CN113106027B - 一种牡蛎内生真菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种牡蛎内生真菌及其发酵生产次生代谢产物的应用，所提供的内生真菌Periconia sp.QAU‑OG‑lsz‑15，菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No：21455。本发明对牡蛎内生真菌进行分离纯化，并进行体外抑制Aβ₄₂蛋白聚集活性筛选，获得了黑团孢属Periconia sp.菌株。本发明的菌株能够高效的表达抑制Aβ₄₂聚集的次生代谢产物。

Description

一种牡蛎内生真菌及其应用

技术领域

本发明属于益生菌筛选应用技术领域，具体涉及一种牡蛎内生真菌及其发酵生产次生代谢产物的应用

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种常见的老年性脑神经退行性病变，发病率较高，死亡率仅次于心血管病、癌症及中风而位居第四，已成为现代社会严重威胁老年人生命的疾病之一。AD发病机制复杂，是一种多病因的疾病，典型的病理变化包括β-淀粉样蛋白(β-amyloid protein，Aβ)沉积形成老年斑(senile plaque，SP)、神经纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFT)、基底前脑胆碱能功能障碍和皮层、海马广泛的神经元丢失及突触形态的改变等。

近年来，根据AD的病因、病理及分子生物学研究进展，许多学者从不同角度提出了多种病因假说和相应的治疗策略，主要有胆碱能学说、Aβ毒性作用、炎性病变、自由基氧化损伤、脑能量代谢障碍、基因缺陷与突变等。

目前临床治疗AD主要采用基于胆碱能假说即以乙酰胆碱酯酶(acetylcho-linesterase，AChE)为靶点的乙酰胆碱酯酶抑制剂(acetylcholinesterase inhibitors，AChEIs)，包括他克林(THA)、多奈哌齐、利凡斯的明和加兰他敏等药物。但由于AD病因的复杂多样性，这些传统的抗AD药物只能在一定程度缓解中、轻度AD患者的病症，并不能终止和逆转AD的病情进展，无法阻止神经元细胞的退变、凋亡。

研究显示，神经毒性Aβ的沉淀、缠结是导致神经元细胞凋亡的主要诱因。因此有人提出Aβ很可能是治疗AD的关键。因此目前抗AD药物筛选的一个重要切入点，很多学者把寻找有效药物的目光移向了海洋天然产物。

海洋环境是一个多变、开放、复杂的生态系统，孕育了种类繁多的海洋微生物，除了生存在水体及海底沉积层的微生物外，还有很多是与海洋动植物处于共生、附生关系的微生物。在漫长的演化过程中，海洋微生物形成了独特和多样的机制来适应高压、黑暗、高盐、低温和寡营养等严酷的生存环境，从而进化出基因型、代谢途径和生理生态功能的多样性。

许多研究已经证实了海洋来源的真菌其代谢产物显示出抗老年痴呆的活性。M.Navarri等从海底沉积物中得到了一株真菌Oidiodendron griseum，从其代谢产物中得到了4个具有抑制CDC2样激酶活性的化合物；B.Wu等从海绵中得到一株真菌Talaromycessp.，其代谢产物具有较好的抑制乙酰胆碱酯酶活性，L.Wen等从中国南海红树林的树皮内生真菌Sporothrix sp.中得到了3个具有抑制乙酰胆碱酯酶活性的化合物；Qiao等从海洋红藻内生真菌A.flavus中得到了6个具有抑制乙酰胆碱酯酶的化合物；Liu等从连云港海洋沉积物中分离出的43株真菌中，发现15株真菌其代谢产物显示出抑制乙酰胆碱酯酶的活性。从以上的研究结果可以看出海洋真菌由于它们生存环境的特异性，会产生新奇骨架和强生理活性的代谢产物，是筛选抗AD活性先导化合物的资源宝库。

牡蛎，又名蚝，营养丰富，含有多种功能活性成份，具有很好的强肝解毒、抗癌、美容养颜，延缓衰老的功效，长期食用可以延缓衰老，预防老年痴呆。基于微生物与宿主之间的内共生理论，牡蛎共生真菌产生抗老年痴呆活性成份的可能性极大。

发明内容

本发明的目的是提供一种牡蛎内生真菌及其发酵生产次生代谢产物的应用，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种内生真菌Periconia sp.QAU-OG-lsz-15，菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No：21455；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2021年01月27日。

本发明所提供的内生真菌在发酵制备次生代谢产物中的应用；

所述的次生代谢产物能够用于抑制Aβ₄₂的聚集；

本发明再一个方面提供内生真菌的一种用途，是在制备抑制Aβ₄₂聚集的制品中的应用。

本发明还提供内生真菌在发酵制备次生代谢产物的一种方法，

所述的方法，是将所述的内生真菌接种到察氏培养基中进行发酵来制备；

所述的当菌株接种量为10％、察氏培养基初始pH为8.0、发酵温度为26℃、发酵天数为12d时。

本发明对牡蛎内生真菌进行分离纯化，并进行体外抑制Aβ₄₂蛋白聚集活性筛选，获得了黑团孢属Periconia sp.菌株。本发明的菌株能够高效的表达抑制Aβ₄₂聚集的次生代谢产物。

