KR20210054501A

KR20210054501A - 폴리우레탄의 효소 분해를 위한 신규 우레탄분해효소(urethanases)

Info

Publication number: KR20210054501A
Application number: KR1020217000851A
Authority: KR
Inventors: 나탈리 비트너; 하트뭇 네프거; 게사 벤켄; 게르노트 예거; 스완체 벤켄; 루카스 라이스키
Original assignee: 코베스트로 인텔렉쳐 프로퍼티 게엠베하 운트 콤파니 카게
Priority date: 2018-06-21
Filing date: 2019-11-13
Publication date: 2021-05-13
Also published as: US20210269834A1; JP2021531036A; EP4151727A1; EP3587570A1; CN113115588A; PT3587570T; EP3587570B1; WO2019243293A1; HUE060559T2; EP3810772A1; CA3104429A1; US20220282287A1

Abstract

본 발명은 폴리우레탄의 효소 분해를 위한 새로운 우레탄분해효소 및 정의된 모노머로의 폴리우레탄의 완전한 분해를 위한 효소 공정에 관한 것이다.

Description

폴리우레탄의 효소 분해를 위한 신규 우레탄분해효소(urethanases)

폴리우레탄은 일상 생활의 많은 영역에서 자리잡고 있다. 예를 들어, 이는 연질 폼(매트리스, 스폰지, 겉천이 씌워진(upholstered) 가구), 경질 폼(단열재, 건축 자재), 열가소성 수지(스포츠화), 또는 코팅(광택제, 페인트, 접착제)에서 발견될 수 있다. 제품에 대한 꾸준히 증가하는 수요는 더 많은 양이 생산되고 있음을 의미한다. 동시에, 더 이상 필요하지 않는 폴리우레탄 제품의 지속가능한 재활용을 최대화 하여, 폴리머의 구성 요소(building blocks)가 재사용되는 것을 가능하게 하는 방법에 대한 요구가 증가하고 있다. 이를 위해, 폴리우레탄의 결합은 정의된 분해 생성물을 얻어 이를 재활용할 수 있도록 선택적으로 절단되어야 한다.

효소가 살아있는 유기체에서 수행하는 생리적 기능에 더해, 효소는 이러한 맥락 밖에서 화학 반응의 촉매 작용을 위해 다양한 방식으로 사용될 수 있다. 상기 반응은 예를 들어 보다 낮은 온도, 중성 pH, 및 공격적인 화학물질의 비사용과 같은, 종래의 화학 공정보다 온화한 조건 하에서 수행될 수 있다. 이를 통해 에너지를 절약할 수 있고, 부산물 형성을 최소화할 수 있으며, 환경을 보호할 수 있어, 운영 비용을 절감할 수 있다. 몇몇 경우에, 효소의 사용을 통해서만 불안정한 출발 물질을 반응 공급 원료로 사용할 수 있다(Jaeger, K.-E. & Reetz, M. T. (1998) Microbial lipases form versatile tools for biotechnology. Trends in biotechnology, 16, 396-403). 게다가, 효소는 종종 위치-, 입체-, 및 거울상 선택적이고, 이는 생성물의 정제를 실질적으로 쉽게 만들어, 다른 방식으로 구하기 어려운 생성물의 효율적인 합성을 가능하게 할 수 있다(Hasan, F., Shah, A. A. & Hameed, A. (2006) Industrial applications of microbial lipases. Enzyme and Microbial Technology, 39, 235-251).

폴리우레탄의 재활용은 열 재활용을 통해 주로 수행된다. 상기 공정은 배치 공정에서 매우 긴 반응 시간 및 매우 높은 온도에서, 촉매의 사용과 함께 일반적으로 발생한다. 상기 공정에서 발생할 수 있는 것은 크래킹 반응에서의 폴리머 사슬의 열 분해가 원치 않고 정의되지 않은 분해 산물을 유도하는 것 또는 에폭시 링의 형성이 발생하는 것이고, 이는 심한 악취 및 재활용된 원료에서 사슬의 불리한 가교를 결과하며, 이는 인간과 밀접한 접촉이 있는 제품, 구체적으로 가구 및 매트리스에 사용되는 폼 제조에 상기 원료를 재사용하는 것을 불가능하게 할 수 있다. 대안적인 옵션은 완전 연소 및 에너지 회수를 수행하는 것인데, 이는 에너지를 발생시키지만, 폴리머 구성 요소의 효율적인 재사용을 허용하지 않는다.

폴리우레탄이 박테리아 및 균류에 의해 어느 정도 분해될 수 있음은 알려져 있다. 폴리에스테르 폴리우레탄은 폴리에테르 폴리우레탄 보다 이러한 미생물/효소 분해에 훨씬 더 민감하다(Nakajima-Kambe, T., Shigeno-Akutsu, Y., Nomura, N., Onuma, F. & Nakahara, T. (1999) Microbial degradation of polyurethane, polyester polyurethanes and polyether polyurethanes. Applied microbiology and biotechnology, 51, 134-140).

폴리에스테르 폴리우레탄의 분해는 에스테르 결합의 가수분해에 의해 쉽게 달성될 수 있다. 폴리에스테르의 상대적으로 간단한 분해는, 자연에서 소수성 기질의 에스테르 결합이 지질이 분해될 때 또한 절단되어야 하고, 우레탄 결합이 없는 폴리에스테르가 마찬가지로 에스테라아제 및 리파아제에 의해 비교적 쉽게 분해될 수 있음을 감안할 때, 놀랍지 않다(Marten, E., Muller, R.-J. & Deckwer, W.-D. (2003) Studies on the enzymatic hydrolysis of polyesters I. Low molecular mass model esters and aliphatic polyesters. Polymer degradation and stability, 80, 485-501; Marten, E., Muller, R.-J. & Deckwer, W.-D. (2005) Studies on the enzymatic hydrolysis of polyesters. II. Aliphatic-aromatic copolyesters. Polymer degradation and stability, 88, 371-381.). 폴리우레탄의 분해를 위해 사용되는 효소는 다양한 문헌 출처에서 에스테라아제로 특성화되었다(Allen, A. B., Hilliard, N. P. & Howard, G. T. (1999) Purification and characterization of a soluble polyurethane degrading enzyme from Comamonas acidovorans. International biodeterioration & biodegradation, 43, 37-41; Blake, R., Norton, W. & Howard, G. (1998) Adherence and growth of a Bacillus species on an insoluble polyester polyurethane. International biodeterioration & biodegradation, 42, 63-73; Crabbe, J. R., Campbell, J. R., Thompson, L., Walz, S. L. & Schultz, W. W. (1994) Biodegradation of a colloidal ester-based polyurethane by soil fungi. International biodeterioration & biodegradation, 33, 103-113; Darby, R. T. & Kaplan, A. M. (1968) Fungal susceptibility of polyurethanes. Applied microbiology, 16, 900-905; Howard, G. T., Norton, W. N. & Burks, T. (2012) Growth of Acinetobacter gerneri P7 on polyurethane and the purification and characterization of a polyurethanase enzyme. Biodegradation, 23, 561-573; Kaplan, A. M., Darby, R. T., Greenberger, M. & Rodgers, M. (1968) Microbial deterioration of polyurethane systems. Dev Ind Microbiol, 82, 362-371; Kay, M., Morton, L. & Prince, E. (1991) Bacterial degradation of polyester polyurethane. International biodeterioration, 27, 205-222; Vega, R. E., Main, T. & Howard, G. T. (1999) Cloning and expression in Escherichia coli of a polyurethane-degrading enzyme from Pseudomonas fluorescens. International biodeterioration & biodegradation, 43, 49-55). 우레탄기를 갖는 분자의 절단에 기초하여 수행되는 효소 특성화의 사례가 없기 때문에 우레탄 결합의 절단에 대한 명확한 증거는 없다

