聚物加入1.5mL反应容器中，向其中添加20μL DMF和150μL对于各自氨基甲酸酯水解酶而言最佳的缓冲液(100mM磷酸钠缓冲液，调节至pH6.0至pH 8.0的对于氨基甲酸酯水解酶而言的各自最佳值)。然后各自加入30μL未稀释且经纯化的氨基甲酸酯水解酶，并将所述混合物在30℃和1000rpm下在加热块上振摇。含有酶储存缓冲液的混合物用作阴性对照。三天后，将所述混合物通过具有PVDF膜且孔径为0.2μm的滤板(Corning，Kaiserslautern)过滤，并使用“二甲氨基苯基偶氮苯磺酰胺95”方法通过HPLC检查滤液中的所形成的甲苯2,4-和2,6-二异氰酸酯。
与不含酶的阴性对照相比，在含有CalB冻干物的混合物中反应后就已经可从宏观上看出，泡沫已失去了各种结构并作为含有小泡沫颗粒的混浊悬浮液存在。在实验开始时几乎完全被泡沫吸收的缓冲液稍后包含解体颗粒形式的整个泡沫块。HPLC分析显示了归咎于所形成的低聚物的明显峰，但是没有指示形成甲苯二胺(TDA)的峰(数据未显示)。
向所述低聚物溶液中添加所有经表达的氨基甲酸酯水解酶和SEQ ID No.12，并然后通过HPLC检查TDA的形成。对于含有SEQ ID No.7和SEQ ID No.3的混合物可以证明这一点，其中在这两种混合物中测得的2,6-TDA量大致相同，并且发现在含有Enz03的混合物中2,4-TDA的形成明显更显著。通过SEQ ID No.3，形成0.057g/L的2,4-TDA和0.025g/L的2,6-TDA，而SEQ ID No.7导致形成0.0075g/L的2,4-TDA和0.024g/L的2,6-TDA。另外，与其它混合物相比，通过这两种酶显示出低聚物峰的变化和普遍减小。在SEQ ID No.7的情况下，在没有事先预处理的情况下就可从聚酯PU泡沫中裂解出TDA，而在SEQ ID No.3的情况下，这仅通过在事先酯裂解之后提供经中和的低聚物才可能实现。被识别为低聚物峰的在用氨基甲酸酯水解酶进一步处理后来自用SEQ ID No.12水解的产物峰显著减小的这一事实(其中明显形成TDA)证实了这些峰是指低聚物。
还可以表明，不溶性的基于TDI的聚酯聚氨酯泡沫可以通过两个反应步骤的组合而裂解成其单体。在第一步骤中，通过使用脂肪酶CalB经由酯键水解来预消化PU泡沫。中和后，将释放的低聚物用作过表达的氨基甲酸酯水解酶的底物。在此，氨基甲酸酯键水解并且可以检测到单体形式的TDA。
最终可以表明，借助于脂肪酶的酯键的水解裂解、低聚物溶液的中和以及随后的氨基甲酸酯键的水解裂解的组合允许使聚氨酯完全分解成特定单体。
Claims (11)
1.将聚酯聚氨酯分解成低分子量分解产物的方法，其包括以下步骤：
a)裂解所述聚酯聚氨酯中包含的酯基团；和
b)用具有氨基甲酸酯水解酶活性的多肽裂解所述聚酯聚氨酯中包含的氨基甲酸酯基团；
条件是方法步骤a)和b)可以任意顺序进行或者同时进行。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述具有氨基甲酸酯水解酶活性的多肽具有选自SEQID No.1至SEQ ID No.10的氨基酸序列和与上述序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中方法步骤a)在方法步骤b)之前进行。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中多元醇、多元羧酸和多胺作为方法产物形成。
5.如权利要求4所述的方法，其中形成至少一种选自下组的多胺：亚甲基-4,4'-二胺、亚甲基-2,4'-二胺、亚甲基-2,2'-二胺、萘-1,4-二胺、萘-1,5-二胺、萘-1,6-二胺、甲苯-2,4-二胺和甲苯-2,6-二胺。
6.如权利要求4所述的方法，其中形成至少一种选自下组的多元醇：乙二醇、二乙二醇、1,4-丁二醇、三乙二醇、丙二醇、1,2-二丙二醇、新戊二醇、甘油、1,1,1-三羟甲基丙烷、蔗糖、山梨糖醇和季戊四醇。
7.如权利要求4所述的方法，其中形成至少一种选自下组的多元羧酸：琥珀酸、戊二酸、己二酸、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、苯三甲酸、油酸和蓖麻油酸。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中方法步骤a)用脂肪酶进行。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述脂肪酶具有如SEQ ID No.11、SEQ ID No.12中的氨基酸序列或与SEQ ID No.11或SEQ ID No.12具有至少90％序列同一性的上述序列的变体。
10.具有选自SEQ ID No.3、SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No. 6、SEQ ID No.8、SEQ ID No.10的氨基酸序列的多肽和所述多肽的变体或具有根据SEQ IDNo.7的氨基酸序列的类似GatA的多肽或其变体的用途，其特征在于：所述多肽具有用于氨基甲酸酯键的酶促裂解的氨基甲酸酯水解酶活性。
11.根据权利要求10所述的用途，其中所述氨基甲酸酯基团是芳族键合的。
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