附图说明

图1：QAU-OG-lsz-15株的真菌形态学图；

图2：QAU-OG-lsz-15株的系统发育树图；

图3：接种量对Aβ₄₂相对抑制率的影响图；

图4：发酵液初始pH值对Aβ₄₂相对抑制率的影响图；

图5：发酵温度对Aβ₄₂相对抑制率的影响图；

图6：发酵时间对Aβ₄₂相对抑制率的影响图；

图7：不同浓度次生代谢产物对秀丽线虫瘫痪率的影响图；

图8：不同浓度次生代谢产物对秀丽线虫存活率的影响图；

图9：不同浓度次生代谢产物对秀丽线虫头部摆动频率的影响图；

图10：次生代谢产物对秀丽线虫存产卵量的影响图；

图11：次生代谢产物对秀丽线虫体内抗氧化酶活性及MDA含量图，其中(a)秀丽线虫蛋白含量(b)秀丽线虫体内MAD含量(c)秀丽线虫体内总SOD活性(d)秀丽线虫体内CAT活性；

图12：次生代谢产物对秀丽线虫体内Aβ聚集的影响图，其中(a)对照组(b)样品量为15μg/mL组。

具体实施方式

本发明使用青岛海域野生牡蛎为原料，采取菌丝尖端切割法，纯化得到牡蛎内生真菌，然后采用形态学和分子生物学对纯化后的内生真菌进行鉴定，并使用筛选获得的内生菌株来发酵生产抑制Aβ₄₂聚集的次生代谢产物。

下面结合实施例和附图来对本发明进行详细的描述。

实施例1牡蛎内生真菌的分离鉴定

本实施例所使用的培养基的配比如下：

筛选分离真菌菌株的水-琼脂(Water Agar，WA)抗生素培养基：在锥形瓶中加入琼脂20g，青霉素40000U，链霉素30000U，蒸馏水补足至1L，将培养基进行121℃，15min高压蒸汽灭菌，在超净工作台中倒入培养皿中凝固，每个平板大约倒入15mL。

海水马铃薯葡萄糖琼脂(Potato Dextrose Agar，PDA)培养基：称取一定量的PDA固体培养基用海水溶解于锥形瓶中，将培养基进行高压蒸汽灭菌，然后倒平板。

海水马铃薯葡萄糖(Potato Dextrose，PD)液体培养基：称取一定量的PD液体培养基用海水溶解于锥形瓶中，将培养基进行高压蒸汽灭菌，对纯化得到的单菌落进行培养，作为种子液。

改良海水察氏培养基：硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，七水硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，蔗糖30g，酵母膏1g，加入海水补足1L。将培养基高压蒸汽灭菌，用于菌株的大量发酵，以获得具有活性次生代谢产物。

一、牡蛎内生真菌的分离纯化

将采自青岛海域的新鲜牡蛎用无菌水洗净，用小刀将壳去除，将牡蛎肉用无菌水洗净后，用75％乙醇和2.5％NaClO分别浸泡5min后用无菌水洗净，用灭菌后的滤纸吸干牡蛎肉表面水分。

将处理好的牡蛎肉转移到超净工作台中，放入灭菌的研钵中研碎，得到匀浆。用移液枪吸取匀浆0.2mL于WA抗生素培养基上，用涂布棒涂布均匀，将涂布完成的平板放入28℃培养箱中倒置培养，待平板长出菌体后，采用菌丝尖端切割法，用接种针挑取不同形态的真菌接种到海水PDA培养基上，对菌株进行分离纯化，将分离纯化好的菌株接种于海水PDA斜面上，置于4℃冰箱保存备用。

对分离得到的内生真菌分别进行发酵，将发酵液减压旋转蒸发后用乙酸乙酯萃取，得到内生真菌次生代谢产物，体外进行Aβ₄₂抑制活性检测，将次生代谢产物抑制能力最强的菌株定为目标菌株，最终筛选的真菌命名为QAU-OG-lsz-15。

二、QAU-OG-lsz-15株的形态学鉴定

将纯化后的内生真菌QAU-OG-lsz-15株接种在海水PDA培养基上，在28℃条件下培养3-7d，观察记录菌落形状、颜色、生长速度、以及菌落的质感，采用水浸法在低倍镜下观察菌丝体的形态，结合《真菌鉴定手册》对菌株菌落形态特征进行记录。