균류 또는 박테리아에 의한 폴리(에스테르 우레판)의 분해는 많은 간행물 및 특허에 설명된다. 그러나 상기 분해는 대부분 비교적 쉽게 절단되는 에스테르 결합만을 대상으로 하며, 폴리머 분해의 거시적 관찰에 의해서만 입증된다. 여기에는 본원 발명에서와 같은 에스테르 및 우레탄 결합의 제어된 분해가 없고, 긴 분해 시간이 종종 결과된다. 상기 간행물은 우레탄분해효소가 일반적으로 발견되는 효소임을 보여주나, 본 발명에 사용되는 특정 능력, 잠재적 용도, 및 이들의 그룹화에 대한 입증을 제공하지 않는다(JP09192633, Tang, Y. W., Labow, R. S., Santerre, J. P. (2003) Enzyme induced biodegradation of polycarbonate-polyurethanes: dose dependence effect of cholesterol esterase. Biomaterials 24 (12), 2003-2011, Vega, R. E., Main, T. & Howard, G. T. (1999) Cloning and expression in Escherichia coli of a polyurethane-degrading enzyme from Pseudomonas fluorescens. International biodeterioration & biodegradation, 43, 49-55)

폴리(에스테르 우레탄)의 효소 분해를 위한 분해 공정은 알려져 있으며, 제1 단계는 탄소원으로 폴리(에스테르 우레탄)만을 사용하여 Comamonas acidovorans 균주의 배양물로부터 에스테라아제를 얻는 것이다. 복잡한 정제 단계에서, 상기 에스테라아제는 분리되어 배치 공정에서 폴리(에스테르 우레탄)의 분해에 사용된다. 이는 다단계 공정에서 긴 분해 시간을 발생시키고, 우레탄 결합의 특정 절단의 증명을 제공하지 않는다(JP 09201192, JP 10271994).

큐티나제, 에스테라아제, 및/또는 리파아제를 사용하는 폴리(에스테르 우레탄)의 분해는 다양한 특허 및 간행물에 설명되어 있다. 그러나 여기서의 분해는 비교적 간단한 에스테르 결합의 분해만을 대상으로 할 뿐, 구체적으로 우레탄 결합이 아니다. 또한, 분해의 선택적 제어를 위한 에스테르 및 우레탄 결합을 절단하는 효소의 특정 조합은 설명되지 않는다. 설명된 공정은 우레탄 결합의 절단을 거의 또는 전혀 결과하지 않는다고 가정할 수 있다. 이는 사용된 디아민을 효율적으로 회수할 수 없음을 의미한다(EP 0968300, US 6180381).

WO 2013/134801은 클래스 EC 3의 효소를 사용한 폴리에테르 폴리올에 기초한 방향족 폴리우레탄의 분해를 설명한다. 본원 발명에 나타난 바와 같은 특정 효소 서열이 언급되지 않았고, 결과적으로 특정 우레탄 결합의 분해 공정의 특이성이나 에스테르 결합의 제어된 절단 및 우레탄 결합의 분리 절단도 인용된 특허에서 입증되지 않았다. 또한, 우레탄분해효소 활성을 유지하기 위한 폴리머 분해 동안의 혼합물의 pH의 조절에 대한 설명이 없다. 더욱이, 위치 선택적 분해나 지방족 폴리(에스테르 우레탄)의 분해도 설명되지 않는다.

WO 2006/019095는 우레탄분해효소 및 단백질 엔지니어링에 의해 얻어지는 상기 효소의 변이체를 설명한다. 상기 효소는 TDA 또는 MDA에 기초하는 우레탄 올리고머를 절단할 수 있다. 그러나 결합은 여기에서 위치 선택적으로 절단되지 않으며, 폴리머의 분해를 위한 에스트라아제와 조합한 어떠한 적용도 없다. 또한, GatA 또는 Aes 패밀리 또는 임의의 다른 그룹의 어떠한 다른 우레탄분해효소도 설명되지 않는다.

따라서 본 발명의 목적은 우레탄 결합의 효소 절단에, 바람직하게는 폴리우레탄의 완전한 효소 절단에 사용될 수 있는 추가 효소를 제공하는 것이었다. 또한, 정의된 모노머로 폴리우레탄을 분해할 수 있는 효소 공정이 제공되어야 한다.

상기 목적은 청구항 및 아래의 설명에 개시되는 구현 예에 의해 달성된다.

첫번째 구현 예에서, 본원 발명은 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 10, 및 상기 폴리펩티드의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 관한 것 또는 SEQ ID No. 7 또는 이의 변이체에 따른 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 관한 것이며, 상기 폴리펩티드가 우레탄분해효소 활성을 갖는 것을 특징으로 한다.

도 1: 본 출원에 개시된 아미노산 서열의 계통 발생 분석 결과

언급된 폴리펩티드에 대한 참조

폴리펩티드용어 "폴리펩티드"는 당업자에게 잘 알려져 있다. 이는 펩티드 결합에 의해 서로 연결되는 아미노산의 적어도 50개, 바람직하게는 적어도 70개의 사슬을 의미한다. 폴리펩티드는 자연 발생 및 합성 아미노산 모두를 포함할 수 있다. 이는 바람직하게는 공지된 단백질생성(proteinogenic) 아미노산을 포함한다.

SEQ ID No. 1 내지 5, 9, 및 10의 경우, 변이체는 각각의 폴리펩티드에 존재하는 아미노산을 10%까지, 바람직하게는 5%까지 추가, 결실, 또는 교환함으로써 얻어진다. SEQ ID No. 7의 바람직한 변이체는 SEQ ID No. 7에 정의된 아미노산을 5%까지 추가, 결실, 또는 교환함으로써 얻어진다. 상기 언급된 폴리펩티드의 특히 바람직한 변이체는 개시된 서열의 아미노산을 최대 20개, 바람직하게는 최대 10개, 보다 바람직하게는 5개를 추가, 결실, 또는 교환함으로써 얻어진다. SEQ ID No. 6 및 SEQ ID No. 8의 바람직한 변이체는 아미노산을 최대 3개, 보다 바람직하게는 최대 2개를 추가, 결실, 또는 교환함으로써 얻어진다. 상기 언급된 변형은 폴리펩티드의 임의의 원하는 지점에서 연속적으로 또는 불연속적으로 원칙적으로 실행될 수 있다. 그러나 이들은 바람직하게는 폴리펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단에서만 실행된다. 그러나 본원 발명에 따라 아미노산을 추가, 교환, 또는 결실함으로써 얻어지는 각각의 변이체는 이하 본 출원에서 정의된 바와 같은 우레탄분해효소 활성을 특징으로 한다.

SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 8, 및 SEQ ID No. 10에 정의된 폴리펩티드는 현재까지 알려진 우레탄분해효소 활성을 갖는 유일한 효소, Ure와 계통 발생학적으로 상이한 그룹을 형성한다(도 1 참조). 해당 활성을 갖는 어떠한 효소도 이전에 상기 그룹으로부터 알려지지 않았다. 상기 폴리펩티드 그룹은 "Aes-유사"로 이하에서 또한 지칭된다.

우레탄분해효소 활성

상기 용어 "우레탄분해효소 활성"은 우레탄기의 절단을 효소적으로 촉진하는 폴리펩티드의 능력을 의미한다. 상기 공정에서, 우레탄기의 각 몰은 1몰의 아민, 1몰의 알코올, 1몰의 CO₂를 생성한다.

우레탄기는 방향족 또는 지방족으로 부착되는(attached) 우레탄기일 수 있다. 방향족으로 부착되는 우레탄기의 경우, 질소 원자는 방향족 링에 직접 부착된다. 지방족으로 부착되는 우레탄기의 경우, 질소 원자는 알킬 라디칼에 부착된다. 알킬 라디칼은 바람직하게는 비분지형이고 적어도 하나, 보다 바람직하게는 적어도 2개, 및 가장 바람직하게는 적어도 3개의 탄소 원자로 구성된다. 본원 발명의 바람직한 구현 예에서, 우레탄분해효소 활성을 갖는 폴리펩티드는 방향족으로 부착되는 우레탄기를 효소적으로 절단할 수 있다.