培养结果显示菌株在PDA培养基上生长速度较快，菌落中部突起，呈绿色，边缘为白色绒毛状(图1)。

三、内生真菌的分子生物学鉴定

1)内生真菌总DNA提取

将已纯化的内生真菌接种到PD培养基中培养3-5d，用真菌DNA提取试剂盒提取得到高质量的基因组DNA。

2)PCR扩增

对所分离真菌的ITS rDNA序列进行PCR扩增，PCR扩增体系如表1所示。

表1：PCR扩增体系表

扩增过程的程序设置如表2所示。

表2：PCR扩增程序表

将5μL扩增后的PCR产物与19μL buffer染料混合后进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，用3μL Maker作对照。对结果进行凝胶成像，观察拍照结果，与Maker得到的扩增产物的大小进行对比，判断PCR产物是否扩增成功。

3)PCR产物测序

PCR产物成功扩增后送生工(上海)有限公司测序，将检测结果NCBI数据库中进行Blast相似序列检索，选取相似性较高的序列，使用MEGA 5.05邻接法构建系统发育树。最后结合形态学和分子生物学的鉴定结果，对内生真菌进行鉴定。

获得的ITS rDNA的序列如下：

TGCGGAAGGATCATTACAAAATACCGGCGCCTGCCCTCCGGGGTCGCGCGCCTCTATTTCAACCCTTTGCCTATGCGTACCCTTATCGCTTCCTCGGCAGGCTCGCCTGCCGCCAGGAACCCCACAAACCCTTTGCATCTATACACGAAAACTTCTGATACAAAACTAAATTATTACAACTTTTAACGATGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTCGGTATTCCGTGGGGCACGCCTGTTCGAGCGTCATTTACACCCTCAAGCCTAGCTTGGTGTTGGGCGTCTGTCCCGCACTCGTTGCGCGGACTCGCCTCAAAGTCATTGGCGGCGGTCGTGCCGGCTCCTCGCGCAGCACATTTGCGCTTCTCGGAGGCCCGGCGGATCGGCATCCAGCAAGCTACTTTTTATGACTTGACCTCGGATCAGGTGAGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATC(SEQ ID NO:1)，blast结果证明该序列与Periconia属的真菌最接近。

通过形态学和分子生物学方法对牡蛎内生真菌进行鉴定，最终确定分离得到的内生真菌为Periconia属(图2)。将该真菌命名为Periconia sp.QAU-OG-lsz-15，于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC保藏，保藏编号为CGMCC No：21455。

实施例2：QAU-OG-lsz-15株的次生代谢产物对抑制Aβ₄₂聚集活性及发酵条件优化

1、牡蛎内生真菌发酵及样品的制备

将低温保藏的纯化得到的牡蛎内生真菌QAU-OG-lsz-15菌株进行活化，将平板上的菌株用接种铲连同培养基一同铲碎，接种于海水PD培养基中，于培养箱中，180r/min，28℃恒温震荡培养3d，得到种子液。将种子液接种到改良的海水察氏培养基中，接种量为10％、28℃继续培养12d，得到发酵液。

将发酵结束的发酵液用4层无菌纱布过滤，分离发酵液和菌丝体，得到过滤液。经过旋转蒸发仪浓缩至体积为1/3后，用体积比1：1的乙酸乙酯萃取三次，合并萃取相，经旋转蒸发仪浓缩得到浸提液，得到次生代谢产物待测样品。

2、牡蛎内生真菌次生代谢产物对Aβ₄₂聚集的抑制作用的检测方法

采用硫磺素T(THT)荧光法，测定体外Aβ₄₂聚集率，首先对Aβ₄₂单体进行处理，将Aβ₄₂室温下解冻后溶解于HFIP中配成终浓度为1.0mg/mL的液体，然后将Aβ₄₂溶液超声30min后常温孵育2h，使Aβ₄₂单体化。然后置于-80℃超低温冰箱中冷冻4h后立即放入真空冷冻干燥机中除去HFIP，Aβ₄₂单体制备完成，保存于-20℃冰箱中。

将处理好的Aβ₄₂单体溶解于20mM NaOH中，在冰水中超声直至蛋白完全溶解，蛋白终浓度为440μM。经0.22μm滤膜过滤蛋白溶液后，用磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.6)稀释至10mM，使Aβ₄₂单体终浓度为40μM。

将所得菌株的次生代谢产物用DMSO溶解，配制成质量浓度为5mg/mL的样品溶液，与制备好的Aβ₄₂单体进行混合，将混合液置于37℃，150rpm摇床中反应24h后，吸取150μL，加入到由25mM PBS(pH 6.0)溶解的3mL 25μM ThT溶液中。在比色皿中充分混合后放入荧光分光光度计中，设置激发波(excitation，Ex)440nm、发射波(emission，Em)480nm、狭缝宽度为5nm进行测量，以表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)为阳性对照。根据以下公式计算样品的相对抑制活性(Vi)：Vi(％)＝100-[(Fi-Fb)/Fo]×100，其中Fi为加入样品后的荧光强度，Fb为样品本身荧光强度(无Aβ₄₂多肽)，Fo为未加入样品时Aβ₄₂自发聚集的荧光强度。每个实验点进行三次平行实验，取平均值。将抑制Aβ₄₂聚集能力最强的次生代谢产物菌株作为目标菌株，对目标菌株进行发酵条件优化。

3、菌株QAU-OG-lsz-15株的发酵条件优化的单因素试验

对菌株QAU-OG-lsz-15株的液体发酵的发酵条件进行优化，首先采用单因素试验，以Aβ₄₂聚集率为指标，分别对发酵过程中所选用的菌株接种量、察氏培养基初始pH值、培养温度、培养时间进行确定。接种量选择5％、10％、15％、20％、25％五个水平；初始pH值选择6、6.5、7.0、7.5、8.0五个水平；培养温度选择22℃、24℃、26℃、28℃、30℃五个水平；发酵天数选择8d、10d、12d、14d、16d五个水平。

4、菌株QAU-OG-lsz-15株发酵条件优化的正交试验

根据单因素实验结果，以菌株QAU-OG-lsz-15株次生代谢产物对Aβ₄₂聚集抑制率为依据，以菌株接种量、察氏培养基初始pH值、培养温度、发酵时间为正交试验因素对QAU-OG-lsz-15株的最佳液体培养条件进行优化。实验中每个因素取三个水平，每个试验进行3次平行试验，采取L₉(3⁴)确定菌株最佳培养条件。

表3：发酵条件优化的水平表

5、数据分析

实验数据均为三次重复实验的平均值，采取正交设计软件对各因素分析之后，采取Graphpad prism 8.0.1软件对所测得的数据进行处理分析并作图，并以Mean±SEM表示。

6、菌株发酵单因素试验的结果

6.1最佳接种量的确定

发酵时菌株接种量直接影响QAU-OG-lsz-15株次生代谢产物对Aβ₄₂聚集的抑制活性，在培养时间为10d，培养温度为28℃，察氏培养基初始pH值为7，菌株接种量分别为5％、10％、15％、20％、25％时得到在不同接种量条件下发酵液提取物对Aβ42聚集抑制活性的影响。分析图3可知，在菌株接种量在5％时，Aβ₄₂的相对抑制率最低为43.3±1.7％，从接种量由5％-15％增加的过程中，Aβ₄₂的相对抑制率呈现上升，而在接种量由15％-25％增加的过程中，Aβ₄₂的相对抑制率下降，在菌种接种量为15％时Aβ₄₂的相对抑制率最高为51.7±1.0％。可能是因为当菌株接种量过少时，菌的密度过小，培养基中的养分未得到充分利用。当接种量过多时，菌的密度过大，QAU-OG-lsz-15未充分发酵产生次生代谢产物，因此，接种量选择10％，15％和20％开展后续正交实验。

6.2发酵液最佳初始pH值的确定

初始pH变化，菌株QAU-OG-lsz-15的次生代谢产物对Aβ₄₂聚集的抑制活性也随之不同，在培养时间为10d，培养温度为28℃，菌株接种量为15％，发酵液初始pH值分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0时，得到在培养基不同初始pH条件下QAU-OG-lsz-15菌株的次生代谢产物对Aβ₄₂聚集相对抑制率的影响。分析图4可知，在发酵液初始pH为6时，发酵液提取物对Aβ₄₂的相对抑制率最低为57.7±1.0％，随着发酵液初始pH值的增加，Aβ₄₂的相对抑制率呈现先上升，后下降的趋势，在发酵液初始pH为7.5时，Aβ₄₂的相对抑制率最高为58.3±1.5％。这可能是因为发酵液pH过酸或是过碱时都不利于菌株的生长和代谢。因此，发酵液初始pH值选择7.0，7.5和8.0开展后续正交实验。

6.3最佳发酵温度的确定

菌株QAU-OG-lsz-15的次生代谢产物对Aβ₄₂的聚集抑制作用随发酵温度的不同而不同，在菌株接种量为15％，发酵液初始pH值分别为7.5，培养时间为10d，培养温度分别为22℃、24℃、26℃、28℃、30℃时，得到在不同发酵温度条件下次生代谢产物对Aβ₄₂聚集相对抑制率的影响。分析图5可知，当发酵温度为22℃时，发酵液提取物对Aβ₄₂的相对抑制率为44.7±0.9％，在发酵温度从22℃到30℃增加的过程中，Aβ₄₂的相对抑制率先迅速上升，在发酵温度为26℃时Aβ₄₂的相对抑制率最高达到54.5±1.4％，后迅速下降，在发酵温度为30℃时，Aβ₄₂的相对抑制率最低为42.7±1.1％。在菌株生长和代谢过程中，发酵温度过低或是过高的温度都会对菌株产生不利的影响，因此发酵温度选择24℃，26℃和28℃开展后续正交实验。