폴리펩티드가 우레탄분해효소 활성을 갖는지는 적합한 모델 기질의 절단을 통해 확인될 수 있다.

방향족으로 부착된 우레탄기를 절단하는 능력에 대한 모델 기질은 바람직하게는 에틸 4-니트로페닐 카르바메이트 (ENPC)이다. 절단은 4-니트로아닐린의 농도 증가를 측정함으로써 입증된다. 이는 바람직하게는 405 nm의 파장에서 측광학적으로 수행된다. 효소 활성은 기질로서 ENPC 0.2 mg/L의 존재하에 6.25 부피%의 에탄올을 갖는 pH 7의 K₂HPO₄/KH₂PO₄100 mM을 함유하는 반응 버퍼에서 바람직하게는 측정된다. 반응 버퍼에서 ENPC와 함께 효소의 배양은 바람직하게는 실온에서, 바람직하게는 24 시간 동안 수행된다.

지방족으로 부착된 우레탄기를 절단하는 능력에 대한 모델 기질은 바람직하게는 에틸 페네틸 카르바메이트(EPEC)이다. 절단은 페네틸아민의 농도 증가를 측정함으로써 입증된다. 이는 바람직하게는 HPLC에 의해 수행된다. 사용되는 반응 버퍼 및 반응 조건은 ENPC에 대해 위에서 설명한 파라미터에 바람직하게는 해당한다.

효소 절단

상기 용어 "우레탄기의 효소 절단"은 위에서 설명한 우레탄기의 절단이 동일한 반응 조건 하에서 효소 없이 반응 버퍼와 함께 배양됐을 때 또는 비활성 폴리펩티드의 존재 하에 동일한 조건 하에서 반응 버퍼와 함께 배양됐을 때 행해지는 것보다 우레탄분해효소 활성을 갖는 폴리펩티드의 존재 하에서 더 빠르게 진행되는 것을 나타낸다. 비활성 폴리펩티드에 대한 바람직한 모델은 소 혈청 알부민이다. 테스트되는 폴리펩티드의 존재 하에, 우레탄기의 절단이 BSA를 갖는 것 외에는 동일한 대조군보다 더 빨리 진행된다면, 상기 폴리펩티드는 본 출원에서 이해되는 바와 같이 우레탄분해효소 활성을 보유한다.

용도

추가의 구현 예에서, 본원 발명은 SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 10, 및 상기 폴리펩티드의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 SEQ ID No. 7 또는 이의 변이체에 따른 아미노산 서열을 갖는 갖는 GatA-유사 폴리펩티드의 용도에 관한 것으로, 상기 폴레펩티드가 우레탄 결합의 효소 절단에서 우레탄분해효소 활성을 갖는 것을 특징으로 한다.

달리 명시적으로 정의되지 않는한, 위에 주어진 모든 정의들은 상기 구현 예에도 적용된다.

우레탄의 저-분자량 분해 생성물으로의 분해

추가 구현 예에서, 본 발명은 폴리에스테르 폴리우레탄을 저-분자량 분해 생성물로 분해하는 공정에 관한 것이고, 이는

a) 폴리에스테르 폴리우레탄에 존재하는 에스테르기를 절단하는 단계; 및

b) 폴리에스테르 폴리우레탄에 존재하는 우레탄기를 우레탄분해효소 활성을 갖는 폴리펩티드로 절단하는 단계를 포함하고, 단, 공정 단계 a) 및 b)는 순서대로 또는 병행하여 수행될 수 있다.

우레탄분해효소 활성을 갖는 펩티드로서 특히 적합한 것은 SEQ ID No. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 및 10 및 상기 언급된 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군에서 정의된 아미노산 서열을 갖는 본 출원에 기재된 펩티드이다. SEQ ID No. 3 또는 7로 정의된 아미노산 서열 및 상기 언급된 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 펩티드가 매우 특히 바람직하다.

결과적으로, 특히 바람직한 구현 예에서, 본원 발명은 폴리에스테르 폴리우레탄을 저-분자량 분해 생성물로 분해하는 공정에 관한 것으로, 이는

b) 폴리우레탄을 우레탄분해효소 활성을 갖고, SEQ ID No. 1 내지 SEQ ID No. 10 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 및 상기 언급된 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로 처리하는 단계를 포함하며,

단, 공정 단계 a) 및 b)는 순서대로 또는 병행하여 수행될 수 있다.

공정 단계 b) 전에 공정 단계 a)를 수행하는 것이 바람직하다.

공정 단계 a)는 리파아제로 바람직하게는 수행된다. 상기 리파아제는 바람직하게는 수용성이며, 고정된 형태로 존재하지 않는다. 여기서 "고정된"은 생명공학에서 일반적으로 알려진 펩티드의 부착, 특히 용기의 표면 또는 수-불용성 입자에의 항체 또는 효소의 부착을 의미한다.

트리부티린을 사용하는 것이 특히 바람직하다. SEQ ID No. 11 또는 SEQ ID No. 12로 정의된 아미노산 서열을 갖거나, 또는 상기 언급된 둘 중 하나의 서열과 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖고, 트리부티린을 절단할 수 있는 폴리펩티드를 사용하는 것이 훨씬 더 특히 바람직하다. 공정 단계 a)는 바람직하게는 사용되는 리파아제가 활성을 나타내는 반응 조건 하에서 수행된다. 그러한 조건은 일반적인 생화학적 방법을 사용하는 일상적인 실험에 의해 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 우레탄분해효소 활성을 갖는 폴리펩티드가 중성 범위에서 최대 활성을 갖기 때문에, 공정 단계 b)는 바람직하게는 6.0 및 10.0 사이, 바람직하게는 6.0 및 8.0 사이의 pH에서 수행된다. 상기 pH는 당업자에게 공지의 모든 적절한 염기를 이용하여 조정될 수 있다.

상기 용어 "폴리에스테르 폴리우레탄"은 하나 이상의 폴리에스테르 폴리올 및 하나 이상의 이소시아네이트로부터 형성되는 폴리우레탄을 의미한다. 폴리우레탄은 발포(foam)되거나, 또는 비-발포될 수 있다. 바람직하게는 발포된다. 비표면적을 증가시키기 위해, 공정 단계 a) 및 b)를 수행하기 전에 폴리우레탄을 분쇄하는 것이 바람직하다. 이는 폴리우레탄이 발포되지 않은 형태로 사용될 때 특히 바람직하다. 분쇄는 당업자에게 친숙한 방식으로 수행될 수 있고, 바람직하게는 밀링, 슬라이스, 찢음, 또는 컷팅에 의해 수행될 수 있다.

폴리우레탄은 이소시아네이트 성분으로서 적어도 하나의 방향족, 지방족, 또는 지환족 이소시아네이트를 포함한다. 상기 폴리우레탄은 바람직하게는 방향족 이소시아네이트만을 포함한다. 바람직한 방향족 이소시아네이트는 메틸렌 디페닐 이소시아네이트(MDI), 3개 이상의 방향족 링을 갖는 MDI 변이체, 나프틸렌 디이소시아네이트, 및 톨릴렌 디이소시아네이트이다. 3개 이상의 방향족 링을 갖는 MDI 변이체는 합성 부산물이고, 폴리우레탄에도 존재할 수 있다. 분해되는 폴리우레탄은 특히 바람직하게는 톨릴렌 2,4-디이소시아네이트 및 톨릴렌 2,6-디이소시아네이트를 포함한다.