6.4最佳发酵时间确定

菌株QAU-OG-lsz-15的次生代谢产物对Aβ₄₂聚集抑制活性随发酵温度的不同而不同，在接种量为15％，pH值分别为7.5，培养温度分别为26℃，培养时间为8d、10d、12d、14d、16d时，得到在不同发酵时间条件下发酵液次生代谢产物对Aβ₄₂聚集的影响。由图6可知，随着发酵时间的延长，发酵液次生代谢产物对Aβ₄₂聚集的相对抑制率先上升，后下降，发酵时间为16d时,发酵液次生代谢产物对Aβ₄₂的相对抑制率最低为42.9±2.2％，在发酵时间为12d时,对Aβ₄₂聚集的相对抑制率最高为58.0±1.6％。菌株培养时间过短时，菌株QAU-OG-lsz-15未充分生长或者产生次生代谢产物，而培养时间过长时，培养液中的营养成分不足，影响到菌株的生长，因此发酵时间不宜过长或是过短。因此，发酵时间选择10d，12d和14d开展后续正交实验。

7、菌株最佳发酵条件的正交实验结果

按照上述单因素实验结果选择实验参数，进一步进行正交实验，确定该菌株发酵的最佳条件，结果如表4所示。

通过极差分析可知，各因素对于Aβ₄₂聚集的抑制作用影响大小顺序为：发酵温度＞发酵时间＞发酵液初始pH值＞菌株接种量，发酵条件的最佳组合为A₁B₃C₂D₂，即接种量为10％、察氏培养基初始pH为8.0、发酵温度为26℃、发酵天数为12d。

此组合未出现在前期试验中，因此进行3次验证试验，测得Aβ₄₂相对抑制率为65.2±1.1％，比条件优化前提高了19.4％。

表4：正交实验结果表

实施例3：QAU-OG-lsz-15菌株次生代谢产物对AD模型秀丽隐杆线虫的影响

利用基因工程技术表达人Aβ_1-42的秀丽隐杆线虫是一种方便的研究AD蛋白毒性的生物模型，自1995年以来，转基因秀丽隐杆线虫模型已用于评估抗AD药物的疗效和用于潜在的AD治疗药物筛选，向线虫体内转入人体肌肉特异性unc-54启动子，可以驱动人类c DNA克隆的适当编码区域的表达，在线虫体内形成人类淀粉样蛋白(Link，1995)。

转基因秀丽隐杆线虫CL4176表现为伴随的进行性瘫痪，利用人源肌肉细胞初始化启动子myo-3来控制Aβ的表达，在体壁肌肉中表达人类淀粉样肽，在温度诱导系统下，Aβ_1-42在秀丽隐杆线虫菌株CL4176的体壁肌肉中聚集，Aβ的表达和随后的聚集导致线虫的麻痹，使线虫出现抽搐等症状，表现为AD的症状和病理变化，是一个非常适合的探究相关的Aβ毒性相关的行为障碍和氧化应激的生物模型。因此，秀丽隐杆线虫CL4176可以作为AD淀粉样蛋白假说生物模型进行试验(李梵，2016)。

1、线虫及菌株

转基因秀丽线虫菌株CL4176基因型为：(smg-1(cc546ts)I；dvIs27[myo-3/Aβminigene+rol-6(su1006)marker gene]X，由Caenorhabditis Genetics Center购得。转基因秀丽线虫菌株CL4176中Aβ_1-42的表达取决于温度从16℃升到23℃。

大肠杆菌OP50(E.coli OP50)：转基因秀丽线虫菌株CL4176的食物，该种大肠杆菌是尿嘧啶缺陷型，该大肠杆菌无法自身合成只能从培养基(NGM)中获取尿嘧啶，所以生长速度会比普通的大肠杆菌慢，这样既可以提供线虫食物，又不会过度生长。而普通的大肠杆菌，由于没有限制，会过度生长，从而制约线虫的生长。

2、主要溶液

线虫生长培养基(nematode growth medium，NGM培养基)(1L)：NaCl 3g，AgarPowder 17g，peptone 2.5g，加去离子水定容至1L，121℃高压蒸汽灭菌20min后，转移超净工作台内，待温度降到60℃以下，依次在无菌操作下加入胆固醇溶液(1mL，1M，用0.22μm滤膜，过滤除菌)、1M硫酸镁溶液、1M氯化钙溶液和1M磷酸钾水溶液，充分混合后倒入培养皿中，冷凝待用。

线虫裂解液(1L体系)：分别取100mL 10％次氯酸钠溶液和5M氢氧化钾溶液配成总体积为1L的线虫裂解液，现用现配。

线虫冻存液(1L体系)：取KH2PO4 6.8g，1M NaOH 5.6ml，NaCl 5.85g，甘油300g，加入离子水定容至1L，高压灭菌20min后放至室温，每升体系冻存液中加入3mL 1M硫酸镁溶液。

3、实验方法

3.1大肠杆菌OP50的准备

将E.coli OP50接入LB液体培养基，放置于37℃培养箱培养24h，将培养后的LB液体培养基在无菌环境下倒入比色皿内，在600nm下测定吸光值，测得OD值为0.5-0.6之间，此时大肠杆菌处于旺盛生长的对数生长期，即得到活化的E.coli OP50。若OD值大于0.6，则用LB培养基稀释至吸光度为0.5-0.6。

3.2培养平板的制备

将次生代谢产物用DMSO溶解配置成为100mg/mL储备液，然后将其用E.coli 0P50分别稀释成为浓度为1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL的样品溶液，将不同浓度样品溶液涂布在NGM平板对线虫CL4176进行给药。分别吸取100μL不同浓度的样品溶液涂布到NGM平板上(涂布时应涂布于平板中心区域，距离平板边缘0.5cm左右，避免涂于平板边缘，线虫爬出培养基而死亡)，放入37℃培养箱培养12h，使E.coli OP50长满NGM平板表面。

3.3秀丽线虫同期化

试验所用线虫为年龄同期化线虫，同期化的方法为使用铂丝将20-30只待产卵的成虫转移到含有不同浓度样品的NGM的制备平板上，将平板放置在16℃培养箱中2h，待卵的数量达到实验要求，用铂丝将产卵的成虫移除，将留有卵的平板转移到16℃生化培养箱培养使卵孵化，38h后，线虫培养到L1期，即得到同期化的线虫。

3.4秀丽线虫CL4176瘫痪缓解实验

秀丽线虫CL4176在16℃到23℃高温诱导条件下会出现瘫痪麻痹症状，反映出线虫肌肉细胞中Aβ₄₂聚集对线虫的毒性作用。瘫痪缓解实验要求同期化时控制线虫数量为100个左右，将卵放置于16℃培养箱培养38h得到同期化线虫后，放入23℃生化培养箱高温诱导24h，线虫开始出现瘫痪，计数瘫痪线虫的数量，此记为第一天。瘫痪的标准为用铂丝刺激线虫，线虫头部可以摆动，尾部无法摆动，身体不能移动。此后每隔1d计数瘫痪线虫的数量，每组设三组平行。

3.5秀丽线虫CL4176寿命测定

寿命试验要求同期化时控制每个平板上线虫的产卵量约为100个，将产卵的平板放置于16℃生化培养箱中孵化38h得到同期化的线虫后，放入23℃生化培养箱中进行高温诱导24h，计数每个平板上线虫的存活情况，此时记作第一天。死亡的标准为以铂丝轻轻碰触线虫后，线虫10s内无任何反应。将死亡的线虫从平板上剔除。每1d记录一次平板上线虫的存活和死亡条数，计算线虫的存活率，实验持续至最后一条秀丽线虫死亡为止。

3.6秀丽线虫CL4176头部摆动频率测定

线虫体内Aβ₄₂聚集会导致线虫的运动能力下降，可以通过测定线虫身体运动情况(例如头部摆动)来研究线虫的神经健康状况。以线虫头部摆动频率为依据，测定样品对秀丽线虫CL4176的运动能力的影响。线虫头部摆动频率试验要求同期化时，每个平板的卵的数量约为50个，将平板放置于16℃培养箱中38h得到同期化的线虫，将平板放置于23℃生化培养箱中高温诱导，从每个平板随机选取20只线虫，用铂丝轻轻刺激线虫，计数20s内线虫头部的摆动频率(头部摆动定义为头从一侧摆向另一侧)，高温诱导后每隔1d计数一次，实验重复三次。

3.7秀丽线虫CL4176生殖能力测定

生殖能力试验要求同期化时，每个平板的卵的数量约为20个，将平板放置于16℃培养箱中38h，待线虫培养到L1期，将平板转移至23℃生化培养箱中，高温诱导24h，此后每24h将线虫转移至新的NGM制备平板上，直到完全失去繁殖能力。计数每天线虫的产卵的数量。每组设3个平行板。

3.8线虫CL4176抗氧化酶活性和MDA含量的测定

为测定线虫体内氧化损伤情况，检测线虫组织匀浆液中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活力以及脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量，来代表抗氧化防御体系各指标的检测结果。

选择样品浓度为15μg/mL为样品组，以涂布不含样品的E.coli OP50的NGM平板为对照组，同期化时，控制每个平板的产卵量为300个，待线虫培养到L1期，将平板放置于23℃生化培养箱中，高温诱导24h，用M9缓冲液将秀丽线虫从培养皿上冲洗下，清洗至透明后移除上清液称重，按比例加入生理盐水，在冰水中研磨成匀浆，匀浆在4℃、2500r/min，离心10min，制成5％的匀浆。

采用考马斯亮蓝法，按照试剂盒说明书要求测定线虫匀浆中蛋白质含量，按照试剂盒说明书要求进行超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活力以及脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量的测定，酶活性和MDA含量通过蛋白质含量标准化。