상기 용어 "폴리에스테르 폴리올"은 당업자에게 공지되어 있으며, 분자당 평균 적어도 1.5, 바람직하게는 적어도 1.8, 및 보다 바람직하게는 적어도 2.0개의 히드록실기를 함유하는 폴리에스테르를 설명한다. 분해될 폴리우레탄에 존재하는 폴리에스테르 폴리올은 특히 바람직하게는 1.5 및 6.0 사이의 작용기(functionality)를 갖는다. 이는 구조적 요소로서 방향족 및/또는 지방족 폴리올 및 또한 임의의 조합으로 방향족 및/또는 지방족 폴리카르복실산을 함유한다.

폴리에스테르-계 폴리우레탄 폼의 저-분자량 분해 생성물은 바람직하게는 1000 g/mol 이하의 분자량을 갖는다. 이들은 바람직하게는

(i) 관련된 폴리우레탄의 생성에 사용되는 이소시아네이트로부터 유래된 아민, 예를 들어 톨릴렌 2,4-디이소시아네이트의 경우 톨릴렌-2,4-디아민; 및

(ii) 관련된 폴리우레탄의 합성에 사용되는 폴리에스테르 폴리올을 형성하기 위해 사용되는 알코올 및 카르복실산이다.

본 출원에서 "폴리올"은 적어도 2개의 히드록실기를 갖는 임의의 화합물을 의미하는 것으로 이해된다. 상기 폴리올은 바람직하게는 300 g/mol 이하의 분자량을 갖는다. 폴리에스테르-계 폴리우레탄 폼의 저-분자량 분해 생성물인 바람직한 폴리올은 에틸렌 글리콜, 디에틸렌 글리콜, 1,4 부탄디올, 트리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 1,2-디프로필렌 글리콜, 네오펜틸 글리콜, 글리세롤, 1,1,1-트리메틸올프로판, 수크로스, 소르비톨, 및 펜타에리스리톨로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

"폴리카르복실산"은 본 출원에서 적어도 2개의 카르복실기를 함유하는 임의의 화합물을 의미하는 것으로 이해된다. 상기 폴리카르복실산은 바람직하게는 300 g/mol 이하의 분자량을 갖는다. 폴리에스테르계 폴리우레탄 폼의 저-분자량 분해 생성물인 바람직한 폴리카르복실산은 숙신산, 글루타르산, 아디프산, 프탈산, 테레프탈산, 벤젠트리카르복실산, 올레산, 및 리시놀레산으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 폴리에스테르계 폴리우레탄 폼의 저-분자량 분해 생성물인 특히 바람직한 폴리카르복실산은 숙신산, 글루타르산, 아디프산, 프탈산, 테레프탈산, 및 벤젠트리카르복실산으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

"폴리아민"은 본 출원에서 적어도 2개의 아미노기를 함유하는 임의의 화합물을 의미하는 것으로 이해된다. 상기 폴리아민은 바람직하게는 300 g/mol 이하의 분자량을 갖는다. 폴리에스테르계 폴리우레탄 폼의 저-분자량 분해 생성물인 바람직한 폴리아민은 메틸렌-4,4'-디아민, 메틸렌-2,4'-디아민, 메틸렌-2,2'-디아민, 톨릴렌-2,4-디아민, 톨릴렌-2,6-디아민,헥사메틸렌디아민, 이소포론 디아민, 자일릴렌디아민, 펜타메틸렌디아민, 파라-페닐렌디아민, 부틸디아민, 및 H12-메틸렌디아민으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 메틸렌-4,4'-디아민, 메틸렌-2,4'-디아민, 메틸렌-2,2'-디아민, 나프틸렌-1,4-디아민, 나프틸렌-1,5-디아민, 나프틸렌-1,6-디아민, 톨린렌-2,4-디아민, 및 톨릴렌-2,6-디아민으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 폴리아민이 더 바람직하다. 메틸렌-4,4'-디아민, 메틸렌-2,4'-디아민, 메틸렌-2,2'-디아민, 톨린렌-2,4-디아민, 및 톨릴렌-2,6-디아민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리아민이 특히 바람직하다.

본 발명에 따른 공정은 2가지 방식으로 폴리우레탄의 효과적인 재활용을 가능하게 한다: (i) 공정 자체는 온화한 반응 조건 하에서 작동하므로, 높은 에너지 투입을 필요로 하지 않으며, 및 (ii) 이는, 그 자체로 가치있는 화학적 원료인 정의된 분해 생성물이 형성되기 때문에, 폴리우레탄이 재활용되는 것을 가능하게 한다.

대조적으로, 폴리우레탄의 재활용을 위한 현재 가장 일반적인 화학분해(chemolysis)이고, 이미 산업적으로 실행되고 있는, 열적 당분해(glycolysis)는 매우 높은 온도에서 수행된다. 여기서 초점은 폴리올의 추출에 있는 반면, 아민은 간섭종(interfering species)으로 분리되어 회수되지 않는다. 비-효소적 가수분해에서, 폴리올 및 아민은 모두 생성물로 얻어진다. 그러나 상기 공정은 높은 온도 및 높은 주변 압력에서 수행된다.

다음 작업 예는 단지 본 발명을 명료하게 하는 역할을 한다. 이들은 어떤 식으로든 청구항의 범위를 제한하기 위한 것이 아니다.

실시 예

ENPC를 이용한 효소 활성 테스트

0.2 mg/ml의 ENPC는 "MTS 2/4" 플레이트 쉐이터(IKA, Staufen)에서 900 rpm, 및 실온에서 6.25 부피%의 에탄올을 함유하는 pH 7.0의 100 mM KH₂PO₄/K₂HPO₄에서 24시간 동안 배양되었다.

샘플을 여과한 후, 각 100 ㎕은 투명 플랫-바텀 96-웰 "UV-Star) 플레이트(Greiner Bio-One, Frickenhausen)로 옮겨지고, 405 및 408 nm에서의 흡광도가 측정되었다. 480 nm에서의 값이 측정되었고, 4-니트로아닐린은 상당한 흡수를 나타내지 않기 때문에, 만약 높은 값이 두 파장 모두에서 관찰되면, 이는 4-니트로아닐린이 아니라 405 nm에서 흡광도를 담당하는 다른 물질일 가능성이 높다

우레탄분해효소에 의한 가수분해는 거의 무색인 ENPC의 4-니트로아닐린, CO2, 및 에탄올로의 절단을 야기하고, 이는 "Infinite M1000PRO" 마이크로타이터 플레이트 광도계(Tecan, Mannedorf, Switzerland)의 405 nm에서 4-니트로아닐린의 검출을 결과한다. 상기 광도계는 3.4.2.0 버전의 "i-control" 소프트웨어(Tecan, Mannedorf, Switzerland)를 사용하여 제어되었다. 4-니트로아닐린은 "답실아민(dabsylamine)" 방법을 사용하여 HPLC에 의해 추가로 검출되었다.

고압 액체 크로마토그래피(HPLC)

고압 액체 크로마토그래피는 UV 및 가시광선 영역에 대한 DAD(diode array detector) 및 오토 샘플러가 장착된 Agilent Technologies(Santa Clara, USA) 1100 시리즈 기기에서 수행되었다. 모든 측정은 3.5 ㎛의 입자 크기 및 4.6 x 75 mm의 치수를 갖는 "Zorbax XDB-C18" 컬럼(Agilent Technologies, Santa Clara, USA)을 사용하여 수행되었다. 모든 방법에서, 5 ㎕ 샘플은 40℃로 가열된 컬럼으로 주입되었다. 흐름은 일반적으로 1.5 ml/분이었다. 역상 컬럼의 사용은 모든 방법에서 용출이 유기 용매의 농도의 증가에 따라 이루어짐을 의미한다.