3.9线虫CL4176体内Aβ₄₂测定

采用硫黄素T(ThT)荧光染色法测定了秀丽线虫CL4176中Aβ₄₂的聚集情况。将同期化处理的30只秀丽线虫CL4176培养于涂布有15μg/mL样品的NGM平板上，在23℃下培养40h，然后将线虫用M9缓冲液冲洗至PE管中，将收集到的线虫在4℃磷酸盐缓冲液(PBS；pH 7.4)配置的4％多聚甲醛中固定过夜。然后将线虫在125mM Tris缓冲液(含5％β-巯基乙醇和1％Triton X-100的pH 7.4)中于37℃反应24h，然后用PBS缓冲液洗涤3次并用含50％乙醇的0.125％ThT染色20min，用50％乙醇连续洗涤脱色，然后将线虫转移到载玻片上并盖上盖玻片，用荧光显微镜拍摄ThT染色后的Aβ_1-42蛋白斑的图像。以培养于不含样品的NGM平板的秀丽线虫CL4176作为对照组。

3.10统计学方法

使用GraphPad Prism 8.0.1进行数据处理。数据表示为平均值±SD，平均值的标准误差在图中用条形表示。

4、结果与讨论

4.1次生代谢产物对秀丽线虫CL4176瘫痪率的影响

在体壁肌肉细胞中表达人源Aβ₄₂基因的转基因秀丽线虫CL4176用于确定次生代谢产物对Aβ₄₂诱导的毒性的影响。当线虫CL4176培养温度从16℃升至23℃时，Aβ₄₂聚集体的沉积将导致CL4176发生麻痹性表型，从而出现瘫痪。如图7所示，随着诱导时间的延长，秀丽线虫CL4176的瘫痪比例持续增加。在样品浓度空白组(0μg/mL)时，线虫的瘫痪速率最快，诱导3d时，线虫瘫痪率达到74.7±2.5％，诱导5d时，线虫瘫痪率达到93.7％，而样品组可以缓解秀丽线虫的瘫痪速率，当高温诱导第3d时，样品浓度为5μg/mL，线虫瘫痪率为57.0％，而10、15、20μg/mL组瘫痪率均低于50％。其中在15μg/mL瘫痪速率在诱导第3d时，线虫瘫痪率为28.3±4.0％，在5d时的瘫痪率为68.0±3.0％。实验结果表明，QAU-OG-lsz-15菌株的次生代谢产物可以显著降低诱导过程中线虫的瘫痪速率。

4.2次生代谢产物对秀丽线虫CL4176寿命的影响

寿命是秀丽线虫衰老最直接的指标，QAU-OG-lsz-15菌株的次生代谢产物对高温诱导过程中秀丽线虫CL4176寿命的影响实验结果如图8所示，随着诱导时间的延长，线虫的存活率不断下降，与空白组(0μg/mL)相比，其余组存活率曲线均右移，不同浓度样品组线虫的寿命均长于空白组，诱导的第3d，空白组线虫开始出现死亡，第10d全部死亡；在样品浓度为10μg/mL，高温诱导第4d线虫出现死亡，第14d全部死亡；当样品浓度为20μg/mL时，高温诱导第4d线虫出现死亡，第15d全部死亡，而样品浓度为15μg/mL组，在高温诱导第5d线虫出现死亡，第16d全部死亡。在样品浓度为15μg/mL时，线虫死亡速率最慢，与空白组相比寿命可以延长6d，由此可以看出，QAU-OG-lsz-15菌株的次生代谢产物可以延长秀丽线虫的寿命，且在样品浓度为15μg/mL时效果最佳。

4.3次生代谢产物对秀丽线虫CL4176运动能力的影响

线虫的运动能力与神经健康有关，高温诱导线虫的Aβ42发生聚集，线虫的头部会出现僵硬，难以运动的状况，所以，线虫的头部摆动频率可以反映线虫其神经健康状况。由图9可以看出，随着诱导时间的延长，各组秀丽线虫CL4176的头部摆动频率都有所降低，在诱导1d后，空白组(0μg/mL)线虫头部摆动频率为18次，而在8d后，线虫的头部摆动频率降为2次，样品浓度为15μg/mL组线虫在诱导1d后，头部摆动频率为24次，诱导8d后，头部摆动频率降为7次。空白组秀丽线虫头部摆动频率明显低于其他各组，而样品浓度为15μg/mL组头部摆动频率最高。结果表明，QAU-OG-lsz-15菌株的次生代谢产物增加了线虫CL4176的头部摆动频率。

4.4次生代谢产物对秀丽线虫CL4176生殖能力的影响

秀丽线虫产卵量与线虫的寿命具有相关性，可以用来评价线虫的衰老速度，用不同浓度的QAU-OG-lsz-15次生代谢产物处理后，秀丽线虫CL4176的产卵量如图10所示。与空白组(0μg/mL)相比，样品组在各天的产卵量和总的产卵量都有明显提高，15μg/mL组各天的产卵量和总的产卵量最高。这说明，不同浓度样品对于秀丽线虫产卵量有明显影响，QAU-OG-lsz-15菌株的次生代谢产物对线虫的生殖能力有增强作用，可延缓线虫衰老。