답실화된(dabsylated) 지방족 아민 및 우레탄의 검출 및 정량화는 "답실아민" 방법을 사용하여 수행되었다. 상기 방법은 방향족 아민 및 우레탄의 높은 고유 흡수로 인해, 유도체화 없이 방향족 아민 및 우레탄의 정량화를 가능하게 한다. 또한, AcN에 더해 용리액으로 사용된 것은 pH 7.0의 10 mM 나트륨 포스페이트 버퍼이며, 여기에 0.005%(w/v) 나트륨 아지드가 첨가되어 미생물 성장을 방지했다. 오염된 펌프 밸브로 인한 압력 문제를 방지하기 위해, 5% (v/v)의 dd H₂O가 후에 AcN에 추가되었고, 상기 방법을 조정했다("답실아민 95"). 4,4'-MDA와 EC의 효소-촉매 반응으로 형성된 MDEC는 "답실아민-12-MeOH"를 사용하여 정량화되었고, 여기서 상기 수성 성분은 산성화되고 양성자화된 방향족 아민이며, 따라서 매우 일찍 용출이 생성되었다. 4,4'-MDA와 DMC, 2,4-TDA와 DMC, 및 2,4-TDA와 EC의 반응은 "답실아민95-H2O" 방법을 사용하여 조사되었고, 이는 순수한 dd H₂O가 버퍼 대신 사용된다는 점에서만 "답실아민95"와 상이하다. 상기 데이터는 "OpenLAB CDS ChemStationLC" 소프트웨어, 버전 A.02.09 [017] (Agilent Technologies, Santa Clara, USA)을 사용하여 분석되었다.

답실아민: 용리액: AcN 및 10 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, pH 7.0

시간 [분] AcN

0 5

6.5 85

8.0 5

10.0 5

답실아민95: 용리액: AcN 함유 5% (v/v) dd H₂O 및 10 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, pH 7.0

시간 [분] % AcN (+ 5% (v/v) dd H₂O)

0 5

6.5 90

8.0 5

10.0 5

답실아민-12-MeOH-lang: 용리액: 메탄올 및 dd H₂O 함유 0.1% (v/v) 메탄산

시간 [분] % 메탄올

0 5

2.5 35

8.0 70

8.5 85

10.0 5

12.0 5

EPEC로 효소 활성 테스트

ENPC에 대해 설명된 바와 같이, 테스트가 수행되었다. 형성도니 페네틸아민은 전술한 바와 같이 HPLC에 의해 검출되었다.

효소의 계통 발생 분석

우레탄분해효소의 관련성을 나타내는 계통 발생 수(phylogenetic trees)는 "MegAlign" 소프트웨어((DNASTAR, Madison, USA), version 10.1.0.을 이용하여 생성되었다.. 상기 계통 발생 수는 "ClustalW"를 이용한 기본 설정으로 생성되었다..

상이한 단백질의 얼라이먼트는 "Clustal Omega" 소프트웨어 (Sievers et al., 2011)를 사용하여 생성되었다.

단백질 서열에 대한 데이터베이스 검색은 BLASTP (Altschul et al., 1990)를 사용하여 수행되었다.

시퀀싱된 메타게놈 서열의 오픈 리딩 프레임(ORFs)은 NCBI (Wheeler et al., 2007)의 온라인 어플리케이션 "ORF Finder"를 이용하여 발견되었다.

동일한 가수분해효소 유전자는 단일 대표로 감소되었고, 유전자의 완전한 서열을 얻기 위해 모든 서열은 ORFs로 조사되었다. 대안의 시작 코돈도 또한 검색에 허용되었다. 여기서 pLip214의 유전자가 aes와 유사하지만, 시작 코돈이 확인되지 않은 N-말단 영역을 포함한다는 것이 분명했다. 상기 유전자 세그먼트는 절삭된(truncated) 유전자를 설명할 수 있는 메타게놈 벡터의 삽입부의 가장자리에 있지 않았다. 추가 분석을 위해, aes와 유사하지만 시작 코돈이 없는 영역은 상기 유전자의 서열로 사용되었다. 확인된 추정 우레탄분해효소 유전자는 실리코에서 번역되었고, BLASTP를 사용하여 NCBI 데이터베이스와 비교되었다. 추정 우레탄분해효소는 리파아제 뱅크의 번호 및 GatA 또는 Aes와의 유사성을 기준으로 명명되었다.

두 확인된 우레탄분해효소 그룹(GatA 및 Aes)의 개별 멤버를 비교하기 위해, 각각의 경우의 얼라이먼트가 "Clustal Omega" 소프트웨어로 생성되었고, 계통 발생 수는 계통 발생 수를 위해 생성된 두 그룹의 공통 얼라이먼트를 이용하여 "MegAlign" 소프트웨어로 추가적으로 생성되었다. 서열 비교는 GatA에 대해 모두 유사성을 나타내는, 문헌의 효소(Ure, Ana, and NfpolyA)에 대한 서열을 또한 포함했다.

계통 발생 수는 도 1에 나타난다. 이는 상기 두 그룹이 상이한 분지에 있으며, 노드의 낮은 부트스트래핑 값에서 볼 수 있듯이 두 그룹 내의 유사성은 몇몇 경우에 명확하지 않다. 상기 그룹의 더 긴 분지 길이에서 볼 수 있듯이 GatA 그룹 내에서 Aes 그룹 내보다 더 큰 차이가 있는 것으로 보인다. 특히 Aes70 및 Aes 72 및 또한 Aes175 및 Aes214는, 계통 발생 수의 비교적 짧은 분지 및 BLASTP 검색에 의해 발견된 가장 큰 유사성을 갖는 동일한 단백질 둘 다에 의해 나타난대로 매우 높은 유사성을 나타낸다

분해 테스트를 위한 폴리우레탄 폼의 생성

아래 열거된 출발 물질은 단일 단계의 폴리우레탄 폼 생성의 통상적인 처리 방식으로 반응되었다.

벌크 밀도는 38　kg/m³ (DIN EN ISO 845, 2009년 10월 버전), 40% 압축 시 압축 강도는 3.5 kPa이었다(DIN EN ISO 3386-1, 2015년 10월 버전).

제형:

100부 데스모펜 2200B

3부 물

19부 데스모듀어 T80

19부 데스모듀어 T65

0.7부 N,N'-디메틸피페라진

1부 테고스탭 8325

원료:

데스모펜^®2200B, Covestro Deutschland AG; 아디프산계 분지형 폴리에스테르 폴리올, 디에틸렌 글리콜, 및 대략 60 mg KOH/g의 히드록실기 값을 갖는 1,1,1-트리메틸올프로판.

데스모듀어^®T80, Covestro Deutschland AG; 대략 80:20의 혼합비로 톨릴렌 2,4- 및 2-6-디이소시아네이트를 포함하는 아이소머 혼합물.

데스모듀어^®T65, Covestro Deutschland AG; 대략 67:33의 혼합비로 톨릴렌 2,4- 및 2-6-디이소시아네이트를 포함하는 아이소머 혼합물.

N,N'-디메틸피페라진, abcr GmbH의 촉매

테고스탭^®B 8325, 폼 안정제, 에보닉

물: 탈이온수

제형은 90 내지 115의 지수로 실행될 수 있다. 상기 지수는 이소시아네이트기 대 이소시아네이트-반응성 기의 몰 비에 100을 곱한 것으로 정의된다.

폴리우레탄 폼의 분해

사용된 기재는 톨릴렌 디이소시아네이트로 생성된 폴리에스테르 폴리우레탄이었다. 분해는 2단 반응 단계로 발생했다. 먼저, 폼이 리파아제로 배양되었다. 생성된 올리고머는 중화되었고, 이후 우레탄분해효소로 모노머로 절단되었다.

첫번째 단계에서, 폼 1g은 20 ml의 칼륨 포스페이트 버퍼 pH 7.0 및 대략 30 mg의 CalB 동결건조물(Roche, Basel, Switzerland의 "Chirazyme L2") (여기서는 SEQ ID No.　12로 지칭됨)과 함께 50 ml 원심분리 튜브로 전달되었고, 37℃에서 5일 동안 200 rpm으로 배양되었다. 폼 잔류물의 단편은 효소가 없는 음성 대조군과 비교하여 "MH2" 현미경(Olympus, Hamburg)으로 사진촬영되었다. 이후 탁한 용액은 대용량 원심분리기에서 4000 rpm으로 25℃에서 10분 동안 원심 분리되었다. 투명한 상청액은 1M NaOH를 이용하여 pH 7.0으로 조정되었다. 실온에서 약 6 시간 후, pH에서 약간의 저하가 재적정되었고, 상기 용액은 살균 여과를 거쳤다. 가용성 올리고머는 사용할 때까지 4℃에서 저장되었다.

추가 사용을 위해, 가용성 올리고머는 1.5 mL 반응 용기로 전달되고, 20 ㎕의 DMF 및 150 ㎕의 각 우레탄분해효소에 대한 최적의 버퍼(pH 6.0 내지 pH 8.0 범위의 우레탄분해효소에 대한 각각의 최적 pH로 조정된 100 mM의 나트륨 포스페이트 버퍼)와 혼합되었다. 이어서 각각에 30 ㎕의 희석되지 않은 정제된 우레탄분해효소가 첨가되었고, 혼합물은 30℃ 및 1000 rpm으로 가열 블록에서 흔들어졌다. 효소 저장 버퍼를 함유하는 혼합물은 음성 대조군으로서 사용되었다. 3일 후, 배치는 PVDF 멤브레인 및 0.2㎛의 기공 크기를 갖는 여과 플레이트(Corning, Kaiserslautern)를 통해 여과되었고, 상기 여과물은 형성된 톨릴렌 2,4- 및 2-6-디이소시아네이트에 관해 "답실아민95" 방법을 사용하여 HPLC에 의해 분석되었다.

CalB 동결 건조물을 함유하는 혼합물에서 반응 후에, 효소가 없는 음성 대조군과 비교하여 폼이 모든 구조를 잃고, 폼의 작은 입자를 함유하는 탁한 현탁액으로 존재한다는 것은 이미 거시적으로 분명했다. 실험이 시작될 때 폼에 거의 완전히 흡수된, 버퍼는, 이후 분해된 입자 형태로 전체 폼 덩어리를 함유했다. HPLC 분석은 형성된 올리고머에 할당된 명확한 피크를 나타냈으나, 톨릴렌디아민(TDA)의 형성을 가리키는 피크는 없었다.

올리고머 용액은 모든 발현된 우레탄분해효소 및 SEQ ID No.12로 처리되었고, 이후 TDA의 형성에 대해 HPLC로 조사되었다. SEQ ID No.7 및 SEQ ID No.3을 함유하는 혼합물에 대해, 측정된 2,6-TDA의 양이 두 혼합물에서 대략 동일하고, Enz03을 함유하는 혼합물에서 2,4-TDA의 형성이 더욱 두드러지는 것이 입증되었다. SEQ ID No.3은 0.057 g/L의 2,4-TDA 및 0.025 g/L의 2,6-TDA를 제공하였고, 반면 SEQ ID No.7은 0.0075 g/L의 2,4-TDA 및 0.024 g/L의 2,6-TDA의 형성을 결과했다. 또한, 다른 혼합물과 달리, 상기 두 효소에 대한 올리고머 피크는 변화 및 일반적인 크기 감소를 나타냈다. SEQ ID No.7의 경우, TDA는 사전처리 없이도 폴리에스테르 PU 폼에서 절단된 반면, SEQ ID No.3의 경우, 선행의 에스테르 절단 후에 중화된 올리고머를 제공함으로써만 이것이 가능했다. SEQ ID No. 12의 가수분해에서 올리고머 피크로 확인된 생성물 피크는 우레탄분해효소로 추가 처리한 후 극적으로 더 작았으며, 이는 상당한 TDA 형성을 동반한다는 사실은 이들이 올리고머 피크임을 확인했다.

또한 불용성 TDI-계 폴리에스테르-폴리우레탄 폼은 2단의 반응 단계의 조합에 의해 모노머로 절단될 수 있음이 입증되었다. 제1 단계에서, PU 폼은 에스테르 결합의 가수분해를 통해 리파아제 CalB를 사용하여 사전분해되었다. 중화 후, 유리된 올리고머는 과발현된 우레탄분해효소의 기질로 역할했다. 이는 우레탄 결합의 가수 분해 및 모노머 형태의 TDA의 검출을 동반했다.