4.5次生代谢产物增加秀丽线虫中抗氧化酶活性并降低MDA含量

氧化化剂酶系统是应对氧化应激并清除生物体内细胞内ROS的最重要防御路线之一。因此，抗氧化酶活性的调节可以有助于秀丽线虫CL4176在氧化应激下的存活率增加。超氧化物歧化酶(SOD)作为线虫体内最主要的抗氧化酶，对机体的抗氧化水平至关重要，SOD能够有效清除超氧阴离子自由基，保护机体，起到抗氧化的作用。另一方面，丙二醛(MAD)是脂质过氧化作用的终产物之一，是氧化应激的重要生物标志物。因此，本发明研究了QAU-OG-lsz-15菌株次生代谢产物对秀丽线虫CL4176体内抗氧化酶SOD和CAT活性以及MDA含量的影响。如图11a-d所示，对照组(0μg/mL)的SOD活性为145.0±1.0U/mg prot，CAT活性为162.0±1.04U/g prot，MAD含量为9.2±0.2nmol/mg prot，15μg/ml样品组SOD活性为243.7±4.7U/mg prot，CAT活性为257±2.65U/g prot，MAD含量为6.3±0.3nmol/mg prot，与对照组(0μg/mL)相比，用15μg/mL样品预处理的秀丽线虫的SOD和CAT活性增加，而MDA含量降低。这些数据表明，QAU-OG-lsz-15菌株次生代谢产物能够通过调节抗氧化酶活性和脂质过氧化作用来改善线虫的抗氧化防御系统。

4.6次生代谢产物对秀丽线虫体内Aβ沉淀的影响

对秀丽线虫CL4176体内淀粉样蛋白进行THT荧光染色，发现与对照组秀丽线虫CL4176体内出现明显沉积，而15μg/mL样品组线虫体内Aβ₄₂明显减少，说明QAU-OG-lsz-15菌株的次生代谢产物可以减少线虫体内淀粉样蛋白的聚集。这一结果表明样品是通过减少线虫体内淀粉样蛋白的聚集，减轻了高温诱导线虫的瘫痪率，延长了线虫的寿命和提高了线虫的头部摆动频率和产卵量，这一结果对AD病症的预防和治疗起到积极的作用。

综上，转基因秀丽线虫菌株CL4176中Aβ₄₂的表达取决于培养温度的升高，当线虫培养温度从16℃升高到23℃时，CL4176线虫体内Aβ₄₂聚集，线虫出现AD症状。设置不同浓度次生代谢产物样品与E.coli OP50混合对线虫进行给药，对线虫进行同期化和高温诱导后，测定了诱导过程中线虫的瘫痪率、寿命、头部摆动频率、产卵量以及线虫体内抗氧化酶活力、MAD含量。通过试验证明，QAU-OG-lsz-15菌株的次生代谢产物可以降低高温诱导线虫的瘫痪率、延长线虫寿命、增加线虫头部摆动频率和产卵量，通过线虫体内抗氧化酶活性的测定，表明QAU-OG-lsz-15菌株的次生代谢产物可以提高线虫体内SOD和CAT活性，降低MAD含量，减少线虫体内的氧化损伤。对线虫体内Aβ₄₂进行荧光成像，发现线虫体内Aβ₄₂聚集明显减少，说明QAU-OG-lsz-15菌株的次生代谢产物具有减少线虫体内Aβ蛋白聚集作用，并通过减少体内Aβ聚集，缓解了AD症状。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 一种牡蛎内生真菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 538

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgcggaagga tcattacaaa ataccggcgc ctgccctccg gggtcgcgcg cctctatttc 60

aaccctttgc ctatgcgtac ccttatcgct tcctcggcag gctcgcctgc cgccaggaac 120

cccacaaacc ctttgcatct atacacgaaa acttctgata caaaactaaa ttattacaac 180

ttttaacgat ggatctcttg gttctggcat cgatgaagaa cgcagcgaaa tgcgataagt 240

agtgtgaatt gcagaattca gtgaatcatc gaatctttga acgcacattg cgcccctcgg 300

tattccgtgg ggcacgcctg ttcgagcgtc atttacaccc tcaagcctag cttggtgttg 360

ggcgtctgtc ccgcactcgt tgcgcggact cgcctcaaag tcattggcgg cggtcgtgcc 420

ggctcctcgc gcagcacatt tgcgcttctc ggaggcccgg cggatcggca tccagcaagc 480

tactttttat gacttgacct cggatcaggt gaggataccc gctgaactta agcatatc 538

Claims (1)

1.一种内生真菌，其特征在于，所述的内生真菌为内生真菌Periconia sp.QAU-OG-lsz-15株，其保藏编号为CGMCC No：21455。

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