결론적으로, 리파아제에 의한 에스테르 결합의 가수분해 절단, 올리고머 용액의 중합, 및 우레탄 결합의 후속 가수분해 절단의 조합은 폴리우레탄의 정의된 모노머로의 완전한 분해를 허용함을 알 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Covestro Deutschland AG <120> Novel urethanases for the enzymatic degradation of polyurethanes <130> COV 17 1 166 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 469 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Derived from metagenome <400> 1 Met Met Gly Gly Val Gly Val Arg Glu Glu Leu Ala Thr Trp Thr Ala 1 5 10 15 Val Arg Leu Ala Glu His Ile Arg Lys Lys Glu Leu Ser Pro Val Glu 20 25 30 Val Thr Asp Tyr Phe Leu Arg Arg Ile Glu Ala Leu Asn Pro Ala Val 35 40 45 Asn Ala Phe Cys Thr Val Asp Ala Asp Gly Ala Met Arg Ala Ala Lys 50 55 60 Ala Ala Glu Gln Arg Leu Met Ala Gly Glu Thr Pro Pro Leu Leu Gly 65 70 75 80 Val Pro Val Ala Ile Lys Asp Leu Thr Pro Thr Lys Gly Ile Arg Thr 85 90 95 Thr Tyr Gly Ser Arg Leu Phe Ala Asp Asn Val Pro Glu Ala Asp Ala 100 105 110 Val Leu Val Thr Arg Leu Lys Gln Ala Gly Ala Ile Ile Val Gly Lys 115 120 125 Thr Asn Thr Pro Glu Phe Gly His Ala Gly Val Thr Asp Asn Arg Leu 130 135 140 Phe Gly Arg Thr Asn Asn Pro Trp Asp Leu Ser Arg Ile Ala Gly Gly 145 150 155 160 Ser Ser Gly Gly Ser Asp Gly Gly Gly Ser Ile Arg Ile Pro Ala Ser 165 170 175 Cys Cys Gly Ile Phe Gly Phe Lys Pro Thr Phe Gly Arg Val Pro His 180 185 190 Asp Thr Gly Ala Thr Ala Phe Ser Ile Thr Ala Pro Phe Leu His His 195 200 205 Gly Pro Met Ser Arg Thr Val Glu Asp Ser Val Leu Met Leu Ala Ala 210 215 220 Met Gln Gly Pro Asp Gly Cys Asp Pro Phe Ser Leu Pro Leu Pro Gly 225 230 235 240 Ile Asp Trp Pro Leu Ser Ala Glu Ile Lys Pro Phe Ser Gln Trp Arg 245 250 255 Ile Ala Tyr Ser Pro Asn Leu Asp Phe Tyr Ala Ile Asp Pro Ala Val 260 265 270 Arg Gln Val Met Glu Gln Ala Val Ser Ala Leu Gln Gly Leu Gly Cys 275 280 285 Arg Val Glu Glu Val Arg Leu Gly Leu Glu Glu Gly Lys Thr Leu Val 290 295 300 Leu Glu Thr Phe Ala Arg Leu Trp Ala Val His Tyr Ala Ala Phe Tyr 305 310 315 320 Glu Glu Leu Leu Glu Arg Glu Ala Glu Leu Ser Lys Gly Phe Val Ala 325 330 335 Thr Ile Arg Tyr Gly Gln Gln Phe Ser Ala Val Glu Tyr Lys Arg Leu 340 345 350 Glu Arg Pro Arg Ala Val Val Tyr Glu Arg Val Glu Asn Val Phe Ala 355 360 365 Lys Tyr Asp Leu Leu Ile Thr Pro Thr Leu Ala Val Pro Pro Phe Ala 370 375 380 His Asp Cys Pro Pro Arg Glu Ile Asp Gly Lys Ala Val Asn Pro Tyr 385 390 395 400 Asn Glu Trp Met Leu Thr Ser Ile Phe Asn Leu Thr Gly His Pro Val 405 410 415 Ala Ser Ile Pro Ala Gly Phe Ser Pro Glu Gly Leu Pro Ile Gly Met 420 425 430 Gln Ile Val Gly Pro Arg Leu Ala Asp Ala Ala Val Leu Glu Phe Ala 435 440 445 Tyr Leu Phe Glu Gln Thr Val Ala Pro Arg Arg Pro Tyr Pro Cys Asp 450 455 460 Asp Val Arg Leu Asn 465 <210> 2 <211> 264 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Derived from metagenome <220> <221> misc_feature <222> (252)..(252) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 2 Leu Asp Tyr Leu Gly Gly Phe Ser Pro Leu Glu Ser Asp Val Thr Val 1 5 10 15 Glu Lys Thr Arg Ile Ala Gly Val Pro Gly Glu Trp Ile Ser Thr Pro 20 25 30 Asp Ala Arg Lys Asp Arg Val Leu Phe Tyr Leu His Gly Gly Ala Tyr 35 40 45 Cys Phe Gly Ser Cys Asp Ser His Arg Gly Leu Val Ser Arg Leu Ala 50 55 60 Arg Ala Cys Gly Ser Arg Ala Leu Leu Ile Glu Tyr Arg Leu Ala Pro 65 70 75 80 Glu His Pro Phe Pro Ala Ala Leu Glu Asp Ser Thr Ala Ala Tyr Arg 85 90 95 Glu Leu Ile Arg Ser Gly Val Arg Pro Glu Asn Leu Val Ile Ala Gly 100 105 110 Asp Ser Ala Gly Gly Gly Leu Thr Met Ala Thr Leu Leu Thr Leu Arg 115 120 125 Asp Glu Gly Asp Pro Leu Pro Ser Ala Ala Val Leu Leu Ser Pro Trp 130 135 140 Thr Asp Leu Glu Gly Thr Gly Glu Ser Met Lys Thr Lys Ala Asp Val 145 150 155 160 Glu Pro Trp Leu Asp Pro Glu Lys Ser His Leu Leu Ala Lys Leu Tyr 165 170 175 Leu Gly Asp Leu Asp Pro Arg His Pro Leu Val Ser Pro Ile His Ala 180 185 190 Asp Leu Asn Asn Leu Pro Pro Leu Leu Val His Val Gly Ser Asp Glu 195 200 205 Cys Leu Leu Asp Asp Ser Val Arg Leu Val Glu Arg Ala Lys Ser Ala 210 215 220 Gly Val Glu Thr Glu Phe Lys Ile Cys Asp Glu Met Trp His Val Phe 225 230 235 240 His Gly Phe Pro Ile Pro Glu Ala Gln Gln Ala Xaa Glu Glu Ile Gly 245 250 255 Ala Phe Val Arg Ala Arg Leu Pro 260 <210> 3 <211> 297 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Derived from metagenome <400> 3 Met Ala Ser Pro Gln Ser Glu Ala Ile Arg Gln Met Leu Arg Glu Gln 1 5 10 15 Lys Glu Ala Ala Lys Lys Gly Ala Pro Ser Ile Glu Glu Gln Arg Arg 20 25 30 Gln Leu Asp Tyr Leu Gly Gly Phe Ser Pro Leu Glu Ser Asp Val Thr 35 40 45 Val Glu Lys Thr Arg Ile Ala Gly Val Pro Gly Glu Trp Ile Ser Thr 50 55 60 Pro Asp Ala Arg Lys Asp Arg Val Leu Phe Tyr Leu His Gly Gly Ala 65 70 75 80 Tyr Cys Phe Gly Ser Cys Asp Ser His Arg Gly Leu Val Ser Arg Leu 85 90 95 Ala Arg Ala Cys Gly Ser Arg Ala Leu Leu Ile Glu Tyr Arg Leu Ala 100 105 110 Pro Glu His Pro Phe Pro Ala Ala Leu Glu Asp Ser Thr Ala Ala Tyr 115 120 125 Arg Glu Leu Ile Arg Ser Gly Val Arg Pro Glu Asn Leu Val Ile Ala 130 135 140 Gly Asp Ser Ala Gly Gly Gly Leu Thr Met Ala Thr Leu Leu Thr Leu 145 150 155 160 Arg Asp Glu Gly Asp Pro Leu Pro Ser Ala Ala Val Leu Leu Ser Pro 165 170 175 Trp Thr Asp Leu Glu Gly Thr Gly Glu Ser Met Lys Thr Lys Ala Asp 180 185 190 Val Glu Pro Trp Leu Asp Pro Glu Lys Ser His Leu Leu Ala Lys Leu 195 200 205 Tyr Leu Gly Asp Leu Asp Pro Arg His Pro Leu Val Ser Pro Ile His 210 215 220 Ala Asp Leu Asn Asn Leu Pro Pro Leu Leu Val His Val Gly Ser Asp 225 230 235 240 Glu Cys Leu Leu Asp Asp Ser Val Arg Leu Val Glu Arg Ala Lys Ser 245 250 255 Ala Gly Val Glu Thr Glu Phe Lys Ile Trp Asp Glu Met Trp His Val 260 265 270 Phe His Gly Phe Pro Ile Pro Glu Ala Gln Gln Ala Ile Glu Glu Ile 275 280 285 Gly Ala Phe Val Arg Ala Arg Leu Pro 290 295 <210> 4 <211> 311 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Derived from metagenome <400> 4 Met Ala Asp Pro Gln Leu Glu Ala Val Leu Val Gly Leu Ala Gln Ala 1 5 10 15 Ser Ala Gly Ala Gln Gly Pro Ala Thr Val Glu Gly Phe Arg Val Ala 20 25 30 Leu Arg Glu Leu Thr Arg Met Leu Asp Phe Arg Asp Ile Pro Val Gly 35 40 45 Arg Val Glu Asn Arg Met Ile Pro Gly Pro Asp Gly Glu Ile Gly Ile 50 55 60 Arg Ile Tyr Thr Pro Ile Ala Ala Gly Ala Arg Met Leu Glu Thr Leu 65 70 75 80 Ile Tyr Phe His Gly Gly Gly Phe Val Ala Gly Asp Leu Glu Thr His 85 90 95 Asp Thr Leu Cys Arg Gly Leu Thr Ala Arg Ser Gly Cys Arg Val Ile 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<213> Unknown <220> <223> Derived from metagenome <400> 5 Met Ser Leu Asp Pro Lys Ala Arg Glu Leu Leu Ala Met Val Tyr Arg 1 5 10 15 Val Asn Ala Pro Arg Phe His Glu Leu Ser Val Ser Gln Ala Arg His 20 25 30 Ala Thr Gln Lys Leu Met Phe Ala Phe Arg Pro Glu Ala Pro Ala Val 35 40 45 Ala Ser Thr Thr Glu Val Pro Ile Pro Arg Pro Asp Gly Ser Val Leu 50 55 60 Phe Ala Arg Leu Tyr Arg Pro Leu Gly Cys His Ala Ser Glu Asp Leu 65 70 75 80 Gly Leu Leu Ile Tyr Phe His Gly Gly Gly Trp Cys Thr Gly Asp Leu 85 90 95 Pro Gly Tyr Asp Val Leu Cys Arg Glu Leu Ala Asn Gln Ser Gly Ala 100 105 110 Ala Val Leu Ser Val Asp Tyr Arg Leu Ala Pro Glu His Arg Phe Pro 115 120 125 Ala Ala Val His Asp Ala Ser Leu Ala Phe Glu Trp Ser Thr Glu Asn 130 135 140 Ala Ser Leu Leu Gly Val Asp Ala Glu Arg Ile Ala Leu Gly Gly Asp 145 150 155 160 Ser Ala Gly Gly Asn Leu Ala Ile Val Ala Ala Leu Glu Ala Arg Asp 165 170 175 Arg Ala Ala Arg Met Pro Arg Ala Leu Ala Leu Ile Tyr Pro Ser Thr 180 185 190 Gln Ile His Ser Glu Arg Ser Ser Arg Glu 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Gly 85 90 95 Gly Ile Arg Cys Leu Arg Asp Phe Lys Leu Asp Val Lys Ser Arg Tyr 100 105 110 Ala Thr Lys Met Glu Glu Ala Gly Ala Val Val Leu Gly Ile Thr Asn 115 120 125 Ser Pro Val Leu Gly Phe Arg Gly Thr Thr Asp Asn Asp Leu Tyr Gly 130 135 140 Pro Thr Arg Asn Pro Phe Asp Leu Ser Arg Asn Ser Gly Gly Ser Ser 145 150 155 160 Gly Gly Thr Ser Ala Ala Val Ala Asp Gly Leu Leu Pro Ile Gly Asp 165 170 175 Gly Thr Asp Gly Gly Gly Ser Ile Arg Ile Pro Ala Ala Trp Cys His 180 185 190 Val Phe Gly Phe Gln Ala Ser Pro Gly Arg Ile Pro Leu Ala Ile Arg 195 200 205 Pro Asn Ala Phe Gly Ala Ala Ala Pro Phe Ile Tyr Glu Gly Pro Ile 210 215 220 Thr Arg Thr Val Glu Asp Ala Ala Leu Ala Met Ser Val Leu Ala Gly 225 230 235 240 Ser Asp Pro Ala Asp Pro Phe Ser Leu Asn Asp Arg Leu Asp Trp Leu 245 250 255 Gly Ala Val Asp Gln Pro Ile Thr Ser Leu Arg Ile Gly Phe Thr Pro 260 265 270 Asp Phe Gly Gly Phe Pro Val Glu Pro Ala Val Ala Ala Thr Ile Ala 275 280 285 His Ala Val Arg Ala Phe Glu Gln Ala Gly Ala Lys Ile Val Pro Leu 290 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Arg Pro Arg Ser Arg Pro His Ala Arg Ala Arg Gly Ala Pro Thr 1 5 10 15 Ile Leu Arg Asp Pro Ala Thr Met Ala Leu His Arg Thr Pro Arg Arg 20 25 30 Asn Asp Met Ala Asp Arg Gly Ile Glu Val Val His Ala His Leu Ala 35 40 45 Lys Leu Pro Pro Ala Asp Ser Leu Thr Val Ala Glu Arg Arg Ala Gln 50 55 60 Tyr Glu Arg Ala Glu Lys Val Phe Pro Leu Ser Pro Asp Val Lys Val 65 70 75 80 Glu Arg Val Thr Ala Gly Ala Ala Pro Ala Glu Trp Leu Arg Pro Pro 85 90 95 Ser Ala Arg Ala Gly His Val Val Leu Tyr Leu His Gly Gly Gly Tyr 100 105 110 Val Ile Gly Ser Pro Arg Ser His Arg His Leu Ala Ala Ala Ile Ala 115 120 125 Gly Ala Ala Gly Thr Asn Ala Leu Leu Leu Asp Tyr Arg Leu Ala Pro 130 135 140 Glu His Pro Phe Pro Ala Ala Leu Asp Asp Ala Val Ala Ala Tyr Arg 145 150 155 160 Trp Leu Leu Asp Gln Gly Ile Ala Ala Glu His Ile Ala Val Ala Gly 165 170 175 Asp Ser Ala Gly Gly Gly Leu Thr Val Ala Thr Leu Leu Ala Leu Arg 180 185 190 Asp Ala His Leu Pro Arg Pro Ala Ala Gly Val Cys Ile Ser Pro Trp 195 200 205 Val Asp Leu Thr Cys Ser 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Claims

폴리에스테르 폴리우레탄을 저-분자량 분해 생성물로 분해하는 공정으로서,
a) 폴리에스테르 폴리우레탄에 존재하는 에스테르기를 절단하는 단계; 및
b) 폴리에스테르 폴리우레탄에 존재하는 우레탄기를 우레탄분해효소 활성을 갖는 폴리펩티드로 절단하는 단계를 포함하고,
공정 단계 a) 및 b)는 순서대로 또는 병행하여 수행될 수 있는, 폴리에스테르 폴리우레탄을 저-분자량 분해 생성물로 분해하는 공정.
청구항 1에 있어서,
우레탄분해효소 활성을 갖는 상기 폴리펩티드는 SEQ ID No. 1 내지 SEQ ID No. 10 및 상기 언급된 서열들과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는, 폴리에스테르 폴리우레탄을 저-분자량 분해 생성물로 분해하는 공정.
청구항 1 또는 2에 있어서,
공정 단계 a)는 공정 단계 b) 전에 수행되는, 폴리에스테르 폴리우레탄을 저-분자량 분해 생성물로 분해하는 공정.
청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서,
폴리올, 폴리카르복실산, 및 폴리아민은 공정 생성물로서 형성되는 것인, 폴리에스테르 폴리우레탄을 저-분자량 분해 생성물로 분해하는 공정.
청구항 4에 있어서,
메틸렌-4,4'-디아민, 메틸렌-2,4'-디아민, 메틸렌-2,2'-디아민, 나프틸렌-1,4-디아민, 나프틸렌-1,5-디아민, 나프틸렌-1,6-디아민, 톨릴렌-2,4-디아민, 및 톨릴렌-2,6-디아민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 폴리아민이 형성되는, 폴리에스테르 폴리우레탄을 저-분자량 분해 생성물로 분해하는 공정.
청구항 4에 있어서,
에틸렌 글리콜, 디에틸렌 글리콜, 1,4- 부탄디올, 트리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 1,2-디프로필렌 글리콜, 네오펜틸 글리콜, 글리세롤, 1,1,1- 트리메틸올프로판, 수크로스, 소르비톨 및 펜타에리트리톨로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 폴리올이 형성되는, 폴리에스테르 폴리우레탄을 저-분자량 분해 생성물로 분해하는 공정.
청구항 4에 있어서,
숙신산, 글루타르산, 아디프산, 프탈산, 테레프탈산, 벤젠트리카르복실산, 올레산 및 리시놀산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 폴리카르복실산이 형성되는, 폴리에스테르 폴리우레탄을 저-분자량 분해 생성물로 분해하는 공정.
청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서,
공정 단계 a)는 리파아제로 수행되는, 폴리에스테르 폴리우레탄을 저-분자량 분해 생성물로 분해하는 공정.
청구항 8에 있어서,
상기 리파아제는 SEQ ID No. 11 또는 SEQ ID No. 12와 같은 아미노산 서열 또는 SEQ ID No. 11 또는 SEQ ID No. 12와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 상기 언급된 서열들의 변이체를 갖는, 폴리에스테르 폴리우레탄을 저-분자량 분해 생성물로 분해하는 공정.
폴리펩티드의 사용 방법으로서,
상기 폴리펩티드는 SED ID No. 3, SEQ ID No.　2, SEQ ID No.　4, SEQ ID No.　5, SEQ ID No.　6, SEQ ID No.　8, SEQ ID No.　10, 및 상기 폴리펩티드의 변이체, 또는 SEQ ID No. 7에 따른 아미노산 서열을 갖는 GatA-유사 폴리펩티드, 또는 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이고, 상기 폴리펩티드는 우레탄 링크(linkages)의 효소 절단에서 우레탄분해효소 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 폴리펩티드의 사용 방법.
청구항 10에 있어서,
상기 우레탄기는 방향족으로(aromatically) 부착되는(attached), 폴리펩티드의 사용 방